Name: Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj analizę interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie. Ta metoda umożliwia badanie kinetyki wiązania i wpływu modyfikacji potranslacyjnych na funkcję białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów National Science Foundation (1929346) i American Cancer Society (RSG-21-028-01). Chcielibyśmy również podziękować członkom laboratorium Balakrishnan za pomocne dyskusje.

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie przynęty, analitu, i czyszczenie uchwytów na krople
<ol>
	<li>Ustawianie instrumentu: Włącz instrument co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Pozwoli to lampie się rozgrzać.</li>
	<li>Przygotowanie do usuwania i czyszczenia
	<ol>
		<li>Bufor do oddzielania: Przygotować 50 ml 0,15 M kwasu fosforowego [pH 2,0]).</li>
		<li>Bufor czyszczący: Przygotować 10 ml 0,5 N HCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bufora BLI
	<ol>
		<li>Przygotuj 50 ml 1x buforu BLI (50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA, 1 mM DTT, 0,05% Tween 20). Przechowywać ten bufor w temperaturze 4 °C. Przed skonfigurowaniem tego testu doprowadź bufor do temperatury pokojowej. 
		UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przygotowanie świeżych do testu, ponieważ stare mogą ulegać zmianom pH lub tworzeniu się agregatów i mogą zawierać zanieczyszczenia mikrobiologiczne, co może zagrozić odtwarzalności i dokładności wyników. Nie zaleca się stosowania, które były przechowywane dłużej niż dwa tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie przynęty/podłoża
	<ol>
		<li>Przygotować 12,5 nM substratu 3'Bio-ss-poly (dT)32 (5' TTT TTT TTT TT 3'Bio) za pomocą buforu BLI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zapasów o stężeniu białka
	<ol>
		<li>Przygotować cztery stężenia RPA (5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM) za pomocą buforu BLI. Najwyższe stężenie białka (40 nM) uzyskuje się poprzez rozcieńczenie białka wyjściowego w buforze BLI. Kolejne rozcieńczenia przygotowuje się przez seryjne rozcieńczanie roztworu roboczego o stężeniu 40 nM. Upewnij się, że wszystkie zapasy białka są trzymane na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu, aby zachować stabilność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie uchwytu kropli
	<ol>
		<li>Dodaj 4 μl wody destylowanej i wyczyść uchwyt na krople niestrzępiącą się ściereczką (powtórz 3x). Następnie powtórz ten krok z 4 μl 70% etanolu i wyczyść niestrzępiącą się chusteczką. Ten etap zapewnia usunięcie zanieczyszczeń powierzchniowych i cząstek kurzu.</li>
		<li>Dodaj 4 μl 0,5 N HCl i pozostaw w uchwycie na krople na 1 minutę. Wyczyść go niestrzępiącą się chusteczką i powtórz ten krok jeszcze raz. Zapewnia to dokładne czyszczenie uchwytu kropli. Dokładne czyszczenie jest szczególnie przydatne do czyszczenia uchwytu na krople z zaschniętych kropli po poprzednim użyciu.</li>
		<li>1Powtórz krok 1, aby umyć uchwyt na krople wodą destylowaną i 70% etanolem i wytrzyj go do sucha niestrzępiącą się chusteczką. Uchwyt kropli jest teraz gotowy do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Podstawowa kinetyka
<ol>
	<li>Konfiguracja urządzenia i oprogramowania
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie i wybierz Podstawowa kinetyka na lewym panelu (Rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Wyjmij stojak z biosensorami z tacki (uzyskanymi ze źródeł komercyjnych) i umieść w niej 96-dołkową płytkę. Dodać 200 μl buforu BLI do pierwszego dołka. Następnie umieść tacę biosensorów z powrotem na 96-dołkowej płytce, upewniając się, że każdy bioczujnik jest włożony do odpowiedniej studzienki. Pierwszy biosensor powinien być teraz zanurzony w buforze BLI w pierwszym dołku.</li>
		<li>W oprogramowaniu kliknij Hydrate i włącz timer na 10 minut, pozwalając pojedynczemu biosensorowi nawodnić się przez co najmniej 10 minut. Etap ten nawilża bioczujnik, aby był gotowy do testu BLI.</li>
		<li>Podczas hydratacji biosensora odpipetuj 250 μl buforu BLI do dwóch probówek o pojemności 0,5 ml. Oznacz jeden jako "A" (skojarzenie), a drugi jako "D" (dysocjacja).</li>
		<li>Uzupełnij dane dotyczące oprogramowania (Nazwa: Powlekanie podłoża i opis testu: RPA- 3'Bio-ss-poly (dT)32: Podstawowa Kinetyka).</li>
		<li>Dostosuj ustawienie uruchamiania dla każdego kroku: Linia bazowa (30 s), Asocjacja (120 s), Dysocjacja (120 s) (Tabela 1). Trzymaj wytrząsarkę włączoną do rurki i uchwytu na krople. Prędkość wytrząsarki jest ustawiona na 2200 obr./min (zakres, 1000–2600 obr./min), co zapobiega efektom transportu masy spowodowanym ograniczoną dyfuzją w pobliżu powierzchni biosensora. 
		UWAGA: Optymalizacja czasu trwania dla każdego kroku (linia bazowa, ładowanie, kojarzenie, dysocjacja) podczas ustawiania testu kinetyki wiązania jest zalecana w celu poprawy pozyskiwania danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustalanie krzywej bazowej
	<ol>
		<li>Umieść probówkę A w uchwycie probówki i podłącz uwodniony bioczujnik do systemu BLI. Wsuń uchwyt probówki pod bioczujnik (pozycja A, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). 
		UWAGA: Biosensory nie mogą być całkowicie wysuszone w żadnym momencie eksperymentu. W przypadku pozostawienia do wyschnięcia odczyty eksperymentu mogą być znacznie zniekształcone.</li>
		<li>Naciśnij Uruchom i postępuj zgodnie z instrukcjami w komunikacie monitu.</li>
		<li>Po wykonaniu początkowego planu bazowego otwórz pokrywę i dodaj 4 μl buforu BLI do uchwytu na krople. Przesuń go w prawo pod tym samym biosensorem (pozycja B, <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Zamknij pokrywę i monitoruj krzywą BLI w oprogramowaniu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3, niebieska krzywa).</li>
		<li>Po zakończeniu otwórz pokrywę, aby zastąpić rurkę "A" rurką "D" i wsuń ją pod bioczujnik (pozycja A, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Zamknij pokrywę i przejdź do etapu dysocjacji. Po zakończeniu otwórz pokrywę, odłącz bioczujnik, umieść go z powrotem na tacy i upewnij się, że bioczujnik jest zanurzony w buforze BLI.</li>
		<li>Wyjąć próbkę/bufor, oczyścić uchwyt kropli buforem przed wysuszeniem go niestrzępiącymi się chusteczkami i wyjąć probówkę "D" z uchwytu probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie podłoża
	<ol>
		<li>Umieść probówkę A w uchwycie probówki i podłącz uwodniony bioczujnik do systemu BLI. Wsuń uchwyt probówki pod biosensor i naciśnij Uruchom. </li>
		<li>Po wstępnym etapie podstawowym dodać 4 μl substratu 12,5 nM [3'Bio-ss-poly (dT)32] do uchwytu kropli i wsunąć go pod bioczujnik. Zamknij pokrywę i monitoruj krzywą BLI w oprogramowaniu. Upewnij się, że ta odpowiedź jest wyższa niż wartość bazowa (Rysunek 3). 
		UWAGA: Stężenie substratu można zoptymalizować, pokrywając biosensory różnymi stężeniami (tylko jedno stężenie na biosensor) i obserwując krzywe wiązania. Krzywa wiązania z widocznie wyższym sygnałem w porównaniu z linią bazową wystarczy, aby potwierdzić pokrycie podłoża. Przeciążenie biosensora może prowadzić do przeszkody sterycznej lub stłoczenia na powierzchni. Rysunek 3pokazuje krzywe dla pięciu stężeń biotynylowanego substratu 3'Bio-ss-poly (dT)32. Dodatkowo, po zakończeniu etapu ładowania przynęty, biosensory można zanurzyć w buforze blokującym streptawidynę (biocytynie) na 30 s, a następnie przemyć w buforze BLI. Spowoduje to zablokowanie niezwiązanej powierzchni streptawidyny i zapobiegnie niespecyficznemu wiązaniu.</li>
		<li>Po zakończeniu etapu asocjacji otwórz pokrywę i zastąp rurkę "A" rurką "D". Wsuń ją pod bioczujnik i zamknij pokrywę.</li>
		<li>Po zakończeniu etapu dysocjacji otwórz pokrywę, odłącz biosensor i umieść go w tacce biosensora zawierającej bufor BLI. Upewnij się, że bioczujnik jest całkowicie zanurzony w buforze i jest odpowiednio nawodniony do kolejnych kroków. Wyczyść uchwyt kropli buforem testowym, osusz go niestrzępiącymi się chusteczkami i wyjmij probówkę "D" z uchwytu probówki. Bioczujnik jest teraz pokryty substratem 3'Bio-ss-poly (dT)32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Białkami
	<ol>
		<li>Odpipetować 250 μl buforu BLI do dziesięciu czarnych probówek do mikrofuge o pojemności 0,5 ml. Oznacz je od A1 do A5 i od D1 do D5.</li>
		<li>Na innej 96-dołkowej płytce dodać 200 μl buforu oddzielającego do studzienki, odpowiadając położeniu uwodnionego biosensora.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem testu wyczyść uchwyt kropli 3x buforem BLI.</li>
		<li>Otwórz nowy plik w oprogramowaniu i wybierz Podstawowa kinetyka na lewym panelu. Nazwij test i dodaj opis w razie potrzeby (rysunek uzupełniający 2). Dostosuj ustawienia uruchamiania zgodnie z wymaganiami (Tabela 1).</li>
		<li>Umieść probówkę oznaczoną A1 w uchwycie probówki i przymocuj biosensor z powłoką 3'Bio-ss-poly (dT)32 do systemu BLI. Wsuń rurkę pod biosensor i naciśnij Uruchom.</li>
		<li>Po wykonaniu początkowego etapu podstawowego otwórz pokrywę, dodaj 4 μl buforu BLI do uchwytu kropli i wsuń go pod bioczujnik. Będzie to stężenie białka 0 nM i posłuży jako krzywa odniesienia.</li>
		<li>Po zakończeniu etapu asocjacji zastąp rurkę A1 rurką D1 i wsuń ją pod biosensor.</li>
		<li>Po zakończeniu etapu dysocjacji wyjmij bioczujnik i umieść go z powrotem w tacy. Upewnij się, że bioczujnik jest całkowicie zanurzony w buforze i odpowiednio nawodniony do kolejnych kroków. Wyjmij probówkę D1, wyczyść uchwyt na krople buforem testowym i osusz go niestrzępiącą się chusteczką.</li>
		<li>Następnie zostanie uzyskana krzywa wiązania dla zapasu 5 nM RPA. Wypełnij szczegóły próbki (Stężenie: 5 nM, Masa cząsteczkowa: 116 KDa] i naciśnij Oblicz. Spowoduje to obliczenie stężenia białka w μg/μl.</li>
		<li>Podłącz bioczujnik pokryty 3'Bio-ss-poly (dT)32 i umieść rurkę A2 w uchwycie probówki. Wsuń go pod biosensor i naciśnij Uruchom.</li>
		<li>Po linii podstawowej dodaj 4 μl 5 nM RPA na uchwyt kropli i wsuń go pod bioczujnik. Zamknij pokrywę i monitoruj krzywą asocjacji. Wiązanie białek z przynętą można uwidocznić za pomocą krzywej biegnącej wyżej niż krzywa podstawowa. Po etapie asocjacji zastąp A2 przez D2, wsuń go pod bioczujnik i zakończ etap dysocjacji.</li>
		<li>Wyjmij biosensor, zanurz go w buforze do strippingu na 30 s, a następnie zanurz w buforze BLI na 3 min. 
		UWAGA: Skuteczność regeneracji zależy od unieruchomionej przynęty i zakłóconego analitu. Niektóre unieruchomione biosensory mogą wytrzymać dziesięć lub więcej cykli regeneracji. Mogliśmy usunąć biotynylowany substrat 3'Bio-ss-poly (dT)32 więcej niż trzy razy (rysunek uzupełniający 3) bez zaobserwowania zauważalnej zmiany w odpowiedzi.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.4.9–2.4.12 dla pozostałych trzech stężeń RPA 10 nM, 20 nM i 40 nM. Upewnij się, że bioczujnik został usunięty dla każdego stężenia. 
		UWAGA: W przypadku testów BLI eksperci zalecają stosowanie czterech (z wyłączeniem krzywej referencyjnej) stężeń, obejmujących w przybliżeniu od 0,1 do 10 razy oczekiwanegoK D w celu uzyskania dokładnych pomiarów kinetycznych. W tym przypadku cztery stężenia uzyskano przez seryjne rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizowanie danych i obliczanie wartościK D
	<ol>
		<li>Przed obliczeniem wartościK D konieczne jest wzrokowe sprawdzenie sensorgramu dla każdego stężenia wiązania RPA na podłożu 3'Bio-ss-poly (dT)32. Upewnij się, że sygnał BLI wzrasta wraz ze wzrostem stężenia RPA, aż do momentu nasycenia unieruchomionego DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
		UWAGA: Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy upewnić się, że co najmniej cztery stężenia białka są pomyślnie związane z substratem, z wyłączeniem stężenia analitu 0 nM. Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby rozwiązać problemy z potencjalnymi błędami.</li>
		<li>W tabeli "Lista przebiegów" sprawdź Ref dla stężenia analitu 0 nM, które ma służyć jako krzywa odniesienia. Sprawdź Analizuj dla wszystkich stężeń analitu.</li>
		<li>Następnie wybierz zarówno Początek asocjacji, jak i Początek dysocjacji dla korekcji kroku. Spowoduje to wyrównanie początku asocjacji z końcem linii bazowej i początku dysocjacji z końcem asocjacji, co jest zwykle spowodowane różnymi wzorcami odbicia między uchwytem kropli a rurką, jeśli bufor dobrze pasuje.</li>
		<li>Wybierz Globalne dopasowanie (1:1) dla tego testu. Analiza globalna oblicza wartościK D dla całego zestawu stężeń białek, podczas gdy analiza lokalna dotyczy stężenia pojedynczego białka. 
		UWAGA: Oprogramowanie dołączone do instrumentu pozwala tylko na montaż 1:1. Może to być potencjalne zastrzeżenie, gdy oczekuje się, że przynęta i analit będą pasować do innych pasujących modeli. Dane z tego oprogramowania mogą być eksportowane do innych programów do drukowania i dopasowywane do wymaganych modeli dopasowania.</li>
		<li>Następnie wybierz pozycję Analizuj. Spowoduje to obliczenie wartości K, D, k, a/k d (tabela 2). Błąd ka i k d w granicach 10% wartości jest ogólnie uważany za dopuszczalny. 
		UWAGA: Upewnij się, że te wartości mieszczą się w rozsądnych granicach. Jeśli błąd jest mniejszy niż 10%, sugeruje to, że dopasowanie danych jest wiarygodne do badania interakcji między cząsteczkami biologicznymi. Dodatkowo, obliczone KD (stała dysocjacji równowagi) przy użyciu tych wartości ka ik d powinny być wystarczająco dokładne dla większości praktycznych zastosowań18.</li>
		<li>Aby wyeksportować dopasowane dane, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres wygenerowany na podstawie przeanalizowanych danych. Wybierz pozycję Eksportuj dane, a następnie wybierz pozycję Tekst/Dane. Kliknij Plik i przeglądaj, aby zapisać dane w formacie ".dat". Plik ten można otworzyć w programie Microsoft Excel i używać w innym oprogramowaniu do kreślenia wykresów. 
		UWAGA: Dopasowanie globalne uwzględnia wszystkie dane dotyczące krzywej wiązania w grupie, podczas gdy dopasowanie lokalne koncentruje się wyłącznie na parametrach kinetycznych dla każdego indywidualnego stężenia analitu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustawianie instrumentu do uruchamiania zaawansowanej kinetyki
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie i wybierz Zaawansowana kinetyka na lewym panelu (Rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę na tacy zawierającej biosensory. Dodać 200 μl buforu BLI do pięciu studzienek. Umieść tacę z biosensorami na 96-dołkowej płytce tak, aby pięć biosensorów zanurzyło się w studzience zawierającej bufor.</li>
	<li>W oprogramowaniu kliknij Hydrate i włącz timer na 10 minut, pozwalając pojedynczemu biosensorowi nawodnić się przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Podczas gdy biosensory nawadniają się, odpipetuj 250 μl buforu BLI do dziesięciu czarnych probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml. Oznacz je jako A1 do A5 i od D1 do D5.</li>
	<li>Uzupełnij dane w oprogramowaniu (Nazwa: Powlekanie podłoża i opis testu: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)32: Advanced Kinetics).</li>
	<li>Wprowadź czas trwania dla każdego kroku (rysunek uzupełniający 4). Początkowa linia bazowa (30 s), obciążenie (120 s), linia bazowa (30 s), asocjacja (120 s), dysocjacja (120 s). Dostosuj ustawienia uruchamiania zgodnie z wymaganiami (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Uzupełnij dane w oprogramowaniu (Stężenie: 0 nM, Masa cząsteczkowa: 116 kDa) i naciśnij Oblicz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść probówkę A1 w uchwycie probówki i przymocuj bioczujnik. Wsuń uchwyt probówki pod bioczujnik i naciśnij Uruchom, aby uzyskać początkową linię bazową.</li>
	<li>Dodaj 4 μl substratu 12,5 nM do uchwytu na krople i wsuń go pod biosensor. Zamknij pokrywę. Spowoduje to załadowanie substratu do bioczujnika. Zamień A1 na D1 w uchwycie probówki i wsuń go pod biosensor. W ten sposób zostanie wyznaczona krzywa bazowa.</li>
	<li>Wyczyść uchwyt kropli niestrzępiącą się chusteczką i załaduj 4 μl bufora BLI. Wsuń go pod biosensor i zamknij pokrywę. Będzie to stężenie białka wynoszące 0 nM i posłuży jako krzywa odniesienia.</li>
	<li>Po zakończeniu etapu asocjacji wsuń rurkę D2 pod biosensor. Kontynuuj etap dysocjacji. Poczekaj na zakończenie dysocjacji.</li>
	<li>Odłącz biosensor, wyjmij D2 z uchwytu probówki i wyczyść uchwyt kropli niestrzępiącą się chusteczką.</li>
	<li>Wprowadź szczegóły (Stężenie: 5 nM, Masa cząsteczkowa: 116 kDa) dla następnego przebiegu i naciśnij Oblicz.</li>
	<li>Podłącz drugi bioczujnik do systemu BLItz, umieść rurkę A2 w uchwycie probówki i wsuń ją pod bioczujnik.</li>
	<li>Po ustaleniu początkowej linii podstawowej dodać 4 μl substratu o stężeniu 12,5 nM do uchwytu na krople. Wsuń go pod biosensor i zamknij pokrywę. Zamień rurkę A2 na D3 i wsuń ją pod biosensor. Następnie dodaj 4 μl 10 nM zapasu RPA do uchwytu probówki i wsuń go pod biosensor.</li>
	<li>Po asocjacji wsuń D4 pod bioczujnik w celu dysocjacji.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.1.12–3.1.15 dla kolejnych trzech stężeń RPA (10 nM, 20 nM, 40 nM). Krzywe wiążące dla tych stężeń są pokazane na Rysunek 5.</li>
	<li>Analiza danych i wartość KD mogą być dopasowane w tej samej procedurze, co podstawowa kinetyka BLI (krok 2.5, tabela 2).</li>
</ol>

Quantitative Analysis of RPA-ssDNA Binding Kinetics Using Label-Free Methods

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Możliwość analizy kinetyki wiązania dowolnego białka z jego substratem za pomocą BLI zapewnia środki do wyizolowania i scharakteryzowania określonych czynników (takich jak sekwencja, struktura lub długość DNA) rządzących interakcjami białko-DNA w komórce19. System Octet N1, który opiera się na zasadach interferometrii biowarstw, pozwala na ilościowy pomiar oddziaływań białko-białko i białko-kwasy nukleinowe. Ponadto przy użyciu tej metodologii można określić interakcje między lipidami, przeciwciał...

Białka komórkowe odgrywają kluczową rolę w organizowaniu złożonych procesów biologicznych, które zachodzą w organizmach żywych. Optymalne funkcjonowanie tych szlaków zależy od wzajemnych oddziaływań między białkami i innymi biomolekułami wewnątrz komórki, w tym interakcji z białkami partnerskimi i kwasami nukleinowymi1. Tak więc zrozumienie zawiłości procesów komórkowych wymaga głębokiego zrozumienia dynamiki interakcji białko-kwas nukleinowy.
Tradycyjnie, interakcje białko-kwas nukleinowy były badane za pomocą testów EMSAs2. W tym teście białka są inkubowane z syntetycznymi oligonukleotydami (DNA/RNA, zawierającymi określone długości lub sekwencje) przez krótki czas, a następnie reakcja jest elektroforezowana na natywnym żelu poliakrylamidowym (PAGE)3,4,5. Aby umożliwić wizualizację interakcji białko-oligonukleotyd, oligonukleotydy są zazwyczaj znakowane radioaktywnie 32P lub znakowane cząsteczkami fluorescencyjnymi. Jeśli białko oddziałuje i wiąże oligonukleotyd, to wiązanie białka spowalnia ruchliwość kwasu nukleinowego w żelu6,7. Dlatego ta metoda jest również nazywana testem przesunięcia żelu lub opóźnienia żelu. Chociaż metoda ta jest szeroko stosowana, istnieje kilka ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z tej metody w celu uzyskania wartościKD, w tym niska rozdzielczość wynikająca ze słabego lub dynamicznego wiązania, wymóg znacznie wysokiego stężenia białek i większy wysiłek. Ponadto EMSA nie są testami w czasie rzeczywistym i dlatego nie mogą dokładnie mierzyć kinetyki wiązania7,8.
Innowacyjne techniki, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) i interferometria biowarstw (BLI), pojawiły się, aby przezwyciężyć te ograniczenia9,10,11,12. Obie metody mierzą stałe szybkości asocjacji/dysocjacji i stałe powinowactwa między cząsteczkami w sposób bezznacznikowy. Ponieważ białko nie musi być znakowane, techniki te eliminują ryzyko zmiany właściwości białka lub zablokowania miejsca wiązania. W SPR światło spolaryzowane oddziałuje z czujnikiem (metalową folią przewodzącą, zwykle złotą), generując falę gęstości ładunku elektronowego zwaną plazmonem. Ta interakcja zmniejsza intensywność odbitej wiązki, a detektor mierzy zmianę określonego kąta, znanego jako kąt rezonansowy13. Aby zbadać oddziaływania ligand (kwas nukleinowy) - analit (białko), ligand jest unieruchamiany w jednej komórce przepływowej na chipie czujnika, a analit jest wstrzykiwany do komory przepływowej zawierającej unieruchomiony ligand. Po związaniu analitu z ligandem następuje wykrywalna zmiana współczynnika załamania światła w pobliżu powierzchni czujnika, co pozwala na pomiar oddziaływań molekularnych14,15,16.
Interferometria biowarstwowa (BLI) mierzy wzór interferencji światła, gdy światło przechodzi przez światłowód z biowarstwą, składającą się z liganda (przynęty) i jego partnera wiążącego (analitu), na dolnej powierzchni końcówki biosensora. Światło jest przepuszczane przez końcówkę i odbijane na obu końcach biowarstwy ze względu na właściwości biowarstwy. Grubość biowarstwy jest proporcjonalna do liczby związanych cząsteczek, które wpływają na wzór odbitego światła. Porównując zmianę krzywej intensywności względnej vs. Długość fali spowodowana interferencją między światłem odbitym od granicy faz odniesienia a powierzchnią międzyfazową biowarstwy/bufora umożliwia określenie zmiany grubości biowarstwy. Gdy wiąże się więcej cząsteczek, następuje większa zmiana, co sprawia, że BLI jest potężnym narzędziem do badania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. Zmiana wzorca interferencji jest mierzona i przedstawiana na sensorgamie jako przesunięcie widmowe17,18 (Rysunek 1A). Charakter interakcji wiązania można dokładnie określić za pomocą odpowiednich elementów sterujących, takich jak konfiguracja bez stężeń zmiennych ligandów partnera wiążącego19,20,21. W porównaniu z SPR, BLI jest opłacalny i przyjazny dla użytkownika, dzięki czemu jest dostępny dla szerokiego grona badaczy. Ponadto próbki używane w BLI pozostają nienaruszone, jeśli nie ma degradacji lub agregacji. Pozwala to na ich ewentualny odzysk i ponowne wykorzystanie, minimalizując w ten sposób ilość odpadów. Przyrząd BLI działa bez użycia mikrofluidyki, eliminując w ten sposób wady układu fluidycznego, takie jak konieczność konserwacji/pielęgnacji, zapychanie czy stosowanie odgazowanych. Minimalizuje to również ryzyko zanieczyszczenia instrumentu przez niefiltrowane lub surowe próbki białka.
W eksperymencie BLI, biowarstwa jest tworzona poprzez unieruchomienie cząsteczki przynęty na biosensorze. Biowarstwa biosensorów może wchodzić w interakcje z różnymi znacznikami, co umożliwia badanie interakcji między cząsteczkami (w tym kwasami nukleinowymi, białkami, przeciwciałami, wirusami, małymi cząsteczkami itp.)22. Różne strategie wychwytywania, w tym biotyna/streptawidyna, 6X-His-tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anty-GST i przeciwciało/anty-Fc, mogą być stosowane do ustanowienia tego unieruchomienia. Utrzymanie struktury i aktywności unieruchomionego liganda jest kluczowe przy wyborze biosensora. Na zmiany we wzorcu interferencyjnym ma wpływ ilość związanej cząsteczki, a także matrix23. Interakcje białko-kwasy nukleinowe są badane za pomocą biotynylowanych sond oligonukleotydowych, które można unieruchomić na biosensorach pokrytych streptawidyną. Próbki białka, co do których oczekuje się, że będą wchodzić w interakcje z unieruchomioną przynętą (oligonukleotydem), pozostają w kontakcie z oligonukleotydem przez określony czas w buforze wiążącym w celu pomiaru asocjacji, a następnie są przełączane na ślepy bufor wiążący w celu pomiaru dysocjacji. Schematyczne przedstawienie wiązania analitu i odpowiadających mu zmian w krzywej wiązania pokazano na rysunku Rysunek 1B. Dodatkowo, interakcje białko-nukleina mogą być również badane przez odwróconą drogę immobilizacji, w której białko (przynęta) jest wychwytywane na biosensorze i oddziałuje z kwasem nukleinowym (analitem).
Obecnie na rynku dostępnych jest wiele instrumentów, które działają na zasadzie interferometrii biowarstw. Prostym i ekonomicznym urządzeniem jest system Octet N1, który posiada pojedynczy kanał do przesyłania danych. Wymaga obsługi ręcznej, zużywa minimalną objętość próbki (4 μl) i przeprowadza analizę próbki w temperaturze otoczenia9,23. Ten jednokanałowy instrument może wykrywać skuteczność wiązania białek większych niż 10 kDa i mierzyć powinowactwo w zakresie mikromolowym (μM) do nanomolowym (nM) 11,12. Niektóre instrumenty z 2, 8, 16 i 96 kanałami do automatycznego odczytu danych są również dostępne i kompatybilne zarówno z formatami 96, jak i 384 dołków19,20. Niektóre z tych instrumentów mogą również pracować w temperaturach od 4 °C do 40 °C, wykrywać biomolekuły o masie cząsteczkowej tak niskiej jak 150 Da i mierzyć powinowactwo w zakresie milimolowym do pikomolarnego19,21. Podczas gdy opisany system jest opłacalny, droższe urządzenia z wieloma kanałami oferują automatyczne przetwarzanie o wysokiej przepustowości. Te zaawansowane systemy są powszechnie stosowane do charakteryzowania i opracowywania biologicznych cząsteczek leków9,23.
Obecny protokół opisuje kroki związane z pomiarem parametrów wiązania białka replikacyjnego A (RPA) z jednoniciowym DNA (ss-DNA) przy użyciu jednokanałowego, manualnego systemu interferometrii biowarstwowej. RPA to heterotrimeryczny kompleks białkowy wiążący ssDNA, który odgrywa kluczową rolę w prawie wszystkich aspektach metabolizmu DNA, w tym w replikacji, naprawie i rekombinacji DNA24. Ze względu na wysokie powinowactwo do ssDNA (mierzone w zakresie subnanomolowym), może szybko wiązać się z ssDNA generowanym podczas różnych transakcji DNA, chronić go przed degradacją nukleolityczną i zapobiegać improwizowanemu wiązaniu innych dalszych białek. RPA odgrywa również kluczową rolę w zapobieganiu tworzeniu się niekanonicznych struktur drugorzędowych i trzeciorzędnych, takich jak G-quadruplexes25. Ludzki RPA składa się z trzech podjednostek: RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) i RPA14 (14 kDa), zwanych również odpowiednio RPA 1, RPA 2 i RPA 324,26,27. W tych podjednostkach znajduje się sześć fałdów wiążących oligonukleotyd/oligosacharydy (fałdy OB) oznaczone od A do F. Wśród nich domeny wiążące DNA (DBD) znajdują się w podjednostkach RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) i RPA2 (DBD-D)28. Początkowo sądzono, że w zależności od długości DNA, RPA wykazuje różne tryby wiązania, w których różne DBD były zaangażowane w określone długości DNA29. Dane z ostatnich badań strukturalnych i pojedynczych cząsteczek pomogły udoskonalić te modele, sugerując, że wiązanie różnych DBD RPA jest bardziej dynamiczne niż początkowo sugerowano30,31,32,33,34,35,36. Ta cecha właściwości dynamicznego wiązania jest niezbędna dla funkcji RPA, ponieważ RPA powinna być w stanie ściśle wiązać się z substratem DNA podczas niektórych transakcji DNA; Jednak powinien być również w stanie przemieścić się z substratu, aby przekazać substrat następnemu białku podczas procesu biologicznego. Korzystając z różnych technik biochemicznych, KD dla RPA określono na około 0,4 nM dla substratu ss-(polydT)30 oraz odpowiednio 80 nM i 200 nM dla substratów ss-(polydA)257 i dG-(polydG)602, mierzone za pomocą anizotropii polaryzacji fluorescencji (FPA)37,38. RPA wykazuje również około 50-krotnie wyższą preferencję do wiązania się z sekwencjami bogatymi w pirymidynę w porównaniu z purynami. Chociaż różne techniki biochemiczne określiły różne pomiary KD dla RPA, wszystkie pomiary mieściły się w zakresie nanomolowym, co sugeruje wysokie powinowactwo RPA do wiązania ssDNA. Wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM), odkryto, że na podstawie długości DNA, RPA wiąże się z co najmniej dwoma trybami wiązania: jednym, który został zdefiniowany przy szybkiej dysocjacji (Kd, 680 pM) i powolnej dysocjacji (Kd, 60 pM) kompleksie33,39. Biorąc pod uwagę jego kluczowy udział w prawie wszystkich szlakach metabolicznych DNA, istnieje duże zainteresowanie tworzeniem inhibitorów, które mogą utrudniać interakcję między RPA a jednoniciowym DNA (ssDNA). Te chemiczne inhibitory są niezbędne w zakłócaniu odpowiedzi na uszkodzenie DNA, czyniąc komórki rakowe bardziej podatnymi na czynniki uszkadzające DNA stosowane w terapiach klinicznych. Wykorzystanie testu BLI pozwala na precyzyjną ilościową ocenę skuteczności inhibitora w modulowaniu funkcji wiązania RPA40,41.
Konfiguracja BLI pozwala na różne ustawienia: kinetykę podstawową i zaawansowaną. W podstawowym trybie kinetyki test składa się z trzech podstawowych etapów: ustalenia linii bazowej, asocjacji i dysocjacji. Jednak przed wykonaniem tego testu bioczujniki muszą być powlekane oddzielnie, za pomocą przyrządu lub ręcznie na stole laboratoryjnym. I odwrotnie, zaawansowany tryb kinetyki wykracza poza podstawowe trzy kroki, umożliwiając włączenie dodatkowych kroków. Te dodatkowe etapy mogą służyć różnym celom, takim jak kondycjonowanie bioczujnika do zmian w buforze lub ułatwianie wykrywania kolejnych interakcji białkowych. Zaawansowana kinetyka pozwala również na usunięcie analitu z biosensora za pomocą dobrej metody regeneracji w celu potencjalnego ponownego wykorzystania, pod warunkiem, że przynęta i bioczujnik pozostaną nienaruszone. Ogólnie rzecz biorąc, zaawansowana kinetyka jest stosowana zamiast kinetyki podstawowej, gdy test obejmuje wiele etapów lub test musi być wykonany w bardziej złożonym formacie.
Ten protokół opisuje obie metody przy użyciu tej samej przynęty [3'Bio-ss-poly (dT)32] i analitu (RPA). Do unieruchomienia przynęty zostanie użyty bioczujnik pokryty streptawidyną i zostaną uzyskane pomiaryK D dla analitu. Protokół ten opisuje kompleksowe podejście do wykonywania testu BLI przy użyciu jednokanałowej interferometrii biowarstw instrumentu, obejmujące przygotowanie przynęty z biosensora, rozważania dotyczące bufora i zarys procedury krok po kroku.

<table><tbody><tr><td>0,5 ml mikroprobówki wirówkowe</td><td>Globe Scientific</td><td>111554A</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Standard Black Microplate</td><td>Dot Scientific</td><td>4ti-0223</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany oligonukleotyd poli dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSD11000-10</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSE57020-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimtec Science&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Octet N1</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>1.4.0.13</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor Octet SA&nbsp;</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>18-5019</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 (10x)</td><td>Gibco</td><td>1666711</td><td></td></tr><tr><td>Test osobisty System oktetu N1</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy&nbsp;</td><td>Ward's Science</td><td>470302-024</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS23020-5000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Dot Scientific</td><td>DST60040-5000</td><td></td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza interakcji dna-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Analyzing DNA-Protein Interactions with Streptavidin-Based Biolayer Interferometry

Interakcje białko-DNA leżą u podstaw podstawowych procesów komórkowych. Zrozumienie tych interakcji ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów molekularnych różnych szlaków. Kluczowe czynniki, takie jak struktura, sekwencja i długość cząsteczki DNA, mogą znacząco wpływać na wiązanie białek. Interferometria biowarstwowa (BLI) to bezznacznikowa technika, która mierzy kinetykę wiązania między cząsteczkami, oferując proste i precyzyjne podejście do ilościowego badania interakcji białko-DNA. Główną przewagą BLI nad tradycyjnymi metodami opartymi na żelu jest jej zdolność do dostarczania w czasie rzeczywistym danych na temat kinetyki wiązania, umożliwiając dokładny pomiar stałej dysocjacji równowagi (KD) dla dynamicznych interakcji białko-DNA. W artykule przedstawiono podstawowy protokół wyznaczania wartości KD interakcji między białkiem replikacyjnym DNA, białkiem replikacyjnym A (RPA) i substratem jednoniciowego DNA (ssDNA). RPA wiąże ssDNA z wysokim powinowactwem, ale musi być również łatwo przemieszczany, aby ułatwić kolejne interakcje białek w szlakach biologicznych. W opisanym teście BLI biotynylowane ssDNA jest unieruchamiane na biosensorze pokrytym streptawidyną. Następnie mierzy się kinetykę wiązania (asocjację i dysocjację) RPA z DNA związanym z biosensorem. Uzyskane dane są analizowane w celu uzyskania precyzyjnych wartości stałej szybkości asocjacji (ka), stałej szybkości dysocjacji (kd) i stałej wiązania równowagi (KD) za pomocą oprogramowania systemowego.

W metodzie BLI białe światło jest odbijane od interfejsu warstwy biologicznej/buforu oraz wewnętrznego interfejsu referencyjnego do spektrometru. Rejestrowany jest powstały wzór interferencyjny, a przesunięcie widmowe jest mierzone w czasie i przedstawiane jako odpowiedź w postaci krzywych wiązania w nm. Reprezentacyjna ilustracja przedstawiająca końcówkę biosensora z i bez wiązania analitytu oraz odpowiadające im przesunięcie długości fali widmowej (nm) znajduje się na Rysunku 1. Krzywe wią...

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Protein-DNA interactions underpin essential cellular processes. Understanding these interactions is critical for elucidating the molecular mechanisms of ...

Oddziaływania biomolekuł, w tym interakcje białko-białko i białko-DNA, są niezbędne w badaniach biochemicznych. W tym badaniu wykorzystujemy interferometrię biowarstw lub BLI, skuteczną technikę analizy tych interakcji. Skupiamy się na białku replikacyjnym A i jego powinowactwie do wiązania z pojedynczą nicią DNA, aby pokazać zasady i możliwości BLI.Interferometria biowarstwowa jest łatwą i opłacalną metodą badania kinetyki białek. Umożliwia szybkie monitorowanie interakcji białek w czasie rzeczywistym i oferuje prosty przepływ pracy przy mniejszej złożoności niż inne techniki. W naszym laboratorium badamy wpływ modyfikacji potranslacyjnych na strukturę i funkcję białek, które są niezbędne do utrzymania stabilności genomu.Te modyfikacje mogą inicjować efekty kaskadowe między ścieżkami replikacji i naprawy. Badając interakcje między białkami, dążymy do odkrycia mechanizmów leżących u podstaw ochrony integralności genomu. Na początek przygotuj 12,5 nanomola trzech pierwszorzędnych bio jednoniciowych substratów przynętowych poli dT 32 i czterech stężeń RPA za pomocą buforu BLI.Za pomocą pipety dodaj 250 mikrolitrów buforu BLI do dwóch 0,5 mililitrowych probówek do mikrofuge i oznacz je jako AND. Na oddzielnej 96-dołkowej płytce odpipetować 200 mikrolitrów buforu BLI do jednego dołka. Umieść tacę z bioczujnikami na płytce 96-dołkowej w taki sposób, aby jeden biosensor zanurzył się w buforze BLI.W oprogramowaniu kliknij opcję nawodnienia i ustaw minutnik na 10 minut. Dostosuj ustawienia uruchamiania dla każdego kroku, planu bazowego, skojarzenia i dysocjacji. Naciśnij uruchom w oprogramowaniu i postępuj zgodnie z instrukcjami w komunikacie monitu.Umieść dwie wnęki w uchwycie probówki i podłącz uwodniony bioczujnik do systemu BLI. Wsuń uchwyt probówki pod bioczujnik w pozycji A i monitoruj linię bazową bioczujnika. Po wykonaniu początkowego schematu bazowego otwórz pokrywę i dodaj cztery mikrolitry buforu BLI do uchwytu na krople.Przesuń uchwyt kropli w prawo pod tym samym biosensorem w pozycji B. Po zamknięciu pokrywy monitoruj krzywą BLI w oprogramowaniu. Następnie otwórz pokrywę i zastąp rurkę A rurką D. Wsuń nową rurkę pod bioczujnik w pozycji A przed zamknięciem pokrywy i przeanalizuj etap dysocjacji w interfejsie. Umieść probówkę A w uchwycie probówki.Podłącz uwodniony bioczujnik do systemu BLI i wsuń uchwyt rurki pod biosensor, jak pokazano wcześniej. Następnie kliknij uruchom w interfejsie oprogramowania, aby skonfigurować linię bazową. Po dodaniu czterech mikrolitrów 12,5 nanomolowej jednoniciowej przynęty DNA do uchwytu na krople i wsunięciu go pod bioczujnik w celu przeprowadzenia etapu asocjacji, monitoruj krzywą BLI w oprogramowaniu.Następnie otwórz pokrywę, aby zastąpić rurkę A rurką D. Wsuń ją pod bioczujnik i kontynuuj etap dysocjacji. Po zakończeniu etapu dysocjacji otwórz pokrywę i odłącz bioczujnik. Następnie umieść biosensor w zasobniku zawierającym bufor BLI.Za pomocą pipety dodaj 250 mikrolitrów buforu BLI do 10 0,5 mililitrowych czarnych probówek do mikrofuge. Oznacz probówki jako A1 do A5 i D1 do D5. Wypełnij szczegóły eksperymentu w interfejsie oprogramowania i naciśnij przycisk obliczeń, aby przetworzyć informacje. W oddzielnej 96-dołkowej pipecie płytkowej 200 mikrolitrów buforu odpędzającego do studzienki odpowiadającej położeniu uwodnionego biosensora.Po umieszczeniu rurki A1 w uchwycie na probówkę, przymocowaniu biosensora pokrytego przynętą do systemu BLI i wsunięciu rurki pod biosensor, naciśnij run w oprogramowaniu. Po zakończeniu początkowego etapu podstawowego otwórz pokrywę i dodaj cztery mikrolitry buforu BLI do uchwytu na krople. Wsuń uchwyt kropli pod bioczujnik i monitoruj krok asocjacji na interfejsie BLI.Zamień rurkę A1 na D1. Wsuń go pod biosensor i zamknij pokrywę. Następnie monitoruj etap dysocjacji na interfejsie BLI. Po zakończeniu etapu dysocjacji otwórz pokrywę, wyjmij biosensor i umieść go z powrotem w tacce zawierającej bufor BLI.Następnie zamocuj biosensor pokryty przynętą i umieść rurkę A2 w uchwycie probówki. Wsuń rurkę pod bioczujnik i kliknij uruchom w oprogramowaniu. Po kroku podstawowym dodaj cztery mikrolitry pięciu nanomolowych RPA na uchwyt kropli.Wsuń uchwyt kropli pod bioczujnik i zamknij pokrywę. Monitoruj krzywą asocjacyjną w interfejsie oprogramowania. Wyjmij bioczujnik i zanurz go w buforze do odpędzania na 30 sekund.Następnie zanurz bioczujnik w buforze BLI na trzy minuty. W tabeli oznaczonej jako Lista przebiegów zaznacz odniesienie do pola dla stężenia analitu o zerowym namolowym wskaźniku, który ma służyć jako krzywa odniesienia, zaznacz pole analizy, dla wszystkich stężeń analitu. Wybierz zarówno początek asocjacji, jak i początek dysocjacji dla korekcji krokowej, wybierz globalne dopasowanie dla testu.Następnie kliknij przycisk Analizuj, aby przetworzyć dane. Aby wyeksportować dopasowane dane, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres wygenerowany na podstawie danych analizy. Wybierz eksport danych, a następnie wybierz tekst lub dane, kliknij plik, a następnie przejdź do zapisania danych w formacie DAT.Otwórz oprogramowanie i wybierz zaawansowaną kinetykę z lewego panelu. Po umieszczeniu 96-dołkowej płytki w tacce biosensora i dodaniu 200 mikrolitrów buforu BLI do pięciu dołków, włóż tackę biosensora do płytki, aby nawodnić czujniki. Podczas gdy biosensory nawadniają się, odpipetuj 250 mikrolitrów buforu BLI do 10 czarnych probówek wirówkowych o pojemności 0,5 mililitra.Wypełnij szczegóły eksperymentu w interfejsie oprogramowania i naciśnij przycisk obliczeń, aby przetworzyć informacje. Po wsunięciu uchwytu probówki z rurką A1 pod biosensor, kliknij uruchom, aby uzyskać początkową linię bazową. Dodać cztery mikrolitry buforu BLI do uchwytu kropli.Wsuń uchwyt kropli pod biosensor, zamknij pokrywę i monitoruj krzywą ładowania w oprogramowaniu. Przesunięcie widmowe podczas wiązania RPA przy użyciu podstawowej kinetyki wykazało zależny od dawki wzrost siły wiązania przy nasyceniu osiągniętym przy 40 nanomolach. Przesunięcie widmowe podczas wiązania RPA przy użyciu zaawansowanej kinetyki podobnie wykazało wiązanie zależne od dawki, ale z indywidualnymi bioczujnikami stosowanymi dla każdego stężenia w celu poprawy dokładności.

analyzing-dna-protein-interactions-with-streptavidin-based-biolayer

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technologię interferometrii biowarstw (BLI) do wykrywania interakcji międzycząsteczkowych między ligandami a docelowymi analitami w czasie rzeczywistym. BLI mierzy zmiany we wzorze interferencji światła białego odbitego od warstwy unieruchomionych ligandów na powierzchni biosensora, gdy oddziałują one z analitami w roztworze.

Technologia interferometrii biowarstw do wykrywania interakcji między ligandem a analitem

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Interakcje czynników transkrypcyjnych (TF) z polimerazą RNA są zwykle badane za pomocą testów pulldown. Stosujemy technologię interferometrii biowarstwowej (BLI) w celu scharakteryzowania oddziaływania GrgA z polimerazą chlamydiowego RNA. W porównaniu z testami pulldown, BLI wykrywa asocjację i dysocjację w czasie rzeczywistym, oferuje wyższą czułość i jest wysoce ilościowy.

Zastosowanie interferometrii biowarstwowej (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Przedstawiamy protokół do szybkiej charakterystyki biomolekularnych oddziaływań fałdowania i wiązania z termolabilnymi ligandami za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej.

Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania

Protokół tutaj opisuje interakcje oczyszczonego białka kanału jonowego hEAG1 z małocząsteczkowym ligandem lipidowym fosfatydyloinozytolem 4,5-bisfosforanem (2). Pomiar pokazuje, że BLI może być potencjalną metodą badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych małych cząsteczek.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

Poznaj analizę interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie. Ta metoda umożliwia badanie kinetyki wiązania i wpływu modyfikacji potranslacyjnych na funkcję białek.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Przeglądaj więcej filmów