Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie
17 stycznia 2025
Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.
Oddziaływania biomolekuł, w tym interakcje białko-białko i białko-DNA, są niezbędne w badaniach biochemicznych. W tym badaniu wykorzystujemy interferometrię biowarstw lub BLI, skuteczną technikę analizy tych interakcji. Skupiamy się na białku replikacyjnym A i jego powinowactwie do wiązania z pojedynczą nicią DNA, aby pokazać zasady i możliwości BLI.
Interferometria biowarstwowa jest łatwą i opłacalną metodą badania kinetyki białek. Umożliwia szybkie monitorowanie interakcji białek w czasie rzeczywistym i oferuje prosty przepływ pracy przy mniejszej złożoności niż inne techniki. W naszym laboratorium badamy wpływ modyfikacji potranslacyjnych na strukturę i funkcję białek, które są niezbędne do utrzymania stabilności genomu.
Te modyfikacje mogą inicjować efekty kaskadowe między ścieżkami replikacji i naprawy. Badając interakcje między białkami, dążymy do odkrycia mechanizmów leżących u podstaw ochrony integralności genomu. Na początek przygotuj 12,5 nanomola trzech pierwszorzędnych bio jednoniciowych substratów przynętowych poli dT 32 i czterech stężeń RPA za pomocą buforu BLI.
Za pomocą pipety dodaj 250 mikrolitrów buforu BLI do dwóch 0,5 mililitrowych probówek do mikrofuge i oznacz je jako AND. Na oddzielnej 96-dołkowej płytce odpipetować 200 mikrolitrów buforu BLI do jednego dołka. Umieść tacę z bioczujnikami na płytce 96-dołkowej w taki sposób, aby jeden biosensor zanurzył się w buforze BLI.
W oprogramowaniu kliknij opcję nawodnienia i ustaw minutnik na 10 minut. Dostosuj ustawienia uruchamiania dla każdego kroku, planu bazowego, skojarzenia i dysocjacji. Naciśnij uruchom w oprogramowaniu i postępuj zgodnie z instrukcjami w komunikacie monitu.
Umieść dwie wnęki w uchwycie probówki i podłącz uwodniony bioczujnik do systemu BLI. Wsuń uchwyt probówki pod bioczujnik w pozycji A i monitoruj linię bazową bioczujnika. Po wykonaniu początkowego schematu bazowego otwórz pokrywę i dodaj cztery mikrolitry buforu BLI do uchwytu na krople.
Przesuń uchwyt kropli w prawo pod tym samym biosensorem w pozycji B. Po zamknięciu pokrywy monitoruj krzywą BLI w oprogramowaniu. Następnie otwórz pokrywę i zastąp rurkę A rurką D. Wsuń nową rurkę pod bioczujnik w pozycji A przed zamknięciem pokrywy i przeanalizuj etap dysocjacji w interfejsie. Umieść probówkę A w uchwycie probówki.
Podłącz uwodniony bioczujnik do systemu BLI i wsuń uchwyt rurki pod biosensor, jak pokazano wcześniej. Następnie kliknij uruchom w interfejsie oprogramowania, aby skonfigurować linię bazową. Po dodaniu czterech mikrolitrów 12,5 nanomolowej jednoniciowej przynęty DNA do uchwytu na krople i wsunięciu go pod bioczujnik w celu przeprowadzenia etapu asocjacji, monitoruj krzywą BLI w oprogramowaniu.
Następnie otwórz pokrywę, aby zastąpić rurkę A rurką D. Wsuń ją pod bioczujnik i kontynuuj etap dysocjacji. Po zakończeniu etapu dysocjacji otwórz pokrywę i odłącz bioczujnik. Następnie umieść biosensor w zasobniku zawierającym bufor BLI.
Za pomocą pipety dodaj 250 mikrolitrów buforu BLI do 10 0,5 mililitrowych czarnych probówek do mikrofuge. Oznacz probówki jako A1 do A5 i D1 do D5. Wypełnij szczegóły eksperymentu w interfejsie oprogramowania i naciśnij przycisk obliczeń, aby przetworzyć informacje. W oddzielnej 96-dołkowej pipecie płytkowej 200 mikrolitrów buforu odpędzającego do studzienki odpowiadającej położeniu uwodnionego biosensora.
Po umieszczeniu rurki A1 w uchwycie na probówkę, przymocowaniu biosensora pokrytego przynętą do systemu BLI i wsunięciu rurki pod biosensor, naciśnij run w oprogramowaniu. Po zakończeniu początkowego etapu podstawowego otwórz pokrywę i dodaj cztery mikrolitry buforu BLI do uchwytu na krople. Wsuń uchwyt kropli pod bioczujnik i monitoruj krok asocjacji na interfejsie BLI.
Zamień rurkę A1 na D1. Wsuń go pod biosensor i zamknij pokrywę. Następnie monitoruj etap dysocjacji na interfejsie BLI. Po zakończeniu etapu dysocjacji otwórz pokrywę, wyjmij biosensor i umieść go z powrotem w tacce zawierającej bufor BLI.
Następnie zamocuj biosensor pokryty przynętą i umieść rurkę A2 w uchwycie probówki. Wsuń rurkę pod bioczujnik i kliknij uruchom w oprogramowaniu. Po kroku podstawowym dodaj cztery mikrolitry pięciu nanomolowych RPA na uchwyt kropli.
Wsuń uchwyt kropli pod bioczujnik i zamknij pokrywę. Monitoruj krzywą asocjacyjną w interfejsie oprogramowania. Wyjmij bioczujnik i zanurz go w buforze do odpędzania na 30 sekund.
Następnie zanurz bioczujnik w buforze BLI na trzy minuty. W tabeli oznaczonej jako Lista przebiegów zaznacz odniesienie do pola dla stężenia analitu o zerowym namolowym wskaźniku, który ma służyć jako krzywa odniesienia, zaznacz pole analizy, dla wszystkich stężeń analitu. Wybierz zarówno początek asocjacji, jak i początek dysocjacji dla korekcji krokowej, wybierz globalne dopasowanie dla testu.
Następnie kliknij przycisk Analizuj, aby przetworzyć dane. Aby wyeksportować dopasowane dane, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres wygenerowany na podstawie danych analizy. Wybierz eksport danych, a następnie wybierz tekst lub dane, kliknij plik, a następnie przejdź do zapisania danych w formacie DAT.
Otwórz oprogramowanie i wybierz zaawansowaną kinetykę z lewego panelu. Po umieszczeniu 96-dołkowej płytki w tacce biosensora i dodaniu 200 mikrolitrów buforu BLI do pięciu dołków, włóż tackę biosensora do płytki, aby nawodnić czujniki. Podczas gdy biosensory nawadniają się, odpipetuj 250 mikrolitrów buforu BLI do 10 czarnych probówek wirówkowych o pojemności 0,5 mililitra.
Wypełnij szczegóły eksperymentu w interfejsie oprogramowania i naciśnij przycisk obliczeń, aby przetworzyć informacje. Po wsunięciu uchwytu probówki z rurką A1 pod biosensor, kliknij uruchom, aby uzyskać początkową linię bazową. Dodać cztery mikrolitry buforu BLI do uchwytu kropli.
Wsuń uchwyt kropli pod biosensor, zamknij pokrywę i monitoruj krzywą ładowania w oprogramowaniu. Przesunięcie widmowe podczas wiązania RPA przy użyciu podstawowej kinetyki wykazało zależny od dawki wzrost siły wiązania przy nasyceniu osiągniętym przy 40 nanomolach. Przesunięcie widmowe podczas wiązania RPA przy użyciu zaawansowanej kinetyki podobnie wykazało wiązanie zależne od dawki, ale z indywidualnymi bioczujnikami stosowanymi dla każdego stężenia w celu poprawy dokładności.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania oddziaływań białko-DNA z wykorzystaniem interferometrii warstw biologicznych (BLI). Podkreśla on efektywność metody BLI w analizie powinowactwa wiązania oraz wpływu modyfikacji potranslacyjnych na funkcje białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Interakcje białko-DNA
- Kinetyka wiązania
Wprowadzenie
- Oddziaływania biomolekularne są kluczowe w badaniach z zakresu biochemii.
- BLI jest efektywną kosztowo metodą badania kinetyki białek.
- Technika ta umożliwia monitorowanie oddziaływań w czasie rzeczywistym.
- Modyfikacje posttranslacyjne mogą wpływać na strukturę i funkcję białek.
Cel badania
- Zaprezentowanie zasad działania BLI.
- Analiza powinowactwa wiązania białka replikacyjnego A do jednoniciowego DNA.
- Przedstawienie prostego schematu postępowania w badaniu oddziaływań białkowych.
Zastosowane metody
- System interferometrii warstw biologicznych oparty na streptawidynie.
- Podstawowa i zaawansowana analiza kinetyki wiązania.
- Monitorowanie oddziaływań białko-DNA w czasie rzeczywistym.
- Ocena równowagowej powinowatości wiązania (K D ).
Główne wyniki
- Skuteczna demonstracja techniki BLI w badaniu oddziaływań DNA-białko.
- Wyznaczenie powinowactwa wiązania dla białka replikacyjnego A.
- Wnioski dotyczące wpływu modyfikacji potranslacyjnych.
- Walidacja BLI jako wiarygodnej metody analizy kinetyki białek.
Wnioski
- BLI jest skutecznym narzędziem do badania oddziaływań biomolekuł.
- Metoda ta upraszcza analizę kinetyki wiązania.
- Zrozumienie oddziaływań białko-DNA jest kluczowe dla badań nad stabilnością genomu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowa analiza oddziaływań białko-DNA stanowi podstawę walidacji celu oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Interferometria warstwy biologicznej (BLI) oparta na streptawidynie umożliwia pomiar kinetyki wiązania w czasie rzeczywistym bez użycia znaczników, co zwiększa pewność prognostyczną podczas badania szlaków sygnałowych i selekcji projektów w portfolio. Możliwość wyznaczenia precyzyjnych stałych kinetycznych przyspiesza podejmowanie decyzji w krytycznych punktach zwrotnych w badaniach i rozwoju (R&D) w branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ilościową weryfikację hipotez dotyczących wiązania białka z DNA w kontekście funkcji szlaków sygnałowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie kinetyki asocjacji i dysocjacji w czasie rzeczywistym.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów poprzez precyzyjne wyznaczanie KD.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy przechodzeniu celów do kolejnych etapów procesu odkrywania leków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane testy wiązania DNA-białko dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki kinetyczne do standaryzacji testu.
- Umożliwia szybką i skalowalną ocenę oddziaływań wiążących w wielu różnych warunkach.
- Wspiera rzetelną ocenę związków poprzez minimalizację złożoności i zmienności testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje odkrycia mechanistyczne ze szlakami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez wyjaśnienie dynamiki oddziaływań białko-DNA.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, wspierając badania nad biomarkerami i szlakami sygnałowymi.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, umożliwiając solidną, ilościową ocenę oddziaływań molekularnych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Analiza oddziaływań białko-DNA oparta na metodzie BLI integruje się z procesem badawczym – od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę mechanizmów wiązania białko-DNA oraz szlaków sygnałowych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane, ilościowe dane kinetyczne w celu oceny gotowości i powtarzalności testu.
- Analityka: Dostarcza stałe asocjacji, dysocjacji i równowagi do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wglądy mechanistyczne z systemami istotnymi dla chorób i strategiami biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań nad oddziaływaniami białko-DNA oraz białko-białko.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy dzięki standaryzowanym, powtarzalnym i skalowalnym analizom kinetycznym.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój aktywów na etapie odkrywania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu analiz kinetycznych i interpretacji danych.
- Wymaga dostępu do aparatury BLI oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Wymaga standaryzacji protokołów analiz i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych substratów białkowych lub DNA oraz systemów modelowych.
- Wyniki powtarzalne są zależne od jakości biosensorów i optymalizacji buforu.
