Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym
19 kwietnia 2024
Tutaj prezentujemy protokół elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakrylamidowym (PAGE) do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych Sipunculus nudus.
Nasze badania koncentrują się na układzie fibrynolitycznym . W tym badaniu staramy się uprościć metodę badań przesiewowych czynników fibrynogenolitycznych u robaków orzechowych przy użyciu techniki fibrynogenu-PAGE. Opracowaliśmy nową metodę fibrynogenu-PAGE poprzez połączenie metody PAGE i płytki fibrynogenu.
W porównaniu z innymi obecnie stosowanymi technikami, nasz protokół składa się z 10-letniego badania oddzielnego i wyświetlającego aktywne geny fibrynogenolityczne w obrębie tego samego patogenu. Co więcej, ta metoda jest przyjazna czasowo i kosztowo. Dzięki naszym odkryciom odkrycie środków neurofibrynogenolitycznych stanie się proste i może przyspieszyć rozwój nowych leków trombolitycznych, które mogą być stosowane w leczeniu różnych chorób sercowo-naczyniowych i innych.
Nasze laboratorium skupi się na badaniu układów krzepnięcia i fibrynogenolitycznych w różnych organizmach w celu wyizolowania i przeprowadzenia badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych środków trombolitycznych, które mogą być przydatne w leczeniu. Na początek zważ 50 gramów robaków orzechowych i dodaj je do homogenizatora wraz ze 150 mililitrami soli fizjologicznej. Homogenizować przy 24 000 obr./min przez 60 sekund.
Odwirować homogenat i zebrać supernatant do dalszych procesów. Do przygotowania żelu poliakryloamidowego fibrynogenu dodaj 0,01 grama fibrynogenu i innych odczynników do 50-mililitrowej szklanej zlewki. Podgrzewać zlewkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Po dodaniu akrylamidu wlej mieszaninę żelu separującego do 10-dołkowej formy żelowej. Następnie dodaj dwa mililitry podwójnie destylowanej wody do formy żelowej i inkubuj przez 30 minut. Odwróć formę, aby usunąć wodę.
Następnie w podobny sposób przygotuj żel ładujący i wlej go do tej samej formy co wcześniej. Na koniec włóż grzebień, aby dobrze się uformować. Na początek przygotuj żel do fibrynogenu-PAGE i umieść go w zbiorniku do elektroforezy razem z formą do kleju.
Wlej 1 300 mililitrów roztworu do elektroforezy do zbiornika i wyjmij grzebień z żelu. Wymieszaj pięć mikrolitrów 5-krotnie niedenaturującego buforu ładującego z 20 mikrolitrami enzymu fibrynolitycznego i homogenatu robaka orzechowego. Załaduj mieszaninę do przygotowanego żelu i rozpocznij elektroforezę przy napięciu 80 woltów przez 30 minut lub przy napięciu 120 woltów przez 20 minut.
Wyjmij żel z formy do kleju i przenieś go do plastikowego pudełka. Dodaj Tris-HCL i Triton do pudełka i inkubuj na wytrząsarce z prędkością od 60 do 70 obr./min przez 10 minut. Usunąć bufor do przemywania i inkubować żel z 50 mililitrami 0,05 molowego Tris-HCL.
Po usunięciu buforu inkubuj żel z 50 mililitrami barwienia, a następnie roztworem odbarwiającym przy 60 do 70 obr./min przez 30 minut każdy. Homogenat robaka orzechowego wykazywał pasma odpowiadające masie cząsteczkowej 25, 33, 43 i 70 kilodaltonów lub więcej.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia uproszczony protokół elektroforezy żelowej (PAGE) z użyciem żelu poliakryloamidowego i fibrynogenu do screeningu czynników fibrynogenolitycznych u Sipunculus nudus. Nowa metoda zwiększa efektywność identyfikacji aktywnych genów fibrynogenolitycznych, co ułatwia opracowywanie leków trombolitycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Farmakologia
Wstęp
- Układ fibrynolityczny odgrywa kluczową rolę w zdrowiu układu sercowo-naczyniowego.
- Czynniki fibrynogenolityczne są istotne dla opracowywania terapii trombolitycznych.
- Obecne metody przesiewania tych czynników mogą być złożone i czasochłonne.
- Sipunculus nudus służy jako organizm modelowy do badania tych czynników.
Cel badania
- Uproszczenie procesu przesiewowego w poszukiwaniu czynników fibrinogenolitycznych.
- Opracowanie kosztowo efektywnej i wydajnej metody identyfikacji aktywnych czynników.
- Wkład w odkrywanie nowych leków trombolitycznych.
Zastosowane metody
- Połączenie metod PAGE oraz płyt fibrinogenowych.
- Protokół opracowany w ciągu 10-letniego okresu badawczego.
- Szybka separacja i wykrywanie czynników fibrinogenolitycznych.
- Podejście oszczędne pod względem czasu i kosztów.
Główne wyniki
- Skuteczna separacja czynnikówy fibrinogenolitycznych z Sipunculus nudus.
- Identyfikacja aktywnych genów fibrinogenolitycznych.
- Wykazana efektywność w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Potencjał do przyspieszenia opracowywania leków na choroby układu sercowo-naczyniowego.
Wnioski
- Nowa metoda fibrinogen-PAGE jest skuteczna i wydajna.
- Podejście to może ułatwić odkrywanie czynników neuro-fibrynogenolitycznych.
- Metoda ta daje nadzieję na postępy w opracowywaniu leków trombolitycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka identyfikacja czynników fibrinogenolitycznych jest kluczowa dla przyspieszenia wczesnych etapów odkrywania leków trombolitycznych oraz redukcji wąskich gardeł w walidacji celów terapeutycznych. Zintegrowana metoda fibrinogen-PAGE umożliwia jednoczesną separację i wykazanie aktywności, co usprawnia proces przesiewowy nowych czynników. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną i efektywność operacyjną w kluczowych punktach zwrotnych w opracowywaniu terapii sercowo-naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację aktywności fibrynogenolitycznej i masy cząsteczkowej w jednym badaniu.
- Wspiera szybkie przesiewowe badania funkcjonalne potencjalnych substancji czynnych pochodzących ze złożonych ekstraktów biologicznych.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez potwierdzenie aktywności przed dalszymi inwestycjami.
- Zwiększa pewność prognostyczną w przypadku wprowadzania kandydatów na leki trombolityczne do kolejnych etapów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowaną, powtarzalną platformę do wysokoprzepustowego przesiewania aktywności fibrynogenolitycznej.
- Dostarcza ilościowych i jakościowych wyników niezbędnych do standaryzacji testu.
- Redukuje zapotrzebowanie na czas i zasoby w porównaniu do wieloetapowych schematów postępowania.
- Umożliwia wiarygodne porównanie wielu kandydackich frakcji lub ekstraktów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera cele translacyjne poprzez pomoc w identyfikacji czynników o bezpośredniej aktywności fibrynogenolitycznej.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, dostarczając użytecznych danych molekularnych.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju poprzez potwierdzenie aktywności mechanistycznej w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy etap wczesnego odkrywania z identyfikacją wiodących związków poprzez integrację procesu rozdziału i oceny aktywności w ramach jednego schematu postępowania, co umożliwia szybką selekcję i priorytetyzację kandydatów na leki trombolityczne.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków dla celów fibrinogenolitycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny i rankingowania kandydatów.
- Analityka: Dostarcza dane dotyczące masy cząsteczkowej i aktywności, umożliwiając porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych poprzez identyfikację czynników o bezpośrednim znaczeniu mechanisticznym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, adaptacyjną platformę do przesiewania czynników fibrinogenolitycznych z różnych organizmów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną we wczesnej fazie poszukiwania leków trombolitycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne i wydajne czasowo przepływy pracy dla screeningu substancji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz alokację kapitału poprzez dostarczanie szybkich, praktycznych danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki trombolityczne.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana biegłość w zakresie elektroforezy białek oraz technik barwienia opartych na aktywności enzymatycznej.
- Wymagany dostęp do aparatury elektroforetycznej oraz infrastruktury analitycznej do obróbki żeli i obrazowania.
- Konieczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda możliwa do zastosowania dla różnych źródeł biologicznych, lecz może wymagać optymalizacji dla różnych typów próbek.
- Ograniczenie do czynników wykazujących wykrywalną aktywność fibrynogenolityczną w warunkach analizy.
