Name: Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym do szybkiego wykrywania aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus. To podejście przyspiesza odkrywanie nowych leków trombolitycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Biuro Nauki i Technologii miasta Xiamen (nr 3502Z20227197), Biuro Nauki i Technologii prowincji Fujian (nr 2019J01070; Nr 2022J01311) oraz projekt innowacji i przedsiębiorczości wysokiego poziomu talentów w ramach planu nauki i technologii Quanzhou (nr 2022C015R). Dziękujemy Fucai Wang (Uniwersytet Huaqiao) i Lei Tongowi (Uniwersytet Huaqiao) za ich pomoc techniczną.

1. Przygotowanie homogenatu z robaków orzechowych
<ol>
	<li>Do homogenizatora dodać 50 g robaków orzeszków ziemnych i 150 ml roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Homogenizować przy 24000 obr./min przez 60 s. 
	UWAGA: Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Odwirować homogenat o stężeniu 9710 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant jako homogenat robaka orzechowego do dalszych badań.</li>
</ol>
2. Preparat żelowy Fibrinogen-PAGE
<ol>
	<li>Odważyć 0,01 g fibrynogenu w szklanej zlewce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 1,9 ml DDH2O, 1,3 ml Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) i 0,05 ml SDS (10% m/v) do zlewki; dobrze wymieszać pipetując.</li>
	<li>Umieścić zlewkę w temperaturze 37 °C na 30 min. 
	UWAGA: Ten krok polega na rozpuszczeniu fibrynogenu.</li>
	<li>Dodać 1,7 ml akrylamidu (30% m/v), 0,05 ml nadsiarczanu amonu (APS; 10%, m/v), 0,002 ml TEMED; dobrze wymieszać pipetując. 
	UWAGA: To jest żel separacyjny.</li>
	<li>Wlej żel separujący do 10-dołkowej formy żelowej.</li>
	<li>Dodać 2 ml DDH2O do formy żelowej; odczekać 30 minut.</li>
	<li>Dokładnie usuń wodę, obracając formę do góry nogami.</li>
	<li>Dodać 1,4 ml DDH2O, 0,25 ml Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 ml SDS (10%, m/v), 0,33 ml akrylamidu (30%, m/v), 0,02 ml APS (10%, w/v), 0,002 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do zlewki; dobrze wymieszać pipetując. 
	UWAGA: To jest ładowanie żelu.</li>
	<li>Wlej żel ładujący do tej samej formy żelowej, co w kroku 2.5; natychmiast włóż grzebień. 
	UWAGA: Zastosowany tutaj żel fibrynogen-PAGE składał się z fibrynogenu (0,2%) zawierającego żel separujący i żel obciążający. Stężenie fibrynogenu można dostosować w zależności od potrzeb.</li>
</ol>
3. Elektroforeza
<ol>
	<li>Przygotowany żel fibrinogen-PAGE wraz z formą klejową umieścić w zbiorniku do elektroforezy; wlać 1300 ml roztworu do elektroforezy (1,963 g Tris, 12,22 g glicyny, 0,65 g SDS i 1300 ml DDH2O) do zbiornika; wyjąć grzebień.</li>
	<li>Dodać 5 μl 5x niedenaturującego buforu ładującego do 20 μl sFE i 20 μl homogenatu robaków orzeszków ziemnych; dobrze wymieszać pipetując; załadować je do przygotowanego żelu fibrinogen-PAGE. 
	UWAGA: Nie gotuj mieszaniny. sFE jest enzymem fibryno(geno)litycznym zidentyfikowanym wcześniej6,7,8 i jest stosowany jako kontrola pozytywna w tym badaniu. Homogenat robaka orzecha ziemnego jest próbką, którą należy wykryć. Niedenaturujący bufor ładujący bez błękitu bromofenolowego, β-merkaptoetanolu i SDS w porównaniu z buforem ładującym SDS-PAGE. Każdy tor próbki jest oddzielony buforem ładującym 1x SDS-PAGE, aby wyraźnie wykryć ruch białka.</li>
	<li>Elektroforezę należy wykonywać przy napięciu 80 V przez 30 minut lub przy napięciu 120 V przez 20 minut.</li>
	<li>Usuń żel fibrinogen-PAGE z formy klejowej.</li>
</ol>
4. Renaturacja
<ol>
	<li>Przenieś żel fibrinogen-PAGE do plastikowego pudełka.</li>
	<li>Do pudełka dodać 100 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) i 2 ml Triton X-100. Umieść go na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min na 10 minut.</li>
	<li>Usunąć bufor do płukania, pipetując. 
	UWAGA: Powtórz trzy razy.</li>
</ol>
5. Inkubacja
<ol>
	<li>Dodaj 50 ml Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) do plastikowego pudełka.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 h. 
	UWAGA: Czas inkubacji można dostosować w zależności od siły aktywności fibrynogenolitycznej.</li>
</ol>
6. Barwienie
<ol>
	<li>Usunąć bufor inkubacyjny przez pipetowanie.</li>
	<li>Dodaj 50 ml roztworu Coomassie Brillant Blue Staining do pudełka i umieść pudełko na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min na 30 minut.</li>
</ol>
7. Odbarwianie
<ol>
	<li>Usunąć roztwór barwiący za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Dodaj 50 ml DDH2O do pudełka.</li>
	<li>Umieść pudełko na wytrząsarce z prędkością 60-70 obr./min przez 30 min. 
	UWAGA: DD H2O został tutaj użyty jako roztwór odbarwiający. Czas wytrząsania można dostosować w zależności od siły aktywności fibrynogenolitycznej.</li>
</ol>

Unveiling Fibrinogenolytic Agents in Peanut Worms with Fibrinogen-PAGE

<ol><li>Bikdeli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+and+thrombotic+or+thromboembolic+disease%3A+Implications+for+prevention%2C+antithrombotic+therapy%2C+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up.</a> J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).</li>
<li>Tsivgoulis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke%3A+current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives.</a> Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).</li>
<li>Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinolytic+drugs+induced+hemorrhage%3A+mechanisms+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).</li>
<li>Lu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+chemical+modification+of+Bacillus+velezensis+SN-14+fibrinolytic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme.</a> Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).</li>
<li>Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombolytic+and+anticoagulant+efficiencies+of+purified+fibrinolytic+enzyme+produced+from+Cochliobolus+hawaiiensis+under+solid-state+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Appl+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation.</a> Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).</li>
<li>Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+approach+to+analyze+the+cell+components+of+cerebral+blood+clots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots.</a> J Vis Exp. (197), e65791(2023).</li>
<li>Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+a+fibrinolytic+enzyme+from+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus.</a> J Vis Exp. (196), e65631(2023).</li>
<li>Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470">https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470</a> (2023).</li>
<li>Walton, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fibrin+plate+method+for+the+assay+of+plasminogen+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators.</a> Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).</li>
<li>Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+life+science%2C+environmental%2C+and+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research.</a> Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).</li>
<li>Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin-+and+streptavidin-mediated+affinity+purification+systems%3A+A+screening+platform+for+enzyme+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).</li>
<li>Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methods+for+milk+proteins+on+polyacrylamide+gel+electrophoresis%3A+Critical+analysis+and+options+for+better+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dairy+Journal%22%5BJournal%5D)">Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution.</a> International Dairy Journal. 114, 104920(2021).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

sFE to nowy enzym fibryno(geno)lityczny wyizolowany z robaków orzechowych przez nasz zespółwcześniej 3,6,8,13. Jednak procesy identyfikacji sFE były czasochłonne i pracochłonne, obejmowały wykrywanie aktywności fibrynogenolitycznej, separację składników białkowych i etapy potwierdzania aktywności. Jako prosta metoda, test płytkowy fibrynogenu jest najczęściej stosowany na wstępnym etapie badań przesiewowych w celu sprawdzenia aktywności fibrynogenolitycznej próbek. Jednak metoda oznaczania płytki fibrynogenu nie może odróżnić, który składnik jest aktywny. W związku z tym chromatografia i metoda natywna/SDS-PAGE muszą być używane do oddzielenia ich składników po wykryciu aktywności. Następnie produkty reakcji są ponownie rozwiązywane przez SDS-PAGE w celu potwierdzenia degradacji substratu fibrynogenu. W tej pracy substrat fibrynogen został dodany do żelu PAGE w celu wykrycia czynnika fibrynogenolitycznego. Po elektroforezie, renaturacji, inkubacji, barwieniu i odbarwieniu, masa cząsteczkowa i aktywność fibrynogenolityczna aktywnych środków fibrynogenolitycznych były wyraźnie widoczne przy użyciu tego samego żelu. Dzięki tej metodzie udało nam się wykryć więcej niż jeden aktywny czynnik fibrynogenolityczny z homogenatu robaka orzechowego w ciągu 6 godzin.
Aby osiągnąć optymalne wyniki, należy zwrócić większą uwagę na przygotowanie żelu fibrinogen-PAGE, renaturację i inkubację. Ogólnie rzecz biorąc, im niższe stężenie fibrynogenu, tym bardziej bezbarwna jest strefa fibrynogenolityczna, co świadczy o aktywności fibrynogenolitycznej środków. Jednak im niższe stężenie fibrynogenu, tym bardziej bezbarwne tło i tym trudniej jest odróżnić strefę fibrynogenolityczną od tła. Czas renaturacji będzie miał znaczący wpływ na aktywność fibrynogenolityczną składników. Jeśli ten czas jest zbyt krótki, aby zmyć SDS w żelu PAGE, aktywność fibrynogenolityczna składników zostanie zahamowana przez resztkową SDS. Podobnie, jeśli czas inkubacji jest zbyt krótki, reakcja fibrynogenolityczna nie jest dokładna. Chociaż czas inkubacji jest zbyt długi, marker używany do wskazywania masy cząsteczkowej zostanie zmyty. W tym badaniu, chociaż warunki te zostały zoptymalizowane, warunki te zostały ustawione tak, aby oddzielić i wyświetlić czynniki fibrynogenolityczne od robaków orzechowych. Tak więc spersonalizowane warunki tych krytycznych kroków powinny być ustalane zgodnie z określonymi czynnikami fibrynogenolitycznymi.
Ważne jest, aby wspomnieć, że ten fibrynogen-PAGE nadaje się tylko do badań przesiewowych czynników fibrynogenolitycznych o aktywności litycznej fibrynogenu, ale nie dla środków o aktywności litycznej fibrynogenu lub aktywacji plazminogenu. Jeśli chcemy uwidocznić te działania, metodę można zoptymalizować, zastępując fibrynogen fibryną lub plazminogenem. Kolejną kwestią, na którą warto zwrócić uwagę, jest to, że aktywne czynniki fibrynogenolityczne testowane w tym badaniu były monomerami, które nie były dotknięte w warunkach elektroforezy SDS. W związku z tym, jeśli badanymi czynnikami są polimery, metodę tę należy dostosować do warunków natywnych PAGE, które nie mogą wyświetlać masy cząsteczkowej. W związku z tym przedstawiona tutaj metoda fibrinogen-PAGE była tylko ogólną wersją podstawową, którą można zoptymalizować w celu szybkiego badania przesiewowego innych czynników fibrynogenolitycznych.

W ostatnich latach, ze względu na ciągły wzrost chorób zakrzepowych, choroby zakrzepowe stały się nowym poważnym globalnym problemem zdrowotnym1. Obecnie leki przeciwzakrzepowe dzieli się na trzy grupy: leki przeciw agregacji płytek krwi, leki przeciwzakrzepowe i leki trombolityczne. Wśród nich leki trombolityczne, takie jak urokinaza (UK), tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) itp., są jedynymi klinicznie stosowanymi lekami, które mogą hydrolizować skrzeplinę2. W międzyczasie opracowywane są bardziej bezpieczne i skuteczne leki trombolityczne poprzez identyfikację nowych leków trombolitycznych 3.
Jednakże, identyfikacja nowych środków trombolitycznych jest czasochłonna i pracochłonna, co głównie obejmuje etapy separacji/oczyszczania i charakteryzacji/sprawdzania. Pierwszym z nich jest oddzielenie każdego składnika, a drugim wyświetlenie ich aktywności fibryno(geno)litycznej4,5. W poprzednich badaniach, pomimo faktu, że udało nam się wyizolować nowy enzym fibryno(geno)lityczny (sFE) z robaka orzechowego (Sipunculus nudus) za pomocą chromatografii powinowactwa i testu płytki fibryny(ogenu)6,7,8, procesy te są tak czasochłonne i pracochłonne. Po pierwsze, konieczne jest określenie, czy homogenaty robaków orzechowych mają aktywność fibryno(geno)lityczną za pomocą metody płytki fibryny(ogenu) i produktów reakcji opartych na PAGE9. Następnie należy przeprowadzić serię chromatografii, takich jak chromatografia jonowymienna, chromatografia filtracji żelowej, chromatografia powinowactwa i inne metody, w celu separacji i oczyszczania10,11. Następnie ponownie przeprowadza się test na płytce fibrynowej w celu sprawdzenia aktywności fibrynogenolitycznej każdego oddzielonego składnika. Na koniec przeprowadza się natywny PAGE i dodecylosiarczan sodu (SDS)-PAGE w celu określenia masy cząsteczkowej aktywnych czynników fibrynogenolitycznych12. Dlatego tak ważne jest szybkie oddzielenie i wyświetlenie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych.
Aby szybko oddzielić i wyświetlić aktywne czynniki fibrynogenolityczne w homogenatach robaków orzechowych, opracowano nową metodę fibrynogenu-PAGE, łącząc metody PAGE i płytki fibrynogenu, tj. substraty środków fibrynomolitycznych fibrynogenu zostały dodane do natywnego żelu PAGE. Po natywnej stronie składniki zostały oddzielone według ich masy cząsteczkowej. Tymczasem każdy aktywny składnik fibrynogenolityczny może być wyświetlany przez barwienie. Dzięki tej metodzie udało nam się wykryć więcej niż jeden aktywny czynnik fibrynogenolityczny homogenatu robaka orzechowego w ciągu 6 godzin. Co więcej, ta metoda fibrynogenu-PAGE jest przyjazna czasowo i kosztowo. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do badania czynników fibrynogenolitycznych innych organizmów.

<table><tbody><tr><td>1&nbsp; M Tris-HCl (pH 6,8)</td><td>Solarbio</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)</td><td>Solarbio</td><td>T1010</td><td></td></tr><tr><td>30% akrylamid/bis-akryloamid</td><td>Biosharp</td><td>BL513B</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>XiLONG SCIENTIFIC</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>PYREX</td><td>2-9425-02</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa (1,5 ml)</td><td>Biosharp</td><td>BS-15-M</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do stałej temperatury</td><td>JINGHONG</td><td>JHS-400</td><td></td></tr><tr><td>Coomas Brillant Blue Roztwór do barwienia</td><td>Beyotime</td><td>P0017F</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczna waga analityczna</td><td>DENVER</td><td>TP-213</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Solarbio</td><td>F8051</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ładowanych żelem, luzem</td><td>Biosharp</td><td>BS-200-GTB</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>AHS</td><td>ATS-1500</td><td></td></tr><tr><td>Oscylator o rotacji poziomej</td><td>NuoMi</td><td>NMSP-600</td><td></td></tr><tr><td>Mili-Q Referencyjny</td><td>miliporowy</td><td>Z00QSV0CN</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-8000~165-8007</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethyloethelenodiamine</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipety (1 mL)</td><td>Axygene</td><td>T-1000XT-C</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet (10 &mikro; L)</td> Końcówka do pipet <td>Axygene</td><td>T-10XT-C</td><td></td></tr><tr><td>(200 &mikro; Piper L)</td> <td>Axygene</td><td>T-200XT-C</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL) Pipetor</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ZY18723</td><td></td></tr><tr><td>(10 i mikro; L)</td> Pipetor <td>ZX98775</td><td></td> <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>(200 &mikro; L)</td> <td>Pipeta do</td><td>ZY20280</td><td></td>Thermo Fisher Scientific</tr><tr><td>(50 &mikro; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ZY15331</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>cence</td><td>H1650R</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarcan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900859</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Solarbio</td><td>T8230</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym

Rapid Separation and Display of Active Fibrinogenolytic Agents in Sipunculus nudus through Fibrinogen-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Środki fibrynogenolityczne, które mogą bezpośrednio rozpuszczać fibrynogen, były szeroko stosowane w leczeniu przeciwzakrzepowym. Ogólnie rzecz biorąc, identyfikacja nowych czynników fibrynogenolitycznych wymaga najpierw oddzielenia każdego składnika, a następnie sprawdzenia ich aktywności fibrynogenolitycznej. Obecnie elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) i chromatografia są najczęściej stosowane na etapie separacji. Tymczasem test płytki fibrynogenu i PAGE oparty na produktach reakcji są zwykle przyjmowane w celu pokazania ich aktywności fibrynogenolitycznej. Jednak ze względu na czasoprzestrzenne rozdzielenie tych dwóch etapów, niemożliwe jest rozdzielenie i wyświetlenie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych za pomocą tego samego żelu. Aby uprościć procesy separacji i wyświetlania identyfikacji czynników fibrynogenolitycznych, skonstruowaliśmy nową metodę fibrynogen-PAGE do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych robaków orzechowych (Sipunculus nudus) w tym badaniu. Metoda ta obejmuje przygotowanie fibrynogenu-PAGE, elektroforezę, renaturację, inkubację, barwienie i odbarwianie. Aktywność fibrynogenolityczną i masę cząsteczkową białka można wykryć jednocześnie. Zgodnie z tą metodą udało nam się wykryć więcej niż jeden aktywny czynnik fibrynogenolityczny homogenianu robaków arachidowych w ciągu 6 godzin. Co więcej, ta metoda fibrynogenu-PAGE jest przyjazna czasowo i kosztowo. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do badania czynników fibrynogenolitycznych innych organizmów.

Po elektroforezie wszystkie prążki markera były wyraźnie widoczne. W ścieżkach ładowania 1x SDS-PAGE widoczne były jedynie prążki 10 kDa (błękit bromofenolowy). Próbki sFE i dżdżownic orzeszkowych nie wykazały żadnych obserwowalnych prążków (Rysunek 1). Mimo że prążki próbek nie są widoczne, prawidłowe działanie markera i błękitu bromofenolowego wskazało, że elektroforeza przebiegła pomyślnie, a próbki zostały rozdzielone zgodnie z ich masą cząsteczkową.
Choć cały żel zabarwił się na niebiesko w wyniku barwienia, odbarwienie spowodowało, że obszary, w których fibrinogen został zdegradowany przez czynniki fibrinogenolityczne, stały się przezroczyste. W porównaniu z markerem, sFE wykazało aktywny prążek fibrinogenolityczny w pobliżu 25 kDa. Homogenat robaka orzeszkowego wykazał prążki o masie 25 kDa, 33 kDa, 43 kDa oraz szereg prążków większych niż 70 kDa (Rysunek 2). Wyniki wskazały, że sFE zawierało jedynie komponent fibrinogenolityczny o masie 25 kDa, natomiast homogenat robaka orzeszkowego zawierał komponenty sFE oraz inne czynniki fibrinogenolityczne. Rysunek uzupełniający 1 przedstawia przykładowy obraz żelu, na którym marker jest ciemnoniebieski, a badane próbki widoczne są jako jasne prążki.
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej SDS-PAGE; rozdział białek według masy cząsteczkowej, widoczne markery kDa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66536/66536fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Żel po elektroforezie. M: Marker; Ścieżka 1: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE; Ścieżka 2: sFE; Ścieżka 3: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE; Ścieżka 4: homogenat robaka orzeszkowego; Ścieżka 5: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66536/66536fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat wyniku elektroforezy białek, pokazujący markery kDa i prążki do analizy masy cząsteczkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66536/66536fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Żel po odbarwieniu. M: Marker; Ścieżka 1: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE; Ścieżka 2: sFE; Ścieżka 3: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE; Ścieżka 4: homogenat robaka orzeszkowego; Ścieżka 5: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66536/66536fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Obraz żelu przedstawiający marker w kolorze ciemnoniebieskim oraz próbki docelowe jako jasne prążki. M: Marker; Ścieżka 1: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE; Ścieżka 2: sFE; Ścieżka 3: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE; Ścieżka 4: homogenat robaka orzeszkowca; Ścieżka 5: 1x bufor do nakładania SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66536/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakrylamidowym (PAGE) do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych Sipunculus nudus.

Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym

Fibrinogenolytic agents that can dissolve fibrinogen directly have been widely used in anti-coagulation treatment. Generally, identifying new ...

Nasze badania koncentrują się na układzie fibrynolitycznym . W tym badaniu staramy się uprościć metodę badań przesiewowych czynników fibrynogenolitycznych u robaków orzechowych przy użyciu techniki fibrynogenu-PAGE. Opracowaliśmy nową metodę fibrynogenu-PAGE poprzez połączenie metody PAGE i płytki fibrynogenu.W porównaniu z innymi obecnie stosowanymi technikami, nasz protokół składa się z 10-letniego badania oddzielnego i wyświetlającego aktywne geny fibrynogenolityczne w obrębie tego samego patogenu. Co więcej, ta metoda jest przyjazna czasowo i kosztowo. Dzięki naszym odkryciom odkrycie środków neurofibrynogenolitycznych stanie się proste i może przyspieszyć rozwój nowych leków trombolitycznych, które mogą być stosowane w leczeniu różnych chorób sercowo-naczyniowych i innych.Nasze laboratorium skupi się na badaniu układów krzepnięcia i fibrynogenolitycznych w różnych organizmach w celu wyizolowania i przeprowadzenia badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych środków trombolitycznych, które mogą być przydatne w leczeniu. Na początek zważ 50 gramów robaków orzechowych i dodaj je do homogenizatora wraz ze 150 mililitrami soli fizjologicznej. Homogenizować przy 24 000 obr./min przez 60 sekund.Odwirować homogenat i zebrać supernatant do dalszych procesów. Do przygotowania żelu poliakryloamidowego fibrynogenu dodaj 0,01 grama fibrynogenu i innych odczynników do 50-mililitrowej szklanej zlewki. Podgrzewać zlewkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Po dodaniu akrylamidu wlej mieszaninę żelu separującego do 10-dołkowej formy żelowej. Następnie dodaj dwa mililitry podwójnie destylowanej wody do formy żelowej i inkubuj przez 30 minut. Odwróć formę, aby usunąć wodę.Następnie w podobny sposób przygotuj żel ładujący i wlej go do tej samej formy co wcześniej. Na koniec włóż grzebień, aby dobrze się uformować. Na początek przygotuj żel do fibrynogenu-PAGE i umieść go w zbiorniku do elektroforezy razem z formą do kleju.Wlej 1 300 mililitrów roztworu do elektroforezy do zbiornika i wyjmij grzebień z żelu. Wymieszaj pięć mikrolitrów 5-krotnie niedenaturującego buforu ładującego z 20 mikrolitrami enzymu fibrynolitycznego i homogenatu robaka orzechowego. Załaduj mieszaninę do przygotowanego żelu i rozpocznij elektroforezę przy napięciu 80 woltów przez 30 minut lub przy napięciu 120 woltów przez 20 minut.Wyjmij żel z formy do kleju i przenieś go do plastikowego pudełka. Dodaj Tris-HCL i Triton do pudełka i inkubuj na wytrząsarce z prędkością od 60 do 70 obr./min przez 10 minut. Usunąć bufor do przemywania i inkubować żel z 50 mililitrami 0,05 molowego Tris-HCL.Po usunięciu buforu inkubuj żel z 50 mililitrami barwienia, a następnie roztworem odbarwiającym przy 60 do 70 obr./min przez 30 minut każdy. Homogenat robaka orzechowego wykazywał pasma odpowiadające masie cząsteczkowej 25, 33, 43 i 70 kilodaltonów lub więcej.

rapid-separation-display-active-fibrinogenolytic-agents-sipunculus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Ten film demonstruje użycie spektrofotometru UV do monitorowania powstawania nierozpuszczalnych skrzepów fibryny w funkcji zmiany zmętnienia roztworu. Spektrofotometr w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV mierzy absorbancję roztworu w czasie, która reprezentuje zmianę zmętnienia spowodowaną tworzeniem się nierozpuszczalnych skrzepów fibryny.

Spektroskopia w zakresie widzialnym UV do monitorowania tworzenia się skrzepów fibryny

Celem jest frakcjonowanie i izolowanie bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów z złożonego ekstraktu roślinnego oraz białek z drobnoustrojów chorobotwórczych za pomocą metody ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej (IEF). Ponadto zidentyfikowano oddzielone cząsteczki i potwierdzono ich bioaktywność.

Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Ten raport opisuje techniki izolacji i oczyszczania siarczanowych glikozaminoglikanów (GAG) z próbek biologicznych oraz metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu przybliżenia ich wielkości. GAG przyczyniają się do budowy tkanek i wpływają na procesy sygnalizacyjne poprzez oddziaływanie elektrostatyczne z białkami. Długość polimeru GAG przyczynia się do ich powinowactwa do pokrewnych ligandów.

Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

Tutaj prezentujemy metodę oczyszczania powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus, która jest prosta, tania i efektywna.

Oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę molekularnego dokowania w połączeniu z testem przesunięcia termicznego komórkowego w celu przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami a celami białkowymi.

Przewidywanie docelowego białka i walidacja związku małocząsteczkowego

Proteinazy są niezbędne dla patogenezy bakterii, umożliwiając inwazję i unikanie odporności. Jednoetapowa ekstrakcja białek cytoplazmatycznych i błonowych bakterii w ich aktywnej postaci jest wstrząsająca. Ten artykuł wideo przedstawia ekstrakcję całych białek komórkowych Leptospira do analizy zymografii w celu wykrycia i scharakteryzowania żelatynaz.

Jednoetapowa ekstrakcja i analiza zymograficzna żelatynaz bakteryjnych

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Protokół ten opisuje test hemostazy Nijmegen, który umożliwia jednoczesne, czasowo rozdzielcze pomiary generacji trombiny i plazminy, zapewniając zintegrowaną ocenę krzepnięcia i fibrynozy. Celem testu jest poprawa charakterystyki równowagi hemostatycznej w badaniach i środowiskach klinicznych wykraczających poza zakresu konwencjonalnych testów hemostatycznych.

Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

Poznaj uproszczoną metodę elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym do szybkiego wykrywania aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus. To podejście przyspiesza odkrywanie nowych leków trombolitycznych.

Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym (Wideo) | JoVE Journal

Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym

Przeglądaj więcej filmów