Szybka separacja i wyświetlanie aktywnych czynników fibrynogenolitycznych w Sipunculus nudus za pomocą elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakryloamidowym
April 19th, 2024
Tutaj prezentujemy protokół elektroforezy w żelu fibrynogenowo-poliakrylamidowym (PAGE) do szybkiego oddzielania i wyświetlania czynników fibrynogenolitycznych Sipunculus nudus.
Nasze badania koncentrują się na układzie fibrynolitycznym . W tym badaniu staramy się uprościć metodę badań przesiewowych czynników fibrynogenolitycznych u robaków orzechowych przy użyciu techniki fibrynogenu-PAGE. Opracowaliśmy nową metodę fibrynogenu-PAGE poprzez połączenie metody PAGE i płytki fibrynogenu.
W porównaniu z innymi obecnie stosowanymi technikami, nasz protokół składa się z 10-letniego badania oddzielnego i wyświetlającego aktywne geny fibrynogenolityczne w obrębie tego samego patogenu. Co więcej, ta metoda jest przyjazna czasowo i kosztowo. Dzięki naszym odkryciom odkrycie środków neurofibrynogenolitycznych stanie się proste i może przyspieszyć rozwój nowych leków trombolitycznych, które mogą być stosowane w leczeniu różnych chorób sercowo-naczyniowych i innych.
Nasze laboratorium skupi się na badaniu układów krzepnięcia i fibrynogenolitycznych w różnych organizmach w celu wyizolowania i przeprowadzenia badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych środków trombolitycznych, które mogą być przydatne w leczeniu. Na początek zważ 50 gramów robaków orzechowych i dodaj je do homogenizatora wraz ze 150 mililitrami soli fizjologicznej. Homogenizować przy 24 000 obr./min przez 60 sekund.
Odwirować homogenat i zebrać supernatant do dalszych procesów. Do przygotowania żelu poliakryloamidowego fibrynogenu dodaj 0,01 grama fibrynogenu i innych odczynników do 50-mililitrowej szklanej zlewki. Podgrzewać zlewkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Po dodaniu akrylamidu wlej mieszaninę żelu separującego do 10-dołkowej formy żelowej. Następnie dodaj dwa mililitry podwójnie destylowanej wody do formy żelowej i inkubuj przez 30 minut. Odwróć formę, aby usunąć wodę.
Następnie w podobny sposób przygotuj żel ładujący i wlej go do tej samej formy co wcześniej. Na koniec włóż grzebień, aby dobrze się uformować. Na początek przygotuj żel do fibrynogenu-PAGE i umieść go w zbiorniku do elektroforezy razem z formą do kleju.
Wlej 1 300 mililitrów roztworu do elektroforezy do zbiornika i wyjmij grzebień z żelu. Wymieszaj pięć mikrolitrów 5-krotnie niedenaturującego buforu ładującego z 20 mikrolitrami enzymu fibrynolitycznego i homogenatu robaka orzechowego. Załaduj mieszaninę do przygotowanego żelu i rozpocznij elektroforezę przy napięciu 80 woltów przez 30 minut lub przy napięciu 120 woltów przez 20 minut.
Wyjmij żel z formy do kleju i przenieś go do plastikowego pudełka. Dodaj Tris-HCL i Triton do pudełka i inkubuj na wytrząsarce z prędkością od 60 do 70 obr./min przez 10 minut. Usunąć bufor do przemywania i inkubować żel z 50 mililitrami 0,05 molowego Tris-HCL.
Po usunięciu buforu inkubuj żel z 50 mililitrami barwienia, a następnie roztworem odbarwiającym przy 60 do 70 obr./min przez 30 minut każdy. Homogenat robaka orzechowego wykazywał pasma odpowiadające masie cząsteczkowej 25, 33, 43 i 70 kilodaltonów lub więcej.
Przegląd
Niniejsza publikacja przedstawia uproszczony protokół elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) fibrynogenu (fibrinogen-PAGE) do przesiewu czynników fibrynogenolitycznych u Sipunculus nudus. Nowa metoda zwiększa wydajność identyfikacji aktywnych genów fibrynogenolitycznych, co ułatwia opracowywanie leków trombolitycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biochemia
- Farmakologia
Wprowadzenie
- Układ fibrynolityczny odgrywa kluczową rolę w zdrowiu układu krążenia.
- Czynnik fibrynogenolityczny są ważne do opracowywania terapii trombolitycznych.
- Obecne metody przesiewu tych czynników mogą być złożone i czasochłonne.
- Sipunculus nudus służy jako organizm modelowy do badania tych czynników.
Cel badania
- Uproszczenie procesu przesiewu czynników fibrynogenolitycznych.
- Opracowanie efektywnej kosztowo i wydajnej metody identyfikacji aktywnych czynników.
- Wniesienie wkładu w odkrywanie nowych leków trombolitycznych.
Wykorzystane metody
- Połączenie metod PAGE i płytkowych metod z fibrynogenem.
- Protokół opracowany w ciągu 10-letniego okresu badawczego.
- Szybkie rozdzielanie i wyświetlanie czynników fibrynogenolitycznych.
- Przyjazne dla czasu i kosztów podejście.
Główne wyniki
- Pomyślne rozdzielenie czynników fibrynogenolitycznych z Sipunculus nudus.
- Identyfikacja aktywnych genów fibrynogenolitycznych.
- Wykazano wydajność w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Potencjał przyspieszenia rozwoju leków dla chorób układu krążenia.
Wnioski
- Nowa metoda fibrinogen-PAGE jest skuteczna i wydajna.
- To podejście może ułatwić odkrywanie neuro-fibrynogenolitycznych czynników.
- Obdarzona obietnicą w zakresie postępu w rozwoju leków trombolitycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid identification of fibrinogenolytic agents is critical for accelerating early-stage thrombolytic drug discovery and reducing bottlenecks in target validation. The integrated fibrinogen-PAGE method enables simultaneous separation and activity display, streamlining the workflow for novel agent screening. This approach enhances predictive confidence and operational efficiency at key inflection points in cardiovascular therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of fibrinogenolytic activity and molecular weight in a single assay.
- Supports rapid functional screening of candidate agents from complex biological extracts.
- Facilitates biological de-risking by confirming activity prior to downstream investment.
- Improves predictive confidence for advancing thrombolytic candidates.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, reproducible platform for high-throughput screening of fibrinogenolytic activity.
- Delivers quantitative and qualitative outputs for assay standardization.
- Reduces time and resource requirements compared to multi-stage workflows.
- Enables reliable comparison of multiple candidate fractions or extracts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational goals by supporting the identification of agents with direct fibrinogenolytic activity.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by providing actionable molecular data.
- De-risks advancement decisions by confirming mechanistic activity in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and lead identification by integrating separation and activity assessment into a single workflow, supporting rapid triage and prioritization of thrombolytic candidates.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification for fibrinogenolytic targets.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for candidate evaluation and ranking.
- Analytics: Provides molecular weight and activity data to inform cross-condition comparisons.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by identifying agents with direct mechanistic relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable platform for screening fibrinogenolytic agents from diverse organisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage thrombolytic discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and time-efficient workflows for agent screening.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital allocation by providing rapid, actionable data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of thrombolytic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein electrophoresis and activity-based staining techniques.
- Needs access to electrophoresis instrumentation and analytical infrastructure for gel handling and imaging.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various biological sources but may require optimization for different sample types.
- Limited to agents with detectable fibrinogenolytic activity under assay conditions.
