Name: Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Poznaj metody izolacji i hodowli beztlenowych bakterii jelitowych z przewodu pokarmowego kurczaka. Protokoły te umożliwiają odzyskanie różnorodnych gatunków bakterii i badanie metabolizmu myo-inozytolu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają program partnerski Rehovot-Hohenheim oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Projekt ten został opracowany w ramach jednostki badawczej P-FOWL (FOR 2601).

Protokół jest podzielony na cztery części: pobieranie próbek, izolacja bakterii, identyfikacja i konserwacja uzyskanych mikroorganizmów. Zatwierdzone zezwolenia na wykorzystanie zwierząt zostały wydane przez komisję etyczną Regierungspräsidium Tübingen w Niemczech o numerach homologacji HOH50/17 TE i HOH67-21TE.
1. Pobieranie próbek do hodowli bakterii beztlenowych
<ol>
	<li>Utrzymanie zwierząt
	<ol>
		<li>Utrzymywanie zwierząt na komercyjnej diecie opartej na kukurydzy ad libitum (Legehennen/ Junghennenfutter; patrz Tabela Materiałów) i trzymanie ich w domu w stacji doświadczalnej Uniwersytetu w Hohenheim.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie rozwiązania transportowego
	<ol>
		<li>Na 1-2 dni przed pobraniem próbki przygotuj roztwór transportowy zawierający 1,00 g/l tioglikolanu sodu, 0,10 g/l dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl 2,2H2O) oraz 0,5% cysteiny21 i 0,1% roztworu rezazuryny sodu.</li>
		<li>Doprowadzić pH pożywki do 6,0 ± 0,2 w temperaturze 25 °C i w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut pod ciśnieniem 15 psi.</li>
		<li>Po ostygnięciu pożywki do temperatury około 50 °C, zastąpić nakrętkę butelki z pożywką sterylną nakrętką z otworem i gumowym korkiem. Włożyć dwie sterylne igły strzykawki do gumowego korka w różnych pozycjach i przymocować hydrofobowy filtr strzykawkowy (0,22 μm) do jednej z igieł. 
		UWAGA: Wymiana nasadek oraz włożenie igieł i filtra powinno odbywać się wewnątrz laminarnego przepływu powietrza (LAF).</li>
		<li>Podłącz rurkę ze 100% azotem (N2) do filtra strzykawkowego i wlewaj gazN2 do butelki przez 10 minut przy 1 psi.</li>
		<li>Następnie przenieść butelkę z pożywką i sterylne probówki Hungate do stacji beztlenowej i aseptycznie przenieść pożywkę transportową do probówek Hungate. Całkowicie napełnij rurki Hungate do góry, upewniając się, że w środku nie ma powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ubój i pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Podczas procesu uboju należy utrzymywać warunki aksoniczne, aby uniknąć zakażenia, używając rękawiczek, maski, plastikowego fartucha laboratoryjnego i sterylnych narzędzi chirurgicznych przez cały czas trwania procedury. Ponadto należy odpowiednio zdezynfekować stół roboczy przy użyciu etanolu i chusteczek, aby utrzymać sterylne środowisko.</li>
		<li>W stacji doświadczalnej znieczulij 10, 50-tygodniowe kury nioski Lohmann za pomocą butelkowanej mieszaniny gazów składającej się z 35% N2, 35% CO2 i 30% O2 i natychmiast odetnij im głowy. 
		UWAGA: Znieczulenie i poświęcenie powinno być przeprowadzone przez technika zwierząt laboratoryjnego dobrze zorientowanego w dobrostanie zwierząt i procedurach naukowych. Gwarantuje to, że procedura poświęcania jest zgodna z normami etycznymi, przepisami prawnymi i wytycznymi bezpieczeństwa.</li>
		<li>Przed przystąpieniem do sekcji przewodu pokarmowego należy zabezpieczyć wymagany odcinek jelita, a mianowicie plon, jelito kręte i jelito czcze, za pomocą sterylnego hemostatu Kelly'ego (znanego również jako zacisk Kelly'ego; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
		UWAGA: Sekcja zwierzęcia powinna być wykonana przez lekarza weterynarii lub dobrze wyszkoloną osobę, która jest zaznajomiona z anatomią kurczaków.</li>
		<li>Przenieś każdą pojedynczą sekcję do osobnej rurki Hungate wypełnionej medium transportowym i prawidłowo zamknij pokrywę. W razie potrzeby dodaj dodatkowe medium transportowe do rury, aby wyprzeć pozostałe powietrze. 
		UWAGA: Przeniesienie sekcji jest kluczowym krokiem i konieczne jest zminimalizowanie wszelkich opóźnień lub otwarcia sekcji, aby zapobiec długotrwałemu narażeniu na tlen</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transport próbki
	<ol>
		<li>Z transportem tub Hungate należy obchodzić się ostrożnie, umieszczając je w styropianowym pudełku, aby zapobiec ryzyku pęknięcia. W przypadku gdy temperatura zewnętrzna jest niższa niż 15 °C, należy utrzymać temperaturę próbki za pomocą ciepłych opakowań. Upewnij się, że czas transportu nie przekracza 4 godzin.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś probówki do wnętrza stacji beztlenowej w celu dalszego procesu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja bakterii beztlenowych
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywek hodowlanych 
	UWAGA: Przedstawiona metoda przedstawia różne rozważania dotyczące przygotowania pożywek hodowlanych. Tabela 1 ilustruje przykładowy podział roztworów do różnorodnej izolacji mikroorganizmów.
	<ol>
		<li>Składniki preparatu pożywki, który ma być użyty, podzielić na cztery grupy roztworów: źródło węgla, źródło azotu, agar i źródło mineralne. W przypadku multimediów, takich jak infuzja mózg-serce (BHI), separacja nie zawsze jest możliwa (patrz przykład pożywki 2 w tabeli 1). W takich przypadkach należy zapewnić oddzielne przygotowanie i autoklawowanie agaru lub dodatkowych roztworów.</li>
		<li>Przygotować roztwór węglowodanowy w 1/4 końcowej wymaganej objętości pożywki, np. w 250 ml na całkowitą objętość 1 litra pożywki. Postępując zgodnie z przykładem pożywki 1 w tabeli 1, rozpuścić 2 g dekstrozy i 0,5 g skrobi w 250 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Przygotować roztwór białkowy w 1/4 końcowej wymaganej objętości pożywki, np. w 250 ml na całkowitą objętość 1 litra pożywki. Postępując zgodnie z przykładem pożywki 1 w tabeli 1, rozpuścić 10 g peptonu w 250 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Przygotować roztwór agaru w 45% do 48% końcowej objętości pożywki, np. w 450 do 480 ml na całkowitą objętość 1 l pożywki. Postępując zgodnie z przykładem mediu 1 w tabeli 1, rozpuść 15 g agaru w 450 do 480 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Przygotować roztwór mineralny w lewej objętości pożywki wynoszącej od 20 do 50 ml, gdy końcowa objętość pożywki wynosi 1 l. Postępując zgodnie z przykładem pożywki 1 w tabeli 1, rozpuścić 0,5 gK2HPO4 w 20 do 50 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Roztwór białkowy, roztwór agaru i roztwory mineralne należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut pod ciśnieniem 21 psi. Roztwór węglowodanowy należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 110 °C przez 30 minut przy ciśnieniu 5 psi.</li>
		<li>Gdy wszystkie roztwory są sterylne, schłodzić je do temperatury 50 °C i wymieszać w sterylnych warunkach do odpowiedniej szklanej butelki z autoklawizowanym kremem z nakrętką z otworem i gumowym korkiem. Następnie wykonaj kroki 1.2.3 i 1.2.4. 
		UWAGA: Mieszanie roztworów powinno odbywać się wewnątrz LAF.</li>
		<li>Po wymieszaniu i odgazowaniu pożywki przelać do sterylnych szalek Petriego lub probówek wewnątrz stacji beztlenowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja bakterii beztlenowych 
	UWAGA: Poniższa metodologia wyjaśnia strategię izolacji w celu hodowli szerokiej gamy bakterii beztlenowych, które zamieszkują przewód pokarmowy kurczaków.
	<ol>
		<li>Przenieść próbki do stacji beztlenowej zawierającej mieszaninę gazów w butlach składającą się z 80% N2 (poziom jakości 5,0), 15 % CO2 (poziom jakości 3,0) i 5 % H2 (poziom jakości 5,0) dostarczonej przez komercyjnego dostawcę (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wewnątrz stacji beztlenowej przenieś wycinek z probówki do zawiesiny na sterylną szalkę Petriego za pomocą autoklawowanych kleszczy.</li>
		<li>Ostrożnie rozciąć skrawek za pomocą sterylnych nożyczek i za pomocą sterylnej szpatułki wyekstrahować około 1 g zawartości trawionej z odcinka jelitowego. 
		UWAGA: Po pobraniu 1 g zawartości trawienia, złomować i przenieść pozostały train do odpowiedniej probówki z pożywką transportową w celu docelowej izolacji.</li>
		<li>Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie przy użyciu sterylnego roztworu fizjologicznego (0,85% NaCl).</li>
		<li>Dozować 0,1 ml próbki z rozcieńczeń 10−4 do 10−7 do sterylnych i odpowiednio oznakowanych szalek Petriego, pożywek i rozprowadzić sterylną szpatelką Drigalskiego.</li>
		<li>Inkubować płytki wewnątrz stacji beztlenowej przez 24–48 godzin w temperaturze 39 °C. 
		UWAGA: Podczas inkubacji w inkubatorze należy przenieść szalki Petriego do hermetycznego pudełka przed wyjęciem szalek Petriego ze stacji beztlenowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ukierunkowana izolacja określonej grupy bakterii. 
	UWAGA: Poniższa metodologia wyjaśnia strategię izolacji bakterii beztlenowych, które mogą potencjalnie asymilować MI.
	<ol>
		<li>W celu przygotowania podłoża wzbogacającego, minimalnej pożywki agarowej i minimalnej pożywki bulionowej, należy postępować zgodnie ze składem określonym w Tabeli 2 i Tabeli 3, przestrzegając wytycznych przedstawionych w kroku 2.1. Dodać 0,2 ml/l filtracyjno-sterylnej mieszaniny witamin (zgodnie z opisem w kompozycji) do minimalnej ilości podłoża agarowego i minimalnej ilości bulionu po procesie autoklawowania.</li>
		<li>Homogenizować początkową próbkę za pomocą mieszalnika wirowego przez 10-15 s. Następnie przenieść homogenizowaną próbkę do probówki zawierającej pożywkę wzbogacającą z szybkością 5% (np. jeśli objętość pożywki wzbogacającej wynosi 10 ml, zaszczepić 0,5 ml homogenizowanej próbki) za pomocą pipety. Świeżo zaszczepioną próbkę inkubować przez 24 godziny w temperaturze 39 °C w stacji beztlenowej.</li>
		<li>Po inkubacji dokładnie wymieszać wzbogaconą probówkę, używając mieszadła wirowego przez 10-15 s lub pipetując. Następnie przenieść wymieszaną próbkę do sterylnego minimalnego podłoża bulionowego z szybkością 5%, a następnie inkubować przez 24 godziny w temperaturze 39 °C.</li>
		<li>Próbki należy seryjnie rozcieńczyć w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (tj. 0,85% NaCl), zaczynając od rozcieńczenia w stosunku 1:10 i kontynuując do rozcieńczenia w stosunku 1:1000. Po każdym rozcieńczeniu należy dokładnie homogenizować próbkę w temperaturze pokojowej, używając mieszalnika wirowego przez 10-15 s lub pipetując.</li>
		<li>W sterylnych i beztlenowych warunkach przenieść 1 ml rozcieńczonej próbki na szalkę Petriego. Wlej około 15-20 ml stopionego minimalnego podłoża agarowego na szalkę Petriego i delikatnie obracaj poziomo, aby uzyskać równomierne wymieszanie. 
		UWAGA: Temperatura agaru powinna wynosić około 45 °C, aby nie było żadnych grudek i aby zapobiec zabiciu próbki przez ciepło. Nalewanie podłoża powinno odbywać się w warunkach beztlenowych.</li>
		<li>Po zestaleniu agaru inkubować szalki Petriego przez 24 godziny w temperaturze 39 °C w pozycji odwróconej w stacji beztlenowej lub w inkubatorze. Po 24 godzinach inkubacji kolonie bakterii pojawiają się jako wyraźne, małe kropki osadzone w pożywce. 
		UWAGA: Podczas inkubacji szalki Petriego w inkubatorze, przed wyjęciem ich ze stacji beztlenowej przenieś płytki do hermetycznego pudełka.</li>
		<li>Używając sterylnej pętli zaszczepiającej, ostrożnie wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną i przenieś ją do oddzielnych probówek z minimalną ilością bulionu.</li>
		<li>Po przeniesieniu kolonii do pojedynczych probówek, zaszczepione probówki inkubować beztlenowo w temperaturze 39 °C przez 24 godziny. Po inkubacji zwiększone zmętnienie pożywki będzie wskazywać na wzrost bakterii. 
		UWAGA: Za każdym razem przed przeniesieniem butelek z pożywką do stacji beztlenowej należy je odgazować, jak wspomniano wcześniej w kroku 2.1.7. Kroki 2-8 należy wykonać wewnątrz stacji beztlenowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Identyfikacja bakterii beztlenowych
<ol>
	<li>Ekstrahuj DNA z kultur o czasie inkubacji od 24 godzin do 48 godzin, zgodnie z protokołem lizy enzymatycznej22.</li>
	<li>Odwirować kulturę przy 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Przemyć osad 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zawieszając w 2 ml PBS. Homogenizować próbkę za pomocą mieszalnika wirowego przez 10-15 s. Powtórzyć etap wirowania przy 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć sklarowany osad.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 0,2 ml PBS o pH 7,4 i inkubować w temperaturze 50 °C z 1 U lizozymu i 1 U rekombinowanej mutanolizyny przez 30 minut, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 56 °C z 5 μl proteinazy K.</li>
	<li>Dodać 4 μl jednostki RNAseA do każdej probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Probówki wirować przy 21168 x g przez 1 min. Odzyskać supernatant i oczyścić za pomocą kulek magnetycznych.</li>
	<li>Przeprowadzić kwantyfikację DNA metodą fluorometryczną zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do kwantyfikacji dsDNA (wymienionego w Tabeli Materiałów). 
	UWAGA: Wyekstrahowane DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Użyj próbek DNA jako matryc do amplifikacji PCR przy użyciu starterów 27f i 1492r23 zgodnie z warunkami przedstawionymi w Tabeli 4. Aby upewnić się, że reakcja PCR zakończyła się sukcesem, należy wykonać elektroforezę w żelu agarozowym zgodnie ze standardową metodą elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu buforu 1X TAE i 1% agarozy.</li>
	<li>Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR, aby pozbyć się starterów, nukleotydów i innych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Wyślij produkt PCR do sekwencjonowania Sangera do odpowiedniego dostawcy usług sekwencjonowania. 
	UWAGA: Wraz z sekwencjonowaniem usługodawcy mogą również świadczyć usługi obejmujące oczyszczanie produktu PCR za dodatkową opłatą. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub -20 °C.</li>
	<li>Po otrzymaniu wyników sekwencjonowania w formacie FASTA wraz z plikiem chromatogramu (zwykle w formacie ABI lub SCF), należy przeanalizować sekwencje za pomocą narzędzi bioinformatycznych. Użyj oprogramowania do analizy sekwencji, aby otworzyć i zobrazować plik chromatogramu. 
	UWAGA: Ogólna jakość chromatogramu została sprawdzona w oparciu o wyraźne i wyraźne piki bez nadmiernego szumu</li>
	<li>Porównaj amplikony i dopasuj do blisko spokrewnionych gatunków w nieredundantnej bazie danych rybosomalnego RNA GenBank 16S z National Center for Biotechnology Information (NCBI) za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) <class="xref">24 i bazy danych genomu Refseq. 
	UWAGA: Korzystając z NCBI BLAST, skopiuj całą sekwencję FASTA w pasku wyszukiwania.</li>
</ol>
4. Zachowanie czystych kultur bakteryjnych
<ol>
	<li>Zebrać komórki bakteryjne z dobrze wyhodowanej kultury trwającej od 24 godzin do 48 godzin przez odwirowanie (3000 x g przez 10 minut) lub pobranie biomasy z kultury aksenicznej na płytce.</li>
	<li>Zawiesić kulturę bakteryjną w odpowiednim sterylnym roztworze izotonicznym (NaCl 0,85%) i przemyć przez odwirowanie roztworu bakteryjnego o sile 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w małej objętości sterylnego roztworu izotonicznego (0,5 ml). Aby zapewnić usunięcie wszelkich pozostałości podłoża wzrostowego, powtórz 1x.</li>
	<li>Zawiesić osad w 0,8 ml do 1 ml sterylnego koncentratu pożywki hodowlanej i homogenizować za pomocą mieszalnika wirowego przez 5-10 s lub delikatnie pipetując.</li>
	<li>Przenieś 0,5 ml zawiesiny komórkowej do sterylnego i odpowiednio oznakowanego kriowialnego o pojemności 1 ml i dodaj 0,5 ml autoklawowanego 50% roztworu glicerolu. Homogenizuj kriowial za pomocą mieszalnika wirowego i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Wszystkie czynności przed przeniesieniem kriowiali do temperatury -80 °C należy wykonać wewnątrz stacji beztlenowej.</li>
</ol>

Cultivation Strategies for Uncultured Microbial Diversity in the Chicken GI Tract

<ol><li>Wylensek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collection+of+bacterial+isolates+from+the+pig+intestine+reveals+functional+and+taxonomic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity.</a> Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).</li>
<li>Medvecky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+and+function+prediction+of+133+gut+anaerobes+isolated+from+chicken+caecum+in+pure+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Geno%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures.</a> BMC Geno. 19 (1), 561(2018).</li>
<li>Zenner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+immune+system+maturation+in+chickens+using+a+synthetic+community+of+cultured+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria.</a> mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).</li>
<li>Borda-Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+the+ileal+microbiota+of+phosphorus+and+calcium+utilization%2C+bird+performance%2C+and+gender+in+japanese+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail.</a> Animals. 10 (5), 885(2020).</li>
<li>Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+culture+through+selective+and+non-selective+conditions%3A+The+evolution+of+culture+media+in+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Micro+New+Infect%22%5BJournal%5D)">Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology.</a> New Micro New Infect. 34, 100622(2020).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hidden+pitfall+in+the+preparation+of+agar+media+undermines+microorganism+cultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).</li>
<li>Kawasaki, K., Kamagata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-catalyzed+hydrogen+peroxide+formation+from+agar%2C+gellan%2C+and+%CE%BA-carrageenan+and+recovery+of+microbial+cultivability+via+catalase+and+pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate.</a> Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).</li>
<li>Kato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+previously+uncultured+slow-growing+bacteria+by+using+a+simple+modification+in+the+preparation+of+agar+media%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media.</a> Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).</li>
<li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).</li>
<li>Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulations+of+myo-inositol+homeostasis%3A+Mechanisms%2C+implications%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biol+Regul%22%5BJournal%5D)">Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives.</a> Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).</li>
<li>Monastra, G., Dinicola, S., Unfer, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMonastra%2C+G+%22Physiological+and+pathophysiological+roles+of+inositols+in+A+clinical+guide+to+inositols%22">Physiological and pathophysiological roles of inositols in A clinical guide to inositols</a>. , Elsevier. (2023).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+origin+and+evolution+of+cellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms.</a> Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).</li>
<li>Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+phytase+superdosing%2C+myo-inositol+and+available+phosphorus+concentrations+on+performance+and+bone+mineralisation+in+broilers%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Nutri%22%5BJournal%5D)">Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers.</a> Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).</li>
<li>Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+high+dose+of+microbial+phytase+and+myo-inositol+supplementation+on+growth+performance%2C+tibia+mineralization%2C+nutrient+digestibility%2C+litter+moisture+content%2C+and+foot+problems+in+broiler+chickens+fed+phosphorus-deficient+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets.</a> Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).</li>
<li>Weber, M., Fuchs, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+in+the+niche%3A+A+large-scale+genome-based+survey+reveals+inositol+utilization+to+be+widespread+among+soil%2C+commensal%2C+and+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbio+Spect%22%5BJournal%5D)">Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria.</a> Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).</li>
<li>Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+transcriptional+regulation+of+myo-inositol+operon+in+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens.</a> FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).</li>
<li>Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+binding+affinity+of+repressor+IolR+avoids+costs+of+untimely+induction+of+myo-inositol+utilization+by+Salmonella+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium.</a> Sci Rep. 7 (1), 44362(2017).</li>
<li>Yebra, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+cluster+enabling+Lactobacillus+casei+BL23+to+utilize+myo-inositol%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).</li>
<li>Zhang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+iol+clusters+in+Lactobacillus+casei+strains%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains.</a> World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).</li>
<li>Labeda, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabeda%2C+DP+%22Bergey%27s+manual+of+systematic+bacteriology%22">Bergey's manual of systematic bacteriology</a>. , Springer. (2001).</li>
<li>Peterson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+media+on+transport+and+recovery+of+anaerobic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria.</a> Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).</li>
<li>Ulrich, R. L., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+procedure+for+isolating+chromosomal+DNA+from+Lactobacillus+species+and+other+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria.</a> Lett Appl Microbiol. 32 (1), 52-56 (2008).</li>
<li>Relman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+bacterial+16s+rRNA+amplification+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Diag+Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing.</a> Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).</li>
<li>Altschul, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST%3A+A+new+generation+of+protein+database+search+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs.</a> Nuc Acid Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li>
<li>Rios-Galicia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+taxonomic+and+functional+diversity+of+eight+bacteria+from+the+upper+digestive+tract+of+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Evol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel taxonomic and functional diversity of eight bacteria from the upper digestive tract of chicken.</a> Int J Syst Evol Microbiol. 74 (1), 006210(2024).</li>
<li>Lagier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+culturomics%3A+Paradigm+shift+in+the+human+gut+microbiome+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Microbial culturomics: Paradigm shift in the human gut microbiome study.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (12), 1185-1193 (2012).</li>
<li>Lagkouvardos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+intestinal+bacterial+collection+%28mibc%29+provides+host-specific+insight+into+cultured+diversity+and+functional+potential+of+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mouse intestinal bacterial collection (mibc) provides host-specific insight into cultured diversity and functional potential of the gut microbiota.</a> Nat Microbiol. 1 (10), 1-15 (2016).</li>
<li>Gilroy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+microbial+diversity+within+the+chicken+gut+microbiome+revealed+by+metagenomics+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture.</a> PeerJ. 9, e10941(2021).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+gut+metagenome+and+the+modulatory+effects+of+plant-derived+benzylisoquinoline+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids.</a> Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microbial+genomes+and+gene+catalog+of+the+chicken+gut+from+metagenomic+sequencing+of+high-fidelity+long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads.</a> GigaScience. 11, 116(2022).</li>
<li>Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-resolved+metagenomics+of+the+chicken+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome.</a> Front Microbiol. 12, 726923(2021).</li>
<li>Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanoidins+from+a+glucose-glycine+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Food+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system.</a> Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).</li>
<li>Ferrario, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+the+cecal+microbiota+of+feral+chickens+by+culturomic+and+metagenomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).</li>
<li>Crhanova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+culturomics+shows+that+half+of+chicken+caecal+microbiota+members+can+be+grown+in+vitro+except+for+two+lineages+of+clostridiales+and+a+single+lineage+of+bacteroidetes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes.</a> Microorganisms. 7 (11), 496(2019).</li>
<li>Rubio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacilli+counts+in+crop%2C+ileum+and+caecum+of+growing+broiler+chickens+fed+on+practical+diets+containing+whole+or+dehulled+sweet+lupin+%28lupinus+angustifolius%29+seed+meal%5BTitle%5D)+AND+%22British+Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal.</a> British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).</li>
<li>Bjerrum, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+composition+of+the+ileum+and+cecum+of+broiler+chickens+as+revealed+by+molecular+and+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques.</a> Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych lub osobistych związanych z pracą opisaną w niniejszym skrypcie.

Celem tej metodologii jest poprawa hodowli beztlenowych bakterii jelitowych poprzez poprawę jakości warunków pobierania próbek, przetwarzania próbek oraz formułowania i przygotowania pożywek. Warunki fizykochemiczne próbek (pH, dostępność węgla, azotu i kofaktorów) muszą być brane pod uwagę przy formułowaniu pożywek hodowlanych. W porównaniu z kolekcjami kultur bakteryjnych uzyskanymi od świń, ludzi lub myszy 1,26,27 raport na temat wyboru pożywki dla kurczaka jest raczej wąski i prawdopodobnie niedoszacowany nawet w przypadku sekcji o dużym zainteresowaniu, takich jak kał i kątnica 2,28. W tym sensie sformułowanie i przygotowanie pożywek użytych w tej pracy zaoferowało 80 różnych warunków, które mają na celu pokrycie zapotrzebowania metabolicznego mikroorganizmów zgłaszanego przez podejścia sekwencjonowania w innych pracach 29,30,31.
Wraz z doborem pożywek i suplementacją obserwuje się formułowanie pożywek hodowlanych i interakcję składników podczas przygotowania i sterylizacji. Unikano połączenia fosforanów i agaru, o których stwierdzono, że wytwarzają H2O2, poprzez oddzielne przygotowanie roztworu fosforanu i agaru. Modyfikacja ta poprawiła spektrum różnorodności izolatów poprzez zwiększenie żywotności bakterii katalazo-ujemnych. Aby uniknąć tworzenia się produktów reakcji Maillarda (MRP) podczas sterylizacji, węglowodany przygotowywano w osobnym roztworze i sterylizowano w różnych warunkach. Te dwie modyfikacje zwiększają zapotrzebowanie na materiał i czas pracy, ale zapewniają przewagę w mieszaniu i formułowaniu wykładniczej liczby różnych kombinacji mediów.
Przygotowanie oddzielnych roztworów w mniejszych objętościach może stanowić wyzwanie podczas rozpuszczania składników i znalezienia odpowiednich warunków sterylizacji, aby uniknąć wytrącania się. Ale preparaty pożywek hodowlanych zwykle nie osiągają nasycenia. Preferujemy filtrowane i sterylizowane roztwory mineralne rozpuszczone w temperaturze 60 °C, aby zapobiec wytrącaniu się osadów. W przypadku roztworów sterylizowanych ciepłem i ciśnieniem w autoklawie szczególną uwagę zwrócono na utlenianie roztworów węglowodanów w wysokich temperaturach i ciśnieniu. Aby uniknąć jakichkolwiek modyfikacji chemicznych, wszystkie roztwory węglowodanów muszą być sterylizowane w temperaturze 110 °C przez 30 minut przy ciśnieniu 5 psi. Te środki ostrożności poprawiają dostępność składników odżywczych, takich jak niezbędne aminokwasy, kofaktory, takie jak miedź, lub żelazo, a także zmniejszają aktywność hydrolityczną niektórych białek modyfikowanych przez wytworzone związki karbonylowe32.
We wszystkich badaniach bardzo niewielu autorów omawia bezpośredni wpływ pożywek hodowlanych na wyniki uprawy. Powszechne zabiegi stosowane w badaniach nad hodowlą ludzi (wstępna inkubacja w posiewie krwi, płynie żwacza lub mucynie) powtarzano bez rozróżnienia wraz z badaniami kulturomiki jelit na innych gatunkach z różnymi schorzeniami jelitowymi 2,28,33. W tej pracy dieta roślinna podawana kurczakom wspierała modyfikację formuły pożywek poprzez wykorzystanie głównych składników roślinnych składników odżywczych (peptydów i węglowodanów), które naśladują środowisko przewodu pokarmowego występujące u kurczaka i uwzględniają dostępność składników odżywczych.
Większość badań opiera się na podejściu do uprawy dolnych obszarów trawiennych kurczaków (kątnica i kał)2,3,28,34. Niewiele metod uprawy wyizolowało członków rodziny Lactobacillaceae, Clostridiaceae i Enterobacteriaceae35,36 z górnego odcinka przewodu pokarmowego. Jednak żaden z nich nie korzystał z nowoczesnych protokołów kulturowicznych. W 2021 roku Zenner i wsp. poinformowali o wyłącznej izolacji Ligilactobacillus aviarius uzyskanej z jelita krętego kurczaka, podczas gdy reszta kultur pochodziła z kątnicy. Dla kontrastu, różnorodność odzyskana w tej pracy wykazała nadmiarową izolację L. aviarius wraz z innymi gatunkami z rodzajów Lactobacillus, Ligilactobacillus i Limosilactobacillus25. Różnica ta ilustruje przewagę stosowania oddzielnie przygotowanych pożywek nad dostępnymi na rynku preparatami gotowymi do użycia.
Utrzymanie warunków beztlenowych przez cały proces izolacji i hodowli jest bardzo ważnym krokiem, ponieważ nawet niewielka ilość tlenu może niekorzystnie wpłynąć na wzrost beztlenowców. W celu monitorowania i utrzymania warunków beztlenowych podczas transportu próbki, do roztworu transportowego dodaje się rezazurynę sodu. Ten związek chemiczny ulega redukcji pod wpływem tlenu, co powoduje przejście koloru z niebieskiego na różowy. W niskim stężeniu nie wpływa na żywotność bakterii. Należy jednak unikać nadmiernych stężeń, ponieważ mogą one prowadzić do niezamierzonego wpływu na bakterie. Dokładna kontrola poziomu resazuryny sodu zapewnia dokładne monitorowanie warunków beztlenowych bez naruszania integralności próbek bakteryjnych. Do izolacji celowej zastosowano metodę płytki nalewającej z wykorzystaniem metody płytki rozsiewającej ze względu na zaletę polegającą na zachowaniu jednorodnego rozmieszczenia kolonii bakteryjnych, co ułatwiało precyzyjną selekcję poszczególnych bakterii. Ponadto metoda ta wykazuje zmniejszoną podatność na zanieczyszczenia drogą powietrzną lub zewnętrzną. Ponadto zapewnia spójne środowisko wzrostu dla różnych typów bakterii, zarówno gatunków szybkorosnących, jak i wolno rosnących, umożliwiając każdemu szczepowi bakteryjnemu namnażanie się w swoim indywidualnym tempie bez ingerencji ze strony innych gatunków drobnoustrojów.
Do konserwacji wybrano bulion glicerolowy na bazie granulek zamiast bulionu glicerolowego, ponieważ ułatwia on wyższe stężenie bakterii i mniejszą podatność na zanieczyszczenia. Metoda ta okazuje się skuteczną metodą konserwacji kultury bakteryjnej w temperaturze -80 °C, zapewniając długotrwałą stabilność przechowywania.
Początkowa część tej metodologii nakreśla podejście do izolowania nowych kultur beztlenowych, którego głównym celem jest zbadanie różnorodności wcześniej niehodowanych szczepów w jelicie kurczaka. Hodowla i identyfikacja bakterii beztlenowych służy jako cenne narzędzie do lepszego zrozumienia zdrowia drobiu, dobrostanu zwierząt, interakcji między drobnoustrojami a gospodarzem oraz potencjalnej izolacji szczepów probiotycznych. Ponadto może również zapewnić głębsze zrozumienie składu genetycznego i możliwości metabolitów, torując drogę do postępów w manipulowaniu mikrobiotą jelitową w celu osiągnięcia pożądanych wyników w produkcji drobiu. Dalsza część metodologii skupia się na potencjalnej izolacji beztlenowców metabolizujących MI beztlenowce. Przedsięwzięcie to jest bardzo obiecujące dla wyjaśnienia szlaku metabolizowania zawału mięśnia sercowego, procesu, który do tej pory pozostawał niejasny. Warto zauważyć, że wszechstronność tych metodologii wykracza poza kurczaki, oferując technikę izolacji mającą zastosowanie do różnych typów próbek. W związku z tym metoda przedstawiona w niniejszym badaniu jest jednym ze skutecznych podejść do izolacji kultur beztlenowych.

Odrodzenie hodowli w badaniu mikroorganizmów uzupełniło spostrzeżenia z badań metagenomicznych, dostarczając materiału do testowania hipotez metabolicznych, które wcześniej były tylko częściowo opisane i skwantyfikowane. Hodowla bakterii jelitowych dostarcza materiału do podtrzymania przyszłych badań nad interakcjami między mikroorganizmami a gospodarzem, ułatwia ukierunkowane badania kolonizacji i ulepsza badania interakcji molekularnych1,2,3. Zdobyta wiedza na temat mikroorganizmów przewodu pokarmowego przyczyniła się do poprawy żywienia i dobrostanu zwierząt, wpływając na formuły dietetyczne i zwiększając dostępność składników odżywczych4. Wiedza ta przyczyniła się do poprawy wydajności w zakresie wykorzystania interakcji prebiotycznych i probiotycznych. Potrzebne są jednak dogłębne badania, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób warunki biochemiczne i fizykochemiczne oddziałują na siebie i wpływają na profil mikrobiologiczny i jego strukturę. Aby osiągnąć ten cel, uprawa pozostaje niezbędna, służąc jako kluczowe narzędzie do zagłębienia się w skomplikowaną dynamikę społeczności drobnoustrojów w środowisku żołądkowo-jelitowym.
W przeciwieństwie do obszernych badań nad mikroorganizmami związanych z ludzkimi jelitami i klinicznych badań nad uprawą5, raporty o mikroorganizmach pochodzących od zwierząt gospodarskich wykorzystywały głównie ograniczony zakres pożywek do izolacji, potencjalnie ograniczając różnorodność izolatów2,3. Co więcej, ulepszenia w formułowaniu pożywek i badania nad interakcją fosforanów i soli z agarem, jak wyjaśnili Tanaka i wsp. oraz Kawasaki i wsp., nie zostały jeszcze wdrożone w badaniach mikrobiomu jelitowego6,7,8,9.
Uważany za substancję półpodstawkową, mio-inozytol (MI) odgrywa kluczową rolę w różnych procesach metabolicznych, fizjologicznych i regulacyjnych10,11. Obejmują one udział w mineralizacji kości, rozwoju mięśni piersiowych, sygnalizacji komórkowej, promowaniu owulacji i płodności, modulacji sygnalizacji neuronalnej oraz działanie jako regulator homeostazy glukozy i regulacji insuliny u drobiu10,11. MI odgrywa rolę prekursora poprzez jego wzajemną konwersję w kluczowych procesach biochemicznych, w tym w procesie glikolizy/glukoneogenezy, cyklu kwasu cytrynowego i szlaku pentozofosforanu. Dodatkowo służy również jako prekursor fosfatydyloinozytolu (PI), który jest dalej zaangażowany w metabolizm glicerofosfolipidów12. Niewiele badań wykazało, że metabolizowanie MI prowadzi do zmian w stabilności kości i wydajności zwierząt. Obejmuje to poprawę współczynnika wykorzystania paszy i przyrostu masy ciała, pokazując jej wpływ po wchłonięciu i wykorzystaniu w zwierzęciu13,14. Jednak szlak metabolizacji MI i jego wpływ na metabolizm drobiu pozostaje nieuchwytny15. Co więcej, niewiele badań sugeruje potencjalną rolę bakterii w wykorzystaniu MI, szczególnie w regionach o wysokiej aktywności metabolicznej, takich jak jelicie kręte16,17,18,19.
Wysiłki nad hodowlą bakterii z GIT zwierząt mają na celu ulepszenie genomicznych baz danych i rozszerzenie badań, weryfikację hipotez opartych na genomie i zrozumienie ekologicznego znaczenia tych zasobów20. Celem tej pracy jest ulepszenie strategii hodowli bakterii z przewodu pokarmowego kurczaka w celu zwiększenia różnorodności izolacji i ukierunkowanej izolacji grupy ekologicznej będącej przedmiotem zainteresowania, która asymiluje i metabolizuje mio-inozytol.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>VWR</td><td>20104.334</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>97064-332</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Carl Roth</td><td>P726.1</td><td></td></tr><tr><td>Stacja beztlenowa</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>A35 HEPA</td><td></td></tr><tr><td>Kwas masłowy</td><td>Merck</td><td>8.0045.1000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym kurczaka (Muramidaza)</td><td>VWR</td><td>1.05281.0010</td><td></td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>VWR</td><td>97061-204</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>VWR</td><td>90000-908</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan dipotasu</td><td>Carl Roth</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Legehennen/ Junghennenfutter</td><td>Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, D&uuml; sseldorf,</td> <td>Niemcy-MagAttract</td><td></td></tr> <tr><td>HMW DNA Kit</td><td>Qiagen</td><td>67563</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina gazów (80% N2 (poziom jakości 5.0), 15% CO2 (poziom jakości 3.0) i 5% H2 (poziom jakości 5.0))</td><td>Westfalen Gase GmbH,</td> <td>Niemcy-Mutanolysin</td><td></td></tr><tr><td>, rekombinowany (liofilizat)</td><td>A& A Biotechnologia</td><td>1017-10L</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inozytol</td><td>Carl Roth</td><td>4191.2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>ChemSolute</td><td>8418.01</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Carl Roth</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2671</td><td></td></tr><tr><td>RNAza A&nbsp;</td><td>QIAGEN Rybonukleaza A (RNaza A)&nbsp;</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>Rezazuryna sodowa</td><td>VWR</td><td>85019-296</td><td></td></tr><tr><td>Tioglikolan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102933</td><td></td></tr><tr><td>Pepton sojowy, wolny od GMO, wolny od zwierząt</td><td>VWR</td><td>97064-186</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Carl Roth</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Carl Roth</td><td>9139.2</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka witamin (suplement)</td><td>VWR</td><td>968290NL</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Star Lab</td><td>07127/92930</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Carl Roth</td><td>9257.05</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-D-fruktoza</td><td>VWR</td><td>53188-23-1</td><td></td></tr></tbody></table>

strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

Strategies to Enhance Cultivation of Anaerobic Bacteria from Gastrointestinal Tract of Chicken

Przewód pokarmowy (GIT) kurczaka to złożony ekosystem zawierający biliony mikrobów, które odgrywają kluczową rolę w fizjologii gospodarza, trawieniu, wchłanianiu składników odżywczych, dojrzewaniu układu odpornościowego i zapobieganiu intruzji patogenów. Aby zapewnić optymalne zdrowie i produktywność zwierząt, konieczne jest scharakteryzowanie tych mikroorganizmów i zrozumienie ich roli. Podczas gdy przewód pokarmowy drobiu zawiera rezerwuar mikroorganizmów o potencjalnych zastosowaniach probiotycznych, większość różnorodności pozostaje niezbadana. Aby lepiej zrozumieć różnorodność mikroorganizmów niehodowanych, konieczne są wspólne wysiłki na rzecz wprowadzenia tych mikroorganizmów do hodowli. Izolacja i hodowla mikroorganizmów kolonizujących przewód pokarmowy pozwala uzyskać powtarzalny materiał, w tym komórki, DNA i metabolity, oferując nowy wgląd w procesy metaboliczne w środowisku. Bez hodowli rola tych organizmów w ich naturalnym środowisku pozostaje niejasna i ograniczona do poziomu opisowego. Naszym celem jest wdrożenie strategii hodowli mających na celu poprawę izolacji różnorodnych drobnoustrojów beztlenowych z przewodu pokarmowego kurcząt, wykorzystując multidyscyplinarną wiedzę z zakresu fizjologii zwierząt, żywienia zwierząt, metagenomiki, biochemii pasz i nowoczesnych strategii hodowli. Ponadto naszym celem jest wdrożenie odpowiednich praktyk w zakresie pobierania próbek, transportu i przygotowywania pożywek, o których wiadomo, że wpływają na powodzenie izolacji. Odpowiednie metodologie powinny zapewniać stałe środowisko beztlenowe, optymalne warunki atmosferyczne, odpowiednią temperaturę inkubacji gospodarza oraz zaspokojenie szczególnych wymagań żywieniowych zgodnie z jego specyficznymi potrzebami. Stosując te metodologie, hodowla nie tylko przyniesie powtarzalne wyniki izolacji, ale także ułatwi procedury izolacji, sprzyjając w ten sposób kompleksowemu zrozumieniu skomplikowanego ekosystemu mikrobiologicznego w przewodzie pokarmowym kurcząt.

Monitorowanie warunków beztlenowych podczas transportu 
Ze względu na dodatek rezazuryny sodowej, zmiana barwy roztworu transportowego na różową przed przeniesieniem próbki do probówki wskazuje na zaburzenie lub utratę warunków beztlenowych. W związku z tym probówki wykazujące zmianę barwy nie były wykorzystywane podczas transportu; używano wyłącznie probówek bez zmiany barwy, co przedstawiono na Rysunku 2.
Analiza wyników sekwencjonowania 
Ekstrakcję DNA z izolatów, których dane chromatograficzne wykazywały nadmierny szum tła lub zakłócenia linii bazowej, niską intensywność sygnału pików, obecność wielu lub nakładających się pików w jednej pozycji oraz niespójną wysokość pików, powtórzono z użyciem świeżej i czystej kultury, ponieważ zjawiska te wskazują na zanieczyszczenie próbki, nierównomierną amplifikację lub problemy podczas procesu sekwencjonowania. Po przeprowadzeniu wyszukiwania BLAST w bazie NCBI, szczep wykazujący najwyższy procent tożsamości oraz wysoki stopień pokrycia zapytania został uznany za szczep spokrewniony z naszym izolatem, co pozwoliło na identyfikację izolatów.
Howadka szerokiego spektrum bakterii beztlenowych 
Izolacja bakterii beztlenowych pozwoliła na uzyskanie ponad 600 izolatów w pięciu różnych pożywkach, przygotowanych i wysterylizowanych w oddzielnych butelkach. Identyfikacja z wykorzystaniem genu 16S rRNA wykazała obecność 15 różnych rodzajów bakterii (Rycina 4). Spośród całkowitej liczby izolatów ponad połowę stanowią beztlenowce ścisłe, a pozostałe to beztlenowce fakultatywne.
Różnorodność izolatów obejmuje osiem szczepów, reprezentujących nowe gatunki taksonomiczne powiązane z członkami rodzin Clostridiaceae, Lactobacillaceae i Oscillospiraceae (Tabela 5)25. Wyniki te podkreślają znaczenie przestrzegania dobrych praktyk w przygotowywaniu pożywek oraz stosowania szerokiej gamy mediów dla powodzenia badań nad hodowlą.
Izolacja celowana 
Obserwacja kolonii na minimalnym medium agarowym sugeruje potencjalną obecność bakterii beztlenowych zdolnych do wykorzystania MI jako źródła węgla (Rysunek 5). Aby ostatecznie potwierdzić te wyniki na poziomie genetycznym, można przeprowadzić kompleksową analizę za pomocą sekwencjonowania całego genomu. Podejście to umożliwia identyfikację specyficznych genów związanych z metabolizmem MI lub przyczyniających się do niego, w tym iolA, iolB, iolC, iolD, iolE, iolF, iolG, iolH, iolI, iolJ, iolT, oraz iolW.
<img alt="Procedura biopsji przewodu pokarmowego; ekstrakcja tkanki, przechowywanie w probówce, wstrzykiwanie strzykawką." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Proces pobierania i transportu fragmentów GIT w celu hodowli bakterii beztlenowych. 1) Fragmenty zostają zaklampowane przed przecięciem. Linie przerywane wskazują zalecaną pozycję cięcia. 2) Przeniesienie pobranego fragmentu do probówki Hungate wypełnionej roztworem transportowym. 3) Zastąpienie atmosfery powietrznej poprzez wstrzyknięcie roztworu transportowego w celu utrzymania warunków beztlenowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Statyw z opisanymi probówkami z kulturami drobnoustrojów do analizy wzrostu, układ eksperymentalny i kontrolny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ilustracja probówek Hungate zawierających próbki pobrane z odcinka jelita krętego kurczaka. Obraz przedstawia prawidłowe napełnienie probówek Hungate roztworem transportowym, co zapewnia brak przestrzeni powietrznej i zachowanie spójnego koloru w porównaniu z kontrolą bez próbki. Widoczne zmętnienie w probówkach z próbkami przypisuje się rozpuszczeniu treści pokarmowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu przygotowania hodowli bakteryjnej, obejmujący etapy wirowania i dodawania pożywki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Kolejne etapy konserwacji bakterii beztlenowych. 1) Zbiór biomasy z aksenicznej hodowli z okresu od 24 h do 48 h w roztworze izotonicznym. 2) Przemywanie komórek bakteryjnych poprzez wirowanie i usunięcie supernatantu w celu pozbycia się pozostałości pożywki. 3) Powtórzenie procesu przemywania. 4) Rozpuszczenie osadu w pożywce hodowlanej i 50% roztworze glicerolu, a następnie przechowywanie w -80 °C w sterylnych probówkach kriogenicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres procentowy izolatów bakteryjnych z podziałem na rodzaje w różnych składach pożywek; skumulowany wykres słupkowy; badanie mikrobiologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Rozkład taksonomiczny wyizolowanych bakterii na poziomie rodzaju. Skumulowany wykres słupkowy przedstawia różnorodność bakterii wyizolowanych z pięciu różnych składów pożywek, podkreślając korzystny wpływ zastosowania zróżnicowanych pożywek w niniejszym badaniu. Składy pożywek wymieniono w Tabeli 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost bakterii na płytkach z agarem, wyniki eksperymentalne w mikrobiologii, analiza tworzenia kolonii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Beztlenowe kolonie bakterii na minimalnym podłożu agarowym. Beztlenowe kolonie bakterii rozwijające się na minimalnych podłożach agarowych po 24 h inkubacji w 39 °C. Powstawanie kolonii sugeruje potencjalną asymilację myo-inozytolu jako głównego źródła węgla, obok innych źródeł węgla. Przedstawiono dwa rozcieńczenia: (A) 10-1, w którym liczba kolonii przekracza możliwości praktycznego zliczenia ze względu na ich obfitość; oraz (B) 10-2, ukazujące wyraźne, możliwe do policzenia kolonie, co ułatwia analizę selektywną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td rowspan="2">Pożywki</td>
			<td >1</td>
			<td >2</td>
			<td >3</td>
			<td >4</td>
			<td >5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pożywka peptonowa</td>
			<td >Pożywka polisacharydowa</td>
			<td >Pożywka z krótkołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi</td>
			<td >Pożywka węglowodanowa</td>
			<td >Pożywka dla bakterii redukujących siarczany (SRB)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2">Źródło węgla (C)</td>
			<td >Dekstroza 0.2%</td>
			<td rowspan="2">Pasza dla drobiu (2%)</td>
			<td rowspan="2">Kwas octowy 0.17%, kwas izowalerianowy 0.01%, kwas propionowy 0.2%, kwas masłowy 0.2%</td>
			<td rowspan="2">Dekstroza 5%</td>
			<td rowspan="2">Laktynian Na-DL, kwas askorbinowy</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Skrobia 0.05%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Źródło azotu (N)</td>
			<td >Aminokwasy z soi (1%)</td>
			<td >-</td>
			<td >Aminokwasy z tryptony i ekstraktu mięsnego (0.1%)</td>
			<td >Aminokwasy z peptonów sojowych (0.1%), cytrynian (NH4)3 (0.1%)</td>
			<td >NH4Cl (0.1%)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Źródło minerałów</td>
			<td >K2HPO4 (0.05%)</td>
			<td >-</td>
			<td >K2HPO4 (0.05%)</td>
			<td >K2HPO4 (0.05%)</td>
			<td >K2HPO4 (0.05%)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td >1.50%</td>
			<td >1.50%</td>
			<td >1.50%</td>
			<td >1.50%</td>
			<td >1.50%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kofaktor (Dodany po sterylizacji)</td>
			<td >Ekstrakt drożdżowy (0.1%)</td>
			<td >-</td>
			<td >Mieszanka witamin (0.01%)</td>
			<td >Mieszanka witamin (0.01%)</td>
			<td >Ekstrakt drożdżowy (0.01%)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inhibitory</td>
			<td >brak</td>
			<td >brak</td>
			<td >Tween 80 (1%)</td>
			<td >Menadion (0.05%)</td>
			<td >-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład pośrodków hodowlanych do izolacji szerokiego spektrum bakterii. Skład pięciu pośrodków agarowych, z których każdy został sformułowany w unikalny sposób w oparciu o zmienność źródła węgla, źródła azotu, źródła minerałów oraz włączenie kofaktorów i inhibitorów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Skład</td>
			<td>Ilość (g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepton kazeinowy</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepton sojowy</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek sodu</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wodorostrzan potasu</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mio-inozytol</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Skład pożywki wzbogaconej. Formuła pożywki opracowana z mieszanki złożonych składników w celu wspierania wzrostu szerokiego spektrum bakterii. Ilość każdego składnika określono w g/L.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Skład</td>
			<td>Minimalne podłoże agarowe (g/ml)/ L</td>
			<td>Minimalne pożywka płynna (g/ml)/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cystyna</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek sodu</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tioglikolan sodu</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wodorosteścian sodu dwuwodny</td>
			<td>0.53</td>
			<td>0.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wodorofosforan potasu</td>
			<td>0.41</td>
			<td>0.41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek amonu</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek wapnia</td>
			<td>0.11</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek magnezu</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptona</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.00773</td>
			<td>0.00773</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór mikroelementów SL7</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanka witaminowa</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mio-inozytol (20 mM)</td>
			<td>3.6</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>15</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH (przy użyciu 1 mM HCl)</td>
			<td>6 ± 0.2</td>
			<td>6 ± 0.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Skład pożywki minimalnej. Pożywka została opracowana z myo-inozytolem jako głównym źródłem węgla.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Denaturacja wstępna</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 min</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>52 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie</td>
			<td>68 °C</td>
			<td>90 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Końcowa elongacja</td>
			<td>68 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Optymalne warunki amplifikacji genu 16S rRNA. Idealna temperatura, czas trwania oraz parametry cykli do zastosowania w termocyklerze w celu wydajnej amplifikacji genu docelowego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nowe przypisanie taksonomiczne</td>
			<td>Wielkość genomu</td>
			<td>zawartość GC</td>
			<td>Region jelita</td>
			<td>numer akcesyjny 16S </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus galli</td>
			<td>1861581</td>
			<td>50.43</td>
			<td>kadrować</td>
			<td>OM760982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus avium</td>
			<td>2158112</td>
			<td>48.49</td>
			<td>jelito cienkie (część końcowa)</td>
			<td>OM760983</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus pulli</td>
			<td>1924125</td>
			<td>45.87</td>
			<td>jelito kręte</td>
			<td>OQ831033</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridium butanoliproducens</td>
			<td>3507657</td>
			<td>28.34</td>
			<td>kadrować</td>
			<td>OQ831034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faecalispora anaeroviscerum</td>
			<td>2921858</td>
			<td>50.36</td>
			<td>jelito cienkie (ileum)</td>
			<td>OM760984</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus viscerum</td>
			<td>1993658</td>
			<td>44.9</td>
			<td>jelito kręte</td>
			<td>OM760986</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligilactobacillus hohenheimensis</td>
			<td>1381484</td>
			<td>50.47</td>
			<td>jelito czcze</td>
			<td>OM760988</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus difficilis</td>
			<td>1998683</td>
			<td>47.38</td>
			<td>jelito kręte</td>
			<td>OQ832131</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5. Identyfikacja taksonomiczna nowych gatunków bakterii. Nowe gatunki bakterii wyizolowane i zidentyfikowane w niniejszym badaniu z przewodu pokarmowego kurcząt zostały wyszczególnione wraz z wielkością ich genomu, zawartością GC, sekcją oraz numerem dostępu do genu 16S rRNA. Tabela została zmodyfikowana na podstawie źródła25.

Protokół przedstawia dwie metodologie poprawy izolacji beztlenowych bakterii jelitowych. Pierwszy z nich koncentruje się na izolacji różnych bakterii przy użyciu różnych pożywek hodowlanych. Drugi koncentruje się na etapach uprawy określonej grupy drobnoustrojów, ewentualnie asymilując mio-inozytol, aby w pełni zrozumieć jego znaczenie ekologiczne.

Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

The gastrointestinal tract (GIT) of chicken is a complex ecosystem harboring trillions of microbes that play a pivotal role in the host&#39;s physiology, ...

Naszym celem jest wyizolowanie i wyhodowanie bakterii z jelita kurczaków, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat sieci mikrobiologicznych i interakcji z gospodarzem. Charakterystyka tych bakterii beztlenowych wspiera wiedzę na temat procesów jelitowych i wzbogaca bazy danych bakterii na potrzeby przyszłych badań. Jednym z głównych wyzwań jest zapobieganie ekspozycji tlenu i form reagujących z tlenem w procesie pobierania próbek i hodowli, aby zapobiec inaktywacji bakterii.Z naszego doświadczenia wynika, że poprawiło to odzysk różnorodności bakterii beztlenowych. Nasz protokół wypełnia lukę w zrozumieniu metabolizmu mio-inozytolu u drobiu Poprzez wyizolowanie potencjalnych bakterii metabolizujących mio-inozytol z jelita kurczaka, naszym celem jest rzucenie światła na specyficzną społeczność bakteryjną i zaangażowane szlaki metaboliczne, pogłębiając wiedzę w tej dziedzinie. Naszym głównym celem jest zrozumienie, w jaki sposób społeczności drobnoustrojów wchodzą w interakcje z gospodarzem, zwłaszcza w jelitach.To tutaj dieta jest rozkładana, składniki odżywcze są wchłaniane i zachodzą znaczące interakcje z tymi mikroorganizmami. Na początek połącz 250 mililitrów każdego roztworu węglowodanowego, białkowego, agarowego i mineralnego w szklanej butelce autoklawu. Zamknąć butelkę nakrętką z otworem i gumowym korkiem.Po odgazowaniu mieszaniny azotem wlej ją do sterylnych szalek Petriego wewnątrz stacji beztlenowej. Następnie przenieś próbki jelit kurczaka do stacji beztlenowej zawierającej butelkową mieszaninę gazów składającą się z azotu, dwutlenku węgla i wodoru. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś próbki jelit z probówki Hungate'a na sterylną szalkę Petriego.Użyj sterylnych nożyczek, aby ostrożnie przeciąć otwartą sekcję. Następnie za pomocą sterylnej szpatułki wyekstrahuj jeden gram treści trawiennej. Przenieść zawartość trawienną do probówki zawierającej sterylny roztwór fizjologiczny i wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie.Odpipetować 0,1 mililitra próbki z rozcieńczeń 10 do 4 do 10 do 7 na sterylne i odpowiednio oznakowane płytki z podłożami. Rozprowadzić próbkę sterylną szpatułką Drigalskiego. Na koniec inkubować szalki Petriego w stacji beztlenowej w pozycji odwróconej przez 24 do 48 godzin w temperaturze 39 stopni Celsjusza.Wyizolowano 15 różnych rodzajów bakterii. Różnorodność izolatów obejmuje osiem szczepów, wykazujących nowe gatunki taksonomiczne spokrewnione z członkami rodzin Clostridiaceae, Lactobacillaceae i Oscillospiraceae. Na początek homogenizuj trawienie kurczaka zebrane z wyekstrahowanego jelita kurczaka na wirze przez 10 do 15 sekund.Przenieść homogenizowaną próbkę do probówki zawierającej pożywkę wzbogacającą. Po inkubacji użyj mieszalnika wirowego, aby dokładnie wymieszać wzbogaconą probówkę przez 10 do 15 sekund. Następnie przenieś zmieszaną próbkę do sterylnego minimalnego podłoża bulionowego przed inkubacją jak poprzednio.Następnie należy seryjnie rozcieńczyć próbki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, zaczynając od rozcieńczenia od 1 do 10 i kontynuując aż do rozcieńczenia od 1 do 1 000. Po każdym rozcieńczeniu dokładnie homogenizować próbkę w mieszaninie wirowej. Przenieść jeden mililitr rozcieńczonej próbki na szalkę Petriego w sterylnych i beztlenowych warunkach.Następnie wlej 15 do 20 mililitrów stopionego minimalnego podłoża agarowego na szalkę Petriego. Delikatnie zakręć naczyniem, aby zapewnić równomierne mieszanie. Gdy agar zastygnie, inkubuj szalki w pozycji odwróconej w stacji beztlenowej przez 24 godziny w temperaturze 39 stopni Celsjusza.Kolonie powinny wyglądać jak wyraźne, małe osadzone kropki pod koniec inkubacji. Teraz użyj sterylnej pętli do zaszczepiania, aby ostrożnie wybrać każdą pojedynczą kolonię bakteryjną. Przenieś kolonie do oddzielnych probówek zawierających pięć mililitrów minimalnej pożywki bulionowej.Zwiększone zmętnienie pod koniec inkubacji wskazuje na wzrost bakterii. Kolonie bakteryjne zdolne do wykorzystania mio-inozytolu obserwowano na minimalnym podłożu agarowym.

strategies-to-enhance-cultivation-anaerobic-bacteria-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Clostridium difficile to bakteria chorobologiczna, która jest ściśle beztlenowca i powoduje biegunkę związaną z antybiotykami (AAD). Opisano tu metody izolacji, hodowli i utrzymania komórek wegetatywnych i zarodników C. difficile. Techniki te wymagają komory beztlenowej, która wymaga regularnej konserwacji w celu zapewnienia odpowiednich warunków do optymalnej uprawy C. difficile.

Hodowla i utrzymanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym

Uważa się, że bakteriocyny odgrywają kluczową rolę w definiowaniu różnorodności mikrobiologicznej w różnych niszach ekologicznych. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę oceny wpływu bakteriocyny na skład mikrobioty jelitowej na modelu zwierzęcym.

Metoda oceny wpływu bakteriocyny na mikrobiotę jelitową myszy

Ponieważ organizmy beztlenowe nie są w stanie rosnąć po ekspozycji na tlen, niezbędne jest stosowanie technik hodowli beztlenowej. W tym miejscu demonstrujemy prostą i skuteczną metodę uprawy mieszanej kultury pochodzącej z biogazowni, od przygotowania pożywki do ilościowego oznaczania gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.

Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

Tutaj opisujemy metodę generowania piskląt wolnych od zarazków z jaj komercyjnej linii brojlerów, Ross PM3. Metoda ta może być dostosowana do hodowli zwierząt wolnych od zarazków z innych gatunków drobiu.

Produkcja szybko rosnących brojlerów wolnych od zarazków z komercyjnej linii do badań mikrobioty

Demonstrujemy metodę izolowania trudnych do wyhodowania członków nowego typu bakterii, Saccharibacteria, poprzez filtrowanie płytki nazębnej i wspólną hodowlę z bakteriami gospodarza.

Ustanawianie stabilnych kultur binarnych symbiotycznych bakterii sacharycznych z jamy ustnej

Protokół przedstawia mysi model kolonizacji pochwy za pomocą beztlenowo hodowanych ludzkich bakterii pochwy. Skupiamy się na Gardnerella vaginalis, jednocześnie zamieszczając sugestie dotyczące Prevotella bivia i Fusobacterium nucleatum. Protokół ten może być również stosowany jako przewodnik do inokulacji dopochwowych i realnego odzyskiwania innych bakterii hodowanych beztlenowo.

Modele kolonizacji pochwy myszy przez bakterie hodowane beztlenowo

Tematem tego artykułu jest szczegółowe opisanie najlepszych praktyk tworzenia pożywek dla wymagających mikroorganizmów beztlenowych pozyskanych ze środowiska. Metody te pomagają w zarządzaniu kulturami beztlenowymi i mogą być stosowane do wspomagania wzrostu nieuchwytnych mikroorganizmów niehodowlanych, "mikrobiologicznej ciemnej materii".

Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę transplantacji ludzkich komórek macierzystych do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego zarodka kurczaka. Stanowi to model in vivo do oceny proliferacji i różnicowania różnych typów ludzkich komórek macierzystych w środowisku tkanki embrionalnej.

Ksenotransplantacja ludzkich komórek macierzystych do zarodka kurczaka

Poznaj metody izolacji i hodowli beztlenowych bakterii jelitowych z przewodu pokarmowego kurczaka. Protokoły te umożliwiają odzyskanie różnorodnych gatunków bakterii i badanie metabolizmu myo-inozytolu.

Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

Przeglądaj więcej filmów