Name: Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Poznaj automatyczną analizę glikanów na białkach rekombinowanych przy użyciu technologii lektynowych. Ta metoda wspiera odkrywanie biomarkerów chorobowych w biotechnologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Adaptable and Seamless Technology transfer poprzez Target-driven R&D (A-STEP), finansowany przez Japońską Agencję Nauki i Technologii (JST), w ramach grantu numer JPMJTR204A oraz częściowo przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant numer 23H02680 dla AK. Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim.

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie specjalistycznej końcówki do automatycznego profilowania glikanów
<ol>
	<li>Przynieś wysuszone kulki utrwalone lektyną, przechowywane w temperaturze 4 °C w szczelnie zamkniętej torbie, na stół i pozwól im powrócić do temperatury pokojowej (~23 °C). 
	UWAGA: Zapobiega to kondensacji pary wodnej na koralikach, co może obniżyć ich jakość. Ta metoda przygotowania koralików utrwalających lektyny została już wcześniej opisana5.</li>
	<li>Umieść antystatyczną szmatkę na biurku i umieść przenośny eliminator ładunków elektrostatycznych przodem do miejsca pracy. Pozwala to na późniejsze wykonywanie prac na stole z zabezpieczeniem antystatycznym (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Włóż koraliki do pustej końcówki za pomocą pęsety antystatycznej tak, aby dwa koraliki dystansowe zostały umieszczone między koralikami mocującymi lektyny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Delikatnie ściśnij górną część końcówki szczypcami, aby zamknąć otwór, uważając, aby nie przeciąć końcówki po wypełnieniu wszystkich koralików (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Ma to na celu zabezpieczenie koralików wewnątrz końcówki. Zaleca się, aby szczypce były wykonane tak, aby uniknąć przecięcia końcówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Wyprostuj końcówkę ręcznie, jeśli jest wygięta.</li>
	<li>Przygotowany końców należy przechowywać w temperaturze 4 °C w szczelnie zamkniętej torbie ze środkiem osuszającym, aż będzie potrzebny. 
	UWAGA: Przed użyciem końcówki należy ją doprowadzić do temperatury pokojowej przed otwarciem szczelnie zamkniętej torebki i wyjęciem jej. Wilgoć drastycznie zmniejsza reaktywność lektyn.</li>
</ol>
2. Przygotowanie analitów
<ol>
	<li>Zapakuj odczynnik do biotynylacji do rutynowej analizy. 
	UWAGA: W przypadku rutynowej analizy pomocne jest wstępne zapakowanie odczynnika do biotynylacji (Biotyna-(AC5)2 Sulfo-Osu, patrz Tabela materiałów) w małe porcje w następujący sposób w celu szybkiej analizy. Zaleca się suszenie i przechowywanie odczynnika biotynylacyjnego, ponieważ jego ester sukcynimidylowy jest ogólnie podatny na hydrolizę.
	<ol>
		<li>Rozpuść odczynnik biotynylacji w wodzie dejonizowanej.</li>
		<li>Dozować 10 μg odczynnika do probówek za pomocą pipety.</li>
		<li>Wysuszyć probówki odczynnikiem biotynylacyjnym w chłodzonym koncentratorze próżniowym i przechowywać je ze środkiem osuszającym w temperaturze 4 °C w światłoszczelnej torbie do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać roztwór analitu (białko o stężeniu 200 ng eq) do probówki zawierającej wysuszony odczynnik do biotynylacji przygotowany w kroku 2.1. 
	UWAGA: Należy zwrócić uwagę na skład buforu używany do rozpuszczania i rozcieńczania analitów, w zależności od właściwości zastosowanego odczynnika do biotynylacji. Na przykład należy unikać używania pierwszorzędowych odczynników aminowych jako do sprzęgania amin. Zapobiegnie to zmniejszeniu skuteczności biotynylacji analitów.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj przez wirowanie, a następnie odwiruj (1000 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej) w wirówce stołowej, aby upuścić płyn z pokrywki na dno probówki.</li>
	<li>Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, osłonięte przed światłem.</li>
	<li>Rozcieńczyć biotynylowane próbki 10-krotnie w buforze sondującym (1% Triton X-100, 0,5 M glicyny, 1 mM CaCl2 i 1 mM MnCl2 w TBS) w celu dezaktywacji wszelkich nieprzereagowanych odczynników biotynylacji. 
	UWAGA: W przypadku reakcji sprzęgania amin, nieprzereagowany odczynnik biotynylacji jest zużywany w reakcji z buforem zawierającym pierwszorzędowy odczynnik aminowy, taki jak Tris w TBS, co zapobiega biotynylacji lektyn i innych substancji unieruchomionych na kulkach w kolejnym pomiarze.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej, osłonięte przed światłem, przez 2 godziny.</li>
	<li>Oceń skuteczność biotynylacji analitów za pomocą Western bloting, używając streptawidyny znakowanej HRP jako sondy wykrywającej, jeśli to konieczne. Zapoznaj się z literaturą dotyczącą metod Western blot6.</li>
</ol>
3. Przygotowanie odczynników do profilowania glikanów za pomocą automatycznego urządzenia do pomiaru reakcji
<ol>
	<li>Rozcieńczyć streptawidynę sprzężoną z HRP roztworem blokującym w stosunku 1:3000.</li>
	<li>Wymieszać z równymi objętościami substratu A i substratu B (patrz Tabela materiałów). Użyć 160 μl zmieszanego substratu na próbkę.</li>
	<li>Dozować roztwór blokujący, bufor do płukania (0,1% Triton X-100/TBS), grużki, sprzężony z HRP roztwór streptawidyny i każdy substrat do wyznaczonych dołków wkładu z 10 zbiornikami cieczy. 
	UWAGA: Zalecana objętość i rozmieszczenie roztworów do wypełnienia każdej studzienki wkładu reakcyjnego są opisane poniżej. Jednak roztwory i rozmieszczenie studni można z wyprzedzeniem zmienić w automatycznym urządzeniu do pomiaru reakcji.
	<ol>
		<li>Dodaj 0,2 ml streptawidyny znakowanej HRP przygotowanej w kroku 3.1 do studzienki #2 za pomocą pipety. Studnia nosi nazwę #1 z przodu wkładu.</li>
		<li>Dodaj 0,2 ml roztworu blokującego do studzienki #3 za pomocą pipety.</li>
		<li>Dodaj 1 ml TBS do studzienek #4 i #6 za pomocą pipety.</li>
		<li>Dodaj 1 ml buforu do płukania do studzienek #7 i #8 za pomocą pipety.</li>
		<li>Dodaj 0,16 ml mieszaniny substratu do studzienki #10 za pomocą pipety.</li>
		<li>Upewnij się, że studzienki #1, #5 i #9 są puste.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj anality przygotowane w kroku 2 do mikroprobówki z zakrętką o pojemności 2 ml i niskim poziomie adsorbcji.</li>
	<li>Otwórz przednie drzwiczki automatycznego urządzenia do pomiaru reakcji.</li>
	<li>Ustawić zbiorniki cieczy przygotowane w kroku 3.3, końcówki przygotowane w kroku 1 i anality przygotowane w kroku 3.4 w wyznaczonych pozycjach automatycznego urządzenia do pomiaru reakcji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D) w następujący sposób. Każdy pomiar wykonywany jest w jednym kierunku linii pionowej.
	<ol>
		<li>Umieść po jednej końcówce przygotowanej w kroku 1 w każdym otworze w pozycji "a" żółty symbol w <silna klasa="xfig">Rysunek 2D. 
		UWAGA: Ponownie, jeśli są przechowywane w lodówce, doprowadź końcówki do temperatury pokojowej przed otwarciem zamkniętej torby. Lektyny drastycznie tracą swój sygnał z powodu wilgoci.</li>
		<li>Zdjąć pokrywkę probówki zawierającej analit przygotowany w kroku 3.4 i włożyć ją do każdego otworu w pozycji "b" w podobny sposób.</li>
		<li>Włóż wkład zawierający płyn przygotowany w kroku 3.3, uważając, aby nie rozlać go w pozycji "c".</li>
		<li>Usuń cały "pojemnik na odpady" w Rysunek 2D, gdy jest pełny, wrzuć zawartość do kosza na śmieci i przywróć "pojemnik na odpady" do pierwotnej pozycji. 
		UWAGA: Odreagowane końcówki są po pomiarze automatycznie zbierane w "pojemniku na odpady".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Profilowanie glikanów za pomocą automatycznego urządzenia do pomiaru reakcji
<ol>
	<li>Włącz wyłącznik zasilania z boku jednostki głównej.</li>
	<li>Dotknij przycisku "Rozpocznij diagnostykę" wyświetlanego na ekranie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Program autodiagnostyczny uruchamia się automatycznie. Po chwili program autodiagnostyczny zostaje zakończony i pojawia się ekran główny (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). 
	UWAGA: Następujące operacje można wykonać, dotykając odpowiednich ikon. "Test", aby rozpocząć pomiar. "Konserwacja", aby potwierdzić ewentualny błąd systemu. "Historia", aby wyświetlić dane pomiarowe z przeszłości.</li>
	<li>Dotknij opcji "Test" wyświetlanej na ekranie GŁÓWNYM, aby wybrać protokół (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3B).</li>
	<li>Wybierz "BAssaySTD" metody oznaczania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C), a następnie naciśnij "Dalej" w prawym dolnym rogu.</li>
	<li>Wprowadź nazwę próbki (Rysunek 3D) dla każdej próbki zgodnie z potrzebami, a następnie dotknij "Dalej" w prawym dolnym rogu.</li>
	<li>Wprowadź nazwę końcówki (Rysunek 3E) używaną dla każdej próbki w razie potrzeby, a następnie dotknij "Dalej" w prawym dolnym rogu.</li>
	<li>Potwierdź nuty po prawej stronie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3F), a jeśli nie ma problemu, dotknij "Start" w prawym dolnym rogu, aby dokonać pomiaru.</li>
	<li>Potwierdź, że ekran przełącza się w tryb pracy (Rysunek 3G) i poczekaj, aż strzałka "zakończ" zostanie podświetlona. W razie potrzeby dotknij "Przerwa", aby zatrzymać tryb biegu. 
	UWAGA: Operacje automatycznie kontrolowane przez automatyczne urządzenie do pomiaru reakcji są następujące: (1) Dysze do automatycznego mikropipetowania wewnątrz przyrządu mocują jednocześnie maksymalnie osiem końcówek (patrz symbol żółty "a" w <silna klasa="xfig">Rysunek 2D); (2) Kilkakrotnie aspirować/rozładowywać roztwór w probówce zawierającej analit przez 5 minut; (3) Przenieść do roztworu blokującego i aspirować/rozładować przez 5 minut; (4) Przeniesienie do TBS i aspiracja/rozładowanie przez 2 minuty; (5) Przenieść do roztworu streptawidyny znakowanego HRP i aspirować/wypisać 5 minut; (6) Przenieść do bufora płuczącego i aspirować/rozładować przez 7 minut; (7) Przeniesienie do TBS i aspiracja/wyładowanie przez 2 minuty; (8) Przenieść do mieszaniny substratów i natychmiast odessać; (9) Zeskanuj chemiluminescencję ośmiu końcówek jednocześnie z tyłu urządzenia, aby uzyskać dane o pikach; (10) Wrzuć zużyte końcówki do pojemnika na odpady; (11) Dysza powraca do pozycji wyjściowej.</li>
	<li>Upewnij się, że ekran zmienił się w tryb wyników (<silna klasa="xfig">Rysunek 3H) po zakończeniu pomiaru. Osiem kodów kropkowych jest jednocześnie wyświetlanych na ekranie w celu łatwej weryfikacji. 
	UWAGA: Dotknij "Historii" w lewym dolnym rogu, aby wyświetlić wykres skanowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 3I,J), wykres słupkowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3K,L), tabelę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3M) i szczegół (<silna klasa="xfig">Rysunek 3N) jako wynik na ekranie. Wyświetl wyniki z innych torów z rozwijanej listy "Tor".</li>
	<li>Włóż pamięć USB do portu USB z boku jednostki głównej i dotknij "Eksportuj" w prawym dolnym rogu trybu wyników, aby zapisać dane wszystkich linii indywidualnie w pamięci USB.</li>
	<li>Eksportuj surowe dane (Rysunek 3M) jako plik CSV za pomocą portu USB w celu dalszej analizy danych i tworzenia indywidualnych wykresów w programie Excel. "Wartość" tabeli oznacza intensywność sygnału każdej lektyny. Wartości intensywności reprezentują maksymalną wartość danych piku (<silna klasa="xfig">Rysunek 3I,J) w skanie przereagowanych końcówek. 
	UWAGA: Można ustawić szczytowy próg ekstrakcji. W zależności od analitów, sygnał w części kulki dystansowej może być ogólnie wyższy, w takim przypadku wartość w części dystansowej jest odejmowana jako tło.</li>
</ol>

Automated Lectin-Based Glycan Profiling Using Bead Array in a Single Tip (BIST)

<ol><li>Butler, M., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+cell+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal cell expression systems.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 175, 1-36 (2021).</li>
<li>Silva, M. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+One+-+Lectin+biosensors+in+cancer+glycan+biomarker+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Chapter One - Lectin biosensors in cancer glycan biomarker detection.</a> Adv Clin Chem. 93, 1-61 (2019).</li>
<li>Hiono, T., Nagai-Okatani, C., Kuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4.07+-+Application+of+glycan-related+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Glycoscience+%28Second+Edition%29%22%5BJournal%5D)">4.07 - Application of glycan-related microarrays.</a> Comprehensive Glycoscience (Second Edition). , 134-148 (2021).</li>
<li>Shimazaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+bead+array+in+a+single+tip+facilitates+fully+automatic+glycoprotein+profiling%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Lectin bead array in a single tip facilitates fully automatic glycoprotein profiling).</a> Anal Chem. 91 (17), 11162-11169 (2019).</li>
<li>Shimazaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoBIST%3A+A+System+for+automatic+glycan+profiling+of+a+target+protein+using+milli-bead+array+in+a+tip%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">GlycoBIST: A System for automatic glycan profiling of a target protein using milli-bead array in a tip.</a> Curr Protoc Protein Sci. 99 (1), e103(2020).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+Technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: Technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Bojar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+guide+to+lectin+binding%3A+machine-learning+directed+annotation+of+57+unique+lectin+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A useful guide to lectin binding: machine-learning directed annotation of 57 unique lectin specificities.</a> ACS Chem Biol. 17 (11), 2993-3012 (2022).</li>
<li>Nagai-Okatani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2.0%3A+An+integrated+visualization+for+lectin+microarray-based+mouse+tissue+glycome+mapping+data+with+lectin+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">2.0: An integrated visualization for lectin microarray-based mouse tissue glycome mapping data with lectin histochemistry.</a> J Proteome Res. 20 (4), 2069-2075 (2021).</li>
<li>Geisler, C., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+glycoanalysis+with+Maackia+amurensis+lectins+requires+a+clear+understanding+of+their+binding+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Effective glycoanalysis with Maackia amurensis lectins requires a clear understanding of their binding specificities.</a> Glycobiology. 21 (8), 988-993 (2011).</li>
<li>Noro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N+-glycan+structures+of+Wisteria+floribunda+agglutinin-positive+Mac2+binding+protein+in+the+serum+of+patients+with+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">N -glycan structures of Wisteria floribunda agglutinin-positive Mac2 binding protein in the serum of patients with liver fibrosis.</a> Glycobiology. 31 (10), 1268-1278 (2021).</li>
<li>Rawitch, A. B., Pollock, H. G., Yang, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroglobulin+glycosylation%3A+Location+and+nature+of+the+N-Linked+oligosaccharide+units+in+bovine+thyroglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Thyroglobulin glycosylation: Location and nature of the N-Linked oligosaccharide units in bovine thyroglobulin.</a> Arch Biochem Biophys. 300 (1), 271-279 (1993).</li>
<li>Dang, K., Zhang, W., Jiang, S., Lin, X., Qian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+lectin+microarrays+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Open%22%5BJournal%5D)">Application of lectin microarrays for biomarker discovery.</a> Chemistry Open. 9 (3), 285-300 (2020).</li>
<li>Chen, S., Qin, R., Mahal, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweet+systems%3A+Technologies+for+glycomic+analysis+and+their+integration+into+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sweet systems: Technologies for glycomic analysis and their integration into systems biology.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 56 (3), 301-320 (2021).</li>
<li>Dwivedi-Agnihotri, H., Srivastava, A., Shukla, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+biotinylation+of+purified+proteins+for+measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reversible biotinylation of purified proteins for measuring protein-protein interactions.</a> Methods Enzymol. 633, 281-294 (2020).</li>
<li>Shimazaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto-lectin+dotcoding+by+two+octopuses%3A+Rapid+analysis+of+fluorescence-labeled+glycoproteins+by+an+8-channel+fully-automatic+bead+array+scanner+with+a+rolling-circle+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Auto-lectin dotcoding by two octopuses: Rapid analysis of fluorescence-labeled glycoproteins by an 8-channel fully-automatic bead array scanner with a rolling-circle detector.</a> Anal Chem. 95 (32), 11868-11873 (2023).</li>
</ol>

AO, TO, NT, HS, KK, MA, SY, TM, KN, OS i KS są pracownikami Precision System Science Co., Ltd.

W niniejszym badaniu opracowano technikę szybkiej oceny glikozylacji wykorzystującą technologię "układu kulek w jednej końcówce". W niniejszym badaniu wprowadzono standardową końcówkę GlycoBIST, przeznaczoną zarówno dla badaczy zajmujących się glikoologią, jak i nie, w celu ułatwienia rutynowej, kompleksowej oceny glikozylacji. Mikromatryca lektyn, zwykle wykorzystująca 20-100 lektyn12,13, jest szeroko wykorzystywana w ocenach. Biorąc jednak pod uwagę nakładającą się na siebie specyficzność niektórych lektyn na mikromacierzy i stosunkowo ograniczoną różnorodność glikoform na docelowej glikoproteinie w porównaniu z glikomikami surowych próbek klinicznych, oczekiwano, że 15 lektyn wystarczy do uproszczonej oceny ukierunkowanego profilowania glikanów.
Krytycznym krokiem w protokole jest umożliwienie unieruchomionym lektyną kulkom lub końcówkom wypełnionym tymi kulkami powrotu do temperatury pokojowej po przechowywaniu przed użyciem ich do pomiarów. W szczególności zaobserwowano, że kondensacja osłabia sygnały; Dlatego zaleca się, aby nigdy nie otwierać torby do przechowywania, dopóki nie powróci do temperatury pokojowej. Do przechowywania odczynników do biotynylacji konieczne jest również całkowite wysuszenie przed przechowywaniem. Niewystarczający proces suszenia zmniejsza skuteczność biotynylacji do białka ze względu na hydrolizę odczynnika biotynylacji14.
Jeśli chodzi o modyfikacje i rozwiązywanie problemów, zbadano metodę zmniejszania zmienności, zwłaszcza w odniesieniu do metody pomiaru w zautomatyzowanym urządzeniu do pomiaru reakcji. W szczególności, gdy objętość buforu w zbiorniku używanym do analizy wynosi 150 μl, pęcherzyki dostają się do końcówki, co prowadzi do zmniejszenia wydajności reakcji i powoduje duże różnice w wartościach. Dlatego zaleca się umieszczenie w zbiorniku co najmniej 200 μl buforu. 
Ważnym czynnikiem jest również ilość płynu, która wypełnia końcówki podczas automatycznego pipetowania. Końcówki nie mogą całkowicie usunąć cieczy, gdy przechodzi ona do następnego etapu reakcji. W związku z tym, w niemałej ilości, bufor z poprzedniego kroku jest przenoszony do następnego kroku, a poprzedni bufor pozostaje w górnej części wprowadzonego roztworu, gdy nowy bufor jest zasysany. Dlatego podłoże i inne roztwory powinny być wystarczająco zasysane, aby napełnić górny zbiornik (patrz rysunek 1A). Biorąc pod uwagę nieodwracalność reakcji przeciwciał na instrumencie, należy zachować ostrożność i unikać błędów podczas początkowej konfiguracji.
Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że jest ona ograniczona do rozpuszczalnych białek pochodzących z supernatantów surowicy i hodowli. W obecnej metodzie lektyna nie jest kowalencyjnie usieciowana ze kulką, co uniemożliwia analizę próbek zawierających wysokie stężenia środków powierzchniowo czynnych, takich jak ekstrakty komórkowe i tkankowe. W związku z tym konieczne są przyszłe ulepszenia, aby wyeliminować te ograniczenia.
Znaczenie układu koralików lektynowych polega na wymienności i rozszerzalności gatunków lektyny umocowanych na koralikach. Na przykład w wielkoskalowej analizie różnicowej (>1000 próbek) przy użyciu zautomatyzowanego systemu profilowania glikanów, użytkownicy mogą dostosować skład 15 lektyn w końcówce w oparciu o wstępne profilowanie glikoproteiny docelowej glikoproteiny (<100 próbek za pomocą mikromacierzy lektynowej). Co więcej, wysoka stabilność kulek mocowanych lektyną umożliwia natychmiastowe eksperymentowanie od początkowego projektu końcówki do pomiaru za pomocą rutynowych procedur. Nie tylko 25 z 28 lektyn, które wykazały wysoką wiarygodność (Tabela 1), ale także wszelkie lektyny interesujące użytkownika mogą być wykorzystane do stworzenia niestandardowego zautomatyzowanego systemu profilowania glikanów dla jego konkretnych eksperymentów, po przeprowadzeniu wyżej wymienionego rutynowego testu niezawodności. Podejście to doprowadziło do zaprojektowania możliwego układu 120-lektynowych kulek składającego się z ośmiu różnych typów końcówek do rozszerzonego pomiaru w połączeniu ze standardowym systemem profilowania glikanów.
Poprzednie badanie koncentrowało się na ustaleniu procedury wykrywania glikoprotein znakowanych Cy3 zgodnie z mikromacierzą lektyny15. Metoda ta była ograniczona do 13 lektyn równolegle w końcówce z powodu interferencji fluorescencji. Obecna metoda, wykorzystująca etykiety wykrywania HRP, mieści 15 kulek utrwalonych lektyną i dwa koraliki kontrolne (dodatnie i ujemne) w końcówce. Ponadto biotynylacja próbek skróciła proces analizy.
Ta metoda analityczna może być stosowana nie tylko w badaniach akademickich, ale także w badaniach medycznych i farmaceutycznych, żywności, kosmetykach i innych dziedzinach przemysłu. Chociaż technologie mikromacierzy lektynowych i glikoproteomiki są dobrze ugruntowane, podejście przyjęte w tym badaniu pozostaje istotne ze względu na jego pełną automatyzację i zdolność do szybkiej analizy przy mniejszej liczbie kroków. W przyszłości udoskonalenia tej analizy zostaną wprowadzone do metody ilościowej poprzez normalizację sygnału przy użyciu niektórych glikoprotein, wykorzystując kulki utrwalone przeciwciałami wraz z kulkami utrwalonymi lektyną w końcówce.

Glikozylacja białek jest kluczową modyfikacją potranslacyjną, która musi być oceniona w biofarmaceutykach. Profile glikanów białek mogą się różnić w zależności od warunków hodowli, procesów oczyszczania i komórek gospodarza1. Do kwalifikacji glikozylacji w procesie bioprocesu wymagane są proste przyrządy. Szacuje się, że ponad 50% wydzielanych i błonowych białek in vivo jest modyfikowanych wieloma glikanami, które zmieniają się w zależności od linii komórkowej, etapu rozwoju i statusu choroby, takiego jak początek nowotworu złośliwego2. Monitorowanie profili glikanów ma znaczny potencjał w zakresie identyfikacji unikalnych markerów diagnostycznych i celów leków. Zautomatyzowane urządzenia zdolne do szybkiego pomiaru wielkości próbek na dużą skalę są bardzo poszukiwane, aby zweryfikować i zweryfikować tak nieprawidłową glikozylację z setek próbek pacjentów w procesie odkrywania.
Technologia mikromacierzy została włączona do glikomiksu do oceny profilowania glikanów glikoprotein3. W tej metodzie kilka lektyn, które są białkami wiążącymi glikany, jest unieruchomionych na powierzchni, takiej jak szkiełko podstawowe. Ta technologia analizy glikologicznej oparta na interakcjach nie wymaga wcześniejszego uwalniania glikanów z białek rdzeniowych, co upraszcza proces dla naukowców początkujących w glikotechnologii. Pomimo jego powszechnego stosowania, do zastosowań przemysłowych, takich jak bioprodukcja, potrzebny był zautomatyzowany system zdolny do szybkiego i łatwego monitorowania glikanów dla większej liczby celów analizy. Aby rozwiązać ten problem, wcześniej opisano zautomatyzowany system profilowania glikanów oparty na unikalnej koncepcji zwanej "matrycą koralików w pojedynczej końcówce" (BIST), początkowo opracowany do genotypowania. Ten system upraszcza proces dzięki jednopunktowemu automatycznemu instrumentowi o wysokiej przepustowości4. Korzystając z końcówek, w których różne kulki utrwalone lektyną są ułożone równolegle4,5, ustalono metodę analizy struktur glikanów zmodyfikowanych w glikoproteinach i nazwano ją GlycoBIST (zwaną dalej "automatycznym systemem profilowania glikanów") (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Lektyny można utrwalić na 1,000 koralików i suszyć, aby utrzymać aktywność przez rok, zarówno przed, jak i po zapakowaniu w końcówkę. Po umieszczeniu końcówek i wkładów zawierających odczynniki, takie jak przeciwciało antystreptawidynowe znakowane HRP (SA-HRP) w prototypowym przyrządzie pomiarowym (zautomatyzowanym urządzeniu do pomiaru reakcji, patrz Tabela materiałów), końcówka działa jako autopipeta. Skaner do wykrywania chemiluminescencji znajdujący się z tyłu instrumentu określa ilościowo sygnały z ośmiu końcówek jednocześnie. Dane ilościowe z tych ośmiu końcówek są kompaktowo i jednocześnie wyświetlane jako kody punktowe na ekranie dotykowym przyrządu w celu szybkiego potwierdzenia wyników pomiarów. Co więcej, wartość reprezentowana jako maksimum zmierzonego piku jest transportowana z instrumentu jako surowe dane i pozwala na tworzenie wykresów przez indywidualnych badaczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, dolny panel).
W tym artykule autorzy opisują ulepszoną metodę znakowania białek biotyną, skracającą czas przetwarzania do 30 minut. Białka docelowe są wcześniej biotynylowane i wykrywane przez SA-HRP (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Standardowa końcówka GlycoBIST (specjalistyczna końcówka do automatycznego profilowania glikanów) z 15 wybranymi lektynami została skonstruowana w celu uzyskania wszechstronnego profilowania glikanów glikoproteinowych w celu uzyskania kompleksowości analitycznej.

<table><tbody><tr><td>0,2 ml 8 probówek do PCR + płaska nakrętka</td><td>FastGene</td><td>FG-0028FC/SE</td><td>Do dozowania i przechowywania odczynników do znakowania biotyny</td></tr><tr><td>2,0 ml SC Micro Tube protein LB</td><td>SARSTEDT AG&Co. KG</td><td>72.694.600</td><td>Do ładowania próbek do LuBEA-VIII</td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne</td><td>SAS Institute Inc.</td>Jonizator antystatyczny <td>JMP 17</td><td></td></tr><tr><td>. 110 V</td><td>Plas-Labs</td><td>800-AS/SPI</td><td>Używaj podczas wkładania koralików do końcówki BIST.</td></tr><tr><td>Pęseta antystatyczna NK2A</td><td>RUBIS&nbsp;</td><td>9-5681-01</td><td>Używaj podczas wkładania koralików do końcówki BIST.</td></tr><tr><td>Zautomatyzowane urządzenie do pomiaru reakcji</td><td>Precision System Science Co., Ltd.</td><td>LuBEA</td><td>Wszystkie dane w tym badaniu uzyskano przy użyciu LuBEA-VIII. Podczas gdy LuBEA jest komercjalizowana, LuBEA-VIII jest obecnie w fazie rozwoju. Strona internetowa, na której można znaleźć szczegółowe informacje o produktach LuBEA i LuBEA-VIII, znajduje się pod następującym adresem URL (https://www.pss.co.jp/english/technology/apit/bist02.html).</td></tr><tr><td>Biotyna-(AC5)2 Sulfo-Osu</td><td>Dojindo</td><td>341-06801</td><td>Jako odczynnik do biotynilacji</td></tr><tr><td>BIST dystans koralik - V-11</td><td>Precision System Science Co., Ltd.</td><td>F4938000</td><td>Średnica: 1 mm</td></tr><tr><td>końcówka i osłona BIST</td><td>Precision System Science Co., Ltd.</td><td>F4930-000</td><td>Wypełnij tę pustą końcówkę koralikami.</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Wako</td><td>039-00475</td><td>Do przygotowania roztworów buforowych</td></tr><tr><td>Może uzyskać roztwór sygnałowy 2</td><td>TOYOBO</td><td>NKB-301</td><td>Ten odczynnik blokujący jest dobry dla tej metody</td></tr><tr><td>Stołowe koncentratory próżniowe CentriVap</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td>Do suszenia odczynnika do biotynilacji. Możliwa jest zamiana zapewniona przez inne firmy.</td></tr><tr><td>Czystość Zachodnie Podłoże ECL&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Do pomiaru próbek metodą LuVEA VIII</td></tr><tr><td>Wymrażarka CentriVap seria</td><td>Labconco</td><td>7460040</td><td>Do suszenia odczynnika do biotynilacji. Możliwa jest zamiana zapewniona przez inne firmy.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Wako</td><td>077-00735</td><td>Do sporządzania roztworów buforowych</td></tr><tr><td>Chlorek manganu(II) Czterowodny</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>Do sporządzania roztworów buforowych</td></tr><tr><td>Mili-Q odniesienie</td><td>MERCK</td><td>ZIQ7000T0C</td><td>Jako woda dejonizazowa do rozcieńczania odczynników i</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td>Do sporządzania roztworów buforowych</td></tr><tr><td>Peroksydaza Streptavidin</td><td>Jackson</td><td>016-030-084</td><td>To przeciwciało jest dobre do analizy GlycoBIST. Jest to przydatne do wykrywania western blotting, chociaż inne firmy mogą zapewnić zamienniki.</td></tr><tr><td>Koralik sondy</td><td>Precyzyjny system Science Co., Ltd.</td><td>FP4936000</td><td>Do przygotowania koralików utrwalonych lektyną. Szczegółowe informacje można znaleźć w Shimazaki, H. et al., Current Protocols in Protein Science, 2020 w sekcji referencyjnej.</td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td>Stosować podczas przygotowywania próbek, takich jak biotynylacja.</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy (do środka osuszającego)</td><td>Kanto chemical</td><td>37039-02</td><td>Stosować podczas przechowywania końcówki GlycoBIST i wysuszonego odczynnika do biotynylacji.</td></tr><tr><td>Arkusz usuwania elektryczności statycznej M</td><td>TRUSCO NAKAYAMA</td><td>SD5050</td><td>Używaj podczas wkładania koralików do końcówki BIST.</td></tr><tr><td>SV Cartridge II</td><td>Daido Chemical Industry</td><td>ED041</td><td>Do pomiaru próbek za pomocą LuVEA VIII</td></tr><tr><td>Stołowa mikrowirówka-CAPSULEFUGE</td><td>TOMY</td><td>PMC-060</td><td>Do odkręcania mieszaniny w każdym procesie</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td>Do przygotowania roztworów buforowych</td></tr></tbody></table>

szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

Rapid Glyco-Qualitative Assessment of Recombinant Proteins Using a Fully Automated System

Glikozylacja białek, krytyczna modyfikacja potranslacyjna, wpływa na stabilność, skuteczność i immunogenność rekombinowanych białek, w tym biofarmaceutyków. Struktury glikanów wykazują znaczną niejednorodność, różniącą się w zależności od typu komórek produkcyjnych, warunków hodowli i metod oczyszczania. W związku z tym monitorowanie i ocena struktur glikanów rekombinowanych białek ma zasadnicze znaczenie, szczególnie w produkcji biofarmaceutycznej. Mikromatryca lektynowa, technika uzupełniająca spektrometrię mas, charakteryzuje się wysoką czułością i łatwością użycia. Jednak zazwyczaj potrzeba więcej niż jednego dnia, aby przynieść wyniki. Aby dostosować go do badań niezwiązanych z glikonauką lub opracowywaniem procesów leczniczych, potrzebna jest zautomatyzowana, wysokowydajna alternatywa. W związku z tym opracowano pierwszy na świecie w pełni zautomatyzowany system profilowania glikanów na bazie lektyn, wykorzystujący koncepcję technologii "matrycy kulek w pojedynczej końcówce (BIST)". System ten pozwala na przygotowanie i przechowywanie kulek unieruchomionych lektyną w jednostkach po 1 000 sztuk, z możliwością dostosowania równoległych zamówień insertowych do różnych celów. W artykule przedstawiono praktyczny protokół badań z udziałem "glikokwalifikowanych" białek rekombinowanych. Po przetestowaniu ich reaktywności w stosunku do 12 koniugatów poliakrylamidowo-glikanowych wybrano 15 lektyn, aby zwiększyć wszechstronność systemu. Ponadto proces etykietowania próbek został zoptymalizowany poprzez przejście z Cy3 na biotynę, co skróciło całkowity czas przetwarzania o 30 minut. W celu natychmiastowej kwalifikacji danych, sygnały wiążące lektyny są wyświetlane jako kod kropkowy na górnym monitorze. Niezawodność systemu została potwierdzona poprzez codzienne testy odtwarzalności, testy powtarzalności i testy długoterminowego przechowywania, ze współczynnikiem zmienności <10%. Ten przyjazny dla użytkownika i szybki analizator glikoanalizatora ma potencjalne zastosowania w monitorowaniu jakości endogennych glikoprotein w celu oceny i walidacji biomarkerów. Metoda ta ułatwia analizę osobom, które dopiero zaczynają przygodę z glikonauką, poszerzając tym samym jej praktyczną użyteczność.

System do automatycznej i szybkiej analizy glikanów na białkach został wcześniej opracowany. W artykule przedstawiono protokół "analizy glikojakościowej", zoptymalizowany dla szerokiego spektrum użytkowników, takich jak osoby zajmujące się analizą struktur glikanów w biofarmaceutykach i innych materiałach glikokoniugatowych.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

Protein glycosylation, a critical post-translational modification, influences the stability, efficacy, and immunogenicity of recombinant proteins, ...

Naszym zakresem jest glikozylacja białek. Struktury glikanów biorą udział w zmianach stabilności i funkcji biofarmaceutyków i są zmieniane wraz z gatunkami komórek gospodarza i warunkami hodowli. W niektórych warunkach produkcji glikan alergizujący byłby do pewnego stopnia zanieczyszczony.Naszym celem jest stworzenie przyjaznych dla użytkownika narzędzi do takiej kwalifikacji glikologicznej. Głównie LC i spektrometria mas. Ale do prostych testów stosuje się technologie oparte na lektynie.Naukowcy mają do dyspozycji wiele rodzajów lektyn o różnej specyfice, a każda lektyna wiąże się z określonymi glikanami. Tak więc możemy oszacować struktury glikanów za pomocą wielozastosowania blottingu lektyny po lektynie, ELISA lektyny i mikromacierzy lektynowej. Glikozylacja zachodzi w funkcjonalnych białkach w naszym organizmie.Struktura glikanów zmienia się wraz z chorobami. Obecnie jako biomarkery diagnostyczne zastosowaliśmy kilka glikozylacji specyficznych dla choroby, takich jak CA 19-9 i AFP-L3. Warto zauważyć, że odkryto nowych kandydatów na biomarkery przy użyciu technologii opartych na lektynie.Do ich walidacji potrzebny jest system kwalifikacji glikologicznej. Kwalifikacja glikologiczna to ciężka praca. Musimy przeanalizować setki lub tysiące liczb w krótkim czasie.Nie ma jednak systemu, który zaspokoiłby te potrzeby. Nasza metoda analityczna jako jedyna posiada w pełni automatyczny proces pomiaru. Drastycznie zmniejsza to siłę roboczą i umożliwia nam przeprowadzanie skutecznej walidacji.Nasze prace mają na celu dalsze ulepszanie naszego szybkiego przyrządu, zwłaszcza do pomiarów ilościowych. Następnie spodziewamy się zrealizować unikalne narzędzie diagnostyczne z panelem biomarkerów glikologicznych mierzonych przez nasz system multilektyny. W związku z tym skupiamy się na odkryciu glikobiomarkerów specyficznych dla choroby.

rapid-glyco-qualitative-assessment-recombinant-proteins-using-fully

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Immunoglobulina G (IgG) N-glikan jest scharakteryzowany za pomocą hydrofilowej chromatografii oddziaływań UPLC. Ponadto struktura N-glikanu IgG jest wyraźnie oddzielona. Przedstawiono tutaj wprowadzenie do tej metody eksperymentalnej, tak aby mogła być szeroko stosowana w warunkach badawczych.

Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Protokół ten opisuje produkcję rekombinowanej ludzkiej rybonukleazy SLFN14 oraz jej stechiometryczną analizę za pomocą fotometrii masowej.<br...

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Poznaj automatyczną analizę glikanów na białkach rekombinowanych przy użyciu technologii lektynowych. Ta metoda wspiera odkrywanie biomarkerów chorobowych w biotechnologii.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

Przeglądaj więcej filmów