Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Celem naszych badań jest zrozumienie wzorców migracji limfocytów T w ściśle określonych warunkach środowiskowych, aby umożliwić świadome eksperymenty in vitro i rozszyfrować interakcje molekularne wpływające na migrację. Obrazowanie na żywo, takie jak mikroskopia wielofotonowa przyżyciowe, służy do zrozumienia kinetyki komórek odpornościowych in vivo. Jednak urządzenia mikroprzepływowe są powszechnym narzędziem in vitro, które zapewnia precyzyjną kontrolę nad mikrośrodowiskiem, na którą nie można sobie pozwolić w przypadku żywej próbki.

Nasz protokół pozwala nam analizować skomplikowane szlaki sygnałowe i zapewnia lepsze zrozumienie ukierunkowanych eksperymentów in vitro w celu dalszego zajęcia się biologicznymi rolami poszczególnych sygnałów w sposób specyficzny dla typu komórki. Nasza metoda jest prosta, powtarzalna i łatwo dostępna w laboratoriach badawczych wyposażonych w mikroskop jasnego pola z dołączoną kamerą cyfrową. W związku z tym nasze podejście zapewnia wiarygodny zestaw metod do badania dynamicznych zdarzeń migracji komórek.

Nasze laboratorium skupi się na badaniu migracji komórek odpornościowych, w tym limfocytów T i neutrofili, w różnych warunkach chorobowych, takich jak nowotwory i infekcje, rozumiejąc w ten sposób mechanizmy, które są ważne dla regulacji migracji komórek odpornościowych. Pomoże to w opracowaniu metod terapeutycznych, które pomogą w leczeniu i zapobieganiu chorobom. Na początek umieść uśpioną mysz na wznak na desce sekcyjnej.

Za pomocą kołków T do preparowania przymocuj podkładki stóp myszy do deski. Za pomocą nożyczek chirurgicznych należy naciąć dolną część brzucha i przeciąć aż do podbródka. Po oddzieleniu skóry od wyściółki otrzewnej rozciągnij ją prostopadle od tułowia i przypnij.

Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń węzły chłonne szyjne, osiowe, ramienne i pachwinowe, a także śledzionę i umieść je w sitku do komórek o średnicy 70 mikrometrów zawierającym 2 mililitry pożywki R9. Aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki, przekręć narzędzie do rozbijania tkanek o pół obrotu zgodnie z ruchem wskazówek zegara i kilkakrotnie przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Umyj sitko 5 mililitrami pożywki.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj ją. Po dekantacji supernatantu dodać do probówki 500 mikrolitrów buforu lizującego w celu usunięcia czerwonych krwinek. Po 1 minucie wymieszaj komórki z 9,5 mililitra pożywki R9, odwiruj probówkę i dokładnie zdekantuj supernatant.

Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki o ujemnej selekcji zawierającej przeciwciała anty-MHC II i anty-CD4 i umieścić probówkę w kołysce na 30 minut. Po otoczkowaniu komórek w stężeniu 270 G przez 5 minut, zdekantować supernatant. Jednocześnie w 15-mililitrowej stożkowej tubie umyj 200 mikrolitrów koralików immunoglobuliny G owiec przeciw szczurom w 7 mililitrach podłoża.

Umieść rurkę na magnesie i usuń medium. Po dwukrotnym umyciu ponownie zawieś koraliki w 7 mililitrach podłoża R9. Następnie wymieszaj 7 mililitrów zawiesiny kulek z granulką komórkową i inkubuj rurkę na kołysce.

Aby usunąć komórki związane z kulkami przeciwciał, umieść stożkową rurkę bezpośrednio na magnesie na 3 minuty. Zassaj zawiesinę komórek do nowej 15-mililitrowej rurki, utrzymując rurkę na magnesie. Ułożyć wzbogacone komórki CD8-dodatnie i przemyć trzykrotnie w pożywce.

Na początek wyizoluj żywe limfocyty z wtórnych tkanek limfatycznych myszy i zwizualizuj komórki pod mikroskopem świetlnym z obiektywem 4x lub 10x. Za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra rozbij aktywowane komórki i przenieś je do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Ułóż komórki w osadach i dodaj pożywkę do separacji limfocytów, aby oddzielić żywe komórki od martwych.

W przypadku mikroskopii poklatkowej płytka 1 razy 10 do 5. CD8-dodatnich limfocytów T w pożywce w komorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wykonaniu blokowania integryn uzyskuj obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne co 10-60 sekund przez 10-60 minut. W obrazowaniu poklatkowym aktywowane limfocyty T CD8-dodatnie miały zwiększoną średnią prędkość, przemieszczenie i wskaźnik meandrowania w porównaniu z komórkami niedoświadczonymi.

Na początek wykonaj obrazowanie poklatkowe żywych limfocytów T, wyizolowanych z wtórnych tkanek limfatycznych neuronów. Aby przeprowadzić analizę migracji limfocytów T, otwórz oprogramowanie Velocity Software i utwórz nową sekwencję obrazów. Wybierz i przenieś wszystkie filmy z mikroskopii poklatkowej do niebieskiego obszaru w Velocity.

Korzystając z narzędzia do poprawy kontrastu, zmodyfikuj jasność i kontrast. Następnie dostosuj rozmiary obrazu do 0,325 mikrometra dla powiększenia 20x i 0,65 mikrometra dla powiększenia 10x. Po skonfigurowaniu sekwencji do ustawiania punktów czasowych należy przejść do zakładki Pomiar i odznaczyć wszystkie punkty czasowe.

Następnie znajdź obiekty za pomocą intensywności i przesuń pasek na prawo od szczytu. Aby uniknąć resztek komórek, należy wykluczyć wszystkie komórki mniejsze niż 10 mikrometrów i o średnicy większej niż 100 mikrometrów. Zaznacz opcję Ignoruj obiekty statyczne, a następnie opcję Automatycznie dołączaj uszkodzone ścieżki.

Aby zapisać nowy protokół, przejdź do Pomiary, kliknij Zapisz protokół, a następnie Nazwij nowy protokół. Na karcie Pomiar kliknij Zmierz wszystkie punkty czasowe i posortuj utwory według przedziału czasu od najwyższego do najniższego. Po zarejestrowaniu numerów identyfikacyjnych ścieżek dla komórek z dobrymi ścieżkami, wyeksportuj plik jako tekst oddzielony przecinkami i prześlij dane do żądanego oprogramowania analitycznego.

Aby wykonać ręczne śledzenie, otwórz ImageJ, przejdź do Wtyczki i wybierz Śledzenie i śledzenie ręczne. Ustaw interwały czasowe, kalibrację x/y, rozmiar piksela i kalibrację z. Następnie kliknij Dodaj ścieżkę, aby rozpocząć śledzenie poszczególnych komórek.

Zaznacz jedną komórkę w pierwszym punkcie czasu i kontynuuj ją przez wszystkie punkty czasowe. Na koniec kliknij Zakończ ścieżkę. Wspomagane programowo śledzenie komórek charakteryzowało zachowania migracyjne aktywowanych pojedynczych limfocytów T, oznaczone różnokolorowymi liniami.