Name: Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Poznaj metodę CRISPRmass do szybkiego montażu bibliotek plazmidów UAS-cDNA/ORF w Drosophila. Ta technika CRISPR znacząco skraca czas konstrukcji bibliotek genomowych i usprawnia badania funkcjonalnej genomiki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była sponsorowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32071135 i 31471010), Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych w Szanghaju (19ZR1446400).

1. Określenie optymalnego miejsca cięcia Cas9/sgRNA przed cDNA/ORF
<ol>
	<li>Otrzymywanie plazmidów cDNA lub ORF z identycznym szkieletem wektorowym
	<ol>
		<li>Kup klony cDNA/ORF, które są dostępne w zasobach publicznych, takich jak Drosophila genome resource center (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, kolekcja genów ssaków myszy (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) oraz ludzka biblioteka ekspresji lentiwirusowej CCSB12. W tym protokole jako przykład bierzemy klony cDNA/ORF oparte na wektorze pOT2, które są dostępne w kolekcji DGRC Gold.</li>
		<li>Wyodrębnij plazmidowe DNA za pomocą zestawu do mini-przygotowania plazmidu. Zmierz stężenie plazmidów za pomocą spektrofotometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie sgRNA
	<ol>
		<li>Odwiedź stronę internetową CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Kliknij przycisk Wklej cel, a następnie wprowadź interesującą Cię sekwencję DNA. Sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania to region o długości 20-100 pz zlokalizowany w szkielecie wektora pOT2 przed końcem cDNA / ORF 5'.</li>
		<li>Wybierz gatunek Drosophila melanogaster. Kliknij przycisk Znajdź witryny docelowe. Wybierz kandydatów sgRNA o przewidywanej skuteczności wyższej niż 80%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymywanie sgRNA
	<ol>
		<li>Zamów oligonukleotydy oczyszczone przez PAGE, starter do przodu (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA 
		GAAATAG-3′), gdzie (N)20 jest sekwencją docelową sgRNA, a rusztowanie sgRNA odwrócony starter sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′). 
		UWAGA: Zaleca się stosowanie wysokiej jakości oligonukleotydów oczyszczonych przez PAGE.</li>
		<li>Przygotuj matrycę DNA metodą PCR do transkrypcji in vitro (IVT) sgRNA. Ustaw reakcję PCR 100 μl w następujący sposób: 5 μl matrycy pX330 (plazmid Addgene 42230, prezent od Feng Zhang; 0,1 ng/μL), 5 μl startera (10 μM), 5 μL sgRNA-REV (10 μM), 50 μL 2x High fidelity PCR master mix i 35 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC) w probówce PCR.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR w następujących warunkach termocyklingu: 1 cykl w temperaturze 98 °C przez 30 s; 5 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 51 °C przez 10 s, 72 °C przez 5 s; 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 72 °C przez 15 s; 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 2 s. Reakcje inkubować w termocyklerze.</li>
		<li>Oddzielić produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%. Fragment DNA o długości ~120 pz powinien być widoczny na żelu w promieniowaniu UV. Oczyść fragment DNA ~120-pz za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Oczyszczony fragment DNA służy jako matryca dla IVT sgRNA.</li>
		<li>Ustaw reakcję IVT o pojemności 5 μl w następujący sposób: 165 ng oczyszczonego fragmentu żelowego DNA o wartości ~120 pz, 1,65 μl mieszaniny buforowej NTP, 0,33 μl mieszaniny polimerazy RNA T7 i woda uzdatniona DEPC. Reakcje inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu do transkrypcji in vitro.</li>
		<li>Dodać 45 μl wody uzdatnionej DEPC do produktu reakcji IVT. Traktuj produkty reakcji IVT jako RNA i użyj wody uzdatnionej DEPC jako ślepej próby. Zmierz stężenie sgRNA za pomocą spektrofotometru. Stężenie rozcieńczonego sgRNA wynosi około 870 ng/μL.</li>
		<li>Rozcieńczyć produkt reakcji IVT do 20 ng/μl wodą uzdatnioną DEPC. Podwielokrotność i przechowywanie sgRNA bezpośrednio w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Po reakcji IVT usunięcie matrycy DNA przez trawienie DNazy nie jest konieczne do pomiaru dokładnego stężenia sgRNA, ponieważ ilość matrycy DNA jest mniejsza niż 0,4% ilości sgRNA, a matryca DNA nie wpływa na późniejszą reakcję CRISPRmass. Dlatego oczyszczanie sgRNA nie jest konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena sgRNA
	<ol>
		<li>Trawić plazmid cDNA/ORF zawierający szkielet wektora pOT2 za pomocą enzymu restrykcyjnego. Oddziel powstałe fragmenty DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%. Oczyść substrat DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. 
		UWAGA: Powstały fragment DNA zawierający sekwencje celujące w sgRNA szkieletu wektora pOT2 służy jako substrat DNA Cas9 / sgRNA. Miejsca rozszczepienia Cas9 / sgRNA są asymetrycznie rozmieszczone w substracie DNA, a zatem rozszczepienie substratu DNA przez Cas9 / sgRNA daje dwa fragmenty DNA o różnych rozmiarach, co ułatwia ich odróżnienie od nierozszczepionego substratu DNA w reakcji trawienia.</li>
		<li>Ustaw reakcję rozszczepienia 5 μl Cas9 w następujący sposób: 0,2 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μl 20 ng / μL sgRNA, 0,015 pmol substratu DNA, 0,5 μl 10x buforu Cas9 i woda uzdatniona DEPC. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Oddzielić produkty cięcia za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%. Załadować nienaruszony substrat DNA jako kontrolę ujemną dla strawionego substratu DNA. 
		UWAGA: W tym przypadku nienaruszony substrat DNA odnosi się do substratu DNA, który nie jest poddawany reakcjom trawienia przez Cas9 / sgRNA. Rozszczepienie substratu DNA przez Cas9/sgRNA daje dwa fragmenty DNA o różnych rozmiarach, co ułatwia ich odróżnienie od rozszczepionego substratu DNA w reakcji trawienia.</li>
		<li>Analizuj wzorce rozszczepienia za pomocą cyfrowego systemu obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Wybierz najbardziej wydajne sgRNA do kolejnych eksperymentów CRISPRmass. Rysunek 2 pokazuje, że wszystkie cztery sgRNA wykazują wysoką wydajność cięcia i mogą być używane do CRISPRmass. Wybierz podkreślone sgRNA do kolejnych eksperymentów. 
		UWAGA: Im mniej jest rozdrażnionego substratu DNA, tym bardziej wydajny jest sgRNA do trawienia Cas9 / sgRNA substratu DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Budowa modułu UAS
UWAGA: moduł UAS składa się z rdzenia UAS i około 20-40 pz sekwencji końcowych 5′ i 3′ nakładających się na końce 5′ i 3′ miejsca rozszczepienia kręgosłupa, odpowiednio (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Sekwencje końcowe 5′ i 3′ modułu UAS są określane przez miejsce cięcia szkieletu wektora pOT2.
<ol>
	<li>Sklonuj moduł UAS specyficzny dla wektora pOT2 do miejsca EcoRI wektora pCR8GW, w wyniku czego powstanie plazmid pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (plik uzupełniający 1). Uwolnić specyficzny dla wektora moduł UAS pOT2 przez mineralizację plazmidu pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 z EcoRI w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Oddzielić produkty cięcia za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,7%. Oczyść moduł 6178-bp UAS za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Rozcieńczyć moduł UAS do 23 ng/μl do kolejnych eksperymentów. Ten fragment 6178-bp służy jako moduł UAS do budowy plazmidów UAS-cDNA/ORF z klonów cDNA/ORF opartych na wektorze pOT2</li>.
</ol>
3. Wielkoskalowa budowa plazmidów UAS-cDNA/ORF przez CRISPRmass
UWAGA: CRISPRmass jest standaryzowany jako masowo równoległe dwuetapowe reakcje w probówkach przed transformacją E. coli (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Reakcja w probówce, krok 1
	<ol>
		<li>Rozszczepić identyczne szkielety wektorowe plazmidów cDNA / ORF przez Cas9 / sgRNA. Ułóż probówki o pojemności 0,2 ml w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie i ostrożnie oznacz probówki. Przygotuj mieszankę wzorcową w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Do pojedynczej reakcji dodać 0,16 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,4 μl 20 ng/μL sgRNA, 0,24 μl 10x buforu Cas9, 1,2 μl wody uzdatnionej DEPC. W przypadku reakcji N dodać (N+1) x 0,16 μL 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 μL 20 ng/μL sgRNA, (N+1) x 0,24 μL 10x buforu Cas9, (N+1) x 1,2 μL wody uzdatnionej DEPC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wiruj, dobrze wymieszaj i odwiruj. Podaniec 2 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Dodaj 0,4 μl z 0,019 μM plazmidu cDNA/ORF do każdej probówki. Inkubować reakcje rozszczepienia w temperaturze 37 °C przez 1 h. 
		UWAGA: Rozcieńczyć każdy plazmid do 0,019 μM wodą uzdatnioną DEPC. Jeśli stężenie plazmidu jest mniejsze niż 0,019 μM, należy dodać plazmidowe DNA bezpośrednio do reakcji rozszczepienia. Używaj probówek wolnych od RNaz i wody uzdatnionej DEPC. Wykonanie tych kroków na dużą skalę zajmie kilka godzin. O ile nie określono inaczej, odczynniki i reakcje należy przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja w probówce, krok 2
	<ol>
		<li>Wstawić specyficzny dla wektora moduł UAS z kroku 2 do linearyzowanych plazmidów cDNA/ORF Cas9 za pomocą jednoetapowego zestawu reakcji. Ustawić jednoetapową reakcję o objętości 1,4 μl dla każdej próbki. Ułóż probówki o pojemności 0,2 ml w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie i ostrożnie oznacz probówki.
		<ol>
			<li>Przygotuj mieszankę wzorcową w następujący sposób. W przypadku pojedynczej reakcji dodać 0,07 μl modułu UAS 0,006 μM i 0,7 μl jednoetapowej mieszanki wzorcowej zespołu reakcji. W przypadku reakcji N dodać (N+1) x 0,07 μl 0,006 μM modułu UAS i (N+1) x 0,7 μl jednoetapowego zestawu reakcyjnego mieszanki wzorcowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wiruj, dobrze wymieszaj i odwiruj. Porcję 0,77 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Dodaj 0,7 μl plazmidu cDNA/ORF zlinearyzowanego Cas9 do każdej probówki. Reakcje inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 h. 
		UWAGA: Oczyszczanie produktów reakcji montażu jednoetapowego nie jest konieczne. Wykonanie tych kroków na dużą skalę zajmuje kilka godzin. O ile nie określono inaczej, odczynniki i reakcje należy przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć jednoetapowe produkty reakcji montażu w E. coli na dużą skalę.
	<ol>
		<li>Schłodź wstępnie końcówki 10 μl w temperaturze 4 °C. Schłodź wstępnie probówki o pojemności 1,5 ml w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie.</li>
		<li>Rozmrażać kompetentne komórki E. coli na lodzie przez 5 minut. Podwielokrotność 10 μl kompetentnych komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Stosować dostępne w handlu kompetentne komórki E. coli o wydajności transformacji co najmniej 1 x 108 CFU/μg DNA pUC19.</li>
		<li>Dodać 1 μl produktu reakcji jednoetapowego składania do 10 μl kompetentnych komórek, delikatnie zamieszać do wymieszania i umieścić na lodzie na 30 minut.</li>
		<li>Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 1 minutę, a następnie natychmiast schładzać na lodzie przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 100 μl pożywki SOC (podgrzanej do 37 °C) do każdej probówki w temperaturze pokojowej i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem (250 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Podgrzać do temperatury 37 °C płytki LB zawierające antybiotyk odpowiadający genowi oporności na antybiotyki modułu UAS. Rozsiać komórki na płytkach i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. 
		UWAGA: Wykonanie tych kroków na dużą skalę zajmuje kilka godzin. O ile nie określono inaczej, odczynniki i reakcje należy przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź plazmidy UAS-cDNA/ORF skonstruowane za pomocą CRISPRmass
	<ol>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w 4,5 ml płynnej pożywki LB uzupełnionej odpowiednim doborem antybiotyków odpowiadających genowi oporności na antybiotyki modułu UAS. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min.</li>
		<li>Wyodrębnij plazmidowe DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu. Ustaw reakcję trawienia restrykcyjnego o pojemności 20 μl w następujący sposób: 300-500 ng/μl plazmidu, odpowiednie enzymy restrykcyjne, bufor trawienia restrykcyjnego i ultraczysta woda. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Oddziel fragmenty DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8% i przeanalizuj za pomocą cyfrowego systemu obrazowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

A High-Throughput UAS-cDNA/ORF Plasmid Library Construction Using CRISPRmass

<ol><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li>
<li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function%3A+insights+from+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86 (4), 521-529 (1996).</li>
<li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Bischof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+platform+for+creating+a+comprehensive+UAS-ORFeome+library+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila.</a> Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+functional+approach+to+uncover+human+genes+and+pathways+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila.</a> Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+complementary+DNA+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).</li>
<li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+gene+collection%3A+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%25+of+D.+melanogaster+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznymi etapami CRISPRmass są projektowanie sgRNA i ocena sgRNA. Wybór wysoce wydajnych sgRNA dla Cas9 jest kluczem do sukcesu CRISPRmass. Jeśli po przekształceniu E. coli z jednoetapowymi produktami montażu reakcji obserwuje się bardzo mało kolonii lub nie obserwuje się ich wcale na większości płytek LB zawierających antybiotyk, należy sprawdzić trawienie plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Jeśli plazmidy nie są dobrze trawione, sprawdź aktywność Cas9, degradację sgRNA i jakość plazmidu; jeśli plazmidy są dobrze trawione, sprawdź odczynniki do jednoetapowego montażu reakcji i upewnij się, że wydajność transformacji kompetentnych komórek wynosi co najmniej 1 x 108 jtk/μg DNA pUC19. Warto zauważyć, że zastosowanie aluminiowego bloku chłodzącego może ułatwić transformację bakteryjną na dużą skalę.
Ograniczenia CRISPRmass wynikają z manipulacji i włączania sekwencji szkieletu wektora, co ogranicza możliwość znakowania cDNA i ORF na końcu 5' lub 3'.
W przeciwieństwie do wszystkich innych istniejących metod 7,8, CRISPRmass manipuluje i włącza wektorowe sekwencje szkieletowe9. Tak więc, po zaprojektowaniu i przygotowaniu modułów UAS, CRISPRmass nie potrzebuje zindywidualizowanego projektowania ani manipulacji dla każdego pojedynczego plazmidu, ale masowo równoległych dwuetapowych reakcji w probówkach przed transformacją bakteryjną, eliminując PCR i związane z nim manipulacje. Co więcej, zarówno transkrybowane in vitro sgRNA, jak i jednoetapowe produkty montażu reakcji nie muszą być oczyszczane do kolejnych eksperymentów. W porównaniu z technologią klonowania Gateway, CRISPRmass jest bardziej odpowiedni do generowania konstruktów UAS-cDNA/ORF, szczególnie z długich lub bogatych w GC cDNA/ORF, ponieważ CRISPRmass nie amplifikuje PCR cDNA ani samych ORF9.
CRISPRmass może być wykorzystany do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF, a także do edycji różnych bibliotek plazmidów obejmujących cały genom. CRISPRmass można zastosować do budowy biblioteki plazmidów ekspresyjnych poprzez wstawienie promotora CMV do wspólnych sekwencji wektorowych sąsiadujących z końcem 5' cDNA lub ORF. CRISPRmass daje nadzieję na przyspieszenie rozwoju genomiki funkcjonalnej.

Bezstronne genetyczne badania przesiewowe całego genomu to skuteczne podejście do identyfikacji genów zaangażowanych w dany proces biologiczny i wyjaśnienia jego mechanizmu. Dlatego jest szeroko stosowany w różnych dziedzinach badań biologicznych. Około 60% genów Drosophila jest konserwatywnych u ludzi1,2, a ~75% genów chorób u ludzi ma homologi w Drosophila3. Badania genetyczne dzielą się głównie na dwa typy: utratę funkcji (LOF) i wzmocnienie funkcji (GOF). Badania genetyczne LOF u Drosophila odegrały kluczową rolę w wyjaśnieniu mechanizmów, które rządzą prawie każdym aspektem biologii. Jednak większość genów Drosophila nie ma oczywistych fenotypów LOF4, dlatego badania przesiewowe GOF są ważną metodą badania funkcji tych genów4,5.
Binarny system GAL4/UAS jest powszechnie używany do ekspresji genów specyficznych dla tkanek w Drosophila6. W tym systemie tkanka specyficznie wyraża aktywator transkrypcji drożdży GAL4, który wiąże się z elementem reagującym na GAL4 (UAS), a tym samym aktywuje transkrypcję dalszych składników genetycznych (np. cDNA i ORF)6. Aby przeprowadzić badania przesiewowe GOF całego genomu u Drosophila, musimy skonstruować bibliotekę plazmidów UAS-cDNA/ORF obejmującą cały genom, a następnie transgeniczną bibliotekę UAS-cDNA/ORF u Drosophila.
Budowa biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF obejmujących cały genom za pomocą konwencjonalnych metod z publicznie dostępnych klonów cDNA/ORF jest czasochłonna i pracochłonna, ponieważ każdy gen wymaga indywidualnych projektów, w tym projektowania i syntezy starterów, reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz oczyszczania żelu, sekwencjonowania, trawienia restrykcyjnego i tak dalej7,8. Dlatego budowa takiej biblioteki plazmidów jest krokiem ograniczającym szybkość tworzenia transgenicznej biblioteki UAS-cDNA/ORF obejmującej cały genom u Drosophila. Niedawno udało nam się rozwiązać ten problem, opracowując nowatorską metodę, CRISPRmass-based modular assembly (CRISPRmass)9. Istotą CRISPRmass jest manipulowanie współdzielonymi sekwencjami wektorowymi biblioteki plazmidowej poprzez połączenie technologii edycji genów i technologii bezproblemowego klonowania.
Tutaj prezentujemy protokół dla CRISPRmass, który obejmuje masowo równoległe dwuetapowe reakcje w probówkach, po których następuje transformacja bakteryjna. CRISPRmass to prosta, szybka, wydajna i opłacalna metoda, która w zasadzie może być stosowana do wysokoprzepustowej budowy różnych bibliotek plazmidowych.
strategia CRISPRmass 
Procedura CRISPRmass rozpoczyna się od równoległych dwuetapowych reakcji w probówkach przed transformacją Escherichia coli (E. coli) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Krok 1 to rozszczepienie identycznych szkieletów wektorowych plazmidów cDNA/ORF przez Cas9/sgRNA. Idealne miejsce rozszczepienia przylega do końca 5′ cDNA / ORF. Produkty łupliwości nie muszą być oczyszczane. Krok 2 polega na wprowadzeniu specyficznego dla wektora modułu UAS do zlinearyzowanych plazmidów cDNA/ORF Cas9 / sgRNA przez montaż Gibsona (zwany dalej reakcją jednoetapową), w wyniku czego powstają plazmidy UAS-cDNA / ORF. Końcowe sekwencje 5′ i 3′ modułu UAS nakładają się na sekwencje linearyzowanych plazmidów cDNA/ORF, umożliwiając reakcję jednoetapową.
Produkty jednoetapowej reakcji są bezpośrednio poddawane przemianie E. coli. Teoretycznie tylko pożądane kolonie UAS-cDNA/ORF mogą rosnąć na płytkach Luria-Bertani (LB), które zawierają antybiotyki selekcyjne odpowiadające genowi oporności na antybiotyki modułu UAS. Moduł UAS składa się z rdzeniowego modułu UAS, genu oporności na antybiotyki odrębnego od plazmidów cDNA lub ORF oraz sekwencji końcowych 5′ i 3′. Podstawowy moduł UAS składa się z 10 kopii UAS, minimalnego promotora Hsp70, sekwencji attB do integracji genomowej za pośrednictwem phiC31 oraz mini-białego markera transformacji dla Drosophila7.

<table><tbody><tr><td>Aluminiowy blok chłodzący</td><td>Aikbbio</td><td>ADMK-0296</td><td>Do przeprowadzania przemian bakteryjnych</td></tr> Zestaw do ekstrakcji żelu <tr><td>DEPC-Treated Water</td><td>Invitrogen</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omega</td><td>D2500</td><td>Do oczyszczania DNA z żelu agarozowego</td></tr><tr><td>System obrazowania żelu</td><td>Tanon</td><td>2500B</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Szybki zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności</td><td>NEB</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit</td><td>Omega</td><td>D6943</td><td>Do izolacji plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>GenScript</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>Shanghai Zhichu&nbsp;</td>Wieloblokowy termocykler <td>serii ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>T</td><td>LongGene</td><td>T20</td><td>Do wykonywania PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Trans10 Chemicznie kompetentna komórka</td><td>TranGen BioTech</td><td>CD101</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr ultrafioletowy</td><td>Shimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td>Do pomiaru stężenia DNA lub RNA</td></tr></tbody></table>

modułowy montaż oparty na crispr do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów uas-cdna/orf

CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

Funkcjonalne badania przesiewowe genomiki oferują potężne podejście do badania funkcji genów i opierają się na budowie bibliotek plazmidowych obejmujących cały genom. Konwencjonalne podejścia do budowy biblioteki plazmidów są czasochłonne i pracochłonne. Dlatego niedawno opracowaliśmy prostą i wydajną metodę, modułowy montaż oparty na CRISPR (CRISPRmass), do wysokoprzepustowej budowy obejmującej cały genom biblioteki plazmidów aktywujących sekwencję komplementarną DNA/otwartą ramkę odczytu (UAS-cDNA/ORF). W tym miejscu przedstawiamy protokół dla CRISPRmass, biorąc za przykład konstrukcję biblioteki plazmidowej UAS-cDNA/ORF opartej na GAL4/UAS. Protokół obejmuje masowo równoległe dwuetapowe reakcje probówkowe, po których następuje transformacja bakteryjna. Pierwszym krokiem jest linearyzacja istniejącego komplementarnego DNA (cDNA) lub plazmidów cDNA lub biblioteki ORF z otwartą ramką odczytu (ORF) poprzez przecięcie wspólnych sekwencji wektorowych sąsiadujących z końcem 5' cDNA lub ORF za pomocą CRISPR/Cas9 wraz z pojedynczym przewodnikiem RNA (sgRNA), a drugim krokiem jest wstawienie modułu UAS do zlinearyzowanych plazmidów cDNA lub ORF za pomocą reakcji jednoetapowej. CRISPRmass pozwala na prostą, szybką, wydajną i ekonomiczną budowę różnych bibliotek plazmidowych. Biblioteka plazmidów UAS-cDNA/ORF może być wykorzystana do badań przesiewowych wzmocnienia funkcji w hodowanych komórkach oraz do budowy transgenicznej biblioteki UAS-cDNA/ORF obejmującej cały genom u Drosophila.

Zastosowaliśmy metodę CRISPRmass do wygenerowania genomowej biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF, wykorzystując 3402 klony cDNA/ORF z wektorem pOT2 z kolekcji DGRC Gold Collection. Przeprowadzono losową analizę tylko jednej kolonii dla każdego konstruktu UAS-cDNA/ORF, a późniejsza analiza restrykcyjna z użyciem PstI wykazała, że 98,6% konstruktów UAS-cDNA/ORF zostało utworzonych pomyślnie9. Uzasadnienie zastosowania PstI do analizy restrykcyjnej konstruktów UAS-cDNA/ORF z wektorem pOT2 jest następujące. W module UAS dla klonów cDNA/ORF opartych na wektorze pOT2 znajdują się dwa miejsca rozpoznawane przez PstI, a w szkielecie wektora pOT2 znajduje się jedno miejsce PstI. W związku z tym trawienie konstruktu UAS-cDNA/ORF opartego na wektorze pOT2 enzymem PstI daje fragment specyficzny dla modułu UAS o długości 408 bp oraz fragment specyficzny dla kompleksu moduł UAS-wektor o długości 5649 bp. Fragmenty PstI o długości 408 bp i 5649 bp wskazują na pomyślne utworzenie konstruktów UAS-cDNA/ORF dla klonów cDNA/ORF opartych na wektorze pOT2; reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 3.
<img alt="Schemat składania plazmidu CRISPR; targetowanie sgRNA, cięcie, składanie Gibsona, transformacja E. coli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66581/66581fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat blokowy konstrukcji biblioteki UAS-cDNA/ORF przy użyciu metody CRISPRmass. Potok CRISPRmass do konstrukcji biblioteki UAS-cDNA/ORF. (1) Pierwszym krokiem jest reakcja w probówce. Identyczne szkielety wektorowe plazmidów cDNA/ORF są cięte przez Cas9/sgRNA. Miejsce cięcia znajduje się w szkieletach wektorowych bezpośrednio powyżej końca 5′ cDNA/ORF. Produkty cięcia, bez oczyszczania, są bezpośrednio poddawane drugiemu etapowi reakcji w probówce. sgRNA użyte w reakcjach cięcia są przygotowane poprzez transkrypcję in vitro i mogą być stosowane bezpośrednio bez oczyszczania. Następnie 28-40 bp końca 5′ miejsca cięcia (żółte pole) definiuje się jako nakładkę końca 5′, a 28-40 bp końca 3′ miejsca cięcia (czerwone pole) definiuje się jako nakładkę końca 3′. Szkielet wektora zawiera gen oporności na antybiotyk A (zielone pole). (2) Drugim krokiem jest reakcja w probówce. Specyficzny dla wektora moduł UAS jest łączony z zlinearyzowanymi przez Cas9 plazmidami cDNA/ORF bezpośrednio powyżej końca 5′ cDNA/ORF za pomocą jednokrokowej reakcji składania, co prowadzi do powstania konstruktów UAS-cDNA/ORF. Produkty jednokrokowej reakcji składania są bezpośrednio poddawane transformacji E. coli. Transformanty są selekcjonowane na płytkach z agarem LB zawierającym antybiotyk B odpowiadający genowi oporności na antybiotyk B (brązowe pole) specyficznego dla wektora modułu UAS. Mogą rosnąć tylko pożądane kolonie UAS-cDNA/ORF. Moduł UAS składa się z 10 kopii UAS, minimalnego promotora Hsp70, sekwencji attB do genomicznej integracji za pośrednictwem phiC31, markera transformacji mini-white dla transgenezy Drosophila, selekcjonowalnego genu oporności na antybiotyk B do selekcji pozytywnej oraz nakładki końca 5′ i nakładki końca 3′ umożliwiających jednokrokową reakcję składania. Jednokrokowa reakcja składania eliminuje wszelkie potencjalne cięcia DNA poza celem wywołane przez CRISPR/Cas9. Rysunek zmodyfikowano na podstawie9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66581/66581fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy DNA; trawienie pOT2-CG4968/HindIII; drabinka par zasad; analiza separacji prążków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66581/66581fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ocena sgRNA celujących w specyficzne regiony szkieletu wektora pOT2 za pomocą analizy cięcia Cas9 in vitro. Podkreślone sgRNA zostały wybrane do CRISPRmass. M oznacza marker DNA. Rysunek zmodyfikowany na podstawie źródła9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66581/66581fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy DNA; rozdział prążków, marker par zasad; analiza żelu w celu identyfikacji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66581/66581fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza restrykcyjna 20 konstruktów UAS-cDNA/ORF wytworzonych za pomocą CRISPRmass. Konstrukty poddano analizie poprzez trawienie enzymem PstI. Zaobserwowano oczekiwane wzory restrykcyjne dla wszystkich konstruktów UAS-cDNA/ORF. M oznacza marker DNA. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie źródła9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66581/66581fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Konstrukcja plazmidu pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70. Moduł UAS specyficzny dla wektora pOT2 zawierający plazmid pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 został skonstruowany w oparciu o trzy plazmidy: pMartini-Amp, pBS-attB-UAS-Hsp70 oraz pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66581/Supplementary%20File%201_RE_v4.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Prezentujemy protokół do modułowego montażu opartego na CRISPR (CRISPRmass), metody wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF u Drosophila przy użyciu publicznie dostępnych zasobów cDNA/ORF. CRISPRmass może być stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidów.

Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. ...

Funkcjonalne badania przesiewowe genomu oferują skuteczne podejście do funkcji genów i opierają się na budowie bibliotek plazmidowych obejmujących cały genom. Konwencjonalne podejścia do budowy biblioteki plazmidów są czasochłonne i pracochłonne. Aby odpowiedzieć na to pytanie, opracowujemy prostą i skuteczną sprawę.Montaż modułowy oparty na CRISPR to masa CRISPR. Tak więc wykorzystanie wspólnych ważnych sekwencji cDNA lub OFSIB przez CRISPR CAS9, a następnie wstawienie modułów UAS przez montaż. Procedura budowy biblioteki plazmidów genomu Y.Ze względu na masę krystaliczną jest standaryzowany jako masywnie sparaliżowany, dwuetapowy test na reakcje przed transformacją bakteryjną. Masa krystaliczna pozwala na prostą, szybką, wydajną i efektywną konstrukcję różnych bibliotek plazmidowych. Może być również stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidowych w całym genomie i jest alternatywą dla technologii bramek w edycji bibliotek plazmidowych o wysokiej jakości, torując drogę do globalnych badań sieci biologicznych.Aby przeprowadzić równoległe, dwuetapowe reakcje probówkowe zespołu modułowego opartego na CRISPR lub masy CRISPR, przystąp do rozszczepienia identycznych szkieletów wektorowych plazmidów cDNA ORF za pomocą CAS9 sgRNA w pierwszym kroku reakcji w probówce. W tym celu ułóż odpowiednio oznakowane rurki o pojemności 0,2 mililitra w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie. Przygotuj mieszankę wzorcową dla liczby N reakcji, mieszając odpowiednie ilości CAS9, sgRNA, buforu CAS9 i wody uzdatnionej DEPC.Po dodaniu składników mieszanki wzorcowej należy ją wymieszać, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Następnie odwiruj mieszaninę i dozuj dwa mikrolitry mieszanki głównej do każdej probówki o pojemności 0,2 mililitra. Następnie dodaj 0,4 mikrolitra 0,019 mikromolowego cDNA, plazmidu ORF do każdej probówki.Inkubować reakcje rozszczepienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W następnej reakcji probówkowej, kroku drugim, przystąp do wstawiania specyficznego dla wektora modułu UAS do powstałych zlinearyzowanych plazmidów cDNA ORF CAS9. Aby ustawić jednoetapową reakcję o pojemności 1,4 mililitra dla każdej próbki, ułóż oznaczone probówki o pojemności 0,2 mililitra w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie.Przygotować mieszaninę wzorcową dla N liczby reakcji, mieszając odpowiednie ilości modułu UAS i jednoetapowej mieszanki wzorcowej zespołu reakcji. Dobrze wymieszaj mieszankę przed jej odwirowaniem, a następnie dozuj 0,77 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Dodaj 0,7 mikrolitra zlinearyzowanego plazmidu cDNA ORF CAS9 do podwielokrotności w każdej probówce i inkubuj reakcje w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę.Aby przekształcić produkty plazmidowe cDNA ORF UAS, uzyskane z modułowego montażu opartego na CRISPR w escherichia coli, należy wstępnie schłodzić końcówki o pojemności 10 mikrolitrów w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponadto wstępnie schłodź 1,5-mililitrowe rurki w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie. Po rozmrożeniu właściwych komórek E. coli na lodzie przez pięć minut, dodaj podwielokrotność 10 mikrolitrów komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Następnie dodaj jeden mikrolitr produktów plazmidowych UAS cDNA ORF do każdej probówki zawierającej 10 mikrolitrów kompetentnych komórek. Delikatnie zakręć rurką, aby wymieszać i umieść ją na lodzie na 30 minut. Inkubować probówki w temperaturze 42 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez jedną minutę.Następnie natychmiast schładzaj na lodzie przez dwie minuty. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki SOC podgrzanej do 37 stopni Celsjusza do każdej probówki w temperaturze pokojowej i inkubuj probówki w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez godzinę. Następnie należy ogrzać płytki LB, zawierające antybiotyk, odpowiadający genowi oporności na antybiotyki modułu UAS do 37 stopni Celsjusza.Rozłóż komórki na ciepłych płytkach i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

crispr-based-modular-assembly-for-high-throughput-construction-uas

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Białko związane z CRISPR, Cpf1, może być prowadzone przez specjalnie zaprojektowane RNA CRISPR (crRNA) do rozszczepiania dwuniciowego DNA w pożądanych miejscach, generując lepkie końce. Na podstawie tej cechy ustalono standard składania DNA (C-Brick), a protokół szczegółowo opisujący jego użycie opisano tutaj.

Protokoły standardowego montażu DNA C-Brick przy użyciu Cpf1

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Tutaj prezentujemy klonowanie gRNA (STAgR), metodę łatwego multipleksowania wektorów gRNA dla podejść CRISPR/Cas9. STAgR sprawia, że multipleksowanie gRNA jest proste, wydajne i konfigurowalne.

Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR)

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Opisujemy protokół wysokoprzepustowej metody klonowania, klonowania wahadłowego opartego na CRISPR (klonowanie wahadłowe CRISPR), który umożliwia transfer interesujących fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR.

Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

Poznaj metodę CRISPRmass do szybkiego montażu bibliotek plazmidów UAS-cDNA/ORF w Drosophila. Ta technika CRISPR znacząco skraca czas konstrukcji bibliotek genomowych i usprawnia badania funkcjonalnej genomiki.

Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

Przeglądaj więcej filmów