Modułowy montaż oparty na CRISPR do wysokoprzepustowej budowy biblioteki plazmidów UAS-cDNA/ORF

Funkcjonalne badania przesiewowe genomu oferują skuteczne podejście do funkcji genów i opierają się na budowie bibliotek plazmidowych obejmujących cały genom. Konwencjonalne podejścia do budowy biblioteki plazmidów są czasochłonne i pracochłonne. Aby odpowiedzieć na to pytanie, opracowujemy prostą i skuteczną sprawę.

Montaż modułowy oparty na CRISPR to masa CRISPR. Tak więc wykorzystanie wspólnych ważnych sekwencji cDNA lub OFSIB przez CRISPR CAS9, a następnie wstawienie modułów UAS przez montaż. Procedura budowy biblioteki plazmidów genomu Y.

Ze względu na masę krystaliczną jest standaryzowany jako masywnie sparaliżowany, dwuetapowy test na reakcje przed transformacją bakteryjną. Masa krystaliczna pozwala na prostą, szybką, wydajną i efektywną konstrukcję różnych bibliotek plazmidowych. Może być również stosowany do edycji różnych bibliotek plazmidowych w całym genomie i jest alternatywą dla technologii bramek w edycji bibliotek plazmidowych o wysokiej jakości, torując drogę do globalnych badań sieci biologicznych.

Aby przeprowadzić równoległe, dwuetapowe reakcje probówkowe zespołu modułowego opartego na CRISPR lub masy CRISPR, przystąp do rozszczepienia identycznych szkieletów wektorowych plazmidów cDNA ORF za pomocą CAS9 sgRNA w pierwszym kroku reakcji w probówce. W tym celu ułóż odpowiednio oznakowane rurki o pojemności 0,2 mililitra w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie. Przygotuj mieszankę wzorcową dla liczby N reakcji, mieszając odpowiednie ilości CAS9, sgRNA, buforu CAS9 i wody uzdatnionej DEPC.

Po dodaniu składników mieszanki wzorcowej należy ją wymieszać, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Następnie odwiruj mieszaninę i dozuj dwa mikrolitry mieszanki głównej do każdej probówki o pojemności 0,2 mililitra. Następnie dodaj 0,4 mikrolitra 0,019 mikromolowego cDNA, plazmidu ORF do każdej probówki.

Inkubować reakcje rozszczepienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W następnej reakcji probówkowej, kroku drugim, przystąp do wstawiania specyficznego dla wektora modułu UAS do powstałych zlinearyzowanych plazmidów cDNA ORF CAS9. Aby ustawić jednoetapową reakcję o pojemności 1,4 mililitra dla każdej próbki, ułóż oznaczone probówki o pojemności 0,2 mililitra w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie.

Przygotować mieszaninę wzorcową dla N liczby reakcji, mieszając odpowiednie ilości modułu UAS i jednoetapowej mieszanki wzorcowej zespołu reakcji. Dobrze wymieszaj mieszankę przed jej odwirowaniem, a następnie dozuj 0,77 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej probówki. Dodaj 0,7 mikrolitra zlinearyzowanego plazmidu cDNA ORF CAS9 do podwielokrotności w każdej probówce i inkubuj reakcje w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę.

Aby przekształcić produkty plazmidowe cDNA ORF UAS, uzyskane z modułowego montażu opartego na CRISPR w escherichia coli, należy wstępnie schłodzić końcówki o pojemności 10 mikrolitrów w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponadto wstępnie schłodź 1,5-mililitrowe rurki w aluminiowym bloku chłodzącym na lodzie. Po rozmrożeniu właściwych komórek E. coli na lodzie przez pięć minut, dodaj podwielokrotność 10 mikrolitrów komórek do każdej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie dodaj jeden mikrolitr produktów plazmidowych UAS cDNA ORF do każdej probówki zawierającej 10 mikrolitrów kompetentnych komórek. Delikatnie zakręć rurką, aby wymieszać i umieść ją na lodzie na 30 minut. Inkubować probówki w temperaturze 42 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez jedną minutę.

Następnie natychmiast schładzaj na lodzie przez dwie minuty. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki SOC podgrzanej do 37 stopni Celsjusza do każdej probówki w temperaturze pokojowej i inkubuj probówki w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez godzinę. Następnie należy ogrzać płytki LB, zawierające antybiotyk, odpowiadający genowi oporności na antybiotyki modułu UAS do 37 stopni Celsjusza.

Rozłóż komórki na ciepłych płytkach i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.