Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej
7 czerwca 2024
Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.
Nasze badania koncentrują się przede wszystkim na analizie autostruktury synaptycznej w dojrzałych organoidach siatkówki. Naszym celem jest opracowanie powtarzalnej i prostej elektromikroskopii transmisyjnej lub metody przygotowania próbek TEM dla organoidów siatkówki, co może przynieść ogromne korzyści w dziedzinie badań nad organoidami siatkówki. W porównaniu z naszymi technikami, takimi jak mikroskop optyczny, transmisyjny mikroskop elektronowy oferuje możliwość scharakteryzowania autostruktury integralnej synapsy i analizy subkomórkowej w organoidach siatkówki na poziomie nanoskali.
Nasz protokół oferuje optymalizację warunków przygotowania próbek organoidów siatkówki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, które są w prostych i przyjaznych dla użytkownika krokach. Nasze odkrycia wyraźnie pokazują ultrastrukturę morfologii synaps w organoidach siatkówki, w tym zarówno synapsy konwencjonalnej, jak i synapsy wstęgowej. To tworzy nasze solidne podstawy i przedstawia powtarzalne metody późniejszych badań funkcjonalnych organoidów siatkówki.
Wraz z oceną zastosowań klinicznych, takich jak badania przesiewowe skokowe. Aby rozpocząć przednie utrwalanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów siatkówki pochodzących z komórek macierzystych lub RO, za pomocą pipety delikatnie przenieś jeden z hodowanych RO z szalki Petriego do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Za pomocą pipety wyjmij pożywkę hodowlaną z probówki mikrowirówki i dodaj 1,5 mililitra 2% utrwalacza paraformaldehydu, 2% aldehydu glutarowego.
Po utrwaleniu RO usuń utrwalacz aldehydu glutarowego paraformaldehydu przed przystąpieniem do mycia organoidów. Delikatnie zawiesić organoidy w probówce mikrowirówkowej, dodając 1 mililitr 0,01 molowego PBS, aby zapewnić całkowite umycie. Następnie odpipetuj pozostały PBS i zastąp go około 150 mikrolitrami 1% kwasu osmowego, aż bloki tkanek zostaną zanurzone.
Umieść probówkę mikrowirówki w ciemnym pudełku. Aby rozpocząć barwienie utrwalonych organoidów siatkówki lub RO do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, należy użyć pipety w celu usunięcia kwasu osmowego wcześniej dodanego do organoidów w probówce mikrowirówki podczas utrwalania. Następnie przemyj RO 0,01 molowym PBS o pH 7,4 trzy razy przez 10 minut każde, a następnie przemyj wodą dejonizowaną trzy razy przez 10 minut każde.
Usuń ostatnie płukanie wodą dejonizowaną. Zastąp go około 150 mikrolitrami octanu uranu i zacej przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Następnie w dygestorium usuń octan uranu i zastąp go jednym mililitrem 50% acetonu, aby odwodnić próbki przez 10 minut.
Następnie wykonaj odwodnienie gradientowe za pomocą 70%80%90% i 2 razy kolejno 100% acetonu, każdy przez 10 minut. Po odwodnieniu gradientowym wyrzuć pozostały aceton i dodaj około 150 mikrolitrów mieszaniny acetonu i żywicy Epon-812. Umieść rurkę w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę.
Po usunięciu poprzedniej mieszanki żywicy acetonowej należy ją zastąpić inną kompozycją mieszanki acetonu i żywicy Epon-812. Tym razem inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Na koniec ostrożnie przenieś organoidy siatkówki do nowej probówki zawierającej około 500 mikrolitrów czystej żywicy epoksydowej.
I inkubuj go w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez godzinę przed przystąpieniem do osadzania organoidów. Na początek dodaj czystą żywicę epoksydową do rowka formy do osadzania do dwóch trzecich jej objętości. Użyj wykałaczki, aby wybrać organoidy siatkówki i przenieść je do formy do zatapiania wyposażonej w czystą żywicę epoksydową.
Następnie wypełnij rowek czystą żywicą epoksydową, aż lekko wystaje lub wybrzusza się. Dostosuj położenie organoidów na obu końcach formy do osadzania w celu osadzania kierunkowego. Zamontuj blok osadzający w przykładowym stojaku montażowym i przykręć śrubokrętem L.
Następnie zainstaluj szklane noże na stojaku na noże i ręcznie dokręć nakrętkę. Odetnij nadmiar żywicy, aż żądany obszar zostanie odsłonięty. Napełnij koryto szklanego noża wodą.
Za pomocą półcienkiego mikrotomu pokrój półcienkie plastry na grubość jednego mikrona i połóż je na szkiełku mikroskopowym za pomocą igły. Dodaj 50 mikrolitrów 1% błękitu toluidynowego, aby zafarbować półcienkie plasterki i inkubować przez minutę w temperaturze 95 stopni Celsjusza na płycie grzewczej. Płucz wodą z destylacją przez dwie minuty.
Użyj zwykłego mikroskopu optycznego 20x, aby obserwować strukturę przekrojów.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia zoptymalizowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Badanie koncentruje się na analizie autostruktury synaptycznej w dojrzałych organoidach siatkówki, oferując przystępną metodę umożliwiającą szczegółową analizę subkomórkową na poziomie nanometrycznym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia siatkówki
- mikroskopia elektronowa
Wstęp
- Organoidy siatkówki stanowią wartościowe modele do badania struktur i funkcji siatkówki.
- Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) umożliwia obrazowanie komponentów komórkowych z wysoką rozdzielczością.
- Celem badania jest udoskonalenie technik przygotowania próbek do TEM w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy.
- Dojrzałe organoidy siatkówki wykazują struktury synaptyczne, które można scharakteryzować za pomocą tej metody.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnej i prostej metody przygotowania próbek organoidów siatkówki do badania za pomocą TEM.
- Ocena morfologii ultrastrukturalnej synaps w obrębie tych organoidów.
- Stworzenie podstaw dla przyszłych badań funkcjonalnych oraz zastosowań klinicznych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie organoidów siatkówki pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs).
- Protokół obejmuje procesy utrwalania, barwienia, odwodnienia i zatapiania, dostosowane do wymogów TEM.
- Kluczowe etapy obejmują barwienie osmem, odwodnienie gradientowe oraz zatapianie w żywicy epoksydowej.
- Obserwacje są przeprowadzane z wykorzystaniem mikrotomu do skrawków półcienkich oraz mikroskopii optycznej po przygotowaniu próbek.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie uwidacznia zarówno synapsy konwencjonalne, jak i wstążkowe w organoidach siatkówki.
- Morfologie ultrastrukturalne są wyraźnie zdefiniowane, co stanowi solidną podstawę do dalszych badań.
- Wyniki potwierdzają powtarzalność metody, umożliwiając przeprowadzenie późniejszych badań funkcjonalnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie umożliwia szczegółową analizę struktur synaptycznych w organoidach siatkówki z wykorzystaniem TEM.
- Zoptymalizowana metoda przygotowania ułatwia przyszłe badania nad funkcjonalnymi organoidami siatkówki.
- Wnioski z badania mają znaczenie dla zrozumienia mechanizmów neuronalnych oraz potencjalnych zastosowań klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ultrastrukturalna analiza organoidów siatkówki o wysokiej rozdzielczości umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację punktów uchwytu w wczesnej fazie odkrywania leków okulistycznych. Protokoły przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) zapewniają powtarzalne, ilościowe informacje na temat architektury synaptycznej, zwiększając pewność predykcyjną w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej. Możliwość ta wzmacnia ciągłość translacyjną od biologii odkrywczej do oceny modeli przedklinicznych w portfolio badań nad siatkówką.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację ultrastruktury synaptycznej w celu walidacji funkcjonalnych celów terapeutycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie synaps wstążkowych i konwencjonalnych w modelach organoidów.
- Zapewnia ilościowe punkty odniesienia morfologicznych dla testowania hipotez w biologii siatkówki.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ustanawia zwalidowane schematy przygotowania próbek dla spójnych obrazowych testów analitycznych.
- Umożliwia odtwarzalną ocenę dojrzewania organoidów i integralności synaptycznej.
- Umożliwia standaryzację obchodzenia się z próbkami w celu skalowalnego przesiewu fenotypów siatkówki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność ultrastruktury organoidów z cechami ludzkiej siatkówki istotnymi dla danej choroby w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Wspiera ciągłość procesu od odkryć in vitro do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczenie wiarygodnych punktów końcowych w zakresie morfologii.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną przy wyborze modelu do opracowywania leków okulistycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół przygotowania próbek do TEM integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając wysoką wiarygodność analizy morfologicznej organoidów siatkówki pochodzących z iPSC.
- Biologia odkrywcza: dostarcza bezpośrednich dowodów na tworzenie się i dojrzewanie kontaktów synaptycznych w systemach organoidów.
- Screening: zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Analityka: umożliwia statystyczną ocenę morfologii i gęstości synaps w kohortach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: łączą wyniki in vitro z punktami końcowymi badań przedklinicznych poprzez analizę ultrastrukturalną.
- Zastosowanie w jednostkach badawczych: oferuje zestandaryzowany, powtarzalny protokół, który można dostosować do różnych platform organoidów siatkówki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w modelowaniu chorób siatkówki oraz walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację przepływów pracy w obrazowaniu ultrastrukturalnym.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez redukcję niepewności mechanistycznej na wczesnym etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli siatkówki do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu próbek do TEM oraz w analizie obrazowania subkomórkowego.
- Wymaga dostępu do specjalistycznego sprzętu do fiksacji, zatapiania i mikroskopii.
- Konieczna jest standaryzacja procedur obchodzenia się z próbkami i protokołów obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w różnych systemach organoidów pochodzących z iPSC poprzez optymalizację protokołu.
- Powtarzalność zależy od kontroli jakości odczynników i materiałów do zatapiania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:38
Retinal Organoid Fixation and Post Fixation Procedure for TEM Sample Preparation
2:39
Staining, Dewatering, and Infiltration of Fixed Retinal Organoids for TEM Sample Preparation
4:24
Retinal Organoid Embedding and Semi‐Thin Slice Positioning for Transmission Electron Microscopy
