Name: Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Poznaj metodę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Protokół umożliwia analizę struktur synaptycznych na poziomie nanometrycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1105503), Państwowego Kluczowego Laboratorium Neuronauki (SKLN-202103) oraz Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Zhejiang (Y21H120019), Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (82070981).

1. Uzyskiwanie RO z iPSCs25
UWAGA: RO zostały uzyskane z iPSC poprzez modyfikację poprzednio zgłoszonej procedury.
<ol>
	<li>Dysocjację iPSC przy ~90% konfluencji za pomocą proteazy bakteryjnej (patrz Tabela materiałów). Pokrój kolonie na kawałki i zeskrob je podnośnikiem komórkowym.</li>
	<li>Po pobraniu ponownie zawieś skupiska komórek w 0,25 ml lodowatego Matrigelu. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C zestalony żel rozsypać pożywką DMEM/F12 (0,5% suplementu N2, 1% suplementu B27, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 0,2 mM substytutu L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny). Zdefiniuj ten czas jako dzień 0 różnicowania.</li>
	<li>Po 5 dniach pływającej hodowli komórki grupują się, tworząc torbiele komórkowe. Przenieś te torbiele komórkowe na 100-milimetrową szalkę Petriego, gdzie będą teraz przylegać i rosnąć.</li>
	<li>W dniu 15 użyj proteazy bakteryjnej, aby oddzielić przylegające komórki i hodować je w pożywce DMEM/F12 (2% suplementu B27, 0,1 mM aminokwasów endogennych).</li>
	<li>W dniu 21 zmień pożywkę na 20 ml pożywki zawierającej surowicę (pożywka DMEM/F12, 8% FBS, 2% suplementu B27, 100 mM tauryny i 2 mM substytut L-glutaminy) i wymieniaj pożywkę co tydzień.</li>
</ol>
2. Przednie unieruchomienie RO
<ol>
	<li>Delikatnie przesunąć jedną z kultur RO (~D180, optymalna jest średnica około 1~2 mm) z szalki Petriego do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety i zaznaczyć odpowiednie informacje o ROs. 
	UWAGA: Przeciąć RO na pół lub odciąć słabo ustrukturyzowaną tkankę brzytwą pod mikroskopem w naczyniu zawierającym utrwalacz, jeśli RO są zbyt duże.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety. Dodać 1,5 ml utrwalacza 2% paraformaldehydu-2% aldehydu glutarowego rozcieńczonego w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) o pH 7,4 i utrwalić w temperaturze pokojowej (RT) przez 4 godziny. Probówki do mikrowirówek należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ten krok można wstrzymać na 1 tydzień, ale zaleca się ponowne uruchomienie tak wcześnie, jak to możliwe. Jeśli RO są pozostawione na dłużej, może to spowodować autolizę komórek prowadzącą do zniszczenia ultrastruktury RO. Ze względu na kruchość RO należy unikać obracania, oscylacji, przewracania lub trudnych operacji.</li>
</ol>
3. Po utrwaleniu RO
<ol>
	<li>Usunąć 2% utrwalacz paraformaldehydu-2% aldehydu glutarowego i przemyć 1 ml 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4 przez 3 x 10 min. Delikatnie zawiesić RO w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml podczas procesu mycia w celu całkowitego wypłukania. Za każdy dodatkowy dzień utrwalania zwiększaj liczbę prań o dwa, aby w jak największym stopniu usunąć resztki utrwalacza.</li>
	<li>Usuń pozostały PBS za pomocą pipety i zastąp go ~150 μl 1% kwasu osmowego (OsO4), aż bloki tkanek zostaną zanurzone. Umieść probówki do mikrowirówek w ciemnym pudełku, aby chronić je przed światłem i infiltruj w temperaturze pokojowej przez 1 h. 
	UWAGA: OsO4 jest silnym utleniaczem i należy się z nim obchodzić w dygestorium.</li>
</ol>
4. Barwienie i odwodnienie
UWAGA: Osuszacz musi być włączony, aby osuszyć środowisko od tego kroku.
<ol>
	<li>Usunąć OsO4 za pomocą pipety, przemyć 0,01 M PBS (pH 7,4) 3 x 10 min, a następnie przemyć 3 x 10 min wodą dejonizowaną. 
	UWAGA: Aby zapewnić całkowite wypłukanie RO, zalecamy zawieszenie RO. Zassać OsO4 do dedykowanej butelki do utylizacji.</li>
	<li>Usuń ostatnie płukanie wodą dejonizowaną i zastąp ~150 μl na probówkę (zapewnić pełną infiltrację bloków tkanek) octanu uranu i zabarwić przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Chroń probówki mikrowirówek przed światłem.</li>
	<li>Usuń octan uranu i zastąp go 1 ml 50% acetonu w dygestorium, odwadniając przez 10 minut. Następnie użyj 70%, 80%, 90%, 100% i 100% acetonu do stopniowego odwadniania RO kolejno. Każde odwodnienie trwa 10 min. 
	UWAGA: Pozostaw trochę płynu, aby namoczyć RO przy każdej wymianie, aby zapobiec narażeniu na powietrze i wilgoć. Dodatkowo działaj szybko, tak szybko, jak to możliwe, ponieważ aceton jest lotny. Odessać octan uranu do specjalnej butelki do utylizacji.</li>
</ol>
5. Infiltracja
<ol>
	<li>Wyrzucić aceton i dodać ~150 μL mieszaniny składającej się z acetonu i żywicy Epon-812 w stosunku 1:1. Wstaw do piekarnika o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Usuń powyższą mieszaninę i zastąp ją mieszaniną składającą się z acetonu i żywicy Epon-812 w stosunku 1:4. Wstaw na noc do piekarnika o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś RO do nowych probówek zawierających ~500 μl czystej żywicy epoksydowej i umieść je w piecu o temperaturze 45 °C na 1 godzinę.</li>
</ol>
6. Osadzanie
<ol>
	<li>Przygotuj 30-50 ml czystej żywicy epoksydowej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, mieszając wcześniej zestaw odczynników zgodnie z instrukcjami producenta. Obracaj czystą żywicę epoksydową powoli do góry nogami przez 30 minut, aby zredukować pęcherzyki powietrza wprowadzane przez mieszalnik. Następnie odstaw do piekarnika o temperaturze 37 °C na 20 minut. Dodaj 2/3 objętości czystej żywicy epoksydowej do rowka formy do zatapiania.</li>
	<li>Użyj wykałaczki, aby pobrać RO do formy do zatapiania wyposażonej w czystą żywicę epoksydową.</li>
	<li>Wypełnij rowek czystą żywicą epoksydową, aż lekko wystaje lub wybrzusza się.</li>
	<li>Dostosuj położenie RO na obu końcach formy do osadzania, aby osadzić kierunkowo. Umieść formę do zatapiania w piekarniku o temperaturze 45 °C na 1-2 godziny, a następnie wstaw ją do piekarnika o temperaturze 65 °C na 48-72 godziny.</li>
</ol>
7. Półcienkie pozycjonowanie
<ol>
	<li>Przeszlifuj nadmiar żywicy epoksydowej wokół tkanki od końców dłuższych czterech boków bloku osadzającego, aby utworzyć trapezoidalną powierzchnię. Zamontuj blok osadzający w przykładowym stojaku montażowym i przykręć śrubokrętem L. Następnie zainstaluj szklane noże na stojaku na noże i ręcznie dokręć nakrętkę.</li>
	<li>Odetnij nadmiar żywicy, aż żądany obszar zostanie odsłonięty.</li>
	<li>Napełnij koryto szklanego noża wodą. Pokrój półcienkie plastry na grubość 1 μm za pomocą półcienkiego mikrotomu i ułóż je na szkiełku mikroskopowym za pomocą igły.</li>
	<li>Dodać 50 μl 1% błękitu toluidynowego do barwienia półcienkich plastrów i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 95 °C na płycie grzewczej. Spłukiwać wodą destylowaną przez 2 min. Użyj zwykłego mikroskopu optycznego 20x, aby obserwować strukturę przekrojów.</li>
</ol>
8. Ultracienkie przekroje
<ol>
	<li>Zamontuj bloki osadzające i noże szklane zgodnie z opisem w kroku 7.1. Dostosuj odległość między nożem a blokiem tkanki, poziom płynu w zlewie i prędkość krojenia. Ultracienkie odcinki o grubości ~70-100 nm należy wyciąć ultracienkim mikrotomem i nanieść plastry na siatkę miedzianą (200 oczek) za pomocą folii nośnej.</li>
	<li>Barwienie ultracienkich skrawków 3% cytrynianem ołowiu przez 15 minut, aby zwiększyć kontrast w procedurze podwójnego barwienia.</li>
</ol>
9. Obrazowanie RO za pomocą TEM
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Kliknij przycisk Tryb pamięci i z grubsza zaznacz każdą ultracienką sekcję.</li>
	<li>Szukaj struktur synaptycznych.
	<ol>
		<li>Wyróżnij laminowaną strukturę RO przy małym powiększeniu.</li>
		<li>Zlokalizuj zewnętrzną warstwę jądrową (ONL), która pokazuje strukturę jądrową o większej gęstości elektronów. Następnie przejdź do terminala fotoreceptora, w którym gromadzą się liczne pęcherzyki. Szukaj końcówek pręcików z pojedynczą wstęgą synaptyczną i końcówek stożkowych z wieloma wstęgami synaptycznymi.</li>
		<li>Przejdź do wewnętrznej warstwy pleksi (IPL) i poszukaj podobnej struktury za pomocą małej wstążki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uchwyć obraz mikroskopowy.
	<ol>
		<li>Kliknij Start i wprowadź odpowiednią moc powiększania.</li>
		<li>Zapisz obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized Protocol for Retinal Organoid Sample Preparation for TEM

<ol><li>Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+pluripotent+stem+cells+to+model+and+treat+inherited+degenerative+diseases+of+the+outer+retina%3A+3d-organoids+limitations+and+bioengineering+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions.</a> Cells. 10 (9), 2489(2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribbon+synapses+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Ribbon synapses of the retina.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Webvision%3A+The+organization+of+the+retina+and+visual%22">Webvision: The organization of the retina and visual</a>. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).</li>
<li>Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+maintenance+and+restoration+in+the+retina+by+ngl2%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2.</a> Elife. 7, e30388(2018).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+A+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: A window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), dev189746 (2020).</li>
<li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).</li>
<li>Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-chip+for+therapy+development+and+fundamental+science%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human-on-chip for therapy development and fundamental science.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).</li>
<li>Chahine Karam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ipsc-derived+retinal+organoids+and+retinal+pigment+epithelium+for+novel+intronic+rpgr+variant+assessment+for+therapy+suitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability.</a> J Pers Med. 12 (3), 502(2022).</li>
<li>Lo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+strategies+for+glaucoma+and+optic+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies.</a> Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3d+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), 171686(2019).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).</li>
<li>Cora, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cleared+view+on+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">A cleared view on retinal organoids.</a> Cells. 8 (5), 391(2019).</li>
<li>Żak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy%E2%94%80development%2C+challenges%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives.</a> Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).</li>
<li>Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+foveola+reinvestigated%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the foveola reinvestigated.</a> PeerJ. 6, e4482(2018).</li>
<li>Syrbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cells+of+the+primate+foveola%3A+An+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study.</a> Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+bipolar+cells+receive+cone+photoreceptor+inputs+through+both+invaginating+synapses+and+flat+contacts+in+the+mouse+and+guinea+pig+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas.</a> J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+rpgra+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%CE%B1-synuclein+in+the+mouse+retina+is+confined+to+inhibitory+presynaptic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements.</a> J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+degeneration+of+photoreceptor+synapse+in+ccl2%2Fcx3cr1-deficient+mice+on+crb1%28rd8%29+background%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background.</a> Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).</li>
<li>De Robertis, E., Franchi, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+observations+on+synaptic+vesicles+in+synapses+of+the+retinal+rods+and+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones.</a> J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).</li>
<li>Frey, T. G., Mannella, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+structure+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The internal structure of mitochondria.</a> Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).</li>
<li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+retinal+organoids+recapitulate+disease+features+of+late-onset+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).</li>
<li>Afanasyeva, T. aV., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+look+into+retinal+organoids%3A+Methods%2C+analytical+techniques%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications.</a> Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym artykule przedstawiliśmy szczegółowy protokół obserwacji konwencjonalnej i wstęgowej ultrastruktury synaptycznej w RO za pomocą TEM. Protokół ten opiera się na wcześniej opisanych metodach preparacji siatkówki z pewnymi modyfikacjami20. Aby poprawić wskaźnik powodzenia obróbki próbek i jakość mikrofotografii TEM, należy wziąć pod uwagę następujące kluczowe punkty. Po pierwsze, ważne jest, aby przyznać, że RO rozwijają się z iPSC, tworząc masę komórkową pozbawioną układu naczyniowego 6,26 i komórek glejowych26. Ten brak może prowadzić do mniej zwartej organizacji w porównaniu z siatkówką in vivo. Dlatego ważne jest, aby obchodzić się z Ros delikatnie, aby zachować ich strukturę i integralność. Dodaj płyny wzdłuż ścianki rury, aby zminimalizować zakłócenia.
Co ważne, należy zapewnić dokładne odwodnienie tkanki w kroku 4 protokołu i włączyć osuszacz, aby zmniejszyć wilgotność w pomieszczeniu przed rozpoczęciem etapu odwadniania. Zastępując aceton, działaj szybko i pozostaw trochę płynu, aby zanurzyć tkankę, zapobiegając poważnemu zniszczeniu struktury tkanki RO. Nieodwodniona tkanka kurczy się gwałtownie na dużych wysokościach EM, a woda w tkance utrudnia penetrację środka zatapiającego.
Ponieważ RO występują jako przezroczyste kule, upewnij się, że podczas cięcia półcienkich plastrów należy zapewnić właściwy kierunek, aby uzyskać nienaruszone struktury lamelarne. Wreszcie, RO w stadium 3 (około po D100-D150) są uważane za dojrzałe i posiadają integralne synapsy12, w wyniku czego zaleca się przeprowadzenie badania kontaktów synaptycznych, w tym synaps wstęgowych i synaps chemicznych, w tych RO.
Chociaż w poprzednich badaniach dostarczono ograniczonych dowodów ultrastrukturalnych na istnienie synaps RO, nie ma szczegółów na temat pełnej procedury przygotowania próbki RO, a także identyfikacji różnych typów struktur synaptycznych 12,13,24. Capowski i wsp. zastosowali różne techniki do zbadania charakterystyki RO indukowanych przez różne linie hPSC na różnych etapach, w tym mikrofotografie elektronowe wykazujące istnienie pęcherzykowatych synaps wstęgowych w szypułce stożka, które ujawniły, że RO w stadium 3 indukowane przez różne linie hPSC są dojrzałe i funkcjonalne12. Korzystając z TEM i obrazowania dwufotonowego, Cowan i wsp. potwierdzili tworzenie funkcjonalnych struktur synaptycznych wstęgowych w dojrzałych RO13, ale nie wskazano rodzaju synapsy (synapsy czopkowe lub pręcikowe). Jednak nasze kilka partii wyników mikrofotografii wykazało strukturę błonową synaps wstęgowych z idealną przejrzystością i kontrastem, co ilustruje, że nasza metoda jest wykonalna i powtarzalna. Ponadto zidentyfikowaliśmy różne typy synaps zgodnie z ich różnymi cechami morfologicznymi: synapsy czopkowe są zwykle większe i mają kilka wstążek, podczas gdy synapsy pręcikowe są zwykle mniejsze, pokazując tylko jedną wstęgę; W synapsach chemicznych pęcherzyki gromadzą się w strukturach presynaptycznych, a gęstość elektronowa szczeliny synaptycznej jest zwiększona.
Ultrastrukturalna integralność kontaktów synaptycznych w RO ma kluczowe znaczenie dla ich funkcjonowania. Wykorzystanie TEM do zbadania tych kontaktów oferuje szerokie i znaczące korzyści w różnych dziedzinach, takich jak między innymi badanie patogenezy siatkówki in vitro, przeprowadzanie badań przesiewowych leków u RO i ocena technik różnicowania RO. Ograniczony przez obrazowanie 2D TEM, można zaobserwować tylko określony aspekt ultrastruktury ROs, co utrudnia stereoskopową analizę całej struktury synapsy. Ponadto ograniczona dyferencjacja przyczynia się do nieprawidłowego rozmieszczenia komórek13,26, co dodatkowo komplikuje proces obserwacji. Tak więc połączenie objętości EM z rekonstrukcją 3D może przezwyciężyć te niedociągnięcia w przyszłości.

Siatkówka, ważny narząd zmysłów wzrokowych u ludzi i ssaków, wykazuje wyraźną laminowaną strukturę charakteryzującą się trzema warstwami jądrowymi mieszczącymi somy neuronów i dwiema warstwami splotowatymi utworzonymi przez połączenia synaptyczne1, w tym konwencjonalne synapsy i wyspecjalizowana synapsa wstęgowa2,3. Synapsa wstęgowa odgrywa kluczową rolę w stopniowym przekazywaniu impulsów pęcherzyków2,3. Proces widzenia obejmuje transmisję sygnału elektrooptycznego przez różne poziomy neuronów i synaps, ostatecznie docierając do kory wzrokowej4,5.
Organoidy siatkówki (RO) reprezentują trójwymiarowy (3D) system hodowli pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), naśladujący stany fizjologiczne tkanki siatkówki in vitro1,6,7. Podejście to jest obiecujące w badaniu chorób siatkówki8, drug screening9 i służy jako potencjalna terapia nieodwracalnych stanów zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki10 i jaskra11. Jako potężny system przewodnictwa optycznego in vitro, synapsa w RO jest kluczową strukturą ułatwiającą efektywną transformację i transfer sygnału5.
Rozwój RO można z grubsza podzielić na trzy etapy, zgodnie z ich cechami morfologicznymi i profilami ekspresji molekularnej6,12. RO w stadium 1 (około D21-D60) obejmują nerwowe komórki progenitorowe siatkówki, wiele komórek zwojowych siatkówki (RGC) i kilka komórek amakrynowych gwiazdotwórczych (SAC), odpowiadających pierwszej epoce rozwoju płodu ludzkiego. W stadium 2 (około D50-D150) RO wyrażają niektóre prekursory fotoreceptorów, interneurony i geny związane z synaptogenezą, co stanowi fazę przejścia. Fotoreceptory osiągają dojrzałość w stadium 3 RO (mniej więcej po D100-D150), co odpowiada trzeciemu etapowi rozwoju płodu ludzkiego6,12,13. Warto zauważyć, że w porównaniu z RO w etapie 1 i etapie 2, RO w etapie 3 mają wyraźną strukturę blaszkową, której synapsy dojrzały12, w tym obecność synaps wstęgowych14. Co więcej, niedawne badania potwierdziły, że dojrzałe synapsy są transmisją sygnałów świetlnych, co wskazuje, że są funkcjonalne13. W związku z tym RO w stadium 3 są często wybierane do badania struktury synaptycznej.
Immunohistochemia jest szeroko stosowana do badania ekspresji różnych białek molekularnych. Jednak ograniczenie mikroskopii optycznej polega na jej zdolności do obserwowania tylko ograniczonej liczby określonych komórek i cząsteczek jednocześnie, co skutkuje brakiem kompleksowej analizy relacji między komórkami a otaczającym je środowiskiem. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) charakteryzuje się wysoką rozdzielczością, z ograniczoną rozdzielczością 0,1-0,2 nm, przewyższając mikroskop świetlny o ~10-20 razy15. Uzupełnia wady mikroskopii optycznej i służy do wyjaśniania rozwoju siatkówki i dojrzewania synaps u ludzi16,17 i różnych gatunków18,19,20,21. TEM umożliwia bezpośrednie rozróżnienie komponentów presynaptycznych i postsynaptycznych18,20, a nawet pozwala na kompleksową obserwację struktur subkomórkowych, takich jak wstążki2,3, vesicles22 i mitochondria23. Dlatego TEM jest niezbędnym narzędziem do identyfikacji typów synaps i badania ultrastruktury kontaktów synaptycznych w RO w nanoskali.
Należy zauważyć, że przygotowanie próbki ma ogromne znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych. Chociaż niektóre badania przeprowadziły EM na ROs12,13,24, szczegółowe procedury są niejasne. Ponieważ jakość obrazu z mikroskopii elektronowej zależy w dużym stopniu od efektu utrwalania RO i przenikania odczynników, podczas przygotowania należy wziąć pod uwagę różne ważne czynniki. W związku z tym, aby lepiej zbadać kontakty synaptyczne w RO, przedstawiamy metodę o dobrej odtwarzalności, która pokazuje punkty działania mocowania RO, osadzania i identyfikacji miejsc obserwacji.

<table><tbody><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-395251</td><td></td></tr><tr><td>Siatki miedziane</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>AZH400HH</tr><tr><td>Oprogramowanie DigitalMicrograph</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td> <td># 07913</td><td>Proteaza bakteryjna</td></tr><tr><td>DMEM / F12 medium</td><td>Gibco</td> <td># 11320033</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GZ10592</tr><tr><td>Żywica Epon-812</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>#14900</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Przemysł biologiczny#</td><td>04-0021A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>aldehydu glutarowego</td><td>Nauka 16020</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Pokazany w Biotechnology Co., Ltd.</td><td>RC01001-A</td><td></td></tr><tr><td>Główny cytrynian</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GZ02618</tr><tr><td>L-GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050061 Substytut</td><td>L-glutaminy</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>CITOTEST</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Składnik PB/PBS</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Składnik PB/PBS</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Sigma</td><td>#M7145</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Laboratoryjny lornetkowy mikroskop biologiczny</td><td>Xsz-107bnii</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Bluepard</td><td>BPG9040A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pół/ultracienki mikrotom</td><td>Reichert-Jung</td><td>396649</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>#T0625</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy</td><td>Sangon Biotech</td><td>E670105-0100</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjne mikroskopy elektronowe</td><td>HITACHI</td><td>H-7500</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Organoidy siatkówki (RO) to trójwymiarowy system hodowli naśladujący cechy ludzkiej siatkówki, które w określonych warunkach różnią się od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Rozwój i dojrzewanie synaps w RO badano pod względem immunocytochemicznym i funkcjonalnym. Jednak bezpośrednie dowody na ultrastrukturę kontaktu synaptycznego są ograniczone, zawierają zarówno specjalne synapsy wstęgowe, jak i konwencjonalne synapsy chemiczne. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) charakteryzuje się wysoką rozdzielczością i szacowną historią wyjaśniającą rozwój siatkówki i dojrzewanie synaps u ludzi i różnych gatunków. Jest to potężne narzędzie do badania struktury synaptycznej w RO i jest szeroko stosowane w dziedzinie badań RO. Dlatego, aby lepiej zbadać strukturę kontaktów synaptycznych RO w nanoskali i uzyskać wysokiej jakości dowody mikroskopowe, opracowaliśmy prostą i powtarzalną metodę przygotowania próbki RO TEM. W tym artykule opisano protokół, użyte odczynniki i szczegółowe etapy, w tym przygotowanie do utrwalenia RO, po utrwaleniu, osadzanie i wizualizację.

Tworzenie trójwymiarowych organoidów siatkówki (RO) poprzez różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stanowi potężne narzędzie do badania mechanizmów chorób siatkówki oraz terapii zastępczej z użyciem komórek macierzystych. Chociaż inni wykazali istnienie połączeń synaptycznych w RO w sposób funkcjonalny i immunocytochemiczny, bezpośrednie dowody na obecność synaps konwencjonalnych i wstążkowych są bardzo ograniczone. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę badania ultrastruktury dwóch typów synaps w RO za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Po 180 dniach hodowli RO zostały utrwalone, barwione, zatopione i pocięte na ultra-cienkie skrawki. Obserwacja TEM ujawniła synapsy wstążkowe w zakończeniach aksonalnych fotoreceptorów (Rysunek 1 i Rysunek 2), które są rozmieszczone w zewnętrznej warstwie splotowej (OPL). W TEM wstążki czopków otaczają wgłębienie synaptyczne, tworząc profil w kształcie podkowy z komórkami horyzontalnymi (Rysunek 1). Pręciki zazwyczaj posiadają tylko jedną wstążkę, natomiast czopki mają wiele wstążek (Rysunek 2). Ponadto zaobserwowano klasyczne synapsy chemiczne między komórkami amakrynowymi w wewnętrznej warstwie splotowej (IPL) (Rysunek 3). W TEM synapsa chemiczna składa się z trzech części: presynaptycznej, szczeliny synaptycznej i postsynaptycznej. Membrany komórkowe odpowiadające częściom presynaptycznej i postsynaptycznej są nieco grubsze niż pozostałe fragmenty, a wąska przerwa między tymi dwiema membranami nazywana jest szczeliną synaptyczną. W cytoplazmie w obrębie błony presynaptycznej znajduje się wiele pęcherzyków synaptycznych. Badanie to potwierdza obecność kompletnych połączeń synaptycznych w 3D RO pochodzących z iPSC. Należy jednak zauważyć, że niedokładne płukanie między kolejnymi etapami prowadzi do wytrącania się czarnych cząsteczek podczas procesu przygotowania próbek (Rysunek 4).
<img alt="Obraz z mikroskopii elektronowej komórek siatkówki przedstawiający struktury pręcików i HC, badanie anatomii komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Obrazy TEM synaps wstążkowych pręcików w ROs. (A,B) Komórki pręcikowe i poziome tworzą profil w kształcie podkowy. W każdej sferuli pręcika w OPL w ROs zaobserwowano pojedynczą wstążkę (groty strzałek), otoczoną licznymi pęcherzykami. Paski skali = 0.2 µm. Skróty: ROs = organoidy siatkówki; HC = komórka pozioma; OPL = zewnętrzna warstwa splotowata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa; struktura komórkowa; szczegółowy schemat komórki czopka; badania; skala 0,2 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazy TEM synaps wstążkowych czopków w ROs. W stopce czopka w OPL w ROs widoczne były trzy synapsy wstążkowe (groty strzałek). Pasek skali = 0,2 µm. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; ROs = organoidy siatkówki; OPL = zewnętrzna warstwa splotowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu elektronowego struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obraz TEM synaps chemicznych w ROs. Obserwowano konwencjonalną synapsę chemiczną między komórkami amakrynowymi w warstwie IPL w ROs. Synapsa chemiczna składa się z trzech części: presynaptycznej, szczeliny synaptycznej i postsynaptycznej. W cytoplazmie w miejscu błony presynaptycznej znajduje się wiele pęcherzyków synaptycznych. Strzałka oznacza kierunek przekazu synaptycznego, wskazując transport licznych pęcherzyków z jednego wypustka AC1 do innego profilu AC2. Pasek skali = 0.2 µm. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; ROs = organoidy siatkówki; IPL = wewnętrzna warstwa splotowa; ACs = komórki amakrynowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu elektronowego, struktura komórek siatkówki; oznaczony czop; analiza ultrastruktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykład problemu, który może wystąpić podczas procesu przygotowania próbki. W stopce czopa znajduje się wiele czarnych cząsteczek (okręgi) z powodu niepełnego płukania pomiędzy poszczególnymi etapami. Strzałki: synapsa wstęgowa. Pasek skali = 0.2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Nasze badania koncentrują się przede wszystkim na analizie autostruktury synaptycznej w dojrzałych organoidach siatkówki. Naszym celem jest opracowanie powtarzalnej i prostej elektromikroskopii transmisyjnej lub metody przygotowania próbek TEM dla organoidów siatkówki, co może przynieść ogromne korzyści w dziedzinie badań nad organoidami siatkówki. W porównaniu z naszymi technikami, takimi jak mikroskop optyczny, transmisyjny mikroskop elektronowy oferuje możliwość scharakteryzowania autostruktury integralnej synapsy i analizy subkomórkowej w organoidach siatkówki na poziomie nanoskali.Nasz protokół oferuje optymalizację warunków przygotowania próbek organoidów siatkówki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, które są w prostych i przyjaznych dla użytkownika krokach. Nasze odkrycia wyraźnie pokazują ultrastrukturę morfologii synaps w organoidach siatkówki, w tym zarówno synapsy konwencjonalnej, jak i synapsy wstęgowej. To tworzy nasze solidne podstawy i przedstawia powtarzalne metody późniejszych badań funkcjonalnych organoidów siatkówki.Wraz z oceną zastosowań klinicznych, takich jak badania przesiewowe skokowe. Aby rozpocząć przednie utrwalanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów siatkówki pochodzących z komórek macierzystych lub RO, za pomocą pipety delikatnie przenieś jeden z hodowanych RO z szalki Petriego do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Za pomocą pipety wyjmij pożywkę hodowlaną z probówki mikrowirówki i dodaj 1,5 mililitra 2% utrwalacza paraformaldehydu, 2% aldehydu glutarowego.Po utrwaleniu RO usuń utrwalacz aldehydu glutarowego paraformaldehydu przed przystąpieniem do mycia organoidów. Delikatnie zawiesić organoidy w probówce mikrowirówkowej, dodając 1 mililitr 0,01 molowego PBS, aby zapewnić całkowite umycie. Następnie odpipetuj pozostały PBS i zastąp go około 150 mikrolitrami 1% kwasu osmowego, aż bloki tkanek zostaną zanurzone.Umieść probówkę mikrowirówki w ciemnym pudełku. Aby rozpocząć barwienie utrwalonych organoidów siatkówki lub RO do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, należy użyć pipety w celu usunięcia kwasu osmowego wcześniej dodanego do organoidów w probówce mikrowirówki podczas utrwalania. Następnie przemyj RO 0,01 molowym PBS o pH 7,4 trzy razy przez 10 minut każde, a następnie przemyj wodą dejonizowaną trzy razy przez 10 minut każde.Usuń ostatnie płukanie wodą dejonizowaną. Zastąp go około 150 mikrolitrami octanu uranu i zacej przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Następnie w dygestorium usuń octan uranu i zastąp go jednym mililitrem 50% acetonu, aby odwodnić próbki przez 10 minut.Następnie wykonaj odwodnienie gradientowe za pomocą 70%80%90% i 2 razy kolejno 100% acetonu, każdy przez 10 minut. Po odwodnieniu gradientowym wyrzuć pozostały aceton i dodaj około 150 mikrolitrów mieszaniny acetonu i żywicy Epon-812. Umieść rurkę w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę.Po usunięciu poprzedniej mieszanki żywicy acetonowej należy ją zastąpić inną kompozycją mieszanki acetonu i żywicy Epon-812. Tym razem inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Na koniec ostrożnie przenieś organoidy siatkówki do nowej probówki zawierającej około 500 mikrolitrów czystej żywicy epoksydowej.I inkubuj go w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez godzinę przed przystąpieniem do osadzania organoidów. Na początek dodaj czystą żywicę epoksydową do rowka formy do osadzania do dwóch trzecich jej objętości. Użyj wykałaczki, aby wybrać organoidy siatkówki i przenieść je do formy do zatapiania wyposażonej w czystą żywicę epoksydową.Następnie wypełnij rowek czystą żywicą epoksydową, aż lekko wystaje lub wybrzusza się. Dostosuj położenie organoidów na obu końcach formy do osadzania w celu osadzania kierunkowego. Zamontuj blok osadzający w przykładowym stojaku montażowym i przykręć śrubokrętem L.Następnie zainstaluj szklane noże na stojaku na noże i ręcznie dokręć nakrętkę. Odetnij nadmiar żywicy, aż żądany obszar zostanie odsłonięty. Napełnij koryto szklanego noża wodą.Za pomocą półcienkiego mikrotomu pokrój półcienkie plastry na grubość jednego mikrona i połóż je na szkiełku mikroskopowym za pomocą igły. Dodaj 50 mikrolitrów 1% błękitu toluidynowego, aby zafarbować półcienkie plasterki i inkubować przez minutę w temperaturze 95 stopni Celsjusza na płycie grzewczej. Płucz wodą z destylacją przez dwie minuty.Użyj zwykłego mikroskopu optycznego 20x, aby obserwować strukturę przekrojów.

preparing-retinal-organoid-samples-for-transmission-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nieludzkie naczelne są istotnym gatunkiem translacyjnym dla naszego zrozumienia rozwoju i starzenia się. Organizacja anatomiczna siatkówki naczelnych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi.

Brama do mózgu: sekcja oka naczelnych

Niniejszy artykuł wideo demonstruje sposób tworzenia organotypowych kultur całej siatkówki oraz procedurę cytospinową służącą do analizy efektów indukowanych egzogennie. Organotypowe kultury całej siatkówki odwzorowują warunki in vivo i znacząco ułatwiają dostęp do siatkówek myszy w manipulacjach eksperymentalnych, pozwalając jednocześnie uniknąć wad klasycznych modeli zwierzęcych u myszy.

Organotypowa hodowla całego preparatu siatkówki mysiej typu in vivo

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół generowania dojrzałych ludzkich organoidów siatkówki i wykorzystywania ich w teście toksyczności fotoreceptorów do identyfikacji kandydatów farmaceutycznych na chorobę zwyrodnieniową siatkówki związaną z wiekiem teleangiektazję plamki żółtej typu 2 (MacTel).

Badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.

Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Poznaj metodę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Protokół umożliwia analizę struktur synaptycznych na poziomie nanometrycznym.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów