Name: Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Poznaj trójwymiarową hodowlę komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z zastosowaniem fotobiomodulacji. Metoda zwiększa proliferację ADSC bez efektów cytotoksycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, grant numer TTK2205035996; Departament Nauki i Innowacji (DSI) sfinansował African Laser Centre (ALC), numer grantu HLHA23X zadanie ALC-R007; University Research Council, grant number 2022URC00513; Departament Nauki i Technologii's South African Research Chairs Initiative (DST-NRF/SARChI), Numer grantu 98337. Organy finansujące nie odegrały żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu, analizie, interpretacji danych ani pisaniu manuskryptu. Autorzy dziękują Uniwersytetowi w Johannesburgu (UJ) i Centrum Badań Laserowych (LRC) za wykorzystanie obiektów i zasobów.

UWAGA: Zobacz Tabela materiałów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat wszystkich materiałów, odczynników i oprogramowania wykorzystanych w tym protokole. Protokół został podsumowany graficznie w Rycina 1.
1. Dwuwymiarowa (2D) hodowla komórkowa
UWAGA: Unieśmiertelnione ADSC (1 x106 komórek) są przechowywane w temperaturze -195,8 °C w ciekłym azocie w fiolce do kriokonserwacji zawierającej 1 mL pożywki do zamrażania komórek.
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki do regeneracji komórek 2D oraz kolby do hodowli 2D
	<ol>
		<li>Przenieś 39 mL pożywki podstawowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL</li>
		<li>Wzbogać pożywkę podstawową 20% płatkową surowicą bydlęcą (FBS; 10 mL) oraz antybiotykami (1 mL) (0,5 mL penicyliny-streptomycyny i 0,5 mL amfoterycyny B).</li>
		<li>Przygotuj kolbę T75, przenosząc do niej 6 mL pożywki do regeneracji komórek, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 85% przez 45 min (można to zrobić podczas wykonywania kroków regeneracji komórek, aby zaoszczędzić czas). 
		UWAGA: Przed użyciem podgrzej kompletną pożywkę do 37 °C; przechowuj w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regeneracja komórek 2D
	<ol>
		<li>Wyjmij kriotubkę z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie i szybko rozmroź ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż do całkowitego rozmrożenia.</li>
		<li>Odwirowuj kriotubkę w wirówce przy 1006 x g przez 5 min (20 °C), a następnie usuń supernatant.</li>
		<li>Resuspenduj osad komórkowy w 1 mL uprzednio ogrzanej pożywki do regeneracji komórek.</li>
		<li>Równomiernie rozdziel zawiesinę komórkową w przygotowanej wcześniej kolbie (objętość końcowa 7 mL) i inkubuj w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 85%.</li>
		<li>Po 24 h usuń i wymień pożywkę do regeneracji komórek.</li>
		<li>Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2-3 dni, aż komórki w kolbie osiągną pełną konfluencję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór komórek z kolby hodowli 2D w formie zawiesiny pojedynczych komórek i liczenie komórek
	<ol>
		<li>Wyjmij kolbę z hodowlą 2D z inkubatora i wylej pożywkę do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
		<li>Przenieś 10 mL roztworu płuczącego do kolby, aby wypłukać komórki oraz usunąć zanieczyszczenia i osady białkowe. Następnie wylej roztwór płuczący.</li>
		<li>Dodaj do kolby z hodowlą 6 mL roztworu odrywającego, aby odczepić komórki. Inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności 85% przez 2 min. 
		UWAGA: Obserwuj kolbę pod mikroskopem, aby potwierdzić, że wszystkie komórki zostały odczepione. Jeśli nie, delikatnie ostukaj kolbę i inkubuj przez kolejną minutę.</li>
		<li>Gdy wszystkie komórki zostaną odczepione, przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL i dodaj do niej 1 mL pożywki do regeneracji komórek (zawierającej 20% FBS). Zneutralizuje to działanie roztworu odrywającego.</li>
		<li>Wirowuj probówkę przez 5 min przy 1711 x g (20 °C).</li>
		<li>Usuń supernatant i resuspenduj komórki w 1 mL kompletnej pożywki.</li>
		<li>Pobierz 10 µL zawiesiny komórkowej, umieść w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 500 µL i zmieszaj z 10 µL błękitu trypanu w stosunku 1:1.</li>
		<li>Nanieś 10 µL mieszaniny zawiesiny komórkowej z błękitem trypanu w dwóch powtórzeniach do komory licznikowej.</li>
		<li>Umieść komorę licznikową w automatycznym liczniku komórek. Licznik wskaże całkowitą liczbę komórek na mL oraz liczbę komórek żywych i martwych. Oblicz średnią liczbę żywych komórek oraz ilość żywych komórek niezbędną do osadzenia w hydrożelu 3D (krok 2.2.6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie pełnej pożywki do hodowli 3D
	<ol>
		<li>Przenieś 44 mL pożywki podstawowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.</li>
		<li>Wzbogać pożywkę w 10% FBS (5 mL) oraz antybiotyki (1 mL) (0,5 mL Penicyliny-Streptomycyny i 0,5 mL Amfoterycyny B). 
		UWAGA: Przed użyciem podgrzej pełną pożywkę do 37 °C i przechowuj w temperaturze 4 °C przez maksymalnie jeden tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hydrożelu
	<ol>
		<li>Przygotuj fast-dekstran, wirując (1000 x g przez 30 s w 20 °C) fiolkę z fast-dekstranem w celu zagęszczenia materiału. Dodaj 175 µL wody do fiolki z fast-dekstranem, aby uzyskać końcowe stężenie 30 mmol/L grup reaktywnych.</li>
		<li>Mieszaj probówkę z roztworem fast-dekstranu na vortexie (średnia prędkość przez 30 s) aż do całkowitego rozpuszczenia materiału. Inkubuj rozpuszczony materiał na lodzie przez 5 min. Wiruj probówkę, krótko wymieszaj na vortexie i przechowuj na lodzie do dalszego użycia.</li>
		<li>Wiruj sieciujący (1000 x g przez 30 s w 20 °C) w celu zagęszczenia materiału. Dodaj 188 µL wody do fiolki z sieciującym, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mmol/L grup tiolowych.</li>
		<li>Mieszaj probówkę z roztworem sieciującego na vortexie (średnia prędkość przez 30 s) aż do rozpuszczenia całego materiału. Inkubuj rozpuszczony sieciujący w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min. Wiruj probówkę, krótko wymieszaj na vortexie i przechowuj w RT do dalszego użycia.</li>
		<li>Zmodyfikuj protokół hydrożelu z 30 µL na 10 µL w celu redukcji kosztów (szczegóły znajdują się w Tabeli 1).</li>
		<li>Przygotuj zawiesinę komórkową tak, aby uzyskać gęstość siewu 2,5 x 103 komórek na 10 µL hydrożelu.</li>
		<li>Połącz składniki zgodnie z Tabelą 1, aby przygotować master mix. Przenieś 9 µL master mixu do dołka w 96-dołkowej płytce paskowej.</li>
		<li>Utwardź żel, dodając 1 µL degradowalnego sieciującego 3 min po przeniesieniu master mixu.</li>
		<li>Przykryj hydrożele 170 µL uprzednio ogrzanej pełnej pożywki do hodowli. Inkubuj przez 1 h. Po 1 h wymień pożywkę hodowlaną. 
		UWAGA: Komórki osadzone w hydrożelu są gotowe do dalszych eksperymentów lub analiz w systemie hodowli 3D. Postępuj zgodnie z dodatkowymi protokołami w zależności od wymagań dla kolejnych etapów analiz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekspozycja na fotobiomodulację
<ol>
	<li>Konfiguracja lasera
	<ol>
		<li>Skonfiguruj system laserów diodowych dla długości fali zielonej (525 nm) lub bliskiej podczerwieni (825 nm). Włącz lasery i pozwól im rozgrzać się przez zalecany czas.</li>
		<li>Stabilizuj moc wyjściową laserów, dopóki nie osiągną stanu ustalonego. Zapewnia to spójne i dokładne naświetlanie.</li>
		<li>Zmień moc wyjściową laserów za pomocą miernika mocy laserowej. Zapisz wartości mocy dla każdej długości fali.</li>
		<li>Użyj równania 1 (Czas naświetlania laserem), aby obliczyć czas naświetlania laserem. Podstaw wartości z Tabeli 2 do równania 1, aby określić odpowiedni czas naświetlania dla każdej gęstości energii (fluencji). W równaniu 1 „r” oznacza promień strefy naświetlania lasera. 
		<img alt="Wzór obliczania gęstości mocy, mW/cm² = mW/(π×r²), stosowany w pomiarach optycznych." src="/files/ftp_upload/66616/66616eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
		<img alt="Wzór konwersji gęstości mocy z W/cm² na mW/cm², równanie do obliczeń naukowych." src="/files/ftp_upload/66616/66616eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> 
		<img alt="Wzór obliczania czasu, \( \text{Time (s)} = \frac{J/\text{cm}^2}{W/\text{cm}^2} \), analiza fotoniki." src="/files/ftp_upload/66616/66616eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"> 
		Równanie 1</li>
		<li>Kieruj się Tabelą 2 w celu uzyskania konkretnych parametrów niezbędnych do obliczeń, w tym gęstości energii (5 J/cm² lub 10 J/cm²) oraz mocy wyjściowej lasera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naświetlanie 3D hodowli komórkowych
	<ol>
		<li>Po wymianie pełnej pożywki (krok 2.2.9) umieść płytkę 96-dołkową zawierającą komórki wbudowane w hydrożel pod systemem laserów diodowych. Naświetlaj hydrożele przez obliczony czas naświetlania dla wybranej gęstości energii (5 J/cm² lub 10 J/cm²) przy wybranej długości fali (zielonej lub bliskiej podczerwieni). W ten sposób hodowle otrzymają tylko jedną dawkę.</li>
		<li>Upewnij się, że każda grupa eksperymentalna posiada grupę kontrolną (n = 4), składającą się z komórek ADSCs wbudowanych w hydrożel bez ekspozycji na PBM. 
		UWAGA: Zawsze noś okulary ochronne odpowiednie dla długości fali światła, z którą pracujesz. Lasery są używane poza komorą bezpieczeństwa, dlatego niezwykle ważne jest zdezynfekowanie obszaru przed użyciem.</li>
		<li>Inkubuj płytki hodowlane w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 85% wilgotności przez czas trwania eksperymentów. Inkubuj płytki przez 24 h przed pierwszą analizą lub przez 10 dni przed drugim okresem analizy, po naświetlaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Morfologia
<ol>
	<li>Inwertowana mikroskopia świetlna
	<ol>
		<li>Włączyć odwrócony mikroskop świetlny i odczekać kilka minut na jego rozgrzanie. Upewnić się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony i skalibrowany.</li>
		<li>Przygotować próbkę do obserwacji na szkiełku przedmiotowym lub w specjalistycznym naczyniu do hodowli komórek, w zależności od konfiguracji eksperymentu. Skalibrować mikroskop w celu uzyskania optymalnych warunków obrazowania.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosować ustawienia ostrości, jasności i kontrastu. Wybrać obiektyw 20x w mikroskopie do obserwacji i rejestracji morfologii komórek.</li>
		<li>Umieścić próbkę na stoliku mikroskopu i odnaleźć interesujące komórki, korzystając z okularu. Obserwować i rejestrować morfologię komórek, korzystając z okularu lub podglądu z kamery. Zwrócić uwagę na kształt, rozmiar oraz wszelkie charakterystyczne cechy komórek.</li>
		<li>Podłączyć moduł kamery do mikroskopu. Skonfigurować kamerę do obrazowania cyfrowego. Upewnić się, że połączenie i komunikacja między kamerą a mikroskopem przebiegają prawidłowo.</li>
		<li>Przechwycić cyfrowe zdjęcia obserwowanych komórek przy użyciu obiektywu 20x. Skorzystać z elementów sterujących kamery, aby dostosować ekspozycję, ostrość i inne odpowiednie parametry. 
		UWAGA: Należy upewnić się, że przechwycone obrazy są wysokiej jakości i stanowią reprezentatywny widok morfologii komórek.</li>
		<li>Uruchomić oprogramowanie do obrazowania na komputerze. Przechwycić obraz i skorzystać z narzędzi analitycznych w programie w celu analizy morfologii komórek.</li>
		<li>Zmierzyć wymiary komórek, policzyć komórki lub przeprowadzić wszelkie analizy właściwe dla celów eksperymentu.</li>
		<li>Dodać do obrazów odpowiedni pasek skali za pomocą oprogramowania. Wykorzystać znane powiększenie obiektywu mikroskopu, aby dokładnie oddać skalę obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analizy biochemiczne
<ol>
	<li>Odzyskiwanie komórek 
	UWAGA: Komórki muszą zostać odzyskane z hydrożelu w formie zawiesiny pojedynczych komórek do dalszych analiz biochemicznych.
	<ol>
		<li>Przygotować enzymatyczny roztwór do odzyskiwania komórek. W warunkach sterylnych przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając enzymatyczny roztwór do odzyskiwania komórek w solance z buforem fosforanowym (PBS) w stosunku 1:20 (roztwór: PBS). Jeśli wymagane jest odzyskanie komórek z określonej liczby żeli lub studzienek, obliczyć całkowitą potrzebną objętość w oparciu o 30 µL roztworu do odzyskiwania na żel.</li>
		<li>Do każdej żelowej studzienki zawierającej komórki do odzyskania dodać 30 µL roztworu roboczego. Aby zapewnić dokładne i równomierne rozprowadzenie roztworu, delikatnie kołysać lub obracać płytką. Inkubować płytkę z roztworem do odzyskiwania zgodnie z zalecanym czasem inkubacji. Informacje te znajdują się zazwyczaj w karcie produktu lub protokole dostarczonym przez producenta.</li>
		<li>Po zakończeniu inkubacji ostrożnie wyjąć płytkę z inkubatora. Wirować płytki przy 1409 x g przez 5 min (20 °C), aby ubić komórki w osad. Zalecane warunki wirowania znajdują się w karcie produktu lub protokole. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usunąć nadsącz, uważając, aby nie zaburzyć osadu komórkowego.</li>
		<li>Delikatnie resuspender osad komórkowy w 220 µL sterylnego PBS. Zapewnić dokładne wymieszanie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek. Komórki są teraz gotowe do dalszych analiz biochemicznych. Należy postępować zgodnie z konkretnymi protokołami dla planowanych analiz, uwzględniając naturę odzyskanych komórek i wymagania układu eksperymentalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test cytotoksyczności dehydrogenazy mleczanowej (LDH)
	<ol>
		<li>Z każdej studzienki ostrożnie pobrać 50 µL pełnej pożywki hodowlanej, dbając o minimalne zaburzenie warstwy komórek.</li>
		<li>Bezpośrednio do każdej studzienki zawierającej pozostałe 50 µL pożywki dodać 50 µL odczynnika do badania cytotoksyczności. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby zapewnić dokładne zmieszanie próbki z odczynnikiem.</li>
		<li>Przygotować kontrolę pozytywną. Przygotować studzienki w trzech powtórzeniach, dodając 5 µL 10-krotnego roztworu lizującego na 50 µL komórek kontroli pozytywnej dołączonych do zestawu.</li>
		<li>Inkubować płytkę w zalecanej temperaturze i czasie. Ten etap pozwala odczynnikowi do badania cytotoksyczności na lizę komórek i uwolnienie LDH do pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Po okresie inkubacji dodać 50 µL roztworu zatrzymującego bezpośrednio do każdej studzienki zawierającej odczynnik do badania cytotoksyczności i lizat komórkowy. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, aby zapewnić prawidłowe zatrzymanie reakcji. 
		UWAGA: Roztwór zatrzymujący hamuje dalsze uwalnianie LDH i zapewnia stabilność wybarwienia.</li>
		<li>Ustawić spektrofotometryczny czytnik płytek zgodnie z instrukcją producenta. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy 490 nm. Długość fali ta jest specyficzna dla kolorymetrycznej detekcji produktu formazanu generowanego w reakcji LDH.</li>
		<li>Odjąć wartości absorbancji tła od obu grup badawczych oraz studni kontrolnych. Odczyty tła uzyskać ze studni zawierających pożywkę i odczynniki do badania cytotoksyczności bez komórek.</li>
		<li>Przeanalizować skorygowane wartości absorbancji dla każdej próbki, aby określić poziom cytotoksyczności. Wyższe wartości absorbancji wskazują na zwiększone uwalnianie LDH, a w konsekwencji na wyższą cytotoksyczność.</li>
		<li>Dla zapewnienia dokładności statystycznej należy upewnić się, że każda grupa eksperymentalna i kontrolna składała się z czterech powtórzeń (krok 3.2.2). Obliczyć i wprowadzić średnią absorbancję każdej grupy i kontroli do odpowiedniego programu statystycznego.</li>
		<li>Porównać wyniki między grupami badawczymi a odpowiednimi kontrolami, aby dokładnie ocenić efekty cytotoksyczne, oraz zapisać wszystkie odczyty absorbancji, obliczenia i warunki eksperymentalne do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test proliferacji ATP
	<ol>
		<li>W warunkach sterylnych zmieszać 50 µL odzyskanych komórek z 50 µL odczynnika ATP w każdej studzience. 
		UWAGA: Dostosować objętość komórek i odczynników w zależności od liczby studzienek i projektu eksperymentalnego. Zachować stałe proporcje dla uzyskania dokładnych wyników.</li>
		<li>Umieścić płytkę na wytrząsarce i wytrząsać energicznie w ciemności przez 5 min. Ten etap zapewnia dokładne wymieszanie komórek z odczynnikiem. Po wytrząsaniu inkubować płytkę przez dodatkowe 25 min w temperaturze pokojowej (RT). Ten okres inkubacji pozwala odczynnikowi na lizę komórek i wygenerowanie sygnału luminescencyjnego proporcjonalnego do ilości obecnego ATP.</li>
		<li>Ustawić czytnik płytek zgodnie z instrukcją producenta w celu detekcji luminescencji. Zmierzyć luminescencję z każdej studzienki zawierającej lizat komórkowy i odczynnik ATP. Upewnić się, że czytnik płytek jest ustawiony na pomiar luminescencji z odpowiednimi parametrami.</li>
		<li>Odjąć odczyty luminescencji tła od obu grup badawczych i studni kontrolnych. Odczyty tła uzyskać ze studni zawierających tylko odczynnik ATP i PBS bez komórek.</li>
		<li>Przeanalizować skorygowane wartości luminescencji dla każdej próbki, aby określić poziom ATP, co odzwierciedla proliferację lub żywotność komórek.</li>
		<li>Dla zapewnienia dokładności statystycznej należy upewnić się, że każda grupa eksperymentalna i kontrolna składała się z czterech powtórzeń (krok 3.2.2). Obliczyć i wprowadzić średnią luminescencję każdej grupy i kontroli do odpowiedniego programu statystycznego.</li>
		<li>Porównać wyniki między grupami badawczymi a odpowiednimi kontrolami, aby dokładnie ocenić proliferację ATP. Zapisać wszystkie odczyty luminescencji, obliczenia i warunki eksperymentalne do późniejszego wykorzystania. 
		UWAGA: W przypadku wszystkich analiz biochemicznych wykonywanych za pomocą zestawów, należy stosować instrukcję zestawu lub protokół dostarczony przez producenta w celu uzyskania szczegółowych informacji, takich jak zalecane czasy inkubacji, stężenia oraz wszelkie dodatkowe kroki lub uwagi. Podczas pracy z chemikaliami i materiałami biologicznymi zawsze należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa w laboratorium.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Photobiomodulation Growth Augmentation of Hydrogel Embedded Stem Cells 

<ol><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+Implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+improving+adipose-derived+stem+cells+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+Trauma%22%5BJournal%5D)">Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration.</a> Burns Trauma. 10, (2022).</li>
<li>Nilforoushzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+embedded+in+an+injectable+thermosensitive+hydrogel%3A+An+in+situ+drug+formation+platform+for+accelerated+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing.</a> ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosensitive+injectable+chitosan%2Fcollagen%2F%CE%B2-glycerophosphate+composite+hydrogels+for+enhancing+wound+healing+by+encapsulating+mesenchymal+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids.</a> ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).</li>
<li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+direct+regeneration+versus+paracrine+effects+of+human+cardiosphere-derived+cells+transplanted+into+infarcted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice.</a> Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).</li>
<li>Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+3d+culture+of+human+adipose-derived+stem+cells+in+an+in-situ+crosslinked+hybrid+hydrogel+composed+of+peg-based+hyperbranched+copolymer+and+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid.</a> Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32(2013).</li>
<li>Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+and+survival+in+the+ischemic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart.</a> The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).</li>
<li>Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery-based+tissue+engineering%3A+General+approaches+and+a+review+of+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments.</a> J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).</li>
<li>Koivunotko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+nanofibrillated+cellulose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel.</a> Biomedicines. 10 (10), 2584(2022).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+tunable+gelatin+hydrogels+enhance+stem+cell+retention+and+improve+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing.</a> Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619(2017).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3d+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Mantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+hydrogels+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Materials. 12 (20), 3323(2019).</li>
<li>Sung, T. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culturing+of+human+adipose-derived+stem+cells+enhances+their+pluripotency+and+differentiation+abilities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities.</a> J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).</li>
<li>Garg, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+force+seeding+of+hydrogels+for+adipose-derived+stem+cell+delivery+in+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell-containing+hyaluronic+acid%2Falginate+hydrogel+improves+vocal+fold+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing.</a> Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+hyaluronic+acid+hydrogel+delivers+adipose-derived+stem+cells+and+promotes+regeneration+of+burn+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury.</a> Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).</li>
<li>Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d">https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d</a> (2024).</li>
<li>Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+hydrogels+for+in+vitro+3d+ovarian+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling.</a> Int J Mol Sci. 23 (6), 3265(2022).</li>
<li>Mashinchian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transcriptomic+profiling+using+cell+encapsulation+identifies+effector+pathways+of+systemic+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging.</a> eLife. 11, e57393(2022).</li>
<li>Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rgd-modified+dextran+hydrogel+promotes+follicle+growth+in+three-dimensional+ovarian+tissue+culture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice.</a> Theriogenology. 183, 120-131 (2022).</li>
<li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+some+labs+put+more+bio+into+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">How some labs put more bio into biomaterials.</a> Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).</li>
<li>Marques, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobiomodulation+therapy+weaknesses%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Dent+Sci%22%5BJournal%5D)">Photobiomodulation therapy weaknesses.</a> Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).</li>
<li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+mitochondrial+redox+signaling+in+photobiomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation.</a> Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+controllable+blue+LEDs+irradiation+enhances+human+dental+pulp+stem+cells+osteogenic+differentiation+via+transient+receptor+potential+vanilloid+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1.</a> J Photochem Photobiol B. 233, 112472(2022).</li>
<li>Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+photobiomodulation+on+stem+cells+important+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Lasers%22%5BJournal%5D)">Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine.</a> Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).</li>
<li>Bikmulina, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+2d%3A+Effects+of+photobiomodulation+in+3d+tissue-like+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems.</a> J Biomed Opt. 25 (4), 048001(2020).</li>
<li>Ahmadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+photobiomodulation-preconditioned+diabetic+stem+cells+accelerates+ischemic+wound+healing+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats.</a> Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494(2020).</li>
<li>Mao, A. S., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine%3A+Current+therapies+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine: Current therapies and future directions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).</li>
<li>De Andrade, A. L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+photobiomodulation+on+the+behaviour+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures.</a> Lasers Med Sci. 38 (1), 221(2023).</li>
<li>Diniz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobiomodulation+of+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+an+injectable+rhbmp4-loaded+hydrogel+directs+hard+tissue+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering.</a> J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).</li>
<li>Carter, M., Shieh, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarter%2C+M+%22Guide+to+Research+Techniques+in+Neuroscience%22">Guide to Research Techniques in Neuroscience</a>. , Elsevier, Academic Press. (2015).</li>
<li>Lutolf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+matrix+metalloproteinase-sensitive+hydrogels+for+the+conduction+of+tissue+regeneration%3A+Engineering+cell-invasion+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).</li>
<li>Robledo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+derived+from+the+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+self-organize+in+complex+adipose+organoids+and+secrete+leptin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin.</a> Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70(2023).</li>
<li>Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+of+mitotic+cells+from+the+surface+of+multicell+spheroids+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth.</a> J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).</li>
<li>Bogacheva, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+definitive+endoderm+cells+in+various+flexible+three-dimensional+cell+culture+systems%3A+Possibilities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 726499(2021).</li>
<li>Chen, X., Thibeault, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+a+synthetic+extracellular+matrix+on+immortalized+vocal+fold+fibroblasts+in+3-d+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture.</a> Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).</li>
<li>Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+and+consecutive+application+of+near-infrared+and+green+irradiation+modulates+adipose+derived+stem+cell+proliferation+and+affect+differentiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors.</a> Biochimie. 196, 225-233 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

ADSC są idealnym typem komórek do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, ponieważ stymulują różne procesy, aby pomóc w gojeniu się ran 3,4. Istnieje jednak kilka wyzwań, które należy obejść, np. słabe wskaźniki przeżycia i nieskuteczne wszczepienie komórek w miejsce urazu9. Unieśmiertelnione komórki wykorzystano jako dostępną na rynku linię komórkową, ponieważ mogą być pasażowane przez więcej pokoleń w porównaniu z komórkami pierwotnymi, nie trzeba ich zbierać, są dobrze scharakteryzowane i stanowią jednorodne populacje zapewniające spójne wyniki31. Celem pracy było określenie potencjału augmentacyjnego PBM na proliferację i cytotoksyczność ADSC z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D. Protokół producenta dla hydrożelu o pojemności 30 μl został dostosowany do 10 μl, aby zaoszczędzićkoszty 32. Jednak ta zmniejszona objętość utrudniała przygotowanie i obchodzenie się z żelem.
Wykazano, że ADSC same agregują się w środowisku3D 33. Podobnie w tym badaniu, komórki utworzyły agregaty komórkowe o wyglądzie przypominającym winogrona. Zidentyfikowano jednak również komórki nieśne. Złuszczanie komórek jest znaną właściwością sferoid, w której komórki odłączają się od głównego ciała sferoidalnego lub zbiorczego i są uwalniane do środowiska hodowli. Wydalanie komórek może wynikać z proliferacji komórek, w której żywe komórki są zrzucane podczas mitozy i umożliwiają migrację34. Alternatywnie, linienie może nastąpić z powodu śmierci komórki i utraty sferoidalnego lub zagregowanego kształtu35, szczególnie w bardzo dużych sferoidach z powodu rosnącego nekrotycznego rdzenia. Komórki przyjęły zaokrągloną morfologię w hodowli 3D, w porównaniu z kształtem wrzeciona w hodowlach 2D. Zgodnie z wynikami podobnych badań, wyniki te wynikają z braku miejsc przyczepu lub macierzy zewnątrzkomórkowej, do której komórki mogłyby przylegać do 6,9. Co więcej, komórki nie wykazały znaczącej migracji w żelu, co dodatkowo sugeruje potrzebę miejsc przyłączenia36. Zaleca się dodanie peptydu adhezyjnego lub innego białka macierzy zewnątrzkomórkowej w celu ułatwienia przyłączenia, adhezji i migracji. Ograniczeniem badania było zastosowanie mikroskopii światła odwróconego do obserwacji morfologii 3D ADSC zamiast układania w stosy Z. Ekspozycja na PBM i hodowla 3D nie miały znaczącego wpływu na cytotoksyczność ADSC zarówno po 24 godzinach, jak i 10 dniach od ekspozycji, co wskazuje, że hodowla hydrożelu i PBM są bezpieczne i nie mają negatywnego wpływu na komórki 6,26. W hodowli komórkowej 3D ADSC są związane z wolniejszym tempem proliferacji w porównaniu z hodowlą komórkową 2D. Potwierdzają to niskie wskaźniki proliferacji w grupie kontrolnej w obecnym badaniu6. PBM (525 nm i 825 nm) znacznie zwiększył tempo proliferacji ADSC w hodowli 3D. Początkowo zielone światło (525 nm) zarówno o płynności 5 J/cm2, jak i 10 J/cm2 wywoływało najwyższe tempo proliferacji w porównaniu ze światłem bliskiej podczerwieni (825 nm). Jednak po 10 dniach światło bliskiej podczerwieni (825 nm) ma najwyższe tempo proliferacji zarówno przy płynności 5 J/cm2, jak i 10 J/cm2. Podobnie wykazano, że PBM (525 nm i 825 nm) zwiększa tempo proliferacji w kulturach 2D37. Zaleca się również uwzględnienie grupy kombinacji długości fal, ponieważ inne badania wykazały synergiczny efekt światła zielonego i bliskiej podczerwieni.
Podsumowując, zastosowany hydrożel jest syntetycznym hydrożelem o ogromnych możliwościach dostosowywania do potrzeb różnych zastosowań. Obecne badanie wykazało, że żel nie ma działania cytotoksycznego na komórki w hodowli przez okres 10 dni. Co więcej, PBM wykazał pozytywny potencjał augmentacyjny poprzez znaczne zwiększenie tempa proliferacji ADSC, mimo że znajduje się w środowisku hodowli 3D. W ten sposób ten hydrożel może służyć jako możliwy nośnik biomateriału do przeszczepu do ran. Przyszłe badania powinny mieć na celu przetestowanie potencjalnej zdolności żelu do wspomagania gojenia się ran za pomocą badań na zwierzętach. Jeśli wyniki badań na zwierzętach są korzystne, przewiduje się, że ADSC pochodzące od pacjentów mogą być zbierane, kapsułkowane i wzmacniane PBM przed przeszczepem do ran, aby pomóc w gojeniu się ran w zastosowaniach klinicznych.

ADSC to mezenchymalne, multipotencjalne komórki progenitorowe zdolne do samoodnawiania się i różnicowania w kilka linii komórkowych. Komórki te mogą być pobrane z frakcji zrębu naczyniowego (SVF) tkanki tłuszczowej podczas procedury lipoaspiracji1. ADSC stały się idealnym typem komórek macierzystych do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, ponieważ komórki te są obfite, minimalnie inwazyjne do pobrania, łatwo dostępne i dobrze scharakteryzowane2. Terapia komórkami macierzystymi oferuje możliwą drogę gojenia się ran poprzez stymulację migracji komórek, proliferacji, neowaskularyzacji i zmniejszanie stanu zapalnego w obrębie ran3,4. Około 80% zdolności regeneracyjnej ADSC można przypisać sygnalizacji parakrynnej za pośrednictwem ich secretome5. Wcześniej sugerowano, że bezpośrednie miejscowe wstrzyknięcie komórek macierzystych lub czynników wzrostu do uszkodzonej tkanki może zakłócić wystarczające mechanizmy naprawcze in vivo6,7,8. Jednak podejście to napotkało kilka wyzwań, takich jak słaba przeżywalność i zmniejszona liczba przeszczepów komórek macierzystych w uszkodzonych tkankach w wyniku środowiska zapalnego 9. Co więcej, jednym z przytoczonych powodów był brak macierzy zewnątrzkomórkowej, która wspierałaby przeżycie i funkcjonalność przeszczepionych komórek10. Aby sprostać tym wyzwaniom, kładzie się obecnie nacisk na rozwój nośników biomateriałów, które wspomagają żywotność i funkcję komórek macierzystych.
Trójwymiarowa (3D) hodowla komórkowa wzmacnia interakcję komórka-komórka i komórka-matryca in vitro, zapewniając środowisko, które lepiej przypomina środowisko in vivo11. Hydrożele były szeroko badane jako klasa nośników biomateriałów, które zapewniają środowisko 3D dla hodowli komórek macierzystych. Struktury te są zbudowane z wody i usieciowanych polimerów12. Enkapsulacja ADSC w hydrożelu praktycznie nie ma wpływu cytotoksycznego na komórki podczas hodowli, przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek6. Komórki macierzyste hodowane w 3D wykazują zwiększoną retencję swojej łodygi i lepszą zdolność różnicowania13. Podobnie, ADSC nasączone hydrożelem wykazały zwiększoną żywotność i przyspieszone zamykanie ran w modelach zwierzęcych14. Co więcej, enkapsulacja hydrożelowa znacznie zwiększa wszczepianie i zatrzymywanie ADSC w ranach15,16. TrueGel3D jest wykonany z polimeru, polialkoholu winylowego lub dekstranu, zestalonego za pomocą środka sieciującego, cyklodekstryny lub glikolu polietylenowego17. Żel jest syntetycznym hydrożelem, który nie zawiera żadnych produktów pochodzenia zwierzęcego, które mogą zakłócać eksperymenty lub wywoływać reakcję immunologiczną podczas przeszczepiania żelu pacjentowi, skutecznie naśladując macierz zewnątrzkomórkową18. Żel jest w pełni konfigurowalny poprzez zmianę składu i poszczególnych składników. Może pomieścić różne komórki macierzyste i wspierać różnicowanie kilku typów komórek, dostosowując sztywność gel19. Miejsca przyłączenia można tworzyć poprzez dodanie peptydów20. Żel ulega degradacji w wyniku wydzielania metaloproteaz, co pozwala na migrację komórek21. Wreszcie, jest przejrzysty i pozwala na techniki obrazowania.
PBM to minimalnie inwazyjna i łatwa do wykonania forma niskopoziomowej terapii laserowej używanej do stymulacji wewnątrzkomórkowych chromoforów. Różne długości fal wywołują różny wpływ na komórki22. Światło w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni stymuluje zwiększoną produkcję trifosforanu adenozyny (ATP) i reaktywnych form tlenu (ROS) poprzez zwiększenie strumienia przez łańcuch transportu elektronów23. Światło w zakresie niebieskim i zielonym stymuluje kanały jonowe bramkowane światłem, umożliwiając niespecyficzny napływ kationów, takich jak wapń i magnez, do komórek, co jest znane z tego, że zwiększa różnicowanie24. Efektem netto jest generowanie wtórnych przekaźników, które stymulują transkrypcję czynników wyzwalających dalsze procesy komórkowe, takie jak migracja, proliferacja i różnicowanie25. PBM może być używany do wstępnego kondycjonowania komórek w celu proliferacji lub różnicowania przed przeszczepieniem komórek do niekorzystnego środowiska, np. uszkodzonej tkanki26. Ekspozycja ADSC na PBM przed i po przeszczepie (630 nm i 810 nm) znacznie poprawiła żywotność i funkcję tych komórek in vivo w modelu szczura z cukrzycą27. Medycyna regeneracyjna wymaga odpowiedniej liczby komórek do skutecznej naprawy tkanek28. W hodowli komórkowej 3D ADSC wiązały się z wolniejszym tempem proliferacji w porównaniu z dwuwymiarową hodowlą komórkową6. Jednak PBM może być używany do wspomagania procesu hodowli komórek 3D ADSC poprzez zwiększanie żywotności, proliferacji, migracji i różnicowania29,30.

<table><tbody><tr><td>Laser diodowy 525 nm</td><td>Narodowe Centrum Laserowe Republiki Południowej Afryki</td><td>EN 60825-1:2007</td><td></td></tr><tr><td>Laser diodowy 825 nm</td><td>Narodowe Centrum Laserowe Republiki Południowej Afryki</td><td>SN 101080908ADR-1800</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki paskowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR782301</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Antybiotyk (0,5%; 0,5 ml)</td></tr><tr><td>Żywotność komórek CellTiter-Glo 3D Test</td><td>Odczynnik ATP Promega</td><td>G9681</td><td>, Zestaw do oznaczania proliferacji</td></tr><tr><td>Corning 2 ml Fiolka kriogeniczna z polipropylenu z gwintem zewnętrznym</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>kriowialna</td></tr><tr><td>CryoSOfree</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9249</td><td>Pożywka do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>CytoTox96 Nieradioaktywna analiza cytotoksyczności</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td>Odczynnik cytotoksyczności</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Pożywka podstawowa (39 ml/44 ml)</td></tr><tr><td>Miernik mocy lasera FieldMate</td><td>Koherentny</td><td>1098297</td><td></td></tr><tr><td>płaskodenna bezbarwna płytka polistyrenowa Corning 96 well</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3370</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td>Wzbogacenie pożywki hodowlanej (5 ml; 10% / 10 ml; 20%)</td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td>Roztwór do płukania</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026280</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Labofuge 400</td><td>Thermo Scientific</td><td>75008371</td><td>Wirówka do płytek 96-dołkowych</td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>ThermoFisher</td><td>75004270</td><td></td></tr><tr><td>Immortalized ADSC</td><td>ATCC</td><td>ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000</td><td>Passage 37</td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 3</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX2000</td><td>Automatyczny licznik komórek do kąpieli wodnej Trypan Blue</td></tr><tr><td>Julabo TW20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615501</td><td>Kąpiel wodna służąca do podgrzewania mediów do 37 & deg; C</td></tr><tr><td>Olympus CellSens Entry</td><td>Olympus</td><td>Wersja 3.2 (23706)&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do obrazowania: cyfrowa akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Olympus CKX41</td><td>Olympus</td><td>SN9B02019</td><td>Mikroskop światła odwróconego</td></tr><tr><td>Aparat Olympus SC30</td><td>Aparat Olympus</td><td>SN57000530</td><td>podłączony do mikroskopu światła odwróconego</td></tr><tr><td>Nieprzezroczystościenne mikropłytki polistyrenowe Corning 96 dołków</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3912</td><td>Nieprzezroczysty dobrze stosowany do luminescencji ATP</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antybiotyk (0,5%; 0,5 ml)</td></tr><tr><td>SigmaPlot 12.0</td><td>Systat Software Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrueGel3D &ndash; True3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRUE3-1KT</td><td>10 &mikro; L</td></tr><tr><td>TrueGel3D Enzymatyczne rozwiązanie do odzyskiwania komórek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRUEENZ 01</td><td>:20</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Thermo Fisher - Invitrogen</td><td>T10282</td><td>0,4% roztwór</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td><td>Gibco</td><td>12563029</td><td>Roztwór do odrywania komórek</td></tr><tr><td>Victor Nivo Czytnik płytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH3522019094</td><td>Czytnik płytek spektrofotometrycznych</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

Three&#45;Dimensional Cell Culture of Adipose-Derived Stem Cells in a Hydrogel with Photobiomodulation Augmentation

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC), posiadające multipotencjalne cechy mezenchymalne podobne do komórek macierzystych, są często stosowane w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich zdolność do różnorodnego różnicowania komórek i zdolność do zwiększania migracji, proliferacji i łagodzenia stanów zapalnych. Jednak ADSC często stają przed wyzwaniami związanymi z przeżyciem i wszczepieniem w rany, głównie z powodu niekorzystnych stanów zapalnych. Aby rozwiązać ten problem, opracowano hydrożele, które podtrzymują żywotność ADSC w ranach i przyspieszają proces gojenia się ran. W tym przypadku naszym celem była ocena synergicznego wpływu fotobiomodulacji (PBM) na proliferację ADSC i cytotoksyczność w ramach hodowli komórkowych 3D. Unieśmiertelnione ADSC rozsiano w 10 μl hydrożeli o gęstości 2,5 x 103 komórek i poddano naświetlaniu przy użyciu diod o długości fali 525 nm i 825 nm o płynności 5 J/cm2 i 10 J/cm2. Zmiany morfologiczne, cytotoksyczność i proliferację oceniano po 24 godzinach i 10 dniach od ekspozycji na PBM. ADSC wykazywały zaokrągloną morfologię i były rozproszone w żelu jako pojedyncze komórki lub agregaty sferoidalne. Co ważne, zarówno PBM, jak i struktura hodowli 3D nie wykazywały działania cytotoksycznego na komórki, podczas gdy PBM znacznie zwiększyły tempo proliferacji ADSC. Podsumowując, badanie to demonstruje zastosowanie hydrożelu jako odpowiedniego środowiska 3D do hodowli ADSC i przedstawia PBM jako istotną strategię augmentacji, w szczególności odnosząc się do powolnych temp proliferacji związanych z hodowlą komórek 3D.

W celu oceny morfologii i wizualnej inspekcji gęstości komórek w hydrożelach zastosowano mikroskopię odwróconą (Rysunek 2). Komórki ADSCs zachowały zaokrągloną morfologię 24 h po wysianiu i ekspozycji na PBM. Komórki były rozproszone w całej objętości żelu jako pojedyncze komórki lub w skupiskach przypominających grona winogrosza. Morfologia nie uległa zmianie po 10 dniach hodowli 3D. Nie odnotowano jednoznacznych różnic w morfologii pomiędzy grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi ani pomiędzy poszczególnymi grupami eksperymentalnymi.
Aby ocenić efekty cytotoksyczne ekspozycji na PBM oraz hodowli 3D z użyciem hydrożelu, zmierzono wyciek LDH (Rysunek 3). Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi po 24 h lub 10 dniach, co wskazuje, że ekspozycja na PBM oraz hodowla w hydrożelu nie miały szkodliwego wpływu na komórki.
Szybkość proliferacji komórek mierzono poprzez oznaczenie zawartości ATP w ADSC (Rysunek 4). Ekspozycja na PBM doprowadziła do zwiększenia tempa proliferacji we wszystkich grupach eksperymentalnych w porównaniu z grupami kontrolnymi. W 24 h po ekspozycji na PBM najwyższe tempo proliferacji stymulowała długość fali 525 nm. Jednak w 10. dniu długość fali 825 nm wykazała wyższy stopień proliferacji w porównaniu z długością fali 525 nm. Pod koniec 10-dniowego okresu hodowli najwyższą szybkość proliferacji odnotowano w grupie 825 nm, 10 J/cm2.
<img alt="Przygotowanie hydrożelu, ekspozycja na PBM, analizy; polimer, mikroskopia, cytotoksyczność, proliferacja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66616/66616fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu. Podsumowanie protokołu przedstawiające przygotowanie hydrożelu w płytkach 96-dołkowych, ekspozycję na PBM oraz pomiar morfologii i analizy biochemiczne po 24 h i 10 dniach od ekspozycji na PBM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66616/66616fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Morfologia komórek, obraz mikroskopowy, skala 60 μm, eksperyment analizujący zmienność struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66616/66616fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: ADSC po samoagregacji po wysiewaniu. Komórki zachowały morfologię od okrągłej do owalnej i były rozmieszczone w hydrożelu jako pojedyncze komórki lub agregaty o wyglądzie przypominającym grona winogron w (A) 24 h i (B) 10 dni po wysiewaniu i ekspozycji na PBM. Po 10 dniach inkubacji nie zaobserwowano definitywnych zmian. Zastosowano kontrole (1 i 4), 525 nm przy 5 J/cm2 (2) i 10 J/cm2 (5) lub 825 nm przy 5 J/cm2 (3) i 10 J/cm2 (6), odpowiednio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66616/66616fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Aktywność enzymu LDH, wykres przedstawiający absorbancję przy 490 nm dla różnych zabiegów świetlnych w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66616/66616fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wyciek komórkowej LDH jako pomiar cytotoksyczności 24 h i 10 dni po ekspozycji na PBM, z użyciem diod 525 nm i 825 nm (5 J/cm2 i 10 J/cm2) w hydrożelu. Nie zaobserwowano istotnego wzrostu cytotoksyczności w porównaniu z kontrolą eksperymentalną. Kontrola dodatnia była reprezentatywna dla całkowitej śmierci komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66616/66616fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy luminescencji ATP; efekty przy 525 nm i 825 nm w czasie; analiza danych fotonicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66616/66616fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Komórkowe ATP jako miara proliferacji 24 h i 10 dni po ekspozycji na PBM, z użyciem diody 525 nm i 825 nm (5 J/cm2 oraz 10 J/cm2) w hydrożelu. Ekspozycja na PBM stymulowała wzrost tempa proliferacji we wszystkich grupach eksperymentalnych w obu punktach czasowych i przy obu gęstościach energii. Istotne różnice (P &lt; 0,001) są oznaczone przez ***. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66616/66616fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Objętość (µL) na dołek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polimer SLO-dekstran (30 mmol/L)</td>
			<td>0.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zawiesina komórkowa</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieciujący / czynnik sieciujący</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Objętości odczynników dla hydrożelu (10 µL).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametry lasera</td>
			<td>Zielony (G)</td>
			<td>Bliska podczerwień (NIR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Źródło światła</td>
			<td>Laser diodowy</td>
			<td>Laser diodowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość fali (nm)</td>
			<td>525</td>
			<td>825</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moc wyjściowa (mW)</td>
			<td>553</td>
			<td>515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gęstość mocy (mW/cm²)2)</td>
			<td>57.48</td>
			<td>53.53</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Parametry lasera.

Tutaj prezentujemy protokół demonstrujący użycie hydrożelu jako trójwymiarowego (3D) szkieletu hodowli komórek do hodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i wprowadzający fotobiomodulację (PBM) w celu zwiększenia proliferacji ADSC w warunkach hodowli 3D.

Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

Adipose-derived stem cells (ADSCs), possessing multipotent mesenchymal characteristics akin to stem cells, are frequently employed in regenerative ...

Dane z badań nad laserami prowadzą do badań nad fototerapią lub promieniowaniem laserowym tkanek biologicznych, koncentrując się na fotobiomodulacji komórek macierzystych w terapii regeneracyjnej. W tym badaniu badamy fotobiomodulację komórek macierzystych w komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu trójwymiarowej hodowli komórkowej. Ostatnie badania koncentrują się na połączeniu fotobiomodulacji i komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w terapii regeneracyjnej komórek macierzystych.Badania wykazały, że fotobiomodulacja zwiększa żywotność, proliferację i różnicowanie komórek macierzystych, potential. 3D techniki hodowli komórkowych naprzód badania nad fotobiomodulacją, ponieważ hodowla komórkowa 3D zapewnia nam fizjologicznie odpowiednie środowisko do badania zachowania komórek. Obecne badanie wykazało, że hydrożel nie ma działania cytotoksycznego na komórki w ciągu 10-dniowego okresu hodowli oraz że fotobiomodulacja ma znaczny pozytywny potencjał wspomagający i może znacznie zwiększyć tempo proliferacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, mimo że znajdują się w trójwymiarowej hodowli komórkowej.Wyniki prowadzonych badań utorują drogę do opracowania wystandaryzowanych parametrów fotobiomodulacji i warunków hodowli w celu różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w różne wyspecjalizowane typy komórek, zwłaszcza koenocyty. Na początek przenieś 44 mililitry podłoża podstawowego do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj pięć mililitrów 10% FBS do pożywki, a następnie pipetuj po 0,5 mililitra roztworów antybiotyków penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B.Odwirować fiolkę zawierającą szybki roztwór dekstranu o stężeniu 1000 G przez 30 sekund w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Dodaj 175 mikrolitrów wody do fiolki, aby uzyskać końcowe stężenie 30 milimoli na litr. Wiruj probówkę przez 30 sekund ze średnią prędkością, aż materiał całkowicie się rozpuści.Inkubować rozpuszczony materiał na lodzie przez pięć minut. Odwiruj probówkę przed ponownym wirowaniem jej zawartości. Następnie umieść probówkę na lodzie do dalszego użycia.Następnie odwiruj środek sieciujący, aby zagęścić materiał. Odpipetować 188 mikrolitrów wody do fiolki sieciującej, aby uzyskać końcowe stężenie 20 milimoli na litr grup tiolowych. Wiruj roztwór sieciujący, aż cały materiał się rozpuści.Po inkubacji odwirować probówkę, a następnie krótko zwirować przed umieszczeniem jej w temperaturze pokojowej do dalszego użycia. Następnie przygotuj zawiesinę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej na 10 mikrolitrów hydrożelu, jak podano w tabeli, aby stworzyć mieszankę wzorcową. Przenieść dziewięć mikrolitrów mieszanki wzorcowej do dołka w 96-dołkowej płytce paskowej.Po trzech minutach dodaj jeden mikrolitr degradowalnego środka sieciującego do mieszanki, aby zestalić żel. Odpipetować 170 mikrolitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej na hydrożele. Po inkubacji wymienić pożywkę hodowlaną.Aby rozpocząć, skonfiguruj system lasera diodowego na zieloną długość fali. Włącz lasery i pozwól im się rozgrzać przez zalecany czas. Po osiągnięciu przez lasery stanu ustalonego i ustabilizowaniu się, użyj miernika mocy lasera, aby zmierzyć moc wyjściową laserów.Zapisz wartości mocy dla każdej długości fali. Po wymianie kompletnej pożywki należy umieścić pod systemem lasera diodowego płytkę studzienkową zawierającą komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej zatopione w hydrożelu. Naświetlić hydrożele obliczonym czasem naświetlania laserem dla wybranej płynności na wybranej długości fali.Upewnić się, że każda grupa doświadczalna ma kontrolę nienapromienioną. Inkubuj płytki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenku węgla i wilgotnością 85%. Następnie rozcieńczyć enzymatyczny roztwór do odzyskiwania komórek PBS w stosunku od 1 do 20, aby przygotować roztwór roboczy.Dodaj 30 mikrolitrów roztworu roboczego do każdego żelu lub studzienki zawierającej komórki wymagające regeneracji. Delikatnie kołysz lub obracaj płytkę, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie roztworu regeneracyjnego. Inkubować płytkę z roztworem regeneracyjnym przez 45 minut.Po inkubacji ostrożnie wyjąć płytkę z inkubatora. Odwirować płytki w temperaturze 1,409 G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza w celu osadzenia komórek. Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.Odpipetować 220 mikrolitrów sterylnego PBS do granulatu. Zapewnić dokładne wymieszanie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej zachowały zaokrągloną morfologię 24 godziny po wysiewie i ekspozycji na fotobiomodulację.Komórki były rozrzucone po całym żelu jako pojedyncze komórki lub w gronach przypominających winogrona. Morfologia pozostała niezmieniona po 10 dniach w hodowli 3D.

three-dimensional-cell-culture-adipose-derived-stem-cells-hydrogel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Tutaj prezentujemy protokół enkapsulacji komórek katabolicznych, które zużywają lipidy do produkcji ciepła w tkance tłuszczowej w jamie brzusznej i zwiększają rozpraszanie energii u otyłych myszy.

Enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu (SVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje łatwy i skuteczny nośnik dla żywotnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej dla różnych wskazań, w tym inżynierii tkankowej i/lub gojenia się ran. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie mechanicznego konstruktu hydrożelowego SVF (mSVF)-fibryna do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.

Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Poznaj trójwymiarową hodowlę komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z zastosowaniem fotobiomodulacji. Metoda zwiększa proliferację ADSC bez efektów cytotoksycznych.

Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną (Wideo) | JoVE Journal

Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

Przeglądaj więcej filmów