Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

Dane z badań nad laserami prowadzą do badań nad fototerapią lub promieniowaniem laserowym tkanek biologicznych, koncentrując się na fotobiomodulacji komórek macierzystych w terapii regeneracyjnej. W tym badaniu badamy fotobiomodulację komórek macierzystych w komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu trójwymiarowej hodowli komórkowej. Ostatnie badania koncentrują się na połączeniu fotobiomodulacji i komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w terapii regeneracyjnej komórek macierzystych.

Badania wykazały, że fotobiomodulacja zwiększa żywotność, proliferację i różnicowanie komórek macierzystych, potential. 3D techniki hodowli komórkowych naprzód badania nad fotobiomodulacją, ponieważ hodowla komórkowa 3D zapewnia nam fizjologicznie odpowiednie środowisko do badania zachowania komórek. Obecne badanie wykazało, że hydrożel nie ma działania cytotoksycznego na komórki w ciągu 10-dniowego okresu hodowli oraz że fotobiomodulacja ma znaczny pozytywny potencjał wspomagający i może znacznie zwiększyć tempo proliferacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, mimo że znajdują się w trójwymiarowej hodowli komórkowej.

Wyniki prowadzonych badań utorują drogę do opracowania wystandaryzowanych parametrów fotobiomodulacji i warunków hodowli w celu różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w różne wyspecjalizowane typy komórek, zwłaszcza koenocyty. Na początek przenieś 44 mililitry podłoża podstawowego do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj pięć mililitrów 10% FBS do pożywki, a następnie pipetuj po 0,5 mililitra roztworów antybiotyków penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B.

Odwirować fiolkę zawierającą szybki roztwór dekstranu o stężeniu 1000 G przez 30 sekund w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Dodaj 175 mikrolitrów wody do fiolki, aby uzyskać końcowe stężenie 30 milimoli na litr. Wiruj probówkę przez 30 sekund ze średnią prędkością, aż materiał całkowicie się rozpuści.

Inkubować rozpuszczony materiał na lodzie przez pięć minut. Odwiruj probówkę przed ponownym wirowaniem jej zawartości. Następnie umieść probówkę na lodzie do dalszego użycia.

Następnie odwiruj środek sieciujący, aby zagęścić materiał. Odpipetować 188 mikrolitrów wody do fiolki sieciującej, aby uzyskać końcowe stężenie 20 milimoli na litr grup tiolowych. Wiruj roztwór sieciujący, aż cały materiał się rozpuści.

Po inkubacji odwirować probówkę, a następnie krótko zwirować przed umieszczeniem jej w temperaturze pokojowej do dalszego użycia. Następnie przygotuj zawiesinę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej na 10 mikrolitrów hydrożelu, jak podano w tabeli, aby stworzyć mieszankę wzorcową. Przenieść dziewięć mikrolitrów mieszanki wzorcowej do dołka w 96-dołkowej płytce paskowej.

Po trzech minutach dodaj jeden mikrolitr degradowalnego środka sieciującego do mieszanki, aby zestalić żel. Odpipetować 170 mikrolitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej na hydrożele. Po inkubacji wymienić pożywkę hodowlaną.

Aby rozpocząć, skonfiguruj system lasera diodowego na zieloną długość fali. Włącz lasery i pozwól im się rozgrzać przez zalecany czas. Po osiągnięciu przez lasery stanu ustalonego i ustabilizowaniu się, użyj miernika mocy lasera, aby zmierzyć moc wyjściową laserów.

Zapisz wartości mocy dla każdej długości fali. Po wymianie kompletnej pożywki należy umieścić pod systemem lasera diodowego płytkę studzienkową zawierającą komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej zatopione w hydrożelu. Naświetlić hydrożele obliczonym czasem naświetlania laserem dla wybranej płynności na wybranej długości fali.

Upewnić się, że każda grupa doświadczalna ma kontrolę nienapromienioną. Inkubuj płytki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenku węgla i wilgotnością 85%. Następnie rozcieńczyć enzymatyczny roztwór do odzyskiwania komórek PBS w stosunku od 1 do 20, aby przygotować roztwór roboczy.

Dodaj 30 mikrolitrów roztworu roboczego do każdego żelu lub studzienki zawierającej komórki wymagające regeneracji. Delikatnie kołysz lub obracaj płytkę, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie roztworu regeneracyjnego. Inkubować płytkę z roztworem regeneracyjnym przez 45 minut.

Po inkubacji ostrożnie wyjąć płytkę z inkubatora. Odwirować płytki w temperaturze 1,409 G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza w celu osadzenia komórek. Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.

Odpipetować 220 mikrolitrów sterylnego PBS do granulatu. Zapewnić dokładne wymieszanie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej zachowały zaokrągloną morfologię 24 godziny po wysiewie i ekspozycji na fotobiomodulację.

Komórki były rozrzucone po całym żelu jako pojedyncze komórki lub w gronach przypominających winogrona. Morfologia pozostała niezmieniona po 10 dniach w hodowli 3D.