Name: Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę tandemowej spektrometrii mas LC-MS do szybkiej analizy i klasyfikacji alkaloidów tropanowych w roślinach. Technika ta umożliwia odkrywanie nowych związków o potencjalnym znaczeniu leczniczym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Grant Badawczy Wydziału (Northern Michigan University, przyznany M.A.C.), stypendium badawcze dla studentów (Northern Michigan University, przyznane J.C.) oraz Wydział Chemii. Autorzy pragną podziękować Johnowi Bergerowi (NMU) za pomoc w przygotowaniu tkanek roślinnych, Hannah Hawkins (NMU) za konserwację LC-MS i pomoc w rozwiązywaniu problemów, a także dr Ryanowi Fornwaldowi i jego studentom CH 495 (Synteza Produktów Naturalnych) za przygotowanie mieszanki acetylotropiny. Autorzy pragną również podziękować dr. Danielowi Jonesowi (Michigan State University) za uzyskanie widm MS/MS o wysokiej rozdzielczości.

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) przed użyciem wymienionych chemikaliów.
1. Przygotowanie próbki
UWAGA: Ciekły azot może powodować oparzenia kriogeniczne. Używaj rękawic kriogenicznych i ochrony oczu w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Próbki roślin zawierające alkaloidy mogą działać drażniąco na skórę; Zawsze obchodź się z nimi w rękawiczkach. Metanol jest toksyczny i łatwopalny i należy go przenosić w dygestorium, z dala od potencjalnych źródeł zapłonu.
UWAGA: Teoretycznie można użyć uprawianej lub dzikiej tkanki roślinnej (suszonej lub mielonej świeżej); poniższa procedura jest właśnie tą wykorzystywaną podczas opracowywania metody.
<ol>
	<li>Jeśli interesująca nas tkanka roślinna jest świeża, zamroź ją, umieszczając ją w stożkowej rurce polipropylenowej i zanurzając w ciekłym azocie na 2-3 minuty.</li>
	<li>Zamrożoną tkankę roślinną umieścić we wstępnie schłodzonym moździerzu (w chłodnicy styropianowej z ciekłym azotem) i za pomocą wstępnie schłodzonego tłuczka zmielić tkankę na jednolity proszek.</li>
	<li>Szybko zważyć żądaną ilość tkanki do wytarowanej polipropylenowej probówki wirówkowej za pomocą wstępnie schłodzonej szpatułki i natychmiast dodać 20% metanolu (w temperaturze pokojowej [RT]) w stężeniu 1 ml na każde 100 mg tkanki. 
	UWAGA: Metanol (20%) jest powszechnie używany do ekstrakcji TAs25. Czasami dodaje się 0,1% kwasu mrówkowego, chociaż podczas opracowywania tej i innych metod nie zaobserwowano różnicy w wydajności ekstrakcji.</li>
	<li>Umieść zakręcone rurki na wytrząsarce na biegunach (średnia prędkość) na minimum 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 9464 x g przez 10 minut. Odpipetować supernatant do fiolki z automatycznym samplerem LC-MS lub, jeśli nadal jest mętny, przefiltrować najpierw przez filtr strzykawkowy 0,45 μm. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać stosowanie protokołu, chociaż przetworzone świeże próbki i ekstrakty roślinne powinny być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C przed analizą, aby uniknąć potencjalnej degradacji alkaloidów.</li>
</ol>
2. Konfiguracja przyrządu LC-MS i zbieranie danych
UWAGA: Acetonitryl jest toksyczny i łatwopalny; trzymaj z dala od źródeł zapłonu i kontroluj opary za pomocą dygestorium. Kwas mrówkowy jest; Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Użyj przyrządu LC-MS ze źródłem jonizacji elektrorozpylania (ESI) i kolumną HPLC z odwróconymi fazami (C18, 4,6 x 100 mm).</li>
	<li>W przypadku HPLC należy użyć 0,1% kwasu mrówkowego wH2Ojako rozpuszczalnika A i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu jako rozpuszczalnika B; zrównoważyć kolumnę z 99% A i 1% B. Skonfigurować 30-minutowy gradient 1%-50% B przez 26 minut, powracając do 1% B po 26,01 min i utrzymując 1% B przez 4 minuty. Użyj temperatury pieca kolumnowego 45 °C i natężenia przepływu 0,5 ml/min.</li>
	<li>W metodzie LC-MS stosuje się następujące parametry pracy spektrometru mas: napięcie interfejsu: 4,0 kV, przepływ gazu nebulizacyjnego: 3 l/min, przepływ gazu grzewczego: 10 l/min, temperatura DL: 250 °C, temperatura bloku grzewczego: 400 °C, temperatura interfejsu: 300 °C, przepływ gazu suszącego: 10 l/min oraz ciśnienie gazu (argonu) wywołanej zderzeniem (CID) 17 kPa.</li>
	<li>Zbuduj metodę MS w trybie dodatnim ESI, która obejmuje zarówno skanowanie Q3, jak i Q1 (100-1000 Da), które działa jako zdarzenie badawcze (ustawione na długość metody LC), z włączonym automatycznym wykluczaniem izotopów. Uwzględnij skan jonów produktu jako zdarzenie zależne od skanu Q1 (analiza DD), z oknem masowym 50-1000 Da, energią ogniwa zderzeniowego -20 V i czasem zdarzenia <0,2 s. 
	UWAGA: Próg zliczania dla wyzwolenia skanowania jonów produktu DD w Q1 może być zmienny, ale zazwyczaj używany jest poziom 7 000-10 000 zliczeń. W przypadku niektórych instrumentów, takich jak ten, który został użyty do opracowania metody, skan Q3 zapewnia większą dokładność masy i czułość niż Q1 i jest uwzględniany w celu potwierdzenia jonów zaobserwowanych w skanie Q1, chociaż można go bez problemu pominąć w kroku 2.4.</li>
	<li>Do powyższej metody MS należy dodać PrIS w postaci dodatniej równe długości metody LC o energiach ogniw zderzeniowych -20 V i czasach zdarzeń 0,75 s. Upewnij się, że we wszystkich przypadkach włączone są funkcje automatycznego wykluczania izotopów lub deizotopowania. Upewnij się, że interesujące wartości m/z dla fragmentów TA (w Da, patrz Rysunek 1A) wynoszą 124.1 (dla monopodstawionych TA, okno masowe 125-1000 Da), 122.1 i 140.1 (dla podstawionych TA, okna mas zaczynające się odpowiednio od 123 i 141 Da) oraz 156.1 i 138.1 (dla trójpodstawionych TA, okna masowe zaczynające się od 157 i 139 Da, odpowiednio). 
	UWAGA: Podczas opracowywania metody, PrIS zostały podzielone na dwie różne metody, jedną dla mono- i dipodstawionych TA, a drugą dla tripodstawionych TA, chociaż można je podzielić lub połączyć w dowolny sposób.</li>
	<li>Utwórz drugą metodę MS, która zawiera parametry w kroku 2.4.
	<ol>
		<li>Do tej metody MS/MS dodaj NLS w trybie dodatnim równą długości metody LC, z energiami ogniw zderzeniowych -20 V i czasami zdarzeń 0,75 s. Upewnij się, że we wszystkich przypadkach włączone są funkcje automatycznego wykluczania lub deizotopowania izotopów.</li>
		<li>Upewnij się, że neutralne masy strat będące przedmiotem zainteresowania dla estrów na TA (w Da, patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) wynoszą 100,05 (dla estrów pochodzących z kwasu tiglowego, okno masowe 110-1000 Da), 60,03 (dla grup acetylowych, okno masowe 100-1000 Da) i 166,06 (estry kwasu fenylomlekowego lub tropikalnego, okno masowe 170-1000 Da).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobierz metodę LC-MS i utwórz pliki danych dla interesujących Cię próbek. Po zrównoważeniu kolumny HPLC w temperaturze 45 °C, należy uruchomić próbki będące przedmiotem zainteresowania w pliku partii lub projektu z odpowiednimi ślepymi próbami rozpuszczalnika ekstrakcyjnego między różnymi gatunkami lub typami tkanek. Typowa objętość wtrysku wynosi 10-20 μL. 
	UWAGA: Przy szczególnie dużych głośnościach detektor spektrometru mas może być nasycony. W przypadku bardzo skoncentrowanych próbek, należy upewnić się, że źródło ESI jest oczyszczone, a instrument jest regularnie strojony. W tym miejscu protokół można wstrzymać po zebraniu wszystkich danych.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Zbadaj całkowity chromatogram jonowy skanów Q1 i Q3 (oraz skan jonów produktu DD) i zanotuj masę macierzystą wszelkich obfitych jonów, które mają cechy podobne do TA: a) masa <500 Da dla jonu [M+H]+, zwykle o masie parzystej, b) typowy r.t.s między 2-22 min przy użyciu powyższej metody LC, oraz c) fragmenty z poniższej listy: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 lub 128 Da.</li>
	<li>Zbadać chromatogram/kanał PrIS dla m/z 124 i zanotować, które piki/jony są przy których rt (zarejestrowane w kroku 3.1) wytwarzają ten fragment. Kliknij skan po skanie przez chromatogram, a także zbadaj pełne widma MS/MS uzyskane w skanowaniu jonów produktu DD, szczególnie dla gatunków o niższej liczebności. 
	UWAGA: Prawdziwy gatunek zawierający ten fragment będzie istniał przez wiele skanów i pojawi się zarówno w skanach Q1, jak i Q3 (jeśli ten drugi jest używany). Arkusz kalkulacyjny jest dołączony do informacji uzupełniających (plik uzupełniający 1), aby pomóc w dodawaniu adnotacji.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.2 z pozostałymi chromatogramami PrIS. Ponieważ zarówno m/z 122, jak i 140 wskazują na dipodstawione TA, a zarówno m/z 138, jak i 156 wskazują na tripodstawione TA, należy zbadać te chromatogramy / kanały razem.</li>
	<li>Zbadaj chromatogram/kanały NLS dla m/z 100, 60 i 166 i zanotuj, które piki/jony, przy których RT (zarejestrowane w kroku 3.1) wytwarzają te neutralne straty. Podobnie jak w przypadku PrIS, należy przechodzić przez chromatogram skan po skanie i porównać z fragmentacją uzyskaną w skanowaniu jonów produktu DD, szczególnie w przypadku gatunków o niższej liczebności.</li>
	<li>Korzystając z kombinacji danych PrIS i NLS, popartych wynikami skanowania jonów produktu DD, dokonaj przypuszczalnych adnotacji obserwowanych alkaloidów, dodając najmniejszą masę tropanu (np. 124, 122 lub 138) i ubytek obojętny, a następnie uwzględniając pozostałą masę. 
	UWAGA: Typowymi grupami podstawiącymi TA (i ich masami w Da) są hydroksyl (18), acetyl (60), propionyl (74), izobutyryl (88), tigloyl (100), nasycony tigloyl/2-metylobutyryl (102) lub fenylolmleczan/kwas tropowy (166).</li>
	<li>Porównaj adnotacje dotyczące alkaloidów z tymi opisanymi w literaturze17 i bazach danych (np. MoNA)26, aby określić, które wzorce substytucji TA są zgłaszane (a które są potencjalnie nowe). Dodatkowo należy stosować wzorce niektórych popularnych alkaloidów tropanowych (np. atropiny, littoryny, skopolaminy), które są dostępne w handlu w celu potwierdzenia.</li>
	<li>Aby uzyskać dodatkowe informacje strukturalne dla próbek o niskiej obfitości (PrIS i NLS mogą wychwytywać jony poniżej progów zdarzenia zależnego), należy pobrać skan określonych jonów produktu (wykorzystując masę będącą przedmiotem zainteresowania jako jon prekursorowy) na bardziej skoncentrowanej próbce. 
	UWAGA: Ta metoda została opracowana na instrumencie QQQ o niskiej rozdzielczości. W przypadku wszystkich przypuszczalnych nowych związków należy użyć instrumentu MS o wysokiej rozdzielczości w celu uzyskania dokładnych widm masowych.</li>
</ol>

Classification of Tropane Alkaloids from Plant Metabolites Using LC-MS/MS

<ol><li>Newman, D. J., Cragg, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+as+sources+of+new+drugs+over+the+30+years+from+1981+to+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010.</a> J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).</li>
<li>Newman, D. J., Cragg, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+as+sources+of+new+drugs+over+the+nearly+four+decades+from+01%2F1981+to+09%2F2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019.</a> J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).</li>
<li>Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropane+alkaloids%3A+Chemistry%2C+pharmacology%2C+biosynthesis+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production.</a> Molecules. 24 (4), 796(2019).</li>
<li>Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beauty+of+the+beast%3A+anticholinergic+tropane+alkaloids+in+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prod+Bioprospect%22%5BJournal%5D)">Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics.</a> Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33(2022).</li>
<li>Web Annex A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Health+Organization+Model+List+of+Essential+Medicines+-+23rd+List%2C+2023%5BTitle%5D)+AND+%22The+Selection+and+Use+of+Essential+Medicines+2023%3A+Executive+Summary+of+the+Report+of+the+24th+WHO+Expert+Committee+on+the+Selection+and+Use+of+Essential+Medicines%22%5BJournal%5D)">World Health Organization Model List of Essential Medicines - 23rd List, 2023.</a> The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , World Health Organization. Geneva. 24-28 (2023).</li>
<li>Kerchner, A., Farkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+poisoning+potential+of+Brugmansia+and+Datura%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura.</a> Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).</li>
<li>Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Datura+delirium%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Datura delirium.</a> Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).</li>
<li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+of+the+panel+on+contaminants+in+the+food+chain+on+a+request+from+the+European+Commission+on+tropane+alkaloids+%28from+Datura+sp.%29+as+undesirable+substances+in+animal+feed%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+J%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed.</a> EFSA J. 691, 1-55 (2008).</li>
<li>González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+and+chemistry+of+Tropane+alkaloids+in+foods%2C+with+a+focus+on+sample+analysis+methods%3A+A+review+on+recent+trends+and+technological+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances.</a> Foods. 11 (3), 407(2022).</li>
<li>Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall'Asta, C., Bruni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+UHPLC-ESI-MS%2FMS+method+for+the+determination+of+tropane+alkaloids+in+herbal+teas+and+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts.</a> Food Control. 105, 285-291 (2019).</li>
<li>Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmorim+Madiera%2C+PJ+%22Tandem+Mass+Spectrometry+-+Applications+and+Principles%22">Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles</a>. Prasain, J. , InTech. London. (2012).</li>
<li>Xing, J., Xie, C., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+natural+products+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis.</a> J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).</li>
<li>Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS+metabolomics+and+chemotaxonomy+of+caffeine-containing+holly+%28Ilex%29+species+and+related+taxa+in+the+Aquifoliaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae.</a> J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).</li>
<li>Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS%2FMS+profile+of+alkaloids+with+cytotoxic+properties+of+selected+medicinal+plants+of+the+Berberidaceae+and+Papaveraceae+families%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longevity%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families.</a> Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872(2017).</li>
<li>Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+alkaloids+and+their+related+tobacco-specific+nitrosamines+in+tobacco+leaves+using+LC-MS-MS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+Sci%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS.</a> J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).</li>
<li>González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+analytical+approach+for+determination+of+tropane+alkaloids+in+leafy+vegetables+based+on+%C2%B5-QuEChERS+combined+with+HPLC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS.</a> Toxins. 14 (10), 650(2022).</li>
<li>Cinelli, M. A., Jones, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaloids+of+the+Genus+Datura%3A+Review+of+a+rich+resource+for+natural+product+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery.</a> Molecules. 26, 2629(2021).</li>
<li>Gonçalves Dantas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dereplication+of+tropane+alkaloids+from+four+Erythroxylum+species+using+liquid+chromatography+coupled+with+ESI-MSn+and+HRESIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629(2023).</li>
<li>Santos, C. L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+networking-based+dereplication+of+strictosidine-derived+monoterpene+indole+alkaloids+from+the+curare+ingredient+Strychnos+peckii%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683(2020).</li>
<li>Qin, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS%2FMS-based+molecular+networking%3A+An+efficient+approach+for+natural+products+dereplication%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication.</a> Molecules. 28, 157(2023).</li>
<li>Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tropane+and+cinnamamide+alkaloids+from+Scopolia+tangutica+by+high-performance+liquid+chromatography+with+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.</a> J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).</li>
<li>Agnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+MS%2FMS+database+for+isoquinoline+alkaloids+and+other+annonaceous+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites.</a> Sci Data. 9 (1), 270(2022).</li>
<li>Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+and+LC-MS%2FMS+workflows+for+the+identification+and+quantitation+of+pyrrolizidine+alkaloids+in+plant+extracts%2C+a+case+study%3A+Echium+plantagineum%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Farmacog%22%5BJournal%5D)">GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum.</a> Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).</li>
<li>Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+strategy+for+discovering+structural+analogues+of+alkaloids+in+plant+food+using+characteristic+structural+fragments+extraction+by+high+resolution+orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22LWT-+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry.</a> LWT- Sci Technol. 154, 112329(2022).</li>
<li>Parks, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+tropane+alkaloid+metabolism+reveals+pyrrolidine+alkaloid+diversity+in+Atropa+belladonna%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna.</a> New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).</li>
<li>MassBank of North America. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu">https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu</a> (2024).</li>
<li>Maier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodaturatin+und+Homofluorodaturatin+-+zwei+neue+%CE%B2-carbolinderivate+in+Samen+von+Datura+stramonium+L.+var.+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Monatsh+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin - zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium.</a> Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).</li>
<li>Jennett-Siems, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxonomy+of+the+pantropical+genus+Merremia+%28Convolvulaceae%29+based+on+the+distribution+of+tropane+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids.</a> Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).</li>
<li>Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+organization+of+scopolamine+biosynthesis+in+Duboisia+myoporoides+R%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R.</a> Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).</li>
<li>Guan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+collision+energy+ramp-MS2+spectrum+in+structural+analysis+relying+on+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS.</a> Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).</li>
<li>Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norlittorine+and+norhyoscyamine+identified+as+products+of+littorine+and+hyoscyamine+metabolism+by+13C-labeling+in+Datura+innoxia+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots.</a> Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3, 211-221 (2007).</li>
<li>Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angeloyl%2C+Tigloyl+and+Senecioyloxytropane+Alkaloids+from+Schizanthus+hookerii%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii.</a> Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).</li>
<li>Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biological+activity+of+alkaloids+from+the+genus+Schizanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus.</a> Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).</li>
<li>Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLounasmaa%2C+M+%22The+Alkaloids%3A+Chemistry+and+Pharmacology%22">The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology</a>. , Academic Press. New York, NY. (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Chociaż parametry urządzenia podane w protokole pozwalają na zadowalającą wydajność, pomyślne zastosowanie tej metody może wymagać szczególnej uwagi lub optymalizacji kilku krytycznych kroków. Chociaż gradient rozpuszczalnika HPLC podany w kroku 2.2 jest ogólnie odpowiedni dla alkaloidów tropanowych, może być konieczna jego modyfikacja w zależności od profilu alkaloidów tropanowych badanej próbki lub gatunku rośliny. Objętość wstrzykiwanej próbki może być również zmieniana w zależności od czułości urządzenia i sposobu stosowania metody. "Głębokie" profilowanie metaboliczne lub dereplikacja powinny wymagać większej objętości wstrzyknięcia (w tym badaniu użyto 15-20 μl), podczas gdy proste wykrywanie alkaloidów może wymagać mniejszych objętości. Przy stosowaniu dużych objętości próbek należy zachować ostrożność w celu a) regularnego czyszczenia źródła jonów, b) monitorowania kolumny HPLC pod kątem zmian ciśnienia lub zatorów (zawsze należy stosować odpowiednią kolumnę ochronną), c) zapobiegania przenoszeniu między próbkami oraz d) badania chromatogramów pod kątem potencjalnego "wycieku izotopu", jak opisano powyżej. Temperatury i napięcia interfejsu nie powinny ulegać znaczącym zmianom w stosunku do temperatur i napięć określonych w metodzie, aby uniknąć przedwczesnej fragmentacji w źródle. Ponadto, chociaż zalecane jest napięcie ogniwa zderzeniowego wynoszące 20 V, może ono nie zapewnić optymalnego sygnału chromatogramu (lub diagnostycznych fragmentów skanowania jonów produktu DD) dla wszystkich TA. Niektóre instrumenty i funkcje MS mają funkcję "narastania energii zderzenia" lub zdolność do zbierania skanów przy wielu lub zoptymalizowanych energiach zderzeń, co również może znaleźć zastosowanie w metodzie takiej jakta.
Ta metoda MS sama w sobie jest również łatwo modyfikowalna: podczas gdy estry kwasu tigliczowego, octowego i fenylolaktowego/tropowego są powszechne u gatunków Datura, wzorce substytucji estrów TA mogą być różne w innych roślinach lub próbkach. Masy NLS można zmienić, aby wykryć inne grupy estrów (np. Utrata 74 Da dla estrów propionowych) lub potencjalnie wykryć glikozylacje (np. Utrata 162 Da dla heksoz). Masy PrIS można również zmieniać. Na przykład, TA w obu próbkach Datura (r.t. = 12,5 min; patrz Plik Uzupełniający 1 i Plik Uzupełniający 2) oznaczono jako norhyoscyjaminę lub norlitorynę (hioscyjamina/littoryna minus grupa N-metylowa tropanu) na podstawie fragmentów skanu jonów produktu DD (m/z 110 i 93) i dopasowano do widm literaturowych31 ; ta TA nie pojawiła się na żadnym z kanałów PrIS fragmentu tropanu. Dla tych dwóch mas można dodać kanał do wykrywania nortropanów. Fragment m/z 93 jest również obecny w większości monopodstawionych TAs17; Dodanie tego kanału może zapewnić dodatkowe potwierdzenie obecności monopodstawionej TA i pomóc w zmniejszeniu liczby wyników fałszywie dodatnich.
Oprócz możliwości adaptacji do różnych typów TA, jedną z głównych zalet tego protokołu (w porównaniu z istniejącymi metodami adnotacji alkaloidów) jest jego szybkość. W zależności od tego, jak skonfigurowana jest metoda MS (i zastosowany czas pracy HPLC), wszystkie dane MS/MS dla próbki można zebrać w ciągu 60-90 minut. Na przykład podczas naszych badań mono- i di-podstawione PrSIS TA były wbudowane w jedną metodę, tripodstawione PrIS TA były w innej metodzie, a NLS były w trzeciej (wszystkie metody zawierały skan jonów produktu DD), w sumie trzy wstrzyknięcia po trzydzieści minut każda. Pełna adnotacja próbki z wykorzystaniem połączonych danych MS/MS jest znacznie szybsza niż ręczne badanie każdego piku lub zbieranie indywidualnych skanów jonów produktu pod kątem wielu interesujących pików. Metoda ta może być wykonywana na dowolnym urządzeniu ze skanowaniem jonów produktu, trybami PrIS i NLS i może być używana do szybkiej oceny jakościowej (tj. czy TA są obecne, czy nie?), do rozróżniania lub "odcisków palców" różnych rodzajów roślin, gatunków, odmian lub odmian, organów lub etapów wzrostu oraz do porównywania obserwowanych TA z tymi zgłoszonymi (w ramach przepływu pracy dereplikacji). Jak wykazano, protokół może być również wykorzystywany do odkrywania nowych TA jako wskazówek do izolacji, oczyszczania lub testów biologicznych, a także do identyfikacji gatunków kandydujących i tkanek, od których należy je wyizolować. Metoda ta może być stosowana w dziedzinie produktów naturalnych i metabolomiki, w tym w celu pomocy w zrozumieniu biochemii roślin i do badań nad odkrywaniem leków na wczesnym etapie. Dodatkowe zastosowania można znaleźć w bezpieczeństwie żywności lub kryminalistyce (np. wykrywanie TA w żywności, suplementach lub płynach biologicznych).
Metoda ma kilka wad, które wymagają dyskusji. Po pierwsze, w zależności od użytego urządzenia i celu zastosowania protokołu, może być wymagana duża objętość wstrzyknięcia próbki, co może powodować problemy z wydajnością urządzenia i w niektórych przypadkach możliwość uzyskania wyników fałszywie dodatnich (jak opisano powyżej). Po drugie, metoda ta została opracowana na instrumencie QQQ o niskiej rozdzielczości, a wyniki fałszywie dodatnie mogą wynikać z niskiej rozdzielczości (np. cecha zawierająca fragment m/z 124 w kontroli ujemnej, która nie jest TA). Przyrząd o wyższej rozdzielczości zapewniłby lepszą zdolność diagnostyczną, a dokładne widma masowe MS / MS powinny być uzyskane dla każdego proponowanego nowego alkaloidu. Dodatkowymi wadami tej metody są po prostu wady analizy MS/MS jako całości. Chociaż MS/MS jest przydatny do proponowania struktur ("adnotacja" zgodnie z Inicjatywą Standardów Metabolomicznych32), nie zapewnia konkretnych przypisań łączności molekularnej ("identyfikacja"). Na przykład w obu próbkach Datury znaleźliśmy kilka izomerów m/z 306 TA, które wydawały się mieć zarówno fragmenty m/z 124, jak i m/z 140 (plik uzupełniający 2), co utrudnia ostateczne przypisanie wzorca podstawienia. Może to reprezentować jeszcze nieodkryty mechanizm fragmentacji, a inna technika (taka jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego) może być pomocna w rozwiązywaniu niejasności. Metody oparte na MS/MS często zmagają się z izomerią: ester kwasu fenylomlekowego littoryna (lub jej pochodne) jest trudny do odróżnienia od hioscyjaminy (ester kwasu tropikalnego), a inne rośliny psiankowate zawierają TA podstawione izomerycznymi grupami tigloyl, senecioyl i angeloilo33,34; W przypadku braku norm odróżnienie tych związków może być trudne, jeśli nie niemożliwe. Metoda nie pozwoli również na rozróżnienie enancjomerów (np. 3,6- vs. 3,7-dihydroksytropanu; numeracja znajduje się na rysunku 1) lub regioizomerów (np. rozróżnienie 3-acetylu od 7-acetylu bez wzorca). Przypisaliśmy większość monopodstawionych tropanów jako 3-podstawione na podstawie wcześniejszych wzorców zgłoszonych w rodzaju Datura i innych roślinach psiankowatych17,35. Ergo, wszelka wiedza biochemiczna lub literatura na temat badanego organizmu (jeśli jest dostępna) powinna być zawsze konsultowana wraz z jakąkolwiek analizą instrumentalną.

Chociaż w ostatnich dziesięcioleciach w pełni syntetyczne molekuły stały się coraz bardziej widoczne w odkrywaniu leków, prawie dwie trzecie wszystkich zatwierdzonych leków z ostatnich 39 lat to produkty naturalne lub inspirowane produktami naturalnymi,1,2 podkreślając nieustające znaczenie badań nad produktami naturalnymi. Alkaloidy, niektóre naturalne produkty zawierające azot, są szczególnie cenione ze względu na swoje właściwości lecznicze. Alkaloidy tropanowe (TA) zawierające [3.2.1.]-bicykliczny system zawierający azot, wytwarzany jest głównie przez rośliny z rodziny Solanaceae (psiankowate), Erythroxylaceae i Convolvulaceae. Przykłady obejmują atropinę, skopolaminę i kokainę; Wiele półsyntetycznych lub syntetycznych tropanów jest również stosowanych klinicznie<klasa SUP="xref">3. TA i ich pochodne są stosowane w leczeniu wielu schorzeń3,4, a kilka z tych leków znajduje się na Liście Leków Podstawowych WHO 20235. Ze względu na ich silne działanie, TA są również używane rekreacyjnie (jako stymulanty lub delirianty) i mogą powodować zatrucie po spożyciu roślin (lub preparatów), które je zawierają6,7. Są one niepożądane w żywności dla ludzi i zwierząt8 i mogą zanieczyszczać herbaty, przyprawy, ziarna, miód i suplementy ziołowe9,10. Ze względu zarówno na ich potencjał leczniczy, jak i zdolność do zatruwania, metody analityczne, które mogą pomóc w odkryciu nowych TA (i identyfikacji znanych TA) są przydatne.
W tandemowej spektrometrii mas (MS/MS), "filtry masowe" (np. kwadrupole, lampy czasu przelotu) są sprzężone ze sobą fizycznie ("w przestrzeni"), lub instrument wykorzystuje dodatkowe etapy reakcji/separacji "w czasie". In-space MS/MS wykorzystuje różne tryby do selekcji i fragmentacji różnych jonów w różnych filtrach masowych (np. kwadrupolach instrumentu z potrójnym kwadrupolem lub QQQ). Te różne tryby mogą być wykorzystane do określenia, które konkretne fragmenty są wytwarzane przez dany jon (skanowanie jonów produktowych), które jony w próbce dają określone fragmenty (skanowanie jonów prekursorowych lub PrIS) lub ulegają ubytkom o charakterystycznej masie (skanowanie utraty obojętnej lub NLS) lub które konkretne związki posiadają które określone fragmenty (monitorowanie wielu reakcji). MS/MS dostarcza zatem fragmentów, które są przydatne do proponowania struktur dla nowych związków lub potwierdzania obecności istniejącego związku. MS/MS jest coraz częściej stosowany w dziedzinie odkrywania leków, chemii produktów naturalnych i metabolomiki11,12, i jest używany do profilowania gatunków zawierających alkaloidy (do charakterystyki fitochemicznej lub analizy chemotaksonomicznej) oraz do wykrywania i ilościowego określania określonych alkaloidów w żywności lub roślinach leczniczych10,13,14,15,16.
Pomimo wielu dostępnych technik spektrometrii mas, istnieją wyzwania związane z poszukiwaniem nowych alkaloidów. Oprócz znalezienia organizmu kandydującego do badań przesiewowych, pełne strukturalne potwierdzenie alkaloidu jest żmudnym procesem, który może obejmować wiele różnych technik analitycznych. Dodatkowo naukowcy mogli wyizolować związek, który jest już znany, marnując pracę, czas i zasoby. Jest to szczególnie trudne w przypadku TA, gdzie zgłaszane są setki, jeśli nie tysiące TA, z których wiele jest izomerycznych względem siebie. Proces "identyfikowania znanych i odróżniania ich od nieznanych" jest znany jako dereplikacja. Bazy danych czasów retencji (r.t.s) i fragmentów masowych różnych TA i innych związków są publikowane, aby pomóc w tym procesie17,18. Niemniej jednak dereplikacja jest pracochłonna; Samo adnotowanie (tj. przypisywanie przypuszczalnych struktur) alkaloidów w całym chromatogramie LC-MS/MS próbki jest czasochłonne. Ostatnio zarówno sieć molekularna19,20, jak i ręczna dereplikacja18,21,22 były używane do benzylizochinoliny, indolu monoterpenowego i alkaloidów tropanowych, a PrIS były używane do "filtrowania strukturalnego" widm w celu identyfikacji alkaloidów typu pirolizydyny i solaniny23,24. Nie ma jednak żadnych konkretnych metod ani przepływów pracy do szybkiej dereplikacji próbek zawierających TA opartej na LC-MS/MS, mimo że TA posiadają wspólne, łatwe do zidentyfikowania fragmenty (Rysunek 1). Opisana tutaj metoda wykorzystuje kombinację zależnych od danych (DD) skanów jonów produktowych, PrIS i NLS do opisywania i klasyfikowania struktur TA w roślinach w oparciu zarówno o odrębne wzorce fragmentacji dla mono-, di- i tripodstawionych tropanów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A), jak i straty wspólnych grup estrowych występujących w tych alkaloidach (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). Badane organizmy to kilka gatunków z rodzaju psiankowatych Datura. Bogate źródło różnorodnych TA, Datura była używana w całej historii świata do celów medycznych i kulturowych17- i jest trudną matrycą do dereplikacji ze względu na liczne, strukturalnie podobne TA, dostarczając nam atrakcyjnych próbek, na których możemy przetestować naszą metodę.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl, Do UHPLC, nadaje się do spektrometrii mas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>rozpuszczalnik Gaz argon</td><td>AirGas</td><td>AR UHP300</td><td>CID Gaz</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, 99% do analizy</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC270480010</td><td>Dodatek HPLC</td></tr><tr><td>Uchwyt kolumny ochronnej</td><td>Restek</td><td>25812</td><td></td></tr><tr><td>HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus</td><td>Shimadzu</td><td>228-65802-58</td><td>Kolumna HPLC</td></tr><tr><td>LCMS, Shimdazu LCMS-8045</td><td>Shimadzu</td><td>225-31800-44</td><td>Spektrometr masowy; uruchomiliśmy oprogramowanie LabSolutions, które jest standardem dla instrumentów Shimadzu</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>AirGas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, do HPLC/UHPLC/LCMS</td><td>VWR</td><td>BDH 85800.400</td><td>Do wytwarzania rozpuszczalnika ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Mikrowirówka&nbsp;</td><td>VWR</td><td>2400-37</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB961C</td><td>Do mielenia tkanek roślinnych</td></tr><tr><td>Tłuczek</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB961M</td><td>Do mielenia tkanek roślinnych</td></tr><tr><td>Pipeta 1000 ml</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F144059M</tr><tr><td>Końcówka do pipety 1000 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Tkanki roślinne</td><td>Różne źródła</td><td>Nie dotyczy</td><td>Może to być cokolwiek dzikiego lub uprawianego</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe z polipropylenu, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-4</td><td></td></tr><tr><td>Chłodnica polistyrenowa</td><td>ULINE</td><td>S-18312</td><td>Rodzaj chłodnic, w których wysyłane są odczynniki do biologii molekularnej, to odpowiedni</td></tr><tr><td>Roc C18 3 i mikro; m, 100 mm x 4,6 mm</td><td>Restek</td><td>9534315</td><td>kolumna HPLC</td></tr><tr><td>Roc C18, 10 mm x 4 mm</td><td>Restek</td><td>953450210</td><td>Kolumna ochronna</td></tr><tr><td>Wytrząsarka kołysana</td><td>Themo Scientific</td><td>11-676-680</td><td></td></tr><tr><td>Wygodny zestaw fiolek z gwintem śrubowym (9 mm)</td><td>Fisher scientific</td><td>13-622-190</td><td>Fiolki z automatycznym samplerem LCMS</td></tr><tr><td>Strzykawka, 3 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-27</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,45 &mikro; m&nbsp;</td><td>Avantor/VWR</td><td>76479-008</td><td></td></tr><tr><td>Woda, do stosowania w chromatografii cieczowej i spektrometrii mas</td><td>JT Baker</td><td>9831-03</td><td>Do wytwarzania rozpuszczalnika ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Roztwór wodny, zawiera 0,1% v/v kwasu mrówkowego, Do UHPLC, odpowiedni do spektrometrii mas</td><td>Rozpuszczalnik Sigma-Aldrich</td><td>900687-1L</td><td>HPLC</td></tr></tbody></table>

zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Applications of Liquid-Chromatography Tandem Mass Spectrometry in Natural Products Research: Tropane Alkaloids as a Case Study

Chociaż wiele obecnie stosowanych leków jest pochodzenia syntetycznego, produkty naturalne nadal stanowią bogate źródło nowej różnorodności chemicznej i bioaktywności, i mogą dostarczyć obiecujących wskazówek dla opornych lub nowo pojawiających się chorób. Wyzwanie jest jednak dwojakie: badacze muszą nie tylko znaleźć naturalne produkty i wyjaśnić ich strukturę, ale także określić, co jest warte wyizolowania i oznaczenia (oraz to, co jest już znane - proces znany jako dereplikacja). Wraz z pojawieniem się nowoczesnej aparatury analitycznej tempo odkrywania i dereplikacji produktów naturalnych przyspieszyło. Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS) stała się szczególnie cenną techniką identyfikacji i klasyfikacji struktur chemicznych. Alkaloidy tropanowe (TA) to związki pochodzenia roślinnego o dużym znaczeniu leczniczym i toksykologicznym. W tym badaniu opracowaliśmy przepływ pracy przesiewowy oparty na LC-MS/MS, wykorzystując wiele konfiguracji MS / MS dostępnych w spektrometrze mas z potrójnym kwadrupolem (QQQ) do opisywania i klasyfikowania struktur TA na podstawie ich odrębnych wzorców fragmentacji. Stosując kombinację zależnych od danych (DD) skanów jonów produktu, skanów jonów prekursorowych (PrIS) i skanów utraty neutralnej (NLS), zastosowaliśmy tę metodę do bogatych w TA ekstraktów psiankowatych Datura stramonium i Datura metel. Metoda ta jest szybka, czuła i została z powodzeniem zastosowana zarówno do wstępnej dereplikacji złożonych próbek zawierających TA, jak i do odkrycia nowego kandydata do izolacji, oczyszczania (i ewentualnego testu biologicznego).

Prezentujemy metodę szybkiej spektrometrii mas (MS)/spektrometrii mas (MS) opartej na adnotacji i klasyfikacji alkaloidów tropanowych, przydatną zarówno do wstępnej dereplikacji próbek zawierających tropan jak i odkrywania nowych alkaloidów do izolacji.

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Although many drugs utilized today are synthetic in origin, natural products still provide a rich source of novel chemical diversity and bioactivity, and ...

W najprostszej formie naszych badań staramy się odkrywać nowe cząsteczki w roślinach. Rośliny są złożone chemicznie, a niektóre z tych chemikaliów mogą być przydatne w medycynie. Jesteśmy szczególnie zainteresowani znalezieniem nowych alkaloidów, które są pewnymi cząsteczkami zawierającymi azot.Ostatnio mamy tak wiele nowych i różnych instrumentów i technik alkaloidowych, że ludzie odkrywają coraz więcej nowych cząsteczek każdego dnia. Dzięki tym instrumentom możemy odpowiedzieć na pytania, takie jak jakie substancje chemiczne są obecne, kiedy są obecne, w jakiej części rośliny można je znaleźć. Spektrometria mas, jako technika analityczna, naprawdę poprawiła się w ciągu ostatnich 50 lat.Instrumenty są mocniejsze, tańsze i mają wyższą rozdzielczość. Techniki te pozwalają nam nie tylko zidentyfikować więcej cząsteczek roślinnych, takich jak alkaloidy, ale także być bardziej pewnym naszej identyfikacji. Ta metoda jest szybka i czuła.Byliśmy w stanie zebrać pełny zestaw danych na temat roślin psiankowatych zawierających wiele alkaloidów tropanowych w ciągu 60 do 90 minut i przypisać proponowane struktury nawet do alkaloidów o niskiej liczebności. Jesteśmy bardzo zainteresowani opracowaniem metod filtrowania opartych na tandemowej spektrometrii mas dla innych klas alkaloidów i wykorzystaniem takich metod do zbadania, jak chemia roślin różni się między różnymi gatunkami, różnymi częściami roślin i różnymi etapami wzrostu. Na początek użyj wstępnie schłodzonej szpatułki, aby dodać 100 miligramów proszku z tkanek roślinnych do wielopoziomowej probówki do mikrowirówki z polipropylenu.Następnie natychmiast dodaj jeden mililitr 20% metanolu do probówki. Umieść zakręconą rurkę na bujanym shakerze na trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować probówkę o masie 9,464 g przez 10 minut i zebrać supernatant do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek LC-MS.Skonfiguruj przyrząd LC-MS ze źródłem jonizacji elektrorozpylania i kolumną HPLC z odwróconymi fazami. W przypadku HPLC użyj 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie jako rozpuszczalnika A i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu jako rozpuszczalnika B. Dostosuj temperaturę pieca kolumnowego do 45 stopni Celsjusza, a natężenie przepływu do 0,5 mililitra na minutę. Zrównoważ kolumnę z 99%A i 1%B.Ustaw 30-minutowy gradient, aby stężenie rozpuszczalnika B wzrosło z 1% do 50% w ciągu 26 minut. Następnie szybko wróć do 1%B po 26.01 minutach i przytrzymaj przez cztery minuty. Skonfiguruj parametry pracy spektrometru mas.Ustaw napięcie interfejsu na cztery kilowolty, przepływ gazu nebulizującego na trzy litry na minutę, a przepływ gazu grzewczego na 10 litrów na minutę. Dostosuj temperaturę linii desolwatacji do 250 stopni Celsjusza, temperaturę bloku grzewczego do 400 stopni Celsjusza, a temperaturę interfejsu do 300 stopni Celsjusza. Ustaw przepływ gazu suszącego na 10 litrów na minutę, a ciśnienie gazu dysocjacyjnego wywołanego kolizją na 17 kilopaskalów.Zbuduj metodę MS w źródle jonizacji elektrorozpylania, tryb dodatni. Uwzględnij zarówno skany Q3, jak i Q1, obejmujące zakres mas od 100 do 1 000 daltonów, przy czym skan Q1 służy jako zdarzenie przeglądowe z automatycznym wykluczeniem izotopów. Dodaj skan jonów produktu połączony ze skanem Q1 z oknem masy od 50 do 1 000 daltonów, energią ogniwa zderzeniowego 20 woltów i czasem zdarzenia krótszym niż 0,2 sekundy.Następnie dostosuj metodę MS, aby dodać skany jonów prekursorowych w trybie dodatnim o długości metody LC z energiami ogniw zderzeniowych wynoszącymi 20 woltów i czasami zdarzeń wynoszącymi 0,75 sekundy. Upewnij się, że we wszystkich przypadkach włączone są funkcje automatycznego wykluczania lub deizotopowania izotopów. Ustaw wartości ładunku głównego dla monopodstawionych, dipodstawionych i tripodstawionych fragmentów alkaloidów tropanowych.Następnie, do metody MS-MS, dodaj skany strat neutralnych w trybie dodatnim równe długości metody LC z energiami ogniw zderzeniowych 20 woltów i czasami zdarzeń 0,75 sekundy. Upewnij się, że we wszystkich przypadkach włączone są funkcje automatycznego wykluczania lub deizotopowania izotopów. Ustaw neutralne masy strat zainteresowania dla estrów na alkaloidach tropanowych dla estrów pochodzących z kwasu tiglowego, grup acetylowych i estrów kwasu fenylomlekowego lub tropikalnego.Pobierz metodę LC-MS i utwórz pliki danych dla interesujących Cię próbek. Po zrównoważeniu kolumny HPLC w temperaturze 45 stopni Celsjusza wstrzyknąć od 10 do 20 mikrolitrów próbki. Po serii LC-MS ekstraktów z korzeni roślin należy zbadać chromatogram jonów całkowitych skanów Q1 i Q3, w tym skan jonów produktu zależny od danych.Obserwuj pozorną masę obfitych jonów o cechach podobnych do alkaloidów tropanowych, w tym masę poniżej 500 daltonów dla dodatnio naładowanego jonu M + H, zwykle liczbę parzystą, czasy retencji od dwóch do 22 minut oraz fragmenty pasujące do wartości ładunku głównego zgodnych z alkaloidami tropanowymi. Zbadaj chromatogram lub kanał skanowania jonów prekursorowych, w szczególności pod kątem ładunku głównego 124, i określ, które piki lub jony, przy których czasach retencji wytwarzają ten konkretny fragment. Klikaj skan po skanie przez chromatogram i przeglądaj pełne widma MS-MS ze skanowania jonów produktu zależnego od danych, szczególnie dla mniej obfitych gatunków.Następnie przeanalizuj chromatogramy skanowania jonów prekursorowych razem pod kątem ładunku głównego 122 i 140, które wskazują na dipodstawione alkaloidy tropanowe oraz ładunek główny 138 i 156, wskazujące na tripodstawione alkaloidy tropanowe. Zbadaj chromatogram lub kanały skanowania strat obojętnych pod kątem ładunku głównego 160 i 166. Zidentyfikuj, które piki lub jony powodują neutralne straty i zanotuj ich czasy retencji.Klikaj skan po skanie, skan po skanie przez chromatogram i porównaj z zależną od danych fragmentacją skanowania jonów produktu, szczególnie w przypadku mniej obfitych gatunków. Użyj kombinacji skanowania jonów prekursorowych i danych skanowania utraty neutralnej, wspieranych przez wyniki skanowania jonów produktu zależne od danych, aby dokonać przypuszczalnych adnotacji obserwowanych alkaloidów. Zacznij od najmniejszej masy tropanu, a następnie dodaj neutralny ubytek i uwzględnij pozostałą masę.Porównaj adnotacje alkaloidów z tymi zgłoszonymi w literaturze, aby określić wzorzec substytucji alkaloidów tropanowych. Dodatkowo w celu potwierdzenia należy użyć dostępnych na rynku wzorców popularnych alkaloidów tropanowych. Pełny chromatogram Q1 ekstraktu z korzenia Datura metel ujawnił różnorodne alkaloidy tropanowe o różnej obfitości.Cechy ładunku głównego 124, 122, 140, 138 i 156 wskazywały na obecność alkaloidów tropanowych. Wiele z tych alkaloidów tropanowych było acetylowanych, tigloilowanych lub pochodziło z kwasu fenylollekowego lub tropowego, o czym świadczą sygnały w chromatogramach skanowania utraty obojętnej. Wykorzystanie danych spektralnych umożliwiło adnotację konkretnych alkaloidów, w szczególności zidentyfikowanie związku o pozornej masie ładunku głównego 224.Metoda ta pozwoliła na wydedukowanie struktury złożonej na podstawie jej wzorca fragmentacji i neutralnej straty, potwierdzając obecność grup tigloylowych jako podstawień. Badanie wodnego ekstraktu metanolowego z nasion Datura stramonium przyniosło pełny chromatogram pików bazowych Q1, identyfikując bardzo obfity monopodstawiony alkaloid tropanowy, prawdopodobnie hioscyjaminę. Widmo MS-MS o wysokiej rozdzielczości pozwala również na identyfikację nowych alkaloidów z nasion Datura stramonium.

applications-liquid-chromatography-tandem-mass-spectrometry-natural

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Opisujemy ogólny protokół, który integruje analizę spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowanie molekularne w badaniach tradycyjnej medycyny chińskiej.

Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC

Opisujemy użycie chromatografii cienkowarstwowej, bezpośredniego testu bioautografii i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas do identyfikacji naturalnych produktów mikrobiologicznych, które wykazują antagonizm wobec patogenów grzybowych, używając patogenu Sclerotinia sclerotiorum i biopestycydowych izolatów Bacillus jako systemu modelowego.

Identyfikacja produktów naturalnych pod kontrolą biologiczną za pomocą chromatografii cienkowarstwowej - bioautografia bezpośrednia

Ten protokół przedstawia zweryfikowaną metodę chromatografii cieczowej, mobilności jonów i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, do określania obecności alkaloidów sporyszu w żywności, zgodnie z niedawno wydanym rozporządzeniem Komisji (UE) 2023/915.

Wykrywanie regulowanych alkaloidów sporyszu w matrycach spożywczych za pomocą chromatografii cieczowej - spektrometria ruchliwości jonów uwięzionych w elektronice - spektrometria mas czasu przelotu

Niniejsze badanie opracowało metodę chromatografii cieczowej wysokiej rozdzielczości połączoną ze spektrometrią mas z potrójnym kwarcykiem (HPLC-QQQ-MS) w celu identyfikacji i ilościowego określania alkaloidów tropanowych (hioscyjamina, anizodamina, skopolamina) w Anisodus tanguticus. Metoda ta okazała się szybką, dokładną i niezawodną dla analizy wysokowydajnej roślin leczniczych.

Skuteczną i szybką metodę HPLC-QQQ-MS do ilościowego oznaczania alkaloidów tropanowych w roślinach leczniczych

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Poznaj metodę tandemowej spektrometrii mas LC-MS do szybkiej analizy i klasyfikacji alkaloidów tropanowych w roślinach. Technika ta umożliwia odkrywanie nowych związków o potencjalnym znaczeniu leczniczym.

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Przeglądaj więcej filmów