Name: Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj system bezkomórkowej syntezy białek stosowany w budowie komórek syntetycznych. Protokół obejmuje przygotowanie ekstraktów S30, mikrofluidykę oraz tworzenie wodnych kropli i GUV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M. Y. dziękuje za dofinansowanie z Podyplomowego Programu Badań i Innowacji w Prowincji Jiangsu, Chiny (Grant No. KYCX22_2803). L.K. jest wdzięczny za wsparcie Badań Nauk Przyrodniczych Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu w Chinach (Grant nr 17KJB180003), Fundacji Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Normalnego Jiangsu w Chinach (Grant nr 17XLR037), Priorytetowego Programu Akademickiego Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu w Chinach oraz programu Jiangsu Specially-Appointed Professor w Chinach.

1. Przygotowanie ekstraktu
<ol>
	<li>Szczep E. coli BL21 (DE3) należy rozprowadzić z wywaru glicerolowego na płytce agarowej Luria Bertani (LB) i inkubować przez co najmniej 15 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować nocną hodowlę wstępną, zaszczepiając pojedynczą kolonię ze świeżo przygotowanej płytki LB do kolby o pojemności 50 ml pożywki Luria Bertani (LB).</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml kultury wstępnej w 500 ml pożywki 2xYTPG w 3-litrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodą. Hodować w temperaturze 37 °C z energicznym wytrząsaniem (między 220 obr./min a 250 obr./min) i zbierać komórki, gdy osiągną środkową fazę logarytmiczną (OD600 ~ 3). Następnie umieścić kultury komórkowe w zimnej, lodowatej wodzie na 10 minut i odwirować w temperaturze 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W tym kroku glukozę w pożywce 2xYTPG można pominąć dla określonych zastosowań9,12.</li>
	<li>Zawiesić powstałe w ten sposób osady komórkowe w 35 ml wstępnie schłodzonego buforu A S30, a następnie odwirować w stężeniu 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 1.4 dwa razy. 
	UWAGA: Granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.</li>
	<li>Ponownie zawiesić końcowe granulki w buforze B S30 (np. Użyj 1,1 ml buforu B S30 na 1 g osadu komórkowego) i rozbić komórki przez jedno przejście przez French Press przy 17 000 psi.
	<ol>
		<li>Aby korzystać z prasy francuskiej, postępuj zgodnie z instrukcją obsługi i przenieś zawieszenie ogniwa do metalowej komory rozrywającej French Press, upewniając się, że wszystkie elementy są zmontowane, a dolny zawór komory rozrywającej jest zamknięty.</li>
		<li>Przenieś zmontowaną komorę zakłóceniową na platformę hydrauliczną i zabezpiecz blokadę bezpieczeństwa.</li>
		<li>Włącz pompę hydrauliczną i rozpocznij zakłócenia.</li>
		<li>Kontroluj zawór wylotowy, aby zawiesina ogniw wypłynęła z rurki wylotowej do nowej probówki o pojemności 50 ml. Dostosuj prędkość przepływu, aby zapewnić skuteczne zakłócenia, najlepiej jedna kropla na raz. Utrzymuj ciśnienie powyżej dolnej granicy 15 000 psi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powstały lizat odwirować w temperaturze 30 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant. Powtórzyć wirowanie raz i zebrać supernatant. Dodać 0,3 objętości buforu preinkubacyjnego do zebranego supernatantu i inkubować, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C przez 80 min. 
	UWAGA: Użycie bufora preinkubacyjnego może zwiększyć ostateczną wydajność, chociaż donoszono, że pusty spływ (bez bufora preinkubacji) może również poprawić wydajność37,38, co zależy od odpowiedniego szczepu źródłowego.</li>
	<li>Otrzymaną mieszaninę należy dializować przez 2 godziny w stosunku do 2 litrów buforu C S30, wymienić raz bufor do dializy na 2 litry świeżego buforu C S30 i dializować przez noc w temperaturze 4 °C39. 
	UWAGA: Drugi etap dializy nocnej można skrócić do około 3 godzin.</li>
	<li>Zebrać dializowaną próbkę i odwirować w temperaturze 30 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i podwielokrotność do odpowiednich objętości i natychmiast błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Zamrożoną próbkę można przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej od 6 miesięcy do 1 roku bez utraty wydajności.</li>
</ol>
2. Polimeraza RNA T7
<ol>
	<li>Przekształć plazmid pAR1219 w BL21(DE3) gwiazdę E. coli kompetentne komórki40.</li>
	<li>Zaszczepić 10 ml kultury przez noc w 1 l pożywki LB (zawierającej 100 μg/ml ampicyliny). Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, aż OD600 osiągnie 0,6-0,8.</li>
	<li>Indukcję należy rozpocząć od dodania końcowego stężenia 1 mM IPTG. Indukować komórki przez dodatkowe 5 godzin i zbierać przez odwirowanie w temperaturze 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C przez okres do kilku tygodni.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki komórek w 30 ml buforu A T7 i rozbić komórki przez jedno przejście przez prasę francuską przy 15 000 psi. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 20 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodawać siarczan streptomycyny kropla po kropli do supernatantu z poprzedniego etapu, osiągając końcowe stężenie 4% (w/v). Po krótkiej inkubacji na lodzie odwirować w temperaturze 20 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant przez membranę filtracyjną 0,45 μm i załadować przefiltrowaną próbkę do kolumny silnej wymiany anionowej (objętość kolumny 40 ml), która została wstępnie zrównoważona z 10 objętościami kolumny buforu B T7, za pomocą zautomatyzowanego systemu chromatografu cieczowego.</li>
	<li>Przemyć załadowaną kolumnę 50 objętościami kolumny buforu B T7 i wymyć próbkę za pomocą 10 objętości kolumny mieszanin buforu C o niskiej zawartości soli (50 mM NaCl) i wysokiej zawartości soli (500 mM), ustanawiając liniowy gradient stężenia NaCl od 50 do 500 mM przy natężeniu przepływu ~3 ml / min41.</li>
	<li>Zbierz frakcje pików i przeanalizuj je za pomocą SDS-PAGE. 
	UWAGA: Polimeraza T7 wykazuje dominujące pasmo przy ~100 kDa, podczas gdy znaczne ilości zanieczyszczeń nadal pojawiają się na żelu SDS-PAGE.</li>
	<li>Zebrać frakcje zawierające polimerazę T7 i dializować w 2 litrach buforu C T7 przez noc.</li>
	<li>Dodaj glicerol, aby osiągnąć końcowe stężenie 10% i zagęścić powstałą mieszaninę do końcowego stężenia 3-4 mg/ml metodą ultrafiltracji42. 
	UWAGA: Jeśli podczas procesu zatężania pojawią się opady, należy je natychmiast przerwać i usunąć osady przez odwirowanie.</li>
	<li>Dostosuj stężenie glicerolu do 50%. Podwielokrotność i błyskawiczne zamrożenie próbki ciekłym azotem. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas. 
	UWAGA: Mała porcja może być również przechowywana w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 miesiąc bez utraty wydajności.</li>
</ol>
3. Przygotowanie bufora
<ol>
	<li>Przygotować zgodnie z tabelą 1 na dzień przed użyciem.</li>
</ol>
4. Projektowanie i przygotowanie szablonu
<ol>
	<li>Sklonuj interesujący nas gen do wektora opartego na promotorze T7 lub wygeneruj liniowy produkt PCR zawierający interesujący gen. 
	UWAGA: Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby zapoznać się z zasadami projektowania.</li>
	<li>Przygotuj plazmid z nocnej hodowli za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu. 
	UWAGA: Zalecamy wybór zestawu plazmidowego, który zawiera etap wytrącania izopropanolu, a następnie procedurę mycia 70% etanolem.</li>
	<li>Rozpuścić wysuszone DNA w małej objętości ultraczystej wody do stężenia od 200 μg/ml do 500 μg/ml, oznaczonego za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
	<li>Opcjonalnie: Bezpośrednia ekspresja białek z produktów liniowego PCR. 
	UWAGA: W takim przypadku potrzebny jest etap oczyszczania PCR.</li>
</ol>
5. Optymalizacja Mg2+ i K+
<ol>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową do badania przesiewowego stężeniaMg2+, jak wskazano w tabeli 2, lub do badania przesiewowego stężenia K+, jak wskazano w tabeli 3.</li>
	<li>Przenieś mieszankę wzorcową do pojedynczych probówek do mikrofuge lub 96-dołkowej płytki w kształcie litery V.</li>
	<li>Odpipetować dokładną objętość roztworów podstawowych Mg2+ lub K+ do pojedynczych probówek do mikrofuge lub 96-dołkowej płytki w kształcie litery V i zakończyć reakcje CFPS ultraczystą wodą. Inkubować reakcje przez co najmniej 2 godziny 
	UWAGA: Jeśli używasz 96-dołkowej płytki w kształcie litery V, uszczelnij płytkę plastikową osłoną, aby zapobiec parowaniu.</li>
	<li>Wyjąć 2 μl mieszaniny reakcyjnej i przenieść do czarnej 96-dołkowej płytki w celu pomiaru fluorescencji za pomocą czytnika płytek. 
	UWAGA: Używamy czytnika płytek fluorescencyjnych o następującej konfiguracji: wzbudzenie/emisja: 485/528, Wzmocnienie: 50, Wysokość odczytu: 7,00 mm. Trzeba by jednak dostroić czytnik płytek, aby wygenerować określoną krzywą kalibracyjną przy użyciu oczyszczonych białek fluorescencyjnych.</li>
</ol>
6. Hermetyzacja
<ol>
	<li>kropelka
	<ol>
		<li>Przygotować olej fluorowany zawierający środki powierzchniowo czynne (2% PFPE-PEG w HFE7500) lub roztwór oleju lipidowo-mineralnego, rozpuszczając lipidy w oleju mineralnym (patrz krok 6.2.1)</li>
		<li>Przygotować całkowitą objętość 100 μl reakcji CFPS, łącząc odpowiednie odczynniki 2-18 z tabeli 4. Dodać reakcję CFPS do 500 μl wcześniej przygotowanego oleju w probówce o pojemności 1,5 ml, a następnie energicznie nacierać probówkę o stojak na probówki 50x, aby powstały drobne kropelki (woda w oleju). Inkubować probówkę w temperaturze 30 °C, aby przeprowadzić reakcję. 
		UWAGA: Proste układy mikroprzepływowe mogą być również używane do generowania jednorodnych kropel43.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV)
	<ol>
		<li>Przygotowanie roztworu oleju lipidowo-mineralnego
		<ol>
			<li>Dodać 57 μl chloroformu do szklanej fiolki o pojemności 4 ml, a następnie dodać 18 μl lipidów 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicerol-3-fosfocholiny (POPC) o stężeniu 25 mg/ml, aby utworzyć roztwór lipidów chloroformu, uzyskując końcowe stężenie 8 mM (użyć innych lipidów o podobnych stężeniach końcowych). 
			UWAGA: Ten etap mieszania miał na celu zapewnienie jednorodnego mieszania różnych lipidów.</li>
			<li>Odparowywać chloroform pod strumieniem argonu przez 15 minut, a następnie dalej odparowywać w próżni przez 1 godzinę.</li>
			<li>Powstałe suche lipidy rozpuścić w 1 500 μl oleju mineralnego, osiągając końcowe stężenie 400 μM. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tworzenie międzyfazowej warstwy lipidowej
		<ol>
			<li>Dodać 500 μl roztworu zewnętrznego (patrz Tabela 5) do probówki o pojemności 1,5 ml i powoli nałożyć 250 μl roztworu oleju lipidowo-mineralnego na wierzch roztworu zewnętrznego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby utworzyć stabilną międzyfazową warstwę lipidową.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie roztworu wewnętrznego
		<ol>
			<li>Wymieszać wszystkie odczynniki z Tabeli 6, aby utworzyć roztwór wstępny i trzymać go na lodzie do czasu użycia. Uzupełnij roztwór wewnętrzny, dodając T7RNAP, ekstrakt S30 i matrycę DNA do roztworu prewewnętrznego jako odczynniki 16-18 wymienione w tabeli 4. 
			UWAGA: Zwiększenie stężenia sacharozy w kapsułkach powyżej 250 mM może zahamować translację bez komórek44.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powstawanie GUV
		<ol>
			<li>Dodać 50 μl roztworu wewnętrznego do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl oleju lipidowo-mineralnego, szybko pipetować w górę i w dół i energicznie wirować.</li>
			<li>Pozostawić probówkę na lodzie na 10 minut i powoli dodać 20 μl mieszaniny emulsji do górnej części fazy olejowej w probówce o pojemności 1,5 ml z kroku 6.2.2.</li>
			<li>Wirować przy 800 × g (przy prędkości wirowania od 100 × g do 1000 × g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C i obserwować tworzenie się GUV na dnie probówki. 
			UWAGA: Można zastosować wyższą prędkość wirowania właściwego; jednak można by wziąć pod uwagę, że prędkość wirowania może wpływać na rozmiar formowanych GUVs45.</li>
			<li>Usuń górną fazę olejową.</li>
			<li>Ostrożnie zassać 30 μl GUV na dnie probówki. Inkubować zebrane GUV w temperaturze 30 °C. 
			UWAGA: Optymalna temperatura inkubacji różni się dla różnych białek.</li>
			<li>Użyj konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (LSM) do monitorowania ekspresji białek fluorescencyjnych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obsługiwana dwuwarstwa lipidowa (SLB)
	<ol>
		<li>Przygotowanie komór SLB
		<ol>
			<li>Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 szkiełka nakrywkowe, dodając siedem kropli kwasu siarkowego i dwie krople 50% nadtlenku wodoru do środka każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować reagenty na szkiełkach nakrywkowych przez co najmniej 45 minut; Dokładnie spłucz ultraczystą wodą.</li>
			<li>Zmontować komorę do rekonstytucji, umieszczając wyciętą probówkę z mikrofugą o pojemności 0,5 ml na oczyszczonych szkiełkach nakrywkowych za pomocą kleju optycznego utwardzonego pod lampą ultrafioletową (365 nm) przez 10 minut, aby utworzyć komorę reakcyjną.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Formacja SLB
		<ol>
			<li>Rozpuścić 80% mol% 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC), 19,95% mol% 1,2-dioleoilo-sn-glicerolu-3-fosfo-L-seryny (DOPS) i 0,05% mol% Atto488-DOPE (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina = DOPE), wymieszać z chloroformem, wysuszyć pod łagodnym przepływem azotu i odkurzać przez 1 godzinę w celu całkowitego usunięcia rozpuszczalnika.</li>
			<li>Ponownie uwodnić wysuszony film lipidowy w buforze A SLB, uzyskując końcowe stężenie lipidów 4 mg/ml.</li>
			<li>Odwiruj i poddaj sonicyjnie otrzymane próbki, aż staną się klarowne.</li>
			<li>Rozcieńczyć 4 mg/ml SUV 130 μl buforu A SLB, przenieść 75 μl zawiesiny do wstępnie uformowanych komór reakcyjnych i inkubować na bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 1 min. Dodać 150 μl buforu A SLB do komory reakcyjnej w celu dalszej inkubacji przez 2 min.</li>
			<li>Przemyć komorę 2 ml buforu B SLB (bufor SLB A bez MgCl2) przed wymianą buforu na bufor C S30 z 0,4% (w/v) BSA dla reakcji CFPS, pozostawiając 100 μl buforu wewnątrz komory, aby zapobiec wysychaniu powstałego SLB.</li>
			<li>Usunąć resztki buforu C S30 i ostrożnie dodać mieszaninę reakcyjną CFPS do komory SLB. Inkubować komorę w temperaturze 30 °C i monitorować ekspresję pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

CFPS Protocols for Micro-Compartmentalized Synthetic Cells

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Niniejszy manuskrypt przedstawia zmodyfikowany system syntezy białek bezkomórkowych (CFPS) przeznaczony do stosowania w różnych mikrokompartmentach na syntetycznych platformach komórkowych, w tym kropelkach wody w oleju, GUV i SLB. Wykorzystaliśmy standardowy szczep gospodarza z rekombinowaną ekspresją białka E. coli, BL21 (DE3), jako ekstrakt źródłowy do budowy syntetycznych systemów komórkowych skoncentrowanych na białkach. Podejście to pozwoliło uzyskać około 0,5 mg/ml białka w różnych przedziałach. Podczas gdy można stosować inne niestandardowe szczepy źródłowe ekstraktów, systemy te zostały przede wszystkim zoptymalizowane pod kątem określonego rodzaju białka lub aktywności metabolicznej, która może być nieoptymalna dla ogólnej ekspresji białka. Ostatnie postępy w ilościowej analizie spektrometrii mas ułatwiły badania pilotażowe nad analizą proteomiczną lizatu komórkowego48,49, szczególnie w różnych warunkach przygotowania.
Pomimo uzyskania wglądu w te badania, ustalenie ilościowej korelacji między tymi zidentyfikowanymi czynnikami białkowymi a ogólną wydajnością systemów CFPS pozostaje wyzwaniem. Ta luka pozostawiła bez odpowiedzi pytania o to, jak ilościowo ocenić wydajność danej partii ekstraktu. Ponadto nie przeprowadzono systematycznego i równoległego porównania różnych szczepów źródłowych. W tym badaniu wykorzystaliśmy pożywkę 2xYPTG w celu zwiększenia produkcji biomasy, strategii zalecanej do przejścia na 2xYPT przy wykorzystaniu endogennej polimerazy RNA do transkrypcji. Pomimo sugestii, że polimeraza T7 może zostać włączona do procedury przygotowania ekstraktu45, zdecydowaliśmy się na oddzielny protokół przygotowania dla ekstraktu S30 i polimerazy RNA T7, aby zmniejszyć duże różnice między partiami.
Produkcja białka docelowego jest nierozerwalnie związana z centralnym procesem transkrypcji/translacji. Właściwy projekt szablonu i czystość mają kluczowe znaczenie dla udanej ekspresji bez komórek. Oprócz matrycy plazmidowej można również zastosować liniowe dwuniciowe DNA generowane metodą PCR, co nadaje się do badań przesiewowych i zastosowań wysokoprzepustowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnego projektowania szablonów do ekspresji in vivo u E. coli, projektowanie szablonów w systemie bezkomórkowym E. coli jest uproszczone bez konieczności rozważań na temat indukcji ekspresji. Jedynym istotnym elementem bezkomórkowego szablonu ekspresji jest sekwencja regulatorowa T7. Jednak w niektórych przypadkach sekwencja 5' docelowego genu może wpływać na inicjację translacji, w zależności od struktury drugorzędowej utworzonej przez odpowiednie transkrybowane mRNA. Jeśli miejsce wiązania rybosomów znajduje się w stabilnej pętli macierzystej transkrybowanego mRNA, inicjacja translacji może być znacznie utrudniona, co prowadzi do słabej ogólnej ekspresji. Podobnie, kolejne rzadkie kodony mogą utrudniać ekspresję i powinny być optymalizowane, podobnie jak w badaniach in vivo . Można to osiągnąć dzięki serwerom typu open source dedykowanym do optymalizacji kodonów50 i przewidywania struktury drugorzędowej mRNA51.
Jeśli chodzi o system buforowy, w naszym układzie eksperymentalnym wykorzystaliśmy bufor octanowy uzupełniony fosforanem kreatyny i kinazą kreatynową jako źródła regeneracji energii. Ta konfiguracja dała umiarkowany poziom ekspresji i stosunkowo szybką kinetykę, co można przypisać jednoetapowej reakcji regeneracji energii katalizowanej przez kinazę kreatynową przy użyciu fosforanu kreatyny. Podczas gdy niektórzy badacze przeszli na system buforowy glutaminianu, powołując się na jego bliższe podobieństwo do środowiska komórkowego52, nie zaobserwowaliśmy żadnych znaczących różnic w wydajności ekspresji białka przy naszych obecnych protokołach. Jednak niedawna analiza proteomiczna wykazała, że różne systemy buforowe w połączeniu z metodami przetwarzania ekstraktu mogą wpływać na ostateczną wydajność ekspresji19. Jeśli chodzi o prekursory energii, różne substraty były badane przez liczne grupy badawcze w celu osiągnięcia opłacalności i zwiększonej ekspresji53,54. W kontekście przedstawionego systemu CFPS celowo wybrano fosforan kreatyny oraz kinazę kreatynową. Wybór ten był motywowany wydajnością regeneracji energii, którą można osiągnąć dzięki jednoetapowej reakcji oraz brakiem interferencji z endogennymi enzymami odziedziczonymi po ekstrakcie. W związku z tym taka konfiguracja tworzy prosty, ale solidny system, który dobrze nadaje się do różnych środowisk mikrokompartmentów.
Jak wskazano w przedstawionych wynikach, wykazaliśmy udaną ekspresję białek w trzech różnych mikrokompartmentach: kropelkach wody w oleju stabilizowanych przez olej półfluorowany, GUV utworzonych przez transfer emulsji oraz na podpartej dwuwarstwie lipidowej. Wszechstronność ekspresji białek w różnych mikrokompartmentach podkreśla solidność naszego systemu CFPS do budowy komórek syntetycznych. Wśród tych metod enkapsulacji, technika kropel emulsji była szczególnie prostym podejściem do kapsułkowania systemu CFPS, wymagającym jedynie mieszania lub wirowania. Jednak kropelki te są zwykle niestabilne ze względu na niepewny interfejs wodny, ograniczenie, któremu można zaradzić, dodając lipidy lub środki powierzchniowo czynne do fazy olejowej. Pomimo praktyczności stabilizowanych kropelek wody w oleju, nie odtwarzają one w pełni naturalnego środowiska komórkowego, które składa się z dwóch wodnych przedziałów oddzielonych błoną komórkową. Zamiast kropelek stworzono gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) o rozmiarach przekraczających 1 mikron, aby dokładniej naśladować komórki. System CFPS został zamknięty w dwuwarstwie lipidowej tych pęcherzyków, zapewniając maszynerię transkrypcji i translacji dla różnych syntetycznych systemów komórkowych55.
Transfer emulsji, znany również jako podwójna emulsja, wyróżnia się jako typowa technika kapsułkowania reakcji CFPS, ze względu na łagodny proces przygotowania i stosunkowo wysoką skuteczność kapsułkowania w porównaniu z metodami bezrozpuszczalnikowymi. Jednak wytwarzanie podwójnych pęcherzyków emulsyjnych może obejmować zarówno proste etapy wirowania, jak i zastosowanie transferu emulsji wspomaganego mikroprzepływowo, przy czym każda metoda ma swoje zalety i wady, jak podsumowano w innym miejscu36. Udana hermetyzacja systemu CFPS w GUV opiera się na dostrojeniu osmolarności i przyłożeniu odpowiedniej siły do przejścia przez granicę faz olej-woda. Chociaż opisana tutaj metoda przenoszenia emulsji jest najprostsza i nie wymaga specjalnego sprzętu laboratoryjnego, wydajność i jednorodność generowanych GUV może się różnić w zależności od partii. Co więcej, wszystkie metody przenoszenia emulsji muszą radzić sobie z resztkami oleju w świetle utworzonego dwuwarstwowego interfejsu, co wymaga dodatkowego etapu usuwania oleju56, co może stanowić wyzwanie w projektach kinetycznych.
Wreszcie, wykazaliśmy udaną ekspresję CFPS na szczycie wspieranej dwuwarstwy lipidowej (SLB), oferując cenne podejście do projektów wymagających syntezy białek w pobliżu środowiska biobłony lipidowej. Poprzez wykorzystanie prezentowanego systemu CFPS wykazaliśmy jego udane zastosowanie w charakterystyce odwracalnego procesu celowania błonowego Cdc4247, centralnej cząsteczki białka kluczowej dla polaryzacji komórkowej. Podsumowując, stała ekspresja pożywki i nieodłączna odporność obserwowana w różnych mikrokompartmentach podkreślają potencjał tego systemu CFPS w budowie różnych syntetycznych systemów komórkowych. Zdolność ta może być dalej rozszerzana o różne modele skoncentrowane na białkach, ostatecznie posuwając się w kierunku realizacji minimalnej liczby komórek.

Synteza syntetycznych lub sztucznych komórek stała się bardzo ważnym obszarem badań interdyscyplinarnych, przyciągając duże zainteresowanie ze strony naukowców z różnych dziedzin biologii syntetycznej, chemii i biofizyki. Naukowców tych łączy wspólny cel, jakim jest zbudowanie minimalnej żywej komórki1,2,3. Szybki rozwój tej dziedziny idzie w parze ze znaczącymi postępami w kluczowych technologiach, takich jak manipulacja rekombinowanym DNA4, materiały biomimetyczne5 oraz techniki mikrowytwarzania do kompartmentalizacji6, w tym metoda syntezy białek bez komórek (CFPS)7. Systemy CFPS obejmują niezbędną maszynerię komórkową do transkrypcji i translacji, zapewniając podstawowe ramy dla rozwoju i integracji wielofunkcyjnych sztucznych komórek.
Chociaż techniki CFPS są często używane do składania syntetycznych komórek, opracowanie solidnego i dostosowanego systemu CFPS do składania różnych syntetycznych systemów komórkowych pozostaje złożonym wyzwaniem. Obecnie dostępnych jest wiele systemów CFPS, wywodzących się zarówno z organizmów modelowych prokariotów, jak i eukariontów8, z których każdy specjalizuje się w określonych zastosowaniach w syntezie komórek syntetycznych. Poza ich centralnymi rolami w transkrypcji i translacji, systemy CFPS różnią się między sobą głównymi komponentami i powiązanymi procedurami przygotowania. Te różnice, które obejmują różnice w ekstraktach komórkowych, polimerazach RNA, metodach przygotowania matryc i składzie, są w dużej mierze spowodowane odrębnymi trajektoriami rozwoju realizowanymi przez grupy badawcze, które intensywnie optymalizowały swoje systemy pod kątem maksymalnej wydajności białka.
Wśród różnych składników systemu CFPS, ekstrakt komórkowy jest krytyczną pulą enzymatyczną dla transkrypcji i translacji, a tym samym kluczowym czynnikiem decydującym o wydajności CFPS9. CFPS oparty na Escherichia coli (E. coli) jest najczęściej stosowanym systemem ze względu na jego status najlepiej poznanego organizmu prokariotycznego. Co więcej, grupa badawcza Ueda opracowała w pełni zrekonstruowany system CFPS składający się z indywidualnie oczyszczonych białek i rybosomów, znany jako PURE10, który jest szczególnie odpowiedni do zastosowań wymagających wyraźnego tła. Obecnie nawet systemy CFPS oparte na E. coli są zróżnicowane, zwłaszcza pod względem szczepów źródłowych dla extrac11 i metod przygotowania12,13, polimeraza RNA14,15, źródła energii16,17, oraz systemy buforowe18,19. Do najczęściej używanych szczepów należą pochodne szczepów K12 i B, takie jak A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 i Rossetta223, wraz z ich genetycznie modyfikowanymi odpowiednikami.
Początkowo, szczepy E. coli o zmniejszonej aktywności RNazy i proteazy zostały wybrane w celu zwiększenia stabilności mRNA i stabilności nowo zsyntetyzowanych białek rekombinowanych, co doprowadziło do zwiększenia końcowej wydajności białek24. Następnie ekstrakty z E. coli zostały zmodyfikowane tak, aby ułatwić określone modyfikacje potranslacyjne, w tym glikozylację25, fosforylację26 i lipidację27, w celu osiągnięcia powyższych modyfikacji potranslacyjnych. Dodatkowo, szereg dodatków, takich jak molekularne białka opiekuńcze28 i stabilizatory chemiczne, zostały włączone w celu wspomagania fałdowania docelowych białek, przyczyniając się do dywersyfikacji systemów CFPS. Polimeraza RNA T7 bakteriofaga, znana ze swojej wysokiej procesywności, jest głównie stosowana do transkrypcji, chociaż wykorzystano również inne polimerazy, takie jak SP629. Endogenna polimeraza RNA E. coli została przystosowana do prototypowania obwodów genetycznych wykorzystujących czynniki sigma30. Wreszcie, różne prekursory energii31,32,33 oraz różne sole i składniki buforowe19,34,35 są systematycznie optymalizowane w celu zwiększenia wydajności.
Oprócz samego systemu CFPS, metody enkapsulacji, jak również materiały do kompartmentacji są również niezbędne dla udanego montażu komórek syntetycznych. Różne systemy, które zostały opracowane w celu skutecznego enkapsulacji reakcji CFPS, obejmują stabilizowane środkami powierzchniowo czynnymi kropelki wody/oleju, lipidy/polimery i ich hybrydowe pęcherzyki jednowarstwowe (o średnicach od 50 nm do kilku μm), a także dwuwarstwy lipidowe podparte planarnie. Jednak ze względu na zawartość skompleksowanych cząsteczek w systemie CFPS, wskaźnik powodzenia enkapsulacji zależy od konkretnych przypadków, szczególnie w przypadku tworzenia pęcherzyków. Aby poprawić wskaźnik sukcesu i skuteczność enkapsulacji CFPS, opracowano różne chipy do mikropłynów, które ułatwiają tworzenie zarówno kropelek, jak i pęcherzyków36. Niemniej jednak konieczne będzie ustanowienie dodatkowych chipów i urządzeń.
Ten protokół określa system CFPS E. coli wykorzystujący szczep BL21(DE3), który jest powszechnie stosowanym gospodarzem do produkcji białek rekombinowanych. Protokół obejmuje szczegółowe opisy przygotowania ekstraktu komórkowego, przygotowania matrycy i optymalizacji standardowej ekspresji przy użyciu fluorescencyjnego białka reporterowego. Ponadto przedstawiono przykładowe wyniki osiągnięte dzięki zamknięciu systemu CFPS w różnych mikrokompartmentach, w tym w kropelkach jednowarstwowych, podwójnych pęcherzykach emulsyjnych i komorach umieszczonych na podpartych dwuwarstwach lipidowych. Na koniec wyjaśniamy kluczowe elementy proceduralne i warunki niezbędne do pomyślnego ustanowienia tych systemów WPRyb w różnych kontekstach środowiskowych.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina(DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna (sól sodowa)(DOPS)</td><td>Avanti</td><td>840035P</td><td></td></tr><tr><td>1,4 ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.11474</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Avanti</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>3,5-cykliczny AMP (cAMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Probówki Eppendorf BioBased</td><td></td></tr><tr><td>50% nadtlenek wodoru</td><td></td> Octan 516813 <td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Proszek agarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040</td><td></td></tr><tr><td>Alanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4349</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Mieszane komórki</td><td>MerckMillipore</td><td>UFSC05001</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu (NH4OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7262</td><td></td></tr><tr><td>Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4474</td><td></td></tr><tr><td>Asparagin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>Aspartat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5474</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche</td><td>11140965001</td><td></td></tr><tr><td>Atto 488 DOPE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67335</td><td></td></tr><tr><td>Atto 647N DOPE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42247</td><td></td></tr><tr><td>Przegroda Kolba Erlenmeyera</td><td>Shuniu</td><td>250 mL, 1000 ml</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td></td>Probówka wirówkowa Roche <td>10711454001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Probówki Eppendorf Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na probówki wirówkowe</td><td>Eppendorf</td><td>0030119819</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania chemiluminescencji i epifluorescencji</td><td>Uvitec</td><td>Alliance Q9 Advanced</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (LSM)</td><td>Szkiełka do komory</td> zliczania komórek ZEISS <td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>Menzel BB02400500A113MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>kinaza kreatynowa (CK)</td><td>Roche</td><td>10127566001</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kreatyny (CP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10621714001</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane</td><td>Huanqiu</td><td>90 mm</td><td></td></tr><tr><td>Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5360</td><td></td></tr><tr><td>Cytydyna 5'-trifosforanowa sól disodowa (CTP)</td> <td>aladyna</td><td>C101487</td><td></td></tr><tr><td>membrana dializy</td><td>Widmo</td><td>Standardowe rurki RC MWCO: 12-14 kD</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6492-01</td><td></td></tr><tr><td>Elektrogrzewczy kultywator stojący</td><td>Instrument Yiheng</td><td>DHP-9602</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td> <td>Biosharp</td><td></td><td></td>1100027</tr><tr><td>Czytnik płyt fluorescencyjnych</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>Olej fluorowany</td><td>Suzhou CChip instrument naukowy</td><td>2%HFE7500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Prasa francuska</td><td>G.Heinemann</td><td>HTU-DIGI-Press</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5667</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5792</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)</td><td>Roche</td><td>10106399001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep Q FF 16/10</td><td>Cytiva</td><td>28936543</td><td></td></tr><tr><td>Histidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>Izoleucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5281</td><td></td></tr><tr><td>Izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Leucin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6914</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat octanu magnezu (Mg(OAc)2 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8439</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka wielofunkcyjna</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td>Kwas nukleinowy <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>i Pomiary UV białek</td><td></td><td>IMPLEN NanoPhotometer N60</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw NucleoBond Xtra Maxi do plazmidu klasy transfekcyjnej DNA</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740414.5</td><td></td></tr><tr><td>Nunc-Immuno MicroWell 96-dołkowe płytki polistyrenowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8616</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler do PCR</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler nexus</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>Fenyloalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8740</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolopirulat (PEP)</td> <td>GLPBIO</td><td>GC44635</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000 (PEG 8000)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu (KOAc)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu ( KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu (K-glutaminian)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Prolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8865</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza pirogronianowa (PK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>Serin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4311</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>Zhichushakers</td><td>ZQZY-AF8</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>aladyn</td><td>S112226</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Jinteng</td><td>0,45 i mu; m</td><td></td></tr><tr><td>Probówka</td><td>Shuniu</td><td>20 ml</td><td></td></tr><tr><td>TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610175</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Threonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8441</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900483</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Tryptofan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8941</td><td></td></tr><tr><td>Tyrozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8566</td><td></td></tr><tr><td>UTP Sól trisodowa (UTP)</td><td></td> <td>U100365</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa z cyrkulacyjnym systemem wodnym</td><td>Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd</td><td>SHB-<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66626/66626eq01.jpg" style="margines: auto; "></td><td></td></tr><tr><td>Valin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4638</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalniki Vortex</td><td>Kylin-Bell</td><td>Vortex QL-861</td><td></td></tr><tr><td>System oczyszczania wody</td><td>MerckMillipore</td><td>Direct ultraczysta woda (typ 1)</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>β-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells

System Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) został szeroko zastosowany w celu ułatwienia oddolnego składania syntetycznych komórek. Służy jako gospodarz dla podstawowej maszynerii Centralnego Dogmatu, stojąc jako optymalne podwozie do integracji i montażu różnych sztucznych systemów mimikry komórkowej. Pomimo częstego stosowania tego systemu w produkcji ogniw syntetycznych, stworzenie dostosowanego do potrzeb i solidnego systemu CFPS do konkretnego zastosowania pozostaje nietrywialnym wyzwaniem. W niniejszym artykule metodycznym przedstawiono kompleksowy protokół dla systemu CFPS, rutynowo stosowanego w budowie ogniw syntetycznych. Protokół ten obejmuje kluczowe etapy przygotowania systemu CFPS, w tym ekstrakcję komórkową, przygotowanie matrycy i rutynową optymalizację ekspresji z wykorzystaniem fluorescencyjnego białka reporterowego. Dodatkowo pokazujemy reprezentatywne wyniki, zamykając system CFPS w różnych mikrokompartmentach, takich jak kropelki jednowarstwowe, pęcherzyki z podwójną emulsją i komory umieszczone na podpartych dwuwarstwach lipidowych. Na koniec wyjaśniamy krytyczne kroki i warunki niezbędne do pomyślnego montażu tych systemów CFPS w różnych środowiskach. Oczekujemy, że nasze podejście ułatwi ustanowienie dobrych praktyk pracy między różnymi laboratoriami w ramach stale rozwijającej się społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając tym samym postęp w dziedzinie rozwoju komórek syntetycznych.

Dla każdej nowej partii ekstraktu komórkowego i polimerazy RNA T7 zaleca się przeprowadzenie podstawowego screeningu stężeń zarówno Mg2+, jak i K+, aby zapewnić optymalne działanie systemu CFPS. Fluorescencja białka superfolder GFP może służyć jako wskaźnik ogólnej wydajności systemu CFPS w różnych warunkach, co przedstawiono na Rysunku 1A,B. Dodatkowo, na Rysunku 1C pokazano równoległe porównanie wydajności systemu CFPS w różnych przedziałach, wykazując spójne działanie w enkapsulowanych systemach CFPS, choć z lekkim spadkiem w GUVs, potencjalnie ze względu na wpływ sacharozy46. Co więcej, reakcje CFPS zostały pomyślnie enkapsulowane w kropelkach (Rysunek 2), GUVs (Rysunek 3) oraz na powierzchni SLBs (Rysunek 4).
Rysunek 2A przedstawia tworzenie się kropel emulsji, które stały się widoczne w momencie, gdy roztwór olejowy stał się turbulentny. Ekspresję zielonych/czerwonych białek fluorescencyjnych (GFP i mCherry) zarejestrowano przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Rysunek 3 obrazuje powodzenie enkapsulacji reakcji CFPS wewnątrz GUV za pomocą prostego procesu transferu emulsji. Kanał czerwony wskazywał znakowane lipidy, kanał zielony wykazywał ekspresję superfolder GFP, a kanał żółty reprezentował obojętny barwnik fluorescencyjny. Rysunek 4A przedstawia komorę SLB, w której można było osadzić reakcję CFPS. Wewnątrz tej komory, na szklanym szkiełku podstawowym, utworzono SLB, a mieszaninę reakcyjną CFPS umieszczono na powierzchni uprzednio uformowanej SLB, co umożliwiło obrazowanie za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Jak wskazano na Rysunku 4B, SLB była wizualizowana za pomocą znakowanych lipidów (kolor zielony), natomiast wyrażona mała GTPaza Cdc42 połączona z mCherry była widoczna w kolorze purpurowym. Pod mikroskopem można było zaobserwować ekspresję in-situ mCherry-Cdc42 oraz odwracalny proces celowania w błonę. Wykorzystany system CFPS został uzupełniony o mechanizm prenylacji, zgodnie ze szczegółami opisanymi w niedawnej publikacji47.
<img alt="stężenie sfGFP w zależności od poziomów Mg²⁺ i K⁺, wykres słupkowy dla metod: bulk, kroplowej, GUV i SLB." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66626/66626fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Optymalizacja i porównanie systemu CFPS. Przesiewowe badanie stężenia (A) Mg2+ oraz (B) K+ dla systemu CFPS w roztworze objętościowym (bulk). (C) Wykres słupkowy przedstawiający wydajność ekspresji białek w różnych przedziałach. Do oznaczenia wydajności systemu CFPS wykorzystano fluorescencję sfGFP, mierzoną za pomocą czytnika płytek lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Skróty: CFPS = bezkomórkowa synteza białek; GFP = zielone białko fluorescencyjne; sfGFP = superfolder GFP; GUV = gigantyczny pęcherzyk jednowarstwowy; SLB = wspierana dwuwarstwa lipidowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Mikroprzepływy kropelkowe: obrazy mikroskopowe emulsji; przygotowanie próbek; analiza fluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66626/66626fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Bezkomórkowa synteza białek w kropelkach. (A) Zdjęcie zamkniętych w kropelkach reakcji CFPS w kropelkach woda-w-oleju stabilizowanych surfaktantem. (B) Obrazy w jasnym polu oraz (C,D) obrazy fluorescencyjne CFPS dla (C) mCherry oraz (D) superfolder GFP zamkniętych w kropelkach, zwizualizowane za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Superfolder GFP zaznaczono kolorem zielonym, a mCherry kolorem purpurowym. Paski skali = 20 µm. Skróty: CFPS = bezkomórkowa synteza białek; GFP = zielone białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, analiza DNA, A) Przygotowanie próbek, B-D) Obraz przedstawiający detekcję emisji spektralnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66626/66626fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Bezkomórkowa synteza białek w GUV. (A) Zdjęcie zamkniętych w GUV reakcji CFPS. (B-D) Obraz fluorescencyjny zamkniętego w POPC GUV układu CFPS, wykazującego ekspresję superfolder GFP. (B) Dwuwarstwa lipidowa została znakowana 0,05% lipidami Atto647N-DOPE, pokazanymi na czerwono, (C) barwnik obojętny pokazany na żółto oraz (D) superfolder GFP wskazany na zielono. Paski skali = 20 µm. Skróty: CFPS = bezkomórkowa synteza białek; GFP = zielone białko fluorescencyjne; GUV = gigantyczny pęcherzyk jednowarstwowy; POPC = 1-palmitylo-2-oleoiloglicerol-3-fosfocholina; DOPE = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat bezkomórkowej ekspresji białek i targetowania błonowego, wraz z obrazowaniem mikroskopii konfokalnej i wykresami analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66626/66626fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Bezkomórkowa synteza białkowa małej GTPazy Cdc42 na powierzchni SLB. (A) Schematyczna ilustracja rekonstrukcji targetowania błonowego Cdc42 oraz zależnej od RhoGDI ekstrakcji z błony na SLB, wizualizowana za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Aparat prenylacji zrealizowano za pomocą ekstraktu wzbogaconego o prenylotransferazę, co zostało szczegółowo opisane w innym opracowaniu47. (B) Widok ortogonalny mieszaniny reakcyjnej na powierzchni SLB przed i po prenylacji. (C,D) Serie czasowe intensywności mCherry-Cdc42 na błonie (różowy) i w roztworze (czarny) podczas (C) targetowania błonowego i (D) ekstrakcji z błony. Paski skali = 10 µm. (A-D) opracowano na podstawie Kai et al.47. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Lista buforów.UWAGA: β-merkaptoetanol oraz DTT należy dodać bezpośrednio przed użyciem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Schemat pipetowania dla screeningu stężenia Mg2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%202_rev.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Schemat pipetowania dla przesiewania stężeń K+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%203_rev.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Skład roztworu wewnętrznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%204_rev.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Skład roztworu zewnętrznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%205_rev.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 6: Skład roztworu przedwewnętrznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%206_rev.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for ...

Wszystkie nasze badania koncentrują się na bezkomórkowej biologii syntetycznej. Obejmuje to oddolne składanie komórek syntetycznych, analizę funkcjonalną i strukturalną białek błonowych, inżynierię białkową przy jednoczesnym włączeniu aminokwasów niekanonicznych oraz bezkomórkową inżynierię metaboliczną. Obecnie, oprócz bezkomórkowej syntezy białek, urządzenia mikroprzepływowe poprzez mikrofabrykację poprzez miękką litografię, rozwój materiałów biokompatybilnych i ogólną sztuczną inteligencję są wiodącymi technologiami, które napędzają szybszy rozwój bezkomórkowej biologii syntetycznej.Konfiguracja przedstawiona jako protokół tworzy prosty, ale solidny system, który jest dobrze dopasowany do różnych środowisk mikrokompartmentów, w tym kropelkowych GUV jako naszej bazy, co pokazaliśmy w naszych reprezentatywnych wynikach. W przyszłości skoncentrujemy się na rozwoju dostosowanych do potrzeb systemów bezkomórkowych, które umożliwiają montaż i integrację różnych modułowych systemów mimikry komórek w celu osiągnięcia ostatecznego celu, jakim jest zbudowanie minimalnej liczby komórek. Na początek uzyskaj wstępnie wyhodowane komórki i umyj je dwukrotnie 35 mililitrami wstępnie schłodzonego buforu S30 A. Zagnieź komórki i ponownie zawieś je w buforze S30 B. W celu rozbicia komórek przenieś zawiesinę komórek do metalowej komory rozrywającej z prasą francuską i zabezpiecz ją na platformie hydraulicznej za pomocą zamka bezpieczeństwa.Włącz pompę hydrauliczną i rozpocznij zakłócenia. Kontroluj zawór wylotowy, aby zebrać zawiesinę ogniw w nowej rurce o pojemności 50 mililitrów, utrzymując ciśnienie na poziomie 17 000 funtów na cal kwadratowy. Odwirować powstały lizat w stężeniu 30 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant.Ponownie odwirować i inkubować zebrany supernatant z 0,3 objętości buforu do wstępnej inkubacji, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 80 minut. Powstałą mieszaninę spływającą przez dwie godziny dializuj w stosunku do dwóch litrów buforu C S30 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować dializowaną próbkę i poddzielić podwielokrotność supernatantu.Próbki należy natychmiast błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Po granulowaniu hodowanych komórek ponownie zawiesić je w 30 mililitrach buforu T7 A. Rozbić komórki w jednym przejściu przez prasę francuską przy 15 000 funtów na cal kwadratowy i odwirować lizat, aby usunąć resztki komórek. Dodawać siarczan streptomycyny kropla po kropli do supernatantu, aby osiągnąć końcowe stężenie 4%Po krótkiej inkubacji na lodzie odwirować lizat jak poprzednio.Przefiltrowane próbki należy załadować do kolumny z mocną wymianą anionową. Po umyciu kolumny należy wymyć próbkę za pomocą 10 objętości buforu C T7 przy natężeniu przepływu 3 mililitrów na minutę. Dodaj glicerol, aby osiągnąć końcowe stężenie 10% i poddaj powstałą mieszaninę ultrafiltracji, aby uzyskać końcowe stężenie od trzech do czterech miligramów na mililitr.Na początek należy zaopatrzyć się w roztwór fluorowanego lub lipidowego oleju mineralnego zawierający surfaktynę. Dodaj bezkomórkową syntezę białek lub mieszaninę CFPS do 500 mikrolitrów wcześniej przygotowanego oleju w 1,5 mililitrowej tubce i energicznie pocieraj probówkę o stojak na probówki 50 razy, aby utworzyć drobne kropelki. W celu przygotowania gigantycznego pęcherzyka jednowarstwowego lub GUV, dodaj 57 mikrolitrów chloroformu do czteromililitrowej szklanej fiolki, a następnie 18 mikrolitrów lipidów do końcowego stężenia ośmiu milimolów.Odparować chloroform pod strumieniem argonu przez 15 minut, a następnie w próżni przez godzinę. Powstałe suche lipidy rozpuścić w 1 500 mikrolitrach oleju mineralnego, aby osiągnąć końcowe stężenie 400 mikromolowych. Aby uzyskać międzyfazową warstwę lipidową, powoli nałóż 250 mikrolitrów lipidowego roztworu oleju mineralnego na 500 mikrolitrów roztworu zewnętrznego pobranego w 1,5 mililitrowej probówce.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby utworzyć stabilną międzyfazową warstwę lipidową. Aby uzyskać roztwór wewnętrzny, dodaj polimerazę RNA T7, ekstrakt S30 i matrycę DNA do zimnego roztworu wstępnego. Wymieszaj 50 mikrolitrów roztworu wewnętrznego i 500 mikrolitrów lipidowego oleju mineralnego i energicznie wiruj.Pozostaw probówkę na lodzie na 10 minut i powoli dodaj 20 mikrolitrów tej mieszaniny emulsji na wierzch wcześniej przygotowanej fazy olejowej w 1,5 mililitrowej tubce. Wirować przy około 800 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i obserwować tworzenie się GUV na dnie probówki. Po usunięciu górnej fazy olejowej ostrożnie odessaj 30 mikrolitrów GUV z dna rurki.Dodaj siedem kropli kwasu siarkowego i dwie krople 50% nadtlenku wodoru do środka szkiełka nakrywkowego i inkubuj przez 45 minut. Po dokładnym spłukaniu ultraczystą wodą przyklej go do wyciętej 0,5 mililitrowej rurki mikrofuge. Utwardzać pod lampą ultrafioletową przez 10 minut, aby utworzyć komorę reakcyjną.Następnie dodaj 75 mikrolitrów małego pęcherzyka jednowarstwowego lub zawiesiny SUV do wstępnie uformowanych komór reakcyjnych i inkubuj na bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Następnie dodaj 150 mikrolitrów podpartej dwuwarstwy lipidowej lub buforu SLB A do komory reakcyjnej w celu dodatkowej dwuminutowej inkubacji. Przemyć komorę 200 mikrolitrami buforu B SLB przed wymianą buforu na bufor C S30, pozostawiając 100 mikrolitrów buforu wewnątrz komory, aby zapobiec wysychaniu podpartej dwuwarstwy lipidowej.Za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej udało się uchwycić ekspresję białka zielonej fluorescencji i mCherry zamkniętych w kropelkach. Fluorescencyjny obraz kapsułkowanego CFPS w GUV wykazał ekspresję super folderowego zielonego białka fluorescencyjnego w znakowanej dwuwarstwie lipidowej.

cell-free-protein-synthesis-system-for-building-synthetic-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Tutaj opisujemy proste metody przygotowania pęcherzyków, enkapsulacji maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej oraz monitorowania produkcji białek. Powstałe w ten sposób systemy bezkomórkowe mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do budowania coraz bardziej złożonych mimik komórkowych.

Enkapsulacja bezkomórkowej maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej w pęcherzykach do budowy mimiki komórkowej

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Prezentujemy szybką i opłacalną metodę produkcji rekombinowanego, bezkomórkowego systemu TX-TL PURE przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

System OnePot PURE bezkomórkowy

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Przedstawiamy zaktualizowany protokół produkcji systemu OnePot 'Protein Synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) oraz prymitywnych rybosomów do syntezy białek wolnych od komórek, koncentrując się na kontrolowaniu wzrostu komórek w celu minimalizacji różnic między partiami.

Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek

Poznaj system bezkomórkowej syntezy białek stosowany w budowie komórek syntetycznych. Protokół obejmuje przygotowanie ekstraktów S30, mikrofluidykę oraz tworzenie wodnych kropli i GUV.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Przeglądaj więcej filmów