Zależna od doświadczenia przebudowa połączeń synaptycznych neuronów czuciowych młodzieńczych neuronów czuciowych we wczesnym okresie życia
March 1st, 2024
Opisujemy tutaj metody indukowania i analizowania zależnej od doświadczenia węchowego przebudowy synaptycznych kłębuszków nerkowych płata czułkowego w mózgu młodocianych Drosophila.
Tak więc moje badania obejmują badanie ról gleju w zależnej od doświadczenia krytycznej przebudowie synaps okresu. Określam rolę gleju w przycinaniu synapsów, szczególnie w okresach krytycznych, oraz komunikację neuron-glej, która umożliwia przycinanie napędzane doświadczeniem. Nasz protokół ma udowodnioną moc genetyki Drosophila do definiowania mechanizmów molekularnych.
Aby badać interakcje gen-środowisko, możemy precyzyjnie manipulować stężeniem zapachu, czasem trwania i czasem jego trwania w krótkim, dobrze zdefiniowanym okresie krytycznym. Protokół ten jest niezwykle wszechstronny w indukowaniu przebudowy synaps. Nasze wyniki stworzyły doskonały model podatny na manipulacje genetyczne i farmaceutyczne, który może potencjalnie ponownie otworzyć krytyczną plastyczność podobną do miesiączki w wieku dorosłym, co jest tematem o ogromnym zainteresowaniu w leczeniu urazów, urazów i zaburzeń neurologicznych.
Na początek weź fiolkę z larwami Drosophila. Za pomocą cienkiego pędzla posortuj od 40 do 50 bardzo ciemnych poczwarek w polistyrenowych fiolkach Drosophila zawierających standardowy pokarm z melasy z mąki kukurydzianej. Umieść drobną siatkę drucianą ze stali nierdzewnej na końcu fiolek Drosophila, aby zatrzymać muchy, zapewniając jednocześnie dobry przepływ powietrza.
Zabezpieczyć nasadki z siatki drucianej przezroczystą folią z boku fiolek. Następnie dodaj jeden mililitr 100% oleju mineralnego lub rozpuszczonego EB w oleju mineralnym w 1,5-mililitrowych tubkach. Umieść te rurki pionowo w pojemniku Glasslock o pojemności 3 700 mililitrów.
Za pomocą taśmy zakotwicz rurki na środku komór nawaniających wraz z fiolkami Drosophila. Umieścić szczelnie zamknięte komory kontrolne pojazdu i komory zapachowe EB zawierające fiolki poczwarek w nawilżonym inkubatorze w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnego ciemnego cyklu. Po czterech godzinach ekspozycji w komorze nawaniającej szybko przenieś od 20 do 25 nowo zamkniętych much do świeżych fiolek Drosophila w komorach ze świeżo przygotowanym środkiem zapachowym.
Muchy należy przechowywać w szczelnych komorach zapachowych w inkubatorach przez łącznie 24 godziny. Na początek weź muchy Drosophila wystawione na działanie oleju mineralnego i EB przez 24 godziny. Oznacz fiolki jako kontrolę nośnika lub EB odsłonięte i utrzymuj te oznaczenia podczas sekcji i przetwarzania mózgu.
Za pomocą kleszczy przenieś pojedynczą znieczuloną muchę do małego naczynia ze świeżo przygotowanym PBS. Całkowicie zanurz muchę w PBS, aby uzyskać pełną sekcję mózgu. Następnie ustaw muchę brzuszną stroną do góry.
Weź dwa cienkie, zaostrzone kleszcze, aby jednym kleszczem chwycić górną część klatki piersiowej, a drugim głowę pod trąbką. Pociągnij głowę i resztę ciała w przeciwnych kierunkach, aby zdjąć głowę. Upewnij się, że głowa łatwo odłącza się od klatki piersiowej i pozostawia izolowaną głowę do sekcji.
Wsuń kleszcze używane wcześniej do chwytania klatki piersiowej pod przeciwną stronę trąbki. Delikatnie pociągnij naskórek egzoszkieletu w przeciwnych kierunkach, aby rozerwać go między oczami i odsłonić mózg. Kontynuuj usuwanie naskórka egzoszkieletu z głowy, upewniając się, że wszystkie części zostały usunięte.
Teraz przepłucz końcówkę pipety P20 za pomocą PBS i 0,2%Triton X-100. Przenieś mózgi do roztworu utrwalającego w zakrytej probówce natychmiast po sekcji. Aby rozpocząć, weź szkiełko i dodaj do niego dwa cienkie paski dwustronnej taśmy klejącej, aby przygotować się do obrazowania.
Odpipetować około 10 do 15 mikrolitrów medium montażowego między dwoma paskami taśmy do montażu mózgu. Przenieś znakowane mózgi Drosophila na szkiełko mikroskopowe za pomocą końcówki pipety P20 wstępnie przepłukanej PBS i 0,2% Triton X-100. Po przeniesieniu mózgów użyj cienkiego pędzla, aby je wyrównać, upewniając się, że płaty anteny są skierowane do góry.
Po ustawieniu mózgów przykryj je szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Następnie wypełnij boki szkiełka nakrywkowego dodatkowym medium montażowym. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
Po dokładnym wysuszeniu szkiełka przechowuj je w lodówce w celu późniejszego obrazowania. Do obrazowania należy używać laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w 63-krotny obiektyw zanurzeniowy w olejku. Zastosuj argon 488 i laser helowo-neonowy 543 do obrazowania płata anteny, kłębuszków synaptycznych i węchowych neuronów czuciowych Or42a.
Określ optymalne wzmocnienie i przesunięcie dla obu kanałów. Umieść obrazowanie w środku mózgu i skup się na kłębuszkach VM7 znajdujących się w przybliżeniu do otworu w środku mózgu. Wybierz rozdzielczość obrazowania 1024 na 1024.
Uchwyć całą konfokalną projekcję stosu Z przez płat anteny, aby zapewnić uchwycenie pełnego unerwienia neuronów Or42a kłębuszków nerkowych VM7. Załaduj genotyp lub obraz z zaślepioną warunkowością na Fidżi. Aby podzielić kanały linii laserowej, przejdź do obrazu, kliknij przycisk Kolor i wybierz opcję Podziel kanały.
W węchowym kanale czuciowym Or42a przewiń przez stos Z, aby określić, które wycinki zawierają unerwienie neuronu Or42a, identyfikując początek i koniec fluorescencji. Aby utworzyć projekcję sumy wycinków, która zawiera tylko wycinki z unerwieniem neuronu Or42a, kliknij pozycję Obraz i przejdź do pozycji Stosy. Następnie kliknij Z Project, zaznacz kilka plasterków i wprowadź żądany zakres.
Użyj narzędzia lasso na Fidżi, aby prześledzić zarys unerwienia neuronu Or42a w kłębuszku nerkowym VM7. Pomnóż obwód śledzonego obszaru przez liczbę plasterków stosu Z i grubość każdego wycinka, aby obliczyć objętość unerwienia kłębuszka synaptycznego VM7. Po 24-godzinnej ekspozycji na kontrolny zapach i nośnik, gęste unerwienie Or42a mCD8-GFP utrzymuje się w kłębuszkach VM7 obu płatów antenowych.
Natomiast 24-godzinna ekspozycja na 25% nawaniacza EB powoduje znaczne przycinanie i utratę objętości kłębuszków synaptycznych. Rosnące stężenie substancji zapachowej EB powoduje stopniowo większe przycinanie kłębuszków synaptycznych. Reprezentatywne oceny ilościowe dla tego zakresu stężeń nawaniacza EB wykazały podobne wyniki dla intensywności fluorescencji i objętości unerwienia.
Przegląd
Badanie to dotyczy roli komórek glialnych w remodelacji synaps zależnej od doświadczeń w płatach czułkowych mózgu młodych Drosophila. Badania podkreślają, jak zmiany synaptyczne mogą być indukowane poprzez kontrolowane doświadczenia olfaktometryczne, mające na celu zdefiniowanie podstawowych mechanizmów molekularnych, które mogą ponownie otworzyć plastyczność przypominającą okres krytyczny w dorosłości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwojowa
- Przetwarzanie węchowe
Tło
- Remodelacja synaps zależna od doświadczeń jest kluczowa dla plastyczności neuronowej.
- Komórki glebowe odgrywają znaczącą rolę w wycinaniu synaps podczas krytycznych okresów.
- Model Drosophila umożliwia precyzyjne manipulacje genetyczne w badaniu tych procesów.
- Badanie komunikacji neuron-gleba może ujawniać wgląd w zmiany synaptyczne wywołane doświadczeniem.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów zaangażowania komórek gleby w wycinanie synaps podczas krytycznych okresów.
- Zrozumienie, jak ekspozycja na określone zapachy wpływa na strukturę kłębuszków synaptycznych.
- Stworzenie modelu ponownego otwarcia plastyczności przypominającej okres krytyczny dla potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Stosowane metody
- Wykorzystano larwy i dorosłe osobniki Drosophila do badania zmian indukowanych doświadczeniem węchowym.
- Kontrolowano stężenie, czas trwania i czas ekspozycji na zapachy, aby wywołać remodelację synaps.
- Przeprowadzono sekcje mózgu i obrazowanie konfokalne, aby ocenić struktury synaptyczne po ekspozycji.
- Każda faza eksperymentu była starannie zaprojektowana, aby zapewnić dokładną ocenę kłębuszków synaptycznych.
Główne wyniki
- Ekspozycja na węchowe stężenia izowalerianianu etylu (EB) prowadziła do znacznego wycinania kłębuszków synaptycznych.
- Wyższe stężenia EB korelowały z bardziej rozległą remodelacją synaps.
- Identyfikowano szczegółowe wyniki ilościowe dotyczące objętości owijaczy synaptycznych i zmian intensywności fluorescencji.
- Wyniki potwierdzają hipotezę dotyczącą plastyczności napędzanej doświadczeniem i potencjału ponownego zaangażowania remodelacji synaps w dorosłości.
Wnioski
- To badanie pokazuje, jak ukierunkowane doświadczenia węchowe mogą przekształcić struktury synaptyczne u Drosophila.
- Oferuje wgląd w mechanizmy glebowe remodelacji synaps, które mogą mieć zastosowanie w leczeniu zaburzeń neurologicznych.
- Podkreśla potencjał wykorzystania manipulacji genetycznych i farmakologicznych do zwiększenia plastyczności w mózgach dorosłych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Experience-dependent synaptic remodeling during early-life critical periods is a key inflection point for understanding neural circuit plasticity and its implications for target validation in neurodevelopmental research. This protocol enables precise, dose- and time-controlled manipulation of olfactory sensory input in Drosophila, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence for synaptic connectivity studies. The approach provides a robust platform for dissecting gene-environment interactions relevant to early discovery and translational neuroscience portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene-environment interactions affecting synaptic pruning and circuit formation.
- Supports functional target validation by quantifying experience-driven synaptic changes in defined neuron classes.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate pathways involved in neural plasticity.
- Provides predictive confidence for advancing neurodevelopmental targets.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated, genetically tractable system for quantifying synaptic remodeling in response to controlled stimuli.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as synaptic innervation volume and fluorescence intensity.
- Enables assay standardization for screening genetic or pharmacological modulators of synaptic plasticity.
- Prepares a scalable platform for downstream compound evaluation in neural circuit modulation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms underlying neurodevelopmental and neuroplasticity disorders.
- Supports translational biomarker identification through quantifiable synaptic endpoints.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement of neuroplasticity-modulating interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of synaptic remodeling mechanisms, supporting both early target validation and translational research workflows.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on experience-dependent synaptic pruning and glial involvement.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers measurable outputs such as innervation volume and fluorescence intensity for condition comparison.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable genetic and imaging platform for diverse neuroplasticity research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural circuit studies.
- Operational Value: Standardizes and scales synaptic remodeling assays for cross-team use.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation for neurodevelopmental target portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of synaptic plasticity targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, confocal imaging, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-resolution confocal microscopy and image processing software (e.g., Fiji).
- Demands rigorous cross-team standardization of exposure protocols and imaging parameters.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization and validation.
- Temporal and dose-dependency of critical period effects must be carefully controlled and interpreted.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:55
Inducing Ethyl Butyrate (EB) Experience‐Dependent Synaptic Pruning of Or42a Receptor
2:14
Drosophila Brain Dissection to Analyze Ethyl Butyrate (EB) Experience‐Dependent Synaptic Pruning of Or42a Receptor
3:38
Confocal Imaging and Synaptic Measurements to Analyze Experience‐Dependent Critical Period Synaptic Glomeruli Pruning
