Zależna od doświadczenia przebudowa połączeń synaptycznych neuronów czuciowych młodzieńczych neuronów czuciowych we wczesnym okresie życia
1 marca 2024
Opisujemy tutaj metody indukowania i analizowania zależnej od doświadczenia węchowego przebudowy synaptycznych kłębuszków nerkowych płata czułkowego w mózgu młodocianych Drosophila.
Tak więc moje badania obejmują badanie ról gleju w zależnej od doświadczenia krytycznej przebudowie synaps okresu. Określam rolę gleju w przycinaniu synapsów, szczególnie w okresach krytycznych, oraz komunikację neuron-glej, która umożliwia przycinanie napędzane doświadczeniem. Nasz protokół ma udowodnioną moc genetyki Drosophila do definiowania mechanizmów molekularnych.
Aby badać interakcje gen-środowisko, możemy precyzyjnie manipulować stężeniem zapachu, czasem trwania i czasem jego trwania w krótkim, dobrze zdefiniowanym okresie krytycznym. Protokół ten jest niezwykle wszechstronny w indukowaniu przebudowy synaps. Nasze wyniki stworzyły doskonały model podatny na manipulacje genetyczne i farmaceutyczne, który może potencjalnie ponownie otworzyć krytyczną plastyczność podobną do miesiączki w wieku dorosłym, co jest tematem o ogromnym zainteresowaniu w leczeniu urazów, urazów i zaburzeń neurologicznych.
Na początek weź fiolkę z larwami Drosophila. Za pomocą cienkiego pędzla posortuj od 40 do 50 bardzo ciemnych poczwarek w polistyrenowych fiolkach Drosophila zawierających standardowy pokarm z melasy z mąki kukurydzianej. Umieść drobną siatkę drucianą ze stali nierdzewnej na końcu fiolek Drosophila, aby zatrzymać muchy, zapewniając jednocześnie dobry przepływ powietrza.
Zabezpieczyć nasadki z siatki drucianej przezroczystą folią z boku fiolek. Następnie dodaj jeden mililitr 100% oleju mineralnego lub rozpuszczonego EB w oleju mineralnym w 1,5-mililitrowych tubkach. Umieść te rurki pionowo w pojemniku Glasslock o pojemności 3 700 mililitrów.
Za pomocą taśmy zakotwicz rurki na środku komór nawaniających wraz z fiolkami Drosophila. Umieścić szczelnie zamknięte komory kontrolne pojazdu i komory zapachowe EB zawierające fiolki poczwarek w nawilżonym inkubatorze w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnego ciemnego cyklu. Po czterech godzinach ekspozycji w komorze nawaniającej szybko przenieś od 20 do 25 nowo zamkniętych much do świeżych fiolek Drosophila w komorach ze świeżo przygotowanym środkiem zapachowym.
Muchy należy przechowywać w szczelnych komorach zapachowych w inkubatorach przez łącznie 24 godziny. Na początek weź muchy Drosophila wystawione na działanie oleju mineralnego i EB przez 24 godziny. Oznacz fiolki jako kontrolę nośnika lub EB odsłonięte i utrzymuj te oznaczenia podczas sekcji i przetwarzania mózgu.
Za pomocą kleszczy przenieś pojedynczą znieczuloną muchę do małego naczynia ze świeżo przygotowanym PBS. Całkowicie zanurz muchę w PBS, aby uzyskać pełną sekcję mózgu. Następnie ustaw muchę brzuszną stroną do góry.
Weź dwa cienkie, zaostrzone kleszcze, aby jednym kleszczem chwycić górną część klatki piersiowej, a drugim głowę pod trąbką. Pociągnij głowę i resztę ciała w przeciwnych kierunkach, aby zdjąć głowę. Upewnij się, że głowa łatwo odłącza się od klatki piersiowej i pozostawia izolowaną głowę do sekcji.
Wsuń kleszcze używane wcześniej do chwytania klatki piersiowej pod przeciwną stronę trąbki. Delikatnie pociągnij naskórek egzoszkieletu w przeciwnych kierunkach, aby rozerwać go między oczami i odsłonić mózg. Kontynuuj usuwanie naskórka egzoszkieletu z głowy, upewniając się, że wszystkie części zostały usunięte.
Teraz przepłucz końcówkę pipety P20 za pomocą PBS i 0,2%Triton X-100. Przenieś mózgi do roztworu utrwalającego w zakrytej probówce natychmiast po sekcji. Aby rozpocząć, weź szkiełko i dodaj do niego dwa cienkie paski dwustronnej taśmy klejącej, aby przygotować się do obrazowania.
Odpipetować około 10 do 15 mikrolitrów medium montażowego między dwoma paskami taśmy do montażu mózgu. Przenieś znakowane mózgi Drosophila na szkiełko mikroskopowe za pomocą końcówki pipety P20 wstępnie przepłukanej PBS i 0,2% Triton X-100. Po przeniesieniu mózgów użyj cienkiego pędzla, aby je wyrównać, upewniając się, że płaty anteny są skierowane do góry.
Po ustawieniu mózgów przykryj je szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Następnie wypełnij boki szkiełka nakrywkowego dodatkowym medium montażowym. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
Po dokładnym wysuszeniu szkiełka przechowuj je w lodówce w celu późniejszego obrazowania. Do obrazowania należy używać laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w 63-krotny obiektyw zanurzeniowy w olejku. Zastosuj argon 488 i laser helowo-neonowy 543 do obrazowania płata anteny, kłębuszków synaptycznych i węchowych neuronów czuciowych Or42a.
Określ optymalne wzmocnienie i przesunięcie dla obu kanałów. Umieść obrazowanie w środku mózgu i skup się na kłębuszkach VM7 znajdujących się w przybliżeniu do otworu w środku mózgu. Wybierz rozdzielczość obrazowania 1024 na 1024.
Uchwyć całą konfokalną projekcję stosu Z przez płat anteny, aby zapewnić uchwycenie pełnego unerwienia neuronów Or42a kłębuszków nerkowych VM7. Załaduj genotyp lub obraz z zaślepioną warunkowością na Fidżi. Aby podzielić kanały linii laserowej, przejdź do obrazu, kliknij przycisk Kolor i wybierz opcję Podziel kanały.
W węchowym kanale czuciowym Or42a przewiń przez stos Z, aby określić, które wycinki zawierają unerwienie neuronu Or42a, identyfikując początek i koniec fluorescencji. Aby utworzyć projekcję sumy wycinków, która zawiera tylko wycinki z unerwieniem neuronu Or42a, kliknij pozycję Obraz i przejdź do pozycji Stosy. Następnie kliknij Z Project, zaznacz kilka plasterków i wprowadź żądany zakres.
Użyj narzędzia lasso na Fidżi, aby prześledzić zarys unerwienia neuronu Or42a w kłębuszku nerkowym VM7. Pomnóż obwód śledzonego obszaru przez liczbę plasterków stosu Z i grubość każdego wycinka, aby obliczyć objętość unerwienia kłębuszka synaptycznego VM7. Po 24-godzinnej ekspozycji na kontrolny zapach i nośnik, gęste unerwienie Or42a mCD8-GFP utrzymuje się w kłębuszkach VM7 obu płatów antenowych.
Natomiast 24-godzinna ekspozycja na 25% nawaniacza EB powoduje znaczne przycinanie i utratę objętości kłębuszków synaptycznych. Rosnące stężenie substancji zapachowej EB powoduje stopniowo większe przycinanie kłębuszków synaptycznych. Reprezentatywne oceny ilościowe dla tego zakresu stężeń nawaniacza EB wykazały podobne wyniki dla intensywności fluorescencji i objętości unerwienia.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje rolę gleju w zależnym od doświadczeń przebudowywaniu synaps w obrębie płatów antenowych mózgu młodzieńczego stadium rozwoju Drosophila. Badanie podkreśla, w jaki sposób zmiany synaptyczne mogą być indukowane poprzez kontrolowane doświadczenia węchowe, mając na celu zdefiniowanie podstawowych mechanizmów molekularnych, które mogłyby ponownie przywrócić plastyczność typową dla okresów krytycznych w wieku dorosłym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Przetwarzanie węchowe
Wstęp
- Zależna od doświadczenia przebudowa synaps jest kluczowa dla plastyczności neuronalnej.
- Komórki glejowe odgrywają istotną rolę w przycinaniu synaptycznym podczas okresów krytycznych.
- Model Drosophila umożliwia precyzyjne manipulacje genetyczne w celu badania tych procesów.
- Badanie komunikacji między neuronami a glejem może dostarczyć wiedzy na temat zmian synaptycznych indukowanych przez doświadczenie.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów udziału gleju w przycinaniu synaptycznym podczas okresów krytycznych.
- Zrozumienie, w jaki sposób ekspozycja na konkretne zapachy wpływa na strukturę synaptyczną kłębuszków węchowych.
- Ustanowienie modelu przywracania plastyczności przypominającej okresy krytyczne w celu potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Zastosowane Metody
- Wykorzystano larwy i dorosłe osobniki Drosophila do badania zmian indukowanych przez doświadczenia węchowe.
- Kontrolowano stężenie zapachu, czas trwania oraz moment ekspozycji w celu wywołania przebudowy synaptycznej.
- Przeprowadzono sekcje mózgu oraz obrazowanie konfokalne, aby ocenić struktury synaptyczne po ekspozycji.
- Każda faza eksperymentalna została starannie zaprojektowana, aby zapewnić dokładną ocenę kłębków synaptycznych.
Główne wyniki
- Ekspozycja węchowa na określone stężenia maślanu etylu (EB) doprowadziła do znacznego przycinania kłębek synaptycznych.
- Wyższe stężenia EB korelowały z bardziej rozległym przebudowaniem synaptycznym.
- Zidentyfikowano szczegółowe wyniki ilościowe dotyczące objętości unerwienia synaptycznego oraz zmian intensywności fluorescencji.
- Wyniki wspierają hipotezę o plastyczności napędzanej doświadczeniem oraz potencjale do ponownego uruchomienia przebudowy synaptycznej w wieku dorosłym.
Wnioski
- Niniejsze badanie demonstruje, w jaki sposób ukierunkowane doświadczenia węchowe mogą zmieniać struktury synaptyczne u Drosophila.
- Dostarcza wiedzy na temat glejalnych mechanizmów przebudowy synaptycznej, co może mieć znaczenie dla leczenia schorzeń neurologicznych.
- Podkreśla potencjał wykorzystania manipulacji genetycznych i farmakologicznych w celu zwiększenia plastyczności mózgów dorosłych osobników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zależne od doświadczenia przebudowy synaptyczne podczas krytycznych okresów we wczesnych etapach życia stanowią kluczowy punkt zwrotny dla zrozumienia plastyczności obwodów neuronalnych oraz jej znaczenia dla walidacji celów w badaniach nad rozwojem neurologicznym. Niniejszy protokół umożliwia precyzyjną, kontrolowaną pod względem dawki i czasu manipulację dopływem bodźców sensorycznych z narządów węchowych u Drosophila, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka oraz zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad łącznością synaptyczną. Podejście to stanowi solidną platformę do analizy interakcji gen-środowisko istotnych dla wczesnych etapów odkryć oraz portfeli badań w zakresie neuronauki translacyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań gen-środowisko wpływających na przycinanie synaptyczne i formowanie obwodów.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie doświadczalnie indukowanych zmian synaptycznych w określonych klasach neuronów.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do szlaków kandydackich zaangażowanych w plastyczność neuronalną.
- Zapewnia pewność prognostyczną w przypadku rozwoju celów neurorozwojowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowany, genetycznie podatny system do ilościowego określania przebudowy synaptycznej w odpowiedzi na kontrolowane bodźce.
- Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników, takich jak objętość unerwienia synaptycznego i intensywność fluorescencji.
- Umożliwia standaryzację testów w celu przesiewania genetycznych lub farmakologicznych modulatorów plastyczności synaptycznej.
- Przygotowuje skalowalną platformę do późniejszej oceny związków w modulacji obwodów neuronalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z mechanizmami istotnymi dla chorób leżących u podstaw zaburzeń neurorozwojowych i neuroplastyczności.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych poprzez mierzalne punkty końcowe synaptyczne.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkryć po walidację w modelach przedklinicznych.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój interwencji modulujących neuroplastyczność.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie mechanizmów przebudowy synaptycznej w oparciu o postawione hipotezy, co wspiera zarówno wczesną walidację celów terapeutycznych, jak i translacyjne procesy badawcze.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących zależnego od doświadczenia przycinania synaptycznego oraz udziału gleju.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki niezbędne do opracowywania testów i przesiewania związków.
- Analityka: Dostarcza mierzalnych wyników, takich jak objętość unerwienia i intensywność fluorescencji, w celu porównania poszczególnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z modelami istotnymi dla chorób i strategiami poszukiwania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę genetyczną i obrazową dla różnorodnych inicjatyw badawczych w zakresie neuroplastyczności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach obwodów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje testy przebudowy synaptycznej do użytku w wielu zespołach.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz alokację kapitału dla portfeli celów neurorozwojowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i interwencji w zakresie plastyczności synaptycznej z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu genetyki Drosophila, obrazowania konfokalnego oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości oraz oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. Fiji).
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów ekspozycji i parametrów obrazowania pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji i walidacji protokołu.
- Wpływ okresów krytycznych w zależności od czasu i dawki musi być starannie kontrolowany i interpretowany.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:55
Inducing Ethyl Butyrate (EB) Experience‐Dependent Synaptic Pruning of Or42a Receptor
2:14
Drosophila Brain Dissection to Analyze Ethyl Butyrate (EB) Experience‐Dependent Synaptic Pruning of Or42a Receptor
3:38
Confocal Imaging and Synaptic Measurements to Analyze Experience‐Dependent Critical Period Synaptic Glomeruli Pruning
