Name: Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Naucz się izolować i hodować pierwotne ludzkie komórki nabłonka sutka (HMEC) z małych próbek tkanki. Ta metoda enzymatyczna wspiera badania nad mastitis granulomatozą i zastosowania kliniczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Programu Nauki i Technologii TCM w prowincji Zhejiang w Chinach (2017ZA055; 2018ZA036) oraz Projekt Naukowo-Technologiczny Zunyi, prowincja Guizhou, Chiny (Zunyi City Kehe Support NS (2020) nr 18) do X. Xu. Autorzy dziękują Laboratorium Biologii Molekularnej firmy Youjia (Hangzhou) Biomedical Technology Company za zapewnienie szkolenia w zakresie hodowli komórkowych.

Świeże normalne tkanki sutka użyte w tym protokole są pobierane z operacji wokół uszkodzenia opornego ziarniniakowego zrazikowego zapalenia wymienia w Pierwszym Szpitalu Stowarzyszonym Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang zgodnie z wytycznymi Komisji Etyki Medycznej Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang (Protokół nr. ChiMCTR2100005281, Data: 2017-07-17).
1. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Pobrać świeże tkanki sutka z próbek chirurgicznych pobranych od dorosłych kobiet do sterylnych probówek zawierających 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 3% penicyliną/streptomycyną (P/S). 
	UWAGA: Z tkankami sutka należy obchodzić się zgodnie z poniższymi szczegółami w ciągu 24 godzin od pobrania z zabiegu.</li>
</ol>
2. Wstępne leczenie tkanek
<ol>
	<li>Usuń tkankę tłuszczową z tkanki sutkowej za pomocą dwóch par kleszczy, upewniając się, że pozostała tkanka sutkowa waży ~1 g.</li>
	<li>Płukać tkankę sutkową w 75% roztworze etanolu (5 ml) przez 5 s, a następnie przemywać 20 ml roztworu myjącego (tabela 1) przez 2 x 5 min.</li>
</ol>
3. Trawienie tkanek
<ol>
	<li>Pokrój tkankę sutka na mniejsze fragmenty, rozdrabniając tkankę za pomocą dwóch ostrzy chirurgicznych przez 15 minut, aby uzyskać jednorodność tkanki. Przenieść kawałki tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 10 ml 5,0 mg/ml dispazy + 5,0 mg/ml roztworu kolagenazy, 3 ml 0,25% trypsyny i 7 ml PBS do łącznie 20 ml roztworu trawiącego w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, która zawiera fragmenty tkanki sutkowej. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 1,5 godziny; Wstrząsaj probówką co 20 minut.</li>
	<li>Zatrzymać proces trawienia, wstrzykując 20 ml roztworu neutralizującego. Wymieszać zawartość pipetując ~15x.</li>
	<li>Przefiltrować mieszaninę przez filtr siatkowy o wielkości 100 μm. Wirować przy 156 × g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i powtórzyć inkubację osadu z 20 ml roztworu neutralizującego. Wymieszać zawartość pipetując 15x i odwirować przy stężeniu 156 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml początkowej pożywki hodowlanej. Zawiesinę komórkową umieścić na płytce w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Hodować komórki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Pierwotną pożywkę hodowlaną należy zastąpić świeżą pożywką komórkową nabłonka co trzeci dzień. Sprawdź komórki i odświeżaj podłoże co 2 dni.</li>
</ol>
4. Przekazywanie komórek
<ol>
	<li>Wyjmij naczynie o średnicy 100 mm z inkubatora, gdy komórki osiągną zlewność 80%-90%, wyrzuć zużytą pożywkę i opłucz naczynie 2x 2 ml PBS. Usuń PBS, a następnie dodaj 2 ml 0,05% trypsyny do każdego naczynia o średnicy 100 mm. 
	UWAGA: Zakręć naczyniem, aby upewnić się, że roztwór trypsyny ma wystarczający kontakt z dnem naczynia.</li>
	<li>Umieścić naczynie o średnicy 100 mm w inkubatorze o temperaturze 37 °C na ~7 minut w celu przeprowadzenia procesu mineralizacji.</li>
	<li>Zbadaj komórki pod mikroskopem za pomocą obiektywu 40x, aby upewnić się, że większość komórek została oddzielona od dna naczynia.</li>
	<li>Zatrzymaj proces trawienia, dodając 8 ml roztworu neutralizującego i przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml. Wymieszaj komórki, pipetując w górę i w dół 10-15 razy. Odwirować komórki o masie 156 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki 10 ml pożywki z komórek nabłonkowych i policzyć liczbę komórek.</li>
	<li>Dodać 1 × 106 komórek w 10 ml pożywki z komórek nabłonka w naczyniu o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Odśwież pożywkę komórkową nabłonka i obserwuj komórki co 2 dni.</li>
</ol>
5. Kriokonserwacja komórek
<ol>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.4.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml roztworu do krioprezerwacji komórek.</li>
	<li>Przenieść 1 ml roztworu do krioprezerwacji zawierającego komórki do każdej fiolki kriogenicznej.</li>
	<li>Zapisz nazwy komórek kriokonserwowanych, numery przejść i daty.</li>
	<li>Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania z kontrolowaną szybkością zamrażania w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
	<li>Wyjmij fiolki kriogeniczne z zamrażarki o temperaturze -80 °C i szybko przenieś je do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>

Protocol for Isolating Mammary Epithelial Cells from Human Tissue

<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoepithelial+cells%3A+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li>
<li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women%27s+breast+cancer+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li>
<li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+rat+mammary+gland%3A+Isolation%2C+characterization%2C+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818(2020).</li>
<li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselective+secondary+tissue+attachment%26%2334%3B+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">A &#34;selective secondary tissue attachment&#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972(2022).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012(2021).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784(2018).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978(2021).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li>
<li>Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologe%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li>
<li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li>
<li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li>
<li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li>
<li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

HMEC są niezbędne do zachowania anatomicznej i funkcjonalnej integralności tkanki sutka i są przydatne w badaniach naukowych, wdrożeniach klinicznych i powiązanych dziedzinach15. Pierwotne komórki nabłonkowe to rodzaj wyspecjalizowanych komórek, które mają ograniczone pasaże i krótszą żywotność. Jednak rozwój HMEC został zahamowany przez ograniczenia techniczne, które w konsekwencji zahamowały postęp w badaniach nad rakiem piersi i innymi chorobami zapalnymi związanymi z piersią16.
Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania stabilnej, wykonalnej i wydajnej metody pozyskiwania HMEC ze świeżych tkanek sutka. Hammond i wsp.8 oraz Band i Sager17 z powodzeniem wyekstrahowali i wyhodowali komórki nabłonka piersi. Jednak wymagany skład pożywki hodowlanej był zbyt złożony. Wcześniejsze badania Taylor-Papidamitriou i wsp. wykazały, że komórki jamy ustnej z mleka matki można hodować przy użyciu pożywki uzupełnionej czynnikami wzrostu i surowicą18. Chociaż ich metoda pozwala na bezpośrednią ekstrakcję HMEC z mleka matki, obecność komórek nienabłonkowych może wpływać na wzrost HMEC, co utrudnia dokładne określenie liczby komórek. Jin i in. opracowali metodę warunkowego przeprogramowania, która umożliwiła pierwotnym HMEC dłuższy cykl życia i zachowanie heterogeniczności komórek w porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowli, ale była w dużym stopniu zależna od określonych warunków hodowli i ograniczała stosowanie tej metody w innych laboratoriach i zastosowaniach12.
W badaniu przeprowadzonym przez grupę Zubeldia-Plazaola opracowano zoptymalizowaną metodę izolacji, która polegała na powolnym trawieniu (przez noc) fragmentów tkanek mielonych przez mieszaninę kolagenazy i hialuronidazy, a następnie trzykrotnym wirowaniu różnicowym drugiego dnia w celu oddzielenia frakcji zrębu/nabłonka. Ta metoda izolacji oraz dodanie Y-27632 do hodowli pozwoliły uzyskać dużą liczbę żywotnych komórek nabłonkowych. Jednak ilość tkanki sutka użytej w ich badaniu wynosiła 40-75 g, a procedura izolacji trwała prawie 2 dni9. Tutaj podajemy użycie tylko 1 g tkanki w tym protokole, a przetestowaliśmy i stwierdziliśmy, że ta metoda działała również w przypadku zaledwie 0,25 g tkanki. Mieszanina enzymów kolagenazy, dypazy i trypsyny sprawnie trawiła 1 g tkanki w ciągu 1,5 godziny, a cała procedura trwała ~3 godziny. Dodanie Y-27632 do początkowej pożywki hodowlanej może promować przyczepianie się i proliferację komórek nabłonka, ale także hamować wzrost komórek zrębu19. Co ważne w tym badaniu, przetestowaliśmy składniki początkowej pożywki i stwierdziliśmy, że 5% FBS w DMEM w celu zastąpienia pożywki G użytej w poprzedniej publikacji było wystarczające do promowania przyczepiania się i wzrostu komórek naskórka10.
Po 2 dniach hodowli w pożywce początkowej komórki hodowano w pożywce keratynocytów bez surowicy. Wzorzec wzrostu komórek dla początkowej hodowli (P0) po inokulacji pokazano na rysunku 2, który pokazuje wzorzec wzrostu kolonii. Ta metoda izolacji prawdopodobnie daje wszystkie typy komórek nabłonkowych, w tym komórki mioepitelialne z tkanek sutka, które muszą być dalej charakteryzowane w przyszłości. Niemniej jednak, porównując wzrost komórek w obecności Y-27632 z grupą kontrolną bez dodawania Y-27632 do początkowej pożywki hodowlanej, możemy zobaczyć, że metoda z Y-27632 znacznie zwiększyła produkcję komórek i poprawiła wydajność hodowli komórkowej (Figura 2A). Zwykle ~ 9-10 dni hodowli po inokulacji komórki naskórka mogą osiągnąć gęstość odpowiednią do pasażowania. Ponadto wykazaliśmy również, że obecność Y-27632 może zwiększyć wzrost HMEC P1 po odzyskaniu komórek P0 zamrożonych pod koniec początkowej hodowli (Figura 3). W naszych rękach odkryliśmy, że ponad 90% komórek było w stanie przetrwać po rozmrożeniu z zamrożonego przechowywania. Komórki miały czas podwojenia wynoszący około 72 godziny, a HMEC były w stanie utrzymać normalny wzrost do 7. pasażu.
W tym badaniu komórki wyrażały wysoki poziom markerów komórek nabłonka sutka CK7 i GATA3, a co ważne, prawie 100% komórek w późnym etapie początkowej hodowli było dodatnich dla CK7 i GATA3 (ryc. 4), co wskazuje na wysoką czystość komórek nabłonkowych uzyskanych tą metodą. Wreszcie, w badaniu tym porównano poziomy ekspresji CK7 i GATA3 w komórkach P0 i P3, ujawniając wysokie poziomy ekspresji w obu, co sugeruje, że pasaż nie zmienił fenotypu komórek (figura 5A, B). Ponadto, niezależnie od obecności Y-27632, CK7 i GATA3 były konsekwentnie wysoce eksprymowane, co sugeruje, że dodanie Y-27632 nie wpłynęło na fenotyp komórki (Figura 5C, D).
Główną przyczyną zwiększenia proliferacji komórek dzięki naszemu podejściu jest włączenie Y-27632, który, jak wykazano, ma korzystny wpływ na namnażanie i specjalizację ludzkich komórek nabłonkowych19,20. Chapman i in. odkryli, że użycie Y-27632 znacznie zwiększyło zdolność komórek nabłonkowych do namnażania się i doprowadziło do udanej nieśmiertelności komórek bez żadnych oznak kryzysu komórkowego21. W naszym badaniu Y-27632 znacznie zwiększył wydajność tych komórek nabłonkowych poprzez zwiększenie ich przyczepiania i proliferacji19.
Jedną z kluczowych cech tej metody jest połączenie dypazy i kolagenazy w celu oddzielenia tkanki nabłonkowej od tkanki łącznej, przy jednoczesnym zastosowaniu trypsyny do dysocjacji komórek nabłonka od tkanki nabłonkowej22. Okazało się, że dyspasa jest szybkim i skutecznym, a jednocześnie delikatnym enzymem do oddzielania nieuszkodzonego naskórka od skóry właściwej, a także nieuszkodzonych warstw komórek nabłonka w hodowli od leżącej poniżej powierzchni, a wszystko to przy zachowaniu żywotności komórek nabłonka23. Kolagenaza typu I ułatwia izolację komórek nabłonkowych oraz zapewnia żywotność i integralność komórek24. Inną kluczową cechą tej metody jest użycie początkowej pożywki z Y-27632 do hodowli nowo wyizolowanych HMEC. Po tym, jak komórki przylgną do naczynia trzeciego dnia, pożywka hodowlana zmienia się na pożywkę bez surowicy keratynocytów. Takie podejście wyraźnie upraszcza etapy eksperymentu i zmniejsza koszt eksperymentu. W rezultacie uzyskaliśmy bardzo zadowalającą liczbę komórek przy użyciu tylko niewielkiej objętości tkanki sutka tą metodą, co wskazuje, że duża ilość tkanki wyjściowej nie jest konieczna. Jednak jedną z wad tego podejścia jest to, że obecność trypsyny nie chroni odpowiednio integralności komórek nabłonkowych. Innym potencjalnie ograniczającym aspektem metody jest możliwość niewielkiego (<1%) zanieczyszczenia komórek mioepitelialnych podczas początkowej hodowli9.
Nasza metoda oferuje usprawnione i skuteczne podejście do izolowania i hodowli pierwotnych HMEC pochodzących z dorosłej tkanki sutka. Technika ta charakteryzuje się prostotą, oszczędnością czasu i zdolnością do utrzymania podstawowych funkcji komórkowych. W związku z tym technika ta ma wyraźne zalety i jest bardzo obiecująca w generowaniu znacznej ilości komórek nabłonkowych. Co więcej, metoda ta pozwala na izolację i hodowlę HMEC od szerokiego grona dawców, nadając się zarówno do badań laboratoryjnych, jak i zastosowań klinicznych, co czyni ją wysoce wszechstronną i mającą szerokie zastosowanie.

Rak piersi jest głównym typem raka diagnozowanym u kobiet na całym świecie i jest główną przyczyną zgonów z powodu raka1. Patogeneza raka piersi jest złożona i obejmuje wiele czynników, takich jak genetyka, środowisko i styl życia. HMEC, aktywne komórki produkujące mleko, są jednym z najważniejszych składników tkanki sutka i prawdopodobnie są oryginalnymi komórkami zaangażowanymi w kancerogenezę raka piersi. W związku z tym HMEC spotkały się z największym zainteresowaniem naukowców w badaniu raka piersi2. Co więcej, komórki pierwotne mają zdolność do zapewnienia biologicznie istotnej charakterystyki złożonych procesów komórkowych ze względu na zachowanie stabilności genetycznej, normalnej morfologii i bardziej kompletnego zestawu podstawowych funkcji komórkowych, których nie można osiągnąć za pomocą unieśmiertelnionych linii komórkowych3. W związku z tym izolacja i hodowla pierwotnych HMEC jest niezbędnym krokiem w badaniu większości chorób związanych z piersiami, takich jak rak piersi i choroby zapalne piersi.
Obecnie ustanowiono stabilny i powtarzalny system izolacji, hodowli i identyfikacji komórek nabłonka sutka od szczurów, krów, świń i kóz4,5,6,7. Jednak izolacja i hodowla pierwotnych HMEC są trudne ze względu na złożone mikrośrodowisko i niską wydajność komórek. Przez dziesięciolecia naukowcy poszukiwali najskuteczniejszej metody izolowania i hodowli HMEC, chociaż system hodowli HMEC został ustanowiony prawie 20 lat temu. Na przykład Hammond i wsp. opracowali pożywkę hodowlaną bez surowicy, w której HMEC rosły wydajnie8. Niedawno Zubeldia-Plazaola i in. przetestowali cztery różne metody izolacji przy użyciu procedur szybkiego/wolnego trawienia enzymatycznego w połączeniu z sekwencyjną filtracją lub etapami wirowania różnicowego, aby uzyskać HMECs9. Odkryli, że metoda powolnego trawienia wraz z wirowaniem różnicowym jest najskuteczniejszą metodą izolowania HMEC ze świeżej tkanki piersi. Jednak ta metoda izolacji wymaga dużych kawałków tkanki (40-75 g) i wykorzystuje większe ilości enzymów trawiennych. Ich procedura jest skomplikowana (co najmniej trzy różne wirowania w celu uzyskania różnych frakcji komórek), a także czasochłonna. W związku z tym nadal potrzebna jest prosta i szybka metoda, aby skutecznie uzyskać populacje HMEC z niewielkich ilości tkanki sutka do celów badawczych i klinicznych9.
Nasze poprzednie badania wykazały, że dodanie inhibitora kinazy Rho (ROCK) Y-27632 do początkowej pożywki hodowlanej może uprościć proces izolowania komórek naskórka ludzkiej skóry10, który jest również z powodzeniem stosowany do izolacji komórek nabłonka dziąseł11. Dodatkowo, wcześniejsze badania przeprowadzone przez grupę Zubeldia-Plazaola i grupę Jina wykazały, że Y-27632 ma zdolność stymulowania szybkiego i nieograniczonego wzrostu in vitro pierwotnych komórek nabłonka pochodzących z tkanki sutka9,12. Niniejsze badanie miało na celu sprawdzenie, czy użycie Y-27632 uprości izolację i hodowlę HMEC i z powodzeniem opracowaliśmy prostą i łatwą do wykonania metodę izolowania HMEC z małych kawałków (1 g) tkanki sutka.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna</td><td>Basalmedia</td><td>K431010</td><td>Do HMEC&nbsp; dysocjacja</td></tr><tr><td>1,5 ml mikrowirówki Probówki</td><td>NEST</td><td>081722CK01</td><td>Do trawienia komórek</td></tr><tr><td>100 &mikro; m filtr siatkowy</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>Do filtracji HMEC</td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu</td><td>solarbio</td><td>P1110-100ml</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HMEC</td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Do wirowania komórek</td></tr><tr><td>Sitko</td> <td>do komórekSolarbio</td><td>431752</td><td>Wirówka do filtracji komórkowej</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5404HN133048</td><td>Wirówka komórkowa</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>42820906</td><td>Do inkubacji komórek</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Merck</td><td>SKU:SCR103</td><td>Do izolacji HMEC</td></tr><tr><td>Dypasa&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>CAS: 42613-33-2</td><td>Do izolacji HMEC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>8122622</td><td>Składnik pożywki neutralizującej</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>2556132P</td><td>Składnik pożywki neutralizującej</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanem</td><td>Tecono</td><td>20201033</td><td>Roztwór myjący</td></tr><tr><td>królik anty CK7</td><td>abcam</td><td>ab68459</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HMEC</td></tr><tr><td>królika anty GATA3</td><td>abcam</td><td>ab199428</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu sprawdzenia markera różnicowania HMEC</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Solarbio</td><td>IY0040</td><td>inhibitor ROCK</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

Gruczoł sutkowy jest podstawową strukturą piersi i odgrywa istotną rolę w reprodukcji. Ludzkie komórki nabłonka sutka (HMEC), które są komórkami źródłowymi raka piersi i innych chorób zapalnych związanych z piersiami, przyciągnęły znaczną uwagę. Jednak izolowanie i hodowla pierwotnych HMEC in vitro do celów badawczych było wyzwaniem ze względu na ich wysoce zróżnicowaną, zrogowaciałą naturę i krótką żywotność. Dlatego opracowanie prostej i skutecznej metody izolowania i hodowli HMEC ma ogromną wartość naukową dla badań nad biologią piersi i chorobami związanymi z piersiami. W tym badaniu z powodzeniem wyizolowaliśmy pierwotne HMEC z niewielkich ilości tkanki sutka poprzez trawienie mieszaniną enzymów w połączeniu z początkową hodowlą w 5% płodowej surowicy bydlęcej-DMEM zawierającej inhibitor kinazy związanej z Rho (ROCK) Y-27632, a następnie ekspansję kultury w pożywce keratynocytów bez surowicy. Takie podejście selektywnie wspomaga wzrost komórek nabłonkowych, co skutkuje zoptymalizowaną wydajnością komórek. Prostota i wygoda tej metody sprawiają, że nadaje się ona zarówno do badań laboratoryjnych, jak i klinicznych, które powinny dostarczyć cennych informacji na temat tych ważnych obszarów badań.

Rysunek 1 przedstawia schemat procedury. Protokół zakłada zastosowanie kombinacji enzymów, a mianowicie: dyspazy, kolagenazy i trypsyny. Kombinacja ta służy do oddzielenia płata nabłonka od znajdującej się pod nim warstwy fibroblastów, a następnie wykorzystuje się trypsynę do dysocjacji komórek nabłonka gruczołu mlekowego do postaci zawiesiny. Dodatkowo wzrost komórek nabłonkowych była skutecznie stymulowany poprzez dodanie Y-27632 do początkowego podłoża hodowlanego. W rezultacie metoda ta pozwala na uzyskanie licznej populacji HMEC, spełniającej wymagania do pasażowania w średnim czasie zaledwie 10 dni.
Aby zbadać kluczową rolę Y-27632 wzrostu komórek po izolacji, podzielono świeżo wyizolowane komórki na dwie grupy: pierwszą grupę wysiano w medium początkowym zawierającym 10 mM Y-27632 (Rysunek 2A), natomiast drugą grupę, służącą jako grupa kontrolna, wysiano w medium początkowym bez dodatku Y-27632 (Rysunek 2B). Po 2 dniach hodowli komórki z obu grup przeniesiono do medium dla komórek epidermalnych (Rysunek 1). Na podstawie Rysunku 2 można zaobserwować, że w porównaniu z trzecim dniem, metoda z zastosowaniem Y-27632 wyraźnie zwiększyła liczbę HMECs w dziewiątym dniu. Komórki HMECs utworzyły spójną grupę przypominającą wyspę o wyraźnych granicach i silnych połączeniach międzykomórkowych. Komórki te rozszerzały się na zewnątrz do otaczającego środowiska. Komórki wysiane z Y-27632 (Rysunek 2A) rosły znacznie szybciej niż komórki w grupie kontrolnej (Rysunek 2B). Aby potwierdzić, że Y-27632 wspomaga wzrost HMEC, rozmrożono zamrożone komórki P0 i wysiano je z dodatkiem lub bez dodatku 10 mM Y-27632, a komórki z pasażu 1 (P1) zebrano w różnych dniach, jak pokazano na Rysunku 3. Żywotność i proliferację komórek analizowano przy użyciu zestawu do liczenia komórek CCK-8 (cell count kit-8). Jak pokazano na Rysunku 3, tempo wzrostu komórek traktowanych medium zawierającym Y-27632 było znacząco wyższe niż w grupie kontrolnej bez Y-27632. Sumując te dane, można stwierdzić, że dodanie Y-27632 do medium początkowego znacząco zwiększa wzrost przytwierdzonych komórek po izolacji.
Aby potwierdzić, że komórki otrzymane tą metodą są HMEC, przeprowadziliśmy analizę immunofluorescencyjną HMEC P0 pod kątem dwóch markerów komórek nabłonka gruczołu mlekowego: CK7 oraz GATA3. CK7, cytokeratyna o dużym znaczeniu diagnostycznym, jest markerem różnicowania gruczołowego w prawidłowym nabłonku gruczołu mlekowego oraz w jego proliferujących procesach nabłonkowych13. Dodatkowo Kouros-Mehr i wsp. wykazali, że GATA3 funkcjonuje jako czynnik transkrypcyjny w komórkach nabłonka gruczołu mlekowego i bierze udział w utrzymaniu różnicowania nabłonka luminalnego w w pełni rozwiniętych gruczołach mlekowych14. Jak pokazano na Rysunku 3, hodowane i namnażane przez nas komórki wykazują silną ekspresję zarówno CK7 (Rysunek 4A), jak i GATA3 (Rysunek 4B). Analiza ilościowa komórek pozytywnych pod kątem CK7 i GATA3 wykazała, że ponad 98% komórek wykazuje ekspresję obu markerów (Rysunek 4C), co wskazuje na ograniczoną kontaminację innymi typami komórek, takimi jak fibroblasty. Sporadycznie obserwowaliśmy niewielką liczbę komórek fibroblastopodobnych (o wydłużonej morfologii) w kulturze pierwotnej (P0, Rysunek 2), jednak rzadko pojawiają się one w komórkach po pasażowaniu (P3, Rysunek 4D).
Aby sprawdzić, czy charakterystyka nabłonkowa HMEC może zostać zachowana po kilku pasażach, przeprowadzono analizę qRT-PCR markerów komórek nabłonkowych piersi CK7 i GATA3 w komórkach hodowanych z dodatkiem lub bez dodatku Y-27632 (Rysunek 5). Poziomy ekspresji zarówno CK7, jak i GATA3 nie różniły się istotnie w komórkach P0 i P3, z dodatkiem lub bez dodatku Y-27632, co wskazuje, że ich charakterystyka fenotypowa i różnicowania nie uległa zmianie w czasie podczas ekspansji hodowli.
<img alt="Schemat procesu hodowli komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego; trawienie enzymatyczne, pożywka hodowlana, pasażowanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat protokołu izolacji i hodowli HMECs. Początkowo fragmenty tkanki gruczołu piersiowego kobiet pocięto ostrzami chirurgicznymi i poddano trawieniu mieszaniną enzymów. Następnie otrzymane pellety komórkowe hodowano w początkowej pożywce hodowlanej zawierającej 10 mM Y-27632. Po 2 dniach początkową pożywkę zastąpiono pożywką dla komórek nabłonkowych. Komórki nabłonkowe gruczołu piersiowego hodowano w pożywce dla komórek epidermalnych do uzyskania satysfakcjonującego stopnia pokrycia po około 8 dniach, po czym stały się one odpowiednie do pasażowania. W razie potrzeby część komórek można poddać krio konserwacji. Skrót: HMECs = ludzkie komórki nabłonkowe gruczołu piersiowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu komórek z Y-27632 i grupy kontrolnej; obrazy mikroskopowe kultur komórkowych w dniach 3, 5, 9." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazy HMECs uzyskane po wstępnym szczepieniu. W ciągu 2 dni po szczepieniu (A) pierwotne HMECs były hodowane w medium początkowym zawierającym Y-27632 oraz (B) pierwotne HMECs były hodowane w medium początkowym bez Y-27632. Po 48-godzinnym okresie hodowli, w obu grupach wymieniono bezsurowicze medium do hodowli keratynocytów. Zdjęcia wykonywano co drugi dzień, aby zarejestrować stan wzrostu komórek. Obie serie reprezentatywnych obrazów wykonano przy użyciu mikroskopu odwróconego (100x) w 3, 5 i 9 dniu po szczepieniu. Paski skali = 100 µm. Skrót: HMECs = ludzkie komórki nabłonka gruczołu piersiowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres absorbancji; Y-27632 vs. kontrola, wzrost komórek w ciągu 9 dni, zaznaczono różnice istotne statystycznie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zwiększony wzrost HMECs z pierwszego pasażu (P1) z dodatkiem Y-27632. Zamrożone komórki P0 rozmrożono i hodowano z dodatkiem lub bez dodatku Y-27632. Komórki (P1) zbierano w 1, 3, 5, 7 i 9 dniu, a absorbancję analizowano przy 450 nm za pomocą zestawu CCK-8. W 1 dniu liczba przytwierdzonych żywych komórek w początkowym medium zawierającym Y-27632 była istotnie wyższa niż w medium bez Y-27632. Ponadto krzywa wzrostu komórek traktowanych Y-27632 wykazała gwałtowniejszy wzrost. **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001. Skrót: HMECs = ludzkie komórki nabłonka gruczołów mlekowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza immunofluorescencyjna; komórki barwione CK7/GATA3, DAPI; wykres wyników; morfologia komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ekspresja markerów HMEC (P0). Ekspresję CK7 i GATA3 w komórkach HMEC przeanalizowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Komórki HMEC barwiono na (A) CK7 (czerwony) oraz (B) GATA3 (czerwony); do barwienia jąder komórkowych użyto DAPI (niebieski). Obrazy wykonano za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego (400x). Paski skali = 20 µm. (C) Procent komórek pozytywnych w barwieniu; (D) reprezentatywny obraz komórek HMEC (P3). Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający ekspresję mRNA CK7 i GATA3 z porównaniem grup P0, P3, kontrolnej oraz Y-27632." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ekspresja CK7 i GATA3 w HMEC w P0 i P3. Wykorzystanie qRT-PCR do wykrywania ekspresji (A) CK7 w HMEC w P0 i P3 w 7. dniu, (B) GATA3 w HMEC w P0 i P3, (C) CK7 w HMEC w P1 hodowanych z Y27632 lub bez niego w 7. dniu, (D) GATA3 w HMEC w P1 hodowanych z Y-27632 lub bez niego w 7. dniu. nsp &gt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

Nasze badania koncentrują się na wyjaśnieniu możliwości leczenia opornego na leczenie ziarniniakowego zapalenia wymienia. Wykorzystanie podejścia integracyjnego, które łączy jednocześnie tradycyjne chińskie i zachodnie metodologie medyczne, ujawni złożone mechanizmy patogenne napędzające chorobę i jej powikłania, ze szczególnym naciskiem na próbę złagodzenia tych problemów i poprawy rokowania pacjentów. Nasze badania wskazują na łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół skutecznego izolowania i hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z niewielkiej ilości tkanki sutka.Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania podstawowych HMEC do zastosowań laboratoryjnych i klinicznych. Opierając się na tym badaniu, dążymy do opracowania modelu komórek nabłonka sutka z ziarniniakowym zapaleniem wymienia, aby pogłębić naszą wiedzę na temat etiologii i zwalidowane strategie leczenia. Zacznij od dysocjacji tkanki.Użyj dwóch par kleszczy, aby usunąć tkankę tłuszczową z tkanki sutkowej. Upewnij się, że pozostała tkanka sutka waży około jednego grama. Płucz tkankę sutka w pięciu mililitrach 75% roztworu etanolu przez pięć sekund.Następnie umyj 20 mililitrami roztworu myjącego dwa razy przez pięć minut każdy. Następnie za pomocą dwóch ostrzy chirurgicznych pokrój tkankę sutka na mniejsze fragmenty w sposób ciągły przez 15 minut, aby uzyskać jednorodny tkankę. Przenieś rozdrobnioną tkankę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Dodaj 10 mililitrów roztworu dypazy i kolagenazy, trzy mililitry 0,25% trypsyny i siedem mililitrów PBS, co daje w sumie 20 mililitrów roztworu wytrawiającego. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez półtorej godziny, potrząsając probówką co 20 minut. Aby zatrzymać proces trawienia, dodaj 20 mililitrów roztworu neutralizującego, a następnie pipetuj zawartość około 15 razy.Aby zapewnić dokładne wymieszanie. Przefiltruj mieszaninę przez filtr siatkowy o wielkości 100 mikronów. Następnie wirować w temperaturze 156G przez pięć minut.Następnie usunąć supernatant. Powtórzyć inkubację osadu z 20 mililitrami roztworu neutralizującego. Następnie wymieszać pipetując.Wirować ponownie przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami początkowej pożywki hodowlanej. Umieść zawiesinę komórek w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórek.Hoduj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pierwotną pożywkę hodowlaną należy zastąpić świeżą pożywką z komórek nabłonka co trzeci dzień. Sprawdź komórki i odświeżaj pożywkę co dwa dni.Za pomocą tego protokołu wyizolowano ludzkie komórki nabłonka sutka z tkanki sutka. Analiza po izolacji wykazała, że komórki traktowane inhibitorem ROCK Y-27632 wykazywały wyraźny wzrost w porównaniu z grupą kontrolną. Test CCK-8 wykazał, że komórki w pożywce zawierającej Y-27632 proliferowały ze znacznie większą szybkością niż te w pożywce kontrolnej.Testy immunofluorescencyjne potwierdziły, że większość komórek wykazywała ekspresję markerów komórek nabłonka sutka CK7 i GATA3 przy znikomej obecności innych typów komórek w kolejnych pasażach. Co więcej, badania qRT-PCR wykazały stałe poziomy ekspresji CK7 i GATA3 przez kilka pasaży, co wskazuje na spójny fenotyp lub zdolność różnicowania.

isolation-and-culture-of-primary-human-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fibroblasty związane z rakiem (CAFs), bogate w myofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenoprzeszczepu guza z jednoczesną implantacją w celu eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. Protokół opisuje sposób tworzenia myofibroblastów CAF, które nabywają zdolności do promowania tumorigennezy.

Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu.  Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Opisujemy model 3D ludzkiego nabłonka piersi, który jest odpowiedni do badania działania hormonów.

Reagujący na hormony model hodowli 3D nabłonka ludzkiego gruczołu sutkowego

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Prezentujemy metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych. Komórki te wykazują wzorce ekspresji genów zgodne z tym, że pochodzą z nabłonka śliny i mogą być hodowane jako salisfery na matrycach błony podstawnej pochodzących z komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm lub jako monowarstwy na traktowanych szalkach hodowlanych.

Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Naucz się izolować i hodować pierwotne ludzkie komórki nabłonka sutka (HMEC) z małych próbek tkanki. Ta metoda enzymatyczna wspiera badania nad mastitis granulomatozą i zastosowania kliniczne.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Przeglądaj więcej filmów