Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka
3 maja 2024
Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.
Nasze badania koncentrują się na wyjaśnieniu możliwości leczenia opornego na leczenie ziarniniakowego zapalenia wymienia. Wykorzystanie podejścia integracyjnego, które łączy jednocześnie tradycyjne chińskie i zachodnie metodologie medyczne, ujawni złożone mechanizmy patogenne napędzające chorobę i jej powikłania, ze szczególnym naciskiem na próbę złagodzenia tych problemów i poprawy rokowania pacjentów. Nasze badania wskazują na łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół skutecznego izolowania i hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z niewielkiej ilości tkanki sutka.
Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania podstawowych HMEC do zastosowań laboratoryjnych i klinicznych. Opierając się na tym badaniu, dążymy do opracowania modelu komórek nabłonka sutka z ziarniniakowym zapaleniem wymienia, aby pogłębić naszą wiedzę na temat etiologii i zwalidowane strategie leczenia. Zacznij od dysocjacji tkanki.
Użyj dwóch par kleszczy, aby usunąć tkankę tłuszczową z tkanki sutkowej. Upewnij się, że pozostała tkanka sutka waży około jednego grama. Płucz tkankę sutka w pięciu mililitrach 75% roztworu etanolu przez pięć sekund.
Następnie umyj 20 mililitrami roztworu myjącego dwa razy przez pięć minut każdy. Następnie za pomocą dwóch ostrzy chirurgicznych pokrój tkankę sutka na mniejsze fragmenty w sposób ciągły przez 15 minut, aby uzyskać jednorodny tkankę. Przenieś rozdrobnioną tkankę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.
Dodaj 10 mililitrów roztworu dypazy i kolagenazy, trzy mililitry 0,25% trypsyny i siedem mililitrów PBS, co daje w sumie 20 mililitrów roztworu wytrawiającego. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez półtorej godziny, potrząsając probówką co 20 minut. Aby zatrzymać proces trawienia, dodaj 20 mililitrów roztworu neutralizującego, a następnie pipetuj zawartość około 15 razy.
Aby zapewnić dokładne wymieszanie. Przefiltruj mieszaninę przez filtr siatkowy o wielkości 100 mikronów. Następnie wirować w temperaturze 156G przez pięć minut.
Następnie usunąć supernatant. Powtórzyć inkubację osadu z 20 mililitrami roztworu neutralizującego. Następnie wymieszać pipetując.
Wirować ponownie przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami początkowej pożywki hodowlanej. Umieść zawiesinę komórek w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórek.
Hoduj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pierwotną pożywkę hodowlaną należy zastąpić świeżą pożywką z komórek nabłonka co trzeci dzień. Sprawdź komórki i odświeżaj pożywkę co dwa dni.
Za pomocą tego protokołu wyizolowano ludzkie komórki nabłonka sutka z tkanki sutka. Analiza po izolacji wykazała, że komórki traktowane inhibitorem ROCK Y-27632 wykazywały wyraźny wzrost w porównaniu z grupą kontrolną. Test CCK-8 wykazał, że komórki w pożywce zawierającej Y-27632 proliferowały ze znacznie większą szybkością niż te w pożywce kontrolnej.
Testy immunofluorescencyjne potwierdziły, że większość komórek wykazywała ekspresję markerów komórek nabłonka sutka CK7 i GATA3 przy znikomej obecności innych typów komórek w kolejnych pasażach. Co więcej, badania qRT-PCR wykazały stałe poziomy ekspresji CK7 i GATA3 przez kilka pasaży, co wskazuje na spójny fenotyp lub zdolność różnicowania.
Overview
To badanie koncentruje się na opracowaniu efektywnego czasowo i ekonomicznie protokołu do izolowania i hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych gruczołów mlecznych (HMEC) z ograniczonych próbek tkanki gruczołowej. Dzięki wykorzystaniu zintegrowanego podejścia badawczego, badanie ma na celu poprawę rozumienia patologii gruźliczego zapalenia gruczołów mlecznych i ułatwienie potencjalnych ścieżek leczenia.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Gruźlicze zapalenie gruczołów mlecznych
- Pierwotne ludzkie komórki nabłonkowe gruczołów mlecznych (HMEC)
- Zintegrowane podejścia medyczne
Tło
- Złożoność gruźliczego zapalenia gruczołów mlecznych z opornością na leczenie
- Znaczenie HMEC dla zastosowań laboratoryjnych i klinicznych
- Potrzeba skutecznych metod ekstrakcji z małych próbek tkanki
Stosowane metody
- Izolowanie i hodowla HMEC z tkanki gruczołowej
- Komórki nabłonkowe gruczołów mlecznych człowieka były używane jako system biologiczny
- Kluczowe technologie obejmują enzymatyczne dysocjację i testy hodowlań komórkowych
Główne wyniki
- Komórki wykazywały lepsze wzrost po leczeniu inhibitorem ROCK Y-27632
- Wskaźniki proliferacji znacząco wyższe niż w grupach kontrolnych, jak pokazały testy CCK-8
- Konsekwentna ekspresja markerów nabłonkowych gruczołów mlecznych CK7 i GATA3 przez kolejne przeszczepy
Wnioski
- Badanie wykazuje skuteczny protokół izolacji HMEC, który może wspierać dalsze badania nad leczeniem zapalenia gruczołów mlecznych
- Wyniki mają znaczące implikacje zarówno dla badań laboratoryjnych jak i praktyki klinicznej
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and culture of primary human mammary epithelial cells (HMECs) addresses a critical bottleneck in breast disease modeling and target validation. This protocol enables reliable generation of disease-relevant cellular systems from limited tissue, supporting mechanistic de-risking and translational research in breast biology and inflammatory pathologies. The approach enhances predictive confidence for early discovery and preclinical studies across biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables generation of primary HMECs for functional studies and pathway interrogation.
- Supports biological de-risking by providing authentic human cell models for target validation.
- Facilitates predictive confidence in early-stage breast disease research and compound triage.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of validated epithelial cells for assay development.
- Improves assay standardization and quantitative output reliability through consistent cell phenotype.
- Enables scalable preparation of screening-ready cell systems for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Establishes disease-relevant cellular models for translational biomarker studies in breast inflammation and cancer.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining consistent cell marker expression.
- Reduces risk in advancing therapeutic hypotheses by enabling robust in vitro modeling.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling seamless progression from hypothesis testing to translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis-driven studies and mechanistic clarification in breast disease.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell-based assays for compound screening and validation.
- Analytics: Supports quantitative proliferation and marker expression analyses for comparative studies.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model requirements for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable method adaptable across breast disease research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in breast disease modeling.
- Operational Value: Streamlines cell isolation, enhances reproducibility, and supports scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of breast disease research assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, enzymatic digestion, and primary cell culture.
- Needs access to cell culture infrastructure and analytical assays for phenotype validation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in multi-site studies.
- Adaptable to various breast tissue sources but may require optimization for disease-specific samples.
- Short lifespan of primary HMECs may limit long-term studies and necessitate batch planning.
