Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Staramy się zrozumieć skomplikowane mechanizmy leżące u podstaw łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu spowodowanego ekspozycją na fale uderzeniowe wywołane wybuchem. Badamy również metody łagodzenia tych objawów. Był to wyczerpujący opis początkowej fazy załamania bariery krew-mózg z powodu fal uderzeniowych wywołanych wybuchem o niskiej intensywności.

W szczególności awaria rozpoczyna się nagle około trzech godzin po ekspozycji, a dotknięte zmiany przechodzą przebudowę przez około jeden dzień po wystąpieniu. Metoda ta pozwala nam bardziej szczegółowo zbadać rozpad bariery krew-mózg, dostarczając dodatkowego wskaźnika do oceny skuteczności różnych zabiegów, które można zastosować w przypadku wybuchu. Na początek przygotuj rurkę uderzeniową, aby wystawić zwierzę na fale uderzeniowe wywołane wybuchem.

Umieść znieczuloną mysz w odległości pięciu centymetrów od końca wyjściowego rurki amortyzującej, upewniając się, że jej oś ciała jest równoległa do osi rurki, ale nie wyrównana z nią. Następnie dostarcz pojedynczą falę uderzeniową o szczytowym nadciśnieniu 25 kilopaskali na głowę zwierzęcia. Do wstrzyknięcia Evansa należy przygotować 4% objętościowy roztwór niebieskiego Evansa w soli fizjologicznej.

Zmieszaj roztwór i przechowuj go w ciemności do czasu użycia. Wstrzyknąć niebieski roztwór Evansa do żyły ogonowej w dawce 2,5 mikrolitra na gram. Po perfuzji znieczulonej myszy barwnikiem FITC-dekstran i paraformaldehydem, użyj nożyczek chirurgicznych i pęsety, aby ostrożnie usunąć mózg.

Umieść mózg na noc w tym samym utrwalaczu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia należy wymienić utrwalacz na PBS. Na początek uzyskaj unieruchomiony mózg myszy poddanej działaniu fali uderzeniowej, której wstrzyknięto barwniki Evans blue i FITC-dekstran.

Przygotuj 24-dołkową płytkę z 500 mikrolitrami 20% glicerolu w buforze fosforanowym dostosowanym do pH 7,4 w każdym dołku. Za pomocą krajalnicy do mózgu pokrój mózg na 12 plasterków, każdy o grubości jednego milimetra. Przenieś każdą cząstkę do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej i przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.

Następnie zastąp roztwór 50% buforem fosforanowym glicerolu i przechowuj go ponownie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Na koniec zastąp roztwór 100% glicerolem. W celu natychmiastowej obserwacji mikroskopowej pozostaw plastry na co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Dodaj 500 mikrolitrów glicerolu na dno naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów. Przenieś wycinek mózgu do roztworu glicerolu i przykryj powierzchnię szkłem nakrywkowym. Usuń nadmiar glicerolu z krawędzi szkła nakrywkowego.

Zmierz intensywność fluorescencji wycinka pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po pomiarze mikroskopowym włóż plasterek z powrotem do dołka płytki. Dodaj 500 mikrolitrów buforu fosforanowego do każdej studzienki i przechowuj 24-dołkową płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Zastąp roztwór 30% buforem fosforanowym glicerolu i inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny przed wykonaniem immunohistochemii Niebieskie znakowanie Evansa wykazało, że rozpad bariery krew-mózg lub bariera BBB rozpoczęła się w ciągu sześciu godzin po ekspozycji na falę uderzeniową i trwała do siedmiu dni. Hotspoty fluorescencji różniły się wielkością i intensywnością, przy czym hotspoty Evansa tylko w kolorze niebieskim wskazują na rozpad BBB podczas wstrzyknięcia niebieskiego Evansa i naprawę po wstrzyknięciu FITC-dekstranu. Skupiska reaktywnych astrocytów były ściśle związane z miejscami rozpadu BBB potwierdzonymi immunohistochemią.

Aktywowany mikroglej i mikroglej ameboidalny obserwowano wraz z reaktywnymi astrocytami trzy dni po ekspozycji na falę uderzeniową.