Name: Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj metodę badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego FtsZ i MreB z wykorzystaniem drożdży rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SMP, SR i AKS dziękują za stypendia otrzymane od National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy. RS potwierdza wsparcie finansowe ze strony Departamentu Energii Atomowej, a prace te są wspierane przez grant badawczy dla RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) z Wydziału Biotechnologii (DBT). Autorzy dziękują również V Badireenathowi Konkimalli za jego komentarze, sugestie i dyskusje podczas opracowywania protokołu.

1. Ekspresja białek cytoszkieletu bakteryjnego znakowanych GFP w S. pombe
UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby uzyskać informacje na temat wszystkich plazmidów i szczepów użytych tutaj. Tabela 2 zawiera informacje o wszystkich składach mediów.
<ol>
	<li>Wykonaj klonowanie E. coli MreB z N-końcową fuzją GFP (GFP-MreB) i S. aureus FtsZ przenoszącym C-końcowy GFP (SaFtsZ-GFP) do wektora ekspresyjnego S. pombe, pREP42 z promotorem tiaminy o średniej mocy, nmt4118,19 zgodnie z wcześniejszym opisem14,15. Utrzymaj, amplifikuj i izoluj plazmidy ze szczepów E. coli (DH10β) zgodnie z opisem w20,21. 
	UWAGA: Można również stosować inne szczepy E. coli, takie jak DH5α, XL1Blue, TOP10 itp. lub inne dostępne na rynku kompetentne komórki rutynowo wykorzystywane do klonowania molekularnego.</li>
	<li>Przemiana plazmidów pREP42-GFP-EcMreB i pREP42-SaFtsZ-GFP w S. pombe
	<ol>
		<li>Przekształć plazmidy pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) i pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) w szczep S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) przy użyciu metody octanu litu22, jak wspomniano w poniższych krokach.</li>
		<li>Dzień 1 - Kultura pierwotna: Zaszczep pętlę świeżo rozpylonej kultury S. pombe w 3 ml autoklawizowanego ekstraktu drożdżowego i bulionu z suplementami (TAK). Inkubować go w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30 °C przez noc (O/N).</li>
		<li>Dzień 2:
		<ol>
			<li>Kultura wtórna: Dodaj około 500 μl kultury podstawowej do 30 ml autoklawowanego bulionu YES. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 3 - 4 godziny z wytrząsaniem, aż OD600 osiągnie 0,4 - 0,6, 
			UWAGA: Do każdej przemiany stosuje się 30 ml.</li>
			<li>Osadzać 30 ml kultury w 2,500 x g przez 6-8 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 50 ml sterylnej wody destylowanej (D/W). Ponownie spulchnić i wyrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml sterylnego roztworu i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Odwirować jak powyżej i odrzucić supernatant.</li>
			<li>Dodać 1 ml 0,1 M roztworu octanu litu, Tris-EDTA (LiAc-TE) i odwirować jak powyżej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml 0,1 M LiAc-TE. Odwirować i odrzucić supernatant, pozostawiając 100 μl roztworu.</li>
			<li>Dodać 10 - 20 μg DNA nośnika (DNA plemników łososia; denaturowane i błyskawicznie schładzane na lodzie) i 2 - 3 μg DNA plazmidu, które należy przekształcić. Delikatnie wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
			<li>Dodać 260 μl 40% PEG/LiAc-TE; delikatnie wymieszać. Inkubować przez 60 minut w wytrząsarce lub termomikserze w temperaturze 30 °C, delikatnie mieszając. Dodać 43 μl DMSO; Delikatnie wymieszaj.</li>
			<li>Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 10 min w termomikserze. Osad w ilości 2 500 x g przez 6-8 minut i odrzucić supernatant. Umyj granulkę 1x 1 ml sterylnego D/W.</li>
			<li>Osad należy wyrzucić supernatantem i ponownie zawiesić osad w 200 μl sterylnego roztworu D/W. Płytka 100 μl na płytkach z minimalnym podłożem Edynburga (EMM) zawierających 5 μg/ml tiaminy (w celu tłumienia promotora nmt41) i suplementy aminokwasowe adeninę (0,225 mg/ml), histydynę (0,225 mg/ml) i leucynę (0,225 mg/ml), ale bez uracylu (marker selekcyjny plazmidu pREP42). 
UWAGA: Na przemian podawaj 70 μL i 130 μL na dwóch różnych płytkach. Dwie różne objętości (70 μl i 130 μl) są siane w celu uzyskania izolowanych kolonii na co najmniej jednej z płytek w zależności od wydajności transformacji, która może się różnić w zależności od eksperymentu.</li>
			<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni, aż pojawią się kolonie. Wymieszać pojedynczą kolonię ze 100 μl sterylnego roztworu i rozprowadzić na świeżej płytce EMM zawierającej tiaminę, ale pozbawionej uracylu, jak opisano powyżej.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni, aż pojawi się kompletny trawnik. Zezłomuj wyrośnięty trawnik komórek za pomocą pętli zaszczepiającej i ponownie zawieś go do 1 ml pożywki YES zawierającej 30% glicerolu w kriofiolce.</li>
			<li>Błyskawicznie zamrozić kriofiolkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu zachowania zamrożonych zapasów drożdży.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja białek cytoszkieletu bakteryjnego w drożdżach rozszczepieniowych
	<ol>
		<li>Aseptycznie rozprowadź plaster z wywaru glicerolu na świeżą płytkę specyficzną dla drożdży, aby uzyskać wystarczającą ilość kultury do dalszych eksperymentów. 
		UWAGA: W przypadku pREP42 użyliśmy płytki agarowej EMM (minimalna pożywka) zawierającej adeninę, histydynę i leucynę (jak przy użyciu szczepu S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) bez uracylu (uracyl obecny w pREP42 jako marker selekcyjny). Do płytek agarowych dodajemy 15 - 20 μM tiaminy (ponieważ pREP42 ma tiaminowy promotor nmt41), aby stłumić ekspresję interesującego genu podczas wzrostu na płytce.</li>
		<li>Zaszczepić małą pętlę inokulum z prążkowanego plastra do 5 ml specyficznej dla drożdży pożywki EMM pozbawionej tiaminy i inkubować przez 10 - 12 godzin w temperaturze 30 °C. 
		UWAGA: Ekspresja FtsZ i MreB z różnych gatunków pod promotorem nmt41 w S. pombe może się różnić, zwykle od 16 do 30 godzin. Optymalny czas ekspresji białek GFP-EcMreB i SaFtsZ-GFP w S. pombe wynosi odpowiednio 20 - 24 h i 16 - 20 h w temperaturze 30 °C bez tiaminy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie kultur S. pombe wykazujących ekspresję białek bakteryjnych cytoszkieletu znakowanych GFP
UWAGA: Wiele różnych cząsteczek leków jest testowanych na wyhodowanych przez noc kulturach drożdży na 96-dołkowej płytce.
<ol>
	<li>Zaszczepić świeżą kulturę, przenosząc 50 μl nocnej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 150 μl świeżych drożdży EMM za pomocą półautomatycznego, 96-dołkowego wielokanałowego urządzenia do pipetowania.</li>
	<li>Podczas pipetowania w celu prawidłowego wymieszania za pomocą półautomatycznej, 96-dołkowej pipety wielokanałowej, powoli wprowadzaj różne rosnące stężenia leków do rosnącej kultury, każdy z nich w trzech egzemplarzach, jak pokazano na schemacie w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
	<li>Jako kontrolę pozytywną należy stosować znane już leki, PC190723 na (S. aureus FtsZ) i A22 (na E. coli MreB) w dwóch egzemplarzach. 
	UWAGA: Jak wcześniej informowaliśmy, PC190723 i A22 zastosowano odpowiednio w stężeniu 56,2 μM17 i 72,6 μM14,17. Tymczasem traktowanie A22 SaFtsZ i PC190723 traktowanie EcMreB służyły odpowiednio jako kontrole negatywne.</li>
	<li>Stosować DMSO jako kontrolę rozpuszczalnika w trzech różnych stężeniach w zależności od najniższego i najwyższego stężenia leków. 
	UWAGA: Rozpuszczalnik, w którym rozpuszczane są leki, jest używany jako kontrola rozpuszczalnika.</li>
	<li>Inkubować kultury kontrolne i poddane działaniu substancji w temperaturze 30 °C przez 6-10 godzin (do momentu, gdy komórki wykazują ekspresję bakteryjnych białek fluorescencyjnych), a następnie obrazować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej.</li>
</ol>
3. Wizualizacja polimerów
<ol>
	<li>Nałożyć warstwę 20 μl 1 mg/ml konkanawaliny A na każdą studzienkę optycznie przezroczystej dolnej płytki 96-dołkowej (o czarnych ściankach do obrazowania fluorescencyjnego) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odessać płyn i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieś 20 μl komórek z płytki hodowlanej do każdej odpowiedniej studzienki i pozostaw na 10 minut. Umyj komórkę 3x-4x sterylną pożywką EMM.</li>
	<li>Mając założoną soczewkę obiektywu, która ma być używana (patrz krok 3.6), użyj trybu nawigatora w panelu akwizycji oprogramowania do akwizycji obrazu, aby wyrównać 96-dołkową płytkę i pokrycie dołka. Wyrównaj krawędzie studni w nawigatorze.</li>
	<li>Następnie wybierz parametry pokrycia studzienki, które obejmują wielopozycyjny wybór obszaru zainteresowania w studzience i użyj adaptacyjnego sterowania autofokusem z trybem na żądanie, aby utrzymać ostrość próbki podczas obrazowania.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i fluorescencji. Ustaw filtry wzbudzenia i emisji odpowiednio 475/28 nm i 525/48 nm, aby zobrazować białka bakteryjne znakowane GFP ulegające ekspresji w drożdżach. Uzyskać stosy Z w kroku o wielkości 0,2 μm przez grubość komórek drożdży (5 μm).</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw olejowy 100x 1,4-NA i kamerę sCMOS o wymiarach 2,000 x 2,000 (rozmiar piksela 6,5 μm x 6,5 μm). Użyj systemu oświetlenia LED do wzbudzenia fluoroforu. 
	UWAGA: Każdy system mikroskopu epifluorescencyjnego, który ma zmotoryzowany stolik dla płytki 96-dołkowej z precyzyjnym pozycjonowaniem wielopunktowym, powinien być odpowiedni. Uzyskaj wszystkie obrazy komórek kontrolnych i leczonych lekami z podobnym czasem ekspozycji (zwykle w zakresie 0,3 - 0,5 s) przy binowaniu 1 x 1 i oświetleniu na poziomie 15% - 20%, aby zminimalizować zmienne eksperymentu i zachować spójność.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja obrazów za pomocą ImageJ
<ol>
	<li>Przetwarzaj obrazy komórek i mierz liczbę plamek na komórkę oraz gęstość dla FtsZ17. W przypadku MreB zmierz gęstość i anizotropię23 i porównaj komórki kontrolne i leczone za pomocą Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.</li>
	<li>Korzystając z obrazów z kanału DIC, najpierw obrysuj poszczególne komórki drożdży za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego i zapisz jako obszar zainteresowania (ROI) w menedżerze ROI. Ten krok nie jest jeszcze zautomatyzowany, ale niedawno opracowane narzędzia wykorzystujące uczenie maszynowe25,26 mogą zostać podjęte i włączone w najbliższej przyszłości.</li>
	<li>Zamaskuj zewnętrzny obszar komórki i wypełnij go na czarno zgodnie z opisem w27.</li>
	<li>Użyj makra analizy OPS threshold IJ1, wbudowanej funkcji na Fidżi, aby policzyć liczbę spotów24.</li>
	<li>Użyj metody otsu do automatycznego progowania i zamaskuj segmentowane cząstki. Uruchom wtyczkę, aby przeanalizować cząstki za pomocą makra.</li>
	<li>Aby zmierzyć gęstość polimeru (ilość cytoszkieletu na jednostkę powierzchni w komórce), przetwarzaj obrazy zgodnie z opisem, w tym etapy maskowania i szkieletyzacji27,28. Użyj filtra Lpx 2Dfilter we wtyczce lpx, aby zszkieletować obrazy.</li>
	<li>Aby uzyskać szczegółowe informacje, sprawdź tę ostatnią publikację17. Przeprowadź kwantyfikację polimerów EcMreB, jak wspomniano wcześniej w23, użyj anizotropii, aby określić ilościowo organizację przestrzenną za pomocą FibrilTool29 zgodnie z wcześniejszym opisem23. 
	UWAGA: Te metody analizy mogą być stosowane do ilościowego oznaczania wszelkich innych białek cytoszkieletu bakteryjnego, które są leczone lub nieleczone lekami.</li>
</ol>

Identifying Drugs that Affect Polymerization of Bacterial Cytoskeletal Proteins

<ol><li>Antimicrobial Resistance Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+bacterial+antimicrobial+resistance+in+2019%3A+a+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis.</a> Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).</li>
<li>Haselbeck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+essential+gene+identification+as+a+platform+for+novel+anti-infective+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharma+Des%22%5BJournal%5D)">Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery.</a> Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+small+molecule+that+inhibits+cell+division+by+blocking+FtsZ%2C+a+novel+therapeutic+target+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).</li>
<li>Sanchez, S., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanchez%2C+S+%22Antibiotics%3A+current+innovations+and+future+trends%22">Antibiotics: current innovations and future trends</a>. , Caister Academic Press. (2015).</li>
<li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prokaryotic+cytoskeleton%3A+a+putative+target+for+inhibitors+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).</li>
<li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+bacterial+Z-ring%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting the bacterial Z-ring.</a> Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).</li>
<li>Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+as+an+antibacterial+target%3A+status+and+guidelines+for+progressing+this+avenue%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue.</a> ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).</li>
<li>Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RND-type+efflux+pumps+confers+the+FtsZ-directed+prodrug+TXY436+with+activity+against+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria.</a> Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).</li>
<li>Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bacterial+cell+division%3A+A+binding+site-centered+approach+to+the+most+promising+inhibitors+of+the+essential+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ.</a> Antibiotics. 9 (2), 69(2020).</li>
<li>Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistance+efflux+pumps+-+not+just+for+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance.</a> Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).</li>
<li>Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+correctly+excises+a+mammalian+RNA+transcript+intervening+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence.</a> Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).</li>
<li>Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%3A+A+unicellular+micromammal+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism.</a> Curr Prot. 1 (6), e151(2021).</li>
<li>Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+targeting+of+Bacillus+subtilis+cell+division+protein+DivIVA+to+division+sites+in+Escherichia+coli+and+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast.</a> EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).</li>
<li>Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filament+formation+of+the+Escherichia+coli+actin-related+protein%2C+MreB%2C+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast.</a> Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).</li>
<li>Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+cytoplasmic+rings+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Dev%22%5BJournal%5D)">The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast.</a> Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).</li>
<li>TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functions+of+chloroplast+FtsZ1+and+FtsZ2+in+Z-ring+structure+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling.</a> J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).</li>
<li>Sharma, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+salt+bridge-mediated+resistance+to+FtsZ+inhibitor+PC190723+revealed+by+a+cell-based+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen.</a> Mol Biol Cell. 34 (3), ar16(2023).</li>
<li>Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TATA+box+mutations+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+nmt1+promoter+affect+transcription+efficiency+but+not+the+transcription+start+point+or+thiamine+repressibility%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility.</a> Gene. 123 (1), 131-136 (1993).</li>
<li>Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+multifunctional+thiamine-repressible+expression+vectors+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast.</a> Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caring+for+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Caring for Escherichia coli.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2018).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22">Cold Spring Harb Protoc</a>. , (2018).</li>
<li>Bähler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li>
<li>Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filament+organization+of+the+bacterial+actin+MreB+is+dependent+on+the+nucleotide+state%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state.</a> J Cell Biol. 221 (5), e202106092(2022).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+for+enumeration+of+cell+colony+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Comput+Ind+Biomed+Art%22%5BJournal%5D)">Machine learning for enumeration of cell colony forming units.</a> Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26(2022).</li>
<li>Moen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+for+cellular+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Deep learning for cellular image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).</li>
<li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+cytoskeletal+organizations+by+microscopic+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Morphol%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis.</a> Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).</li>
<li>Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACTIN+DEPOLYMERIZING+FACTOR4+regulates+actin+dynamics+during+innate+immune+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Butler, M. S., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+in+the+clinical+pipeline+in+October+2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibio%22%5BJournal%5D)">Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019.</a> J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).</li>
<li>Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+antibacterial+inhibitors+targeting+cell+division+protein+ftsz+at+its+nucleotide+and+allosteric+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites.</a> Biomedicines. 10 (8), 1825(2022).</li>
<li>Vještica, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+stable+integration+vectors+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> J Cell Sci. 133 (1), jcs240754(2020).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+bacterial+actin+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Pers+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure and function of bacterial actin homologs.</a> Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364(2010).</li>
<li>Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+yeast+for+young+geneticists%3A+A+primer+on+the+Schizosaccharomyces+pombe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system.</a> Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).</li>
<li>Aoi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+first+and+the+second+meiotic+divisions+using+a+marker-less+drug-hypersensitive+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast.</a> Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+sensitivity+of+HIV-1+protease+inhibitors+by+restriction+of+cellular+efflux+system+in+a+fission+yeast+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model.</a> Pathogens. 11 (7), 804(2022).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stanowi poważne globalne zagrożenie dla zdrowia i istnieje pilne zapotrzebowanie na nowe antybiotyki o nowych celach. Cytoszkielet bakteryjny stał się atrakcyjnym celem do opracowania nowych antybiotyków, a małocząsteczkowe inhibitory białka podziału komórkowego FtsZ, takie jak TXA709, są już w fazie I badań klinicznych30. Opracowano kilka metod identyfikacji inhibitorów polimeryzacji FtsZ 7,31. Niedawno użyliśmy drożdży eukariotycznych w teście komórkowym, aby wykazać, że lek stabilizujący FtsZ, PC190723, może celować w HpFtsZ17. Co więcej, wykazaliśmy również, że chociaż leki takie jak berberyna i sangwinaryna wpływają na polimeryzację FtsZ, wpływają również na morfologię komórek drożdży17. Zainspirowani tymi badaniami i obserwacjami, postanowiliśmy opracować jednoetapowy test komórkowy do badań przesiewowych w kierunku małocząsteczkowych modulatorów cytoszkieletu bakteryjnego przy użyciu platformy ekspresji drożdży rozszczepienia. Ponieważ badanie przesiewowe opiera się na hamowaniu składania białek cytoszkieletu znakowanych GFP, małe cząsteczki o podobnych właściwościach fluoroforowych mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie. Unikanie filtrów długoprzepustowych i wybieranie filtrów wąskopasmowo-przepustowych może pomóc w zmniejszeniu liczby fałszywych alarmów powstających w wyniku fluorescencyjnych małych cząsteczek. W tym miejscu pokazujemy etapy związane z ustawianiem średnioprzepustowego badania przesiewowego za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w 96-dołkowy uchwyt na płytki, który można wykorzystać do badań przesiewowych w kierunku leków ukierunkowanych na SaFtsZ lub EcMreB. Przepływ pracy obejmuje półautomatyczne pozyskiwanie i analizę obrazów, które w przyszłości można łatwo skalować do ekranów o wysokiej przepustowości za pomocą zrobotyzowanych systemów obsługi cieczy i rurociągów przetwarzania obrazu.
Co więcej, badanie przesiewowe powinno być przydatne w przypadku innych bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak fałd aktynowy zawierający białko podtrzymujące plazmid ParM32 oraz przeciwko każdemu białku, które łączy się w struktury polimerowe w drożdżach rozszczepialnych. Jednak optymalne poziomy ekspresji dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania będą musiały zostać ustandaryzowane przed zastosowaniem w jakichkolwiek badaniach przesiewowych leków. Podczas gdy w przypadku FtsZ stwierdziliśmy, że nmt41 jest optymalnym promotorem, dla innych interesujących białek silniejszą lub słabszą wersją promotora nmt1 (siła promotora (i nieszczelność): nmt1 > nmt41 > nmt81) lub innych konstytutywnych promotorów, takich jak drożdże adh1 lub act118,33 mogą być próbowane w celu uzyskania optymalnych poziomów ekspresji i składania struktur polimerowych. Co więcej, podczas stosowania plazmidów episomalnych, zmiany liczby kopii z komórki na komórkę również stwarzają problemy z jednolitą ekspresją genów. Aby obejść te problemy, niedawno opracowano kilka wektorów, które można zintegrować z genomem drożdży rozszczepieniowych (SIV dla stabilnych wektorów integracji) przenoszących promotory o różnej sile34. Zastosowanie tych wektorów może zapewnić bardziej jednolite i ilościowe wyniki w porównaniu z wektorami episomalnymi zastosowanymi w tym badaniu. Zastosowanie SIV może pozwolić uniknąć dużej niejednorodności poziomów ekspresji, postrzeganej jako różnica w intensywności fluorescencji w komórkach i powinno lepiej nadawać się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
Co więcej, leki takie jak PC190723 działają stabilizująco na polimery FtsZ, co skutkuje wczesnym składaniem włókien FtsZ w porównaniu z komórkami nieleczonymi. O ile badanie przesiewowe nadaje się do badań przesiewowych leków hamujących polimeryzację bakteryjnych białek cytoszkieletu, o tyle ze względu na wizualną ocenę fluorescencji rozproszonej w punkcie końcowym, badania przesiewowe leków stabilizujących polimery FtsZ wymagają dalszej optymalizacji poziomów ekspresji białek i czasu potrzebnego do osiągnięcia maksymalnej liczby komórek posiadających polimery. W związku z tym bardzo ważne jest, aby mieć rozsądne oszacowanie czasu potrzebnego do ekspresji białka do osiągnięcia krytycznego stężenia wymaganego do złożenia i odpowiednio określić punkt końcowy testu. W przypadku leków, które mogą działać w celu zmniejszenia krytycznego stężenia wymaganego do polimeryzacji białka, wybór punktu końcowego byłby zazwyczaj czasem, w którym znaczna populacja nieleczonych komórek wykazuje rozproszoną fluorescencję, ale kultury poddane działaniu leków wykazywałyby zespoły polimerowe.
Jednym z ograniczeń, który jest również czasochłonnym etapem przepływu pracy, jest wymóg identyfikacji i segmentacji poszczególnych komórek na potrzeby ilościowej analizy obrazu. Obecnie, w proponowanym schemacie, jest to ręczny krok mający na celu identyfikację pojedynczych komórek drożdży i przypisanie obszaru zainteresowania (ROI) w celu ilościowego określenia działania leków. Przewidujemy jednak, że niedawno opracowane algorytmy uczenia maszynowego wykorzystujące zestawy uczące, takie jak te możliwe do zaimplementowania w ilastik35 , powinny zminimalizować potrzebę ręcznej interwencji.
Podczas gdy nasze podejście z wykorzystaniem platformy drożdżowej jest przydatne do identyfikacji trafień i potencjalnych małych cząsteczek celujących w cytoszkielet bakteryjny, ostatecznie trzeba będzie przetestować ich aktywność przeciwbakteryjną za pomocą standardowych testów minimalnego stężenia hamującego i skuteczności w modelach zwierzęcych. Niemniej jednak największym wyzwaniem dla globalnego wzrostu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) nadal jest przepuszczalność zewnętrznej błony bakterii Gram-ujemnych oraz liczne pompy wypływowe u wielu gatunków bakterii chorobotwórczych. Co więcej, pompy wypływowe w drożdżach rozszczepialnych mogą również stwarzać podobne problemy, a w procesie badań przesiewowych mogą być wymagane wyższe stężenia leków. Alternatywnie, rozszczepialne szczepy drożdży, które są nadwrażliwe na leki (S. pombe MDR-supML), w wyniku delecji siedmiu genów oporności wielolekowej, w tym czterech genów transportera i czynnika transkrypcyjnego, mogą być wykorzystywane jako gospodarze do badań przesiewowych32,33. Aby poradzić sobie z rosnącą opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe, konieczne będą przyszłe osiągnięcia w zakresie technologii, które łączą ukierunkowane odkrycie środków przeciwbakteryjnych i rozwiązują problem oporności spowodowanej ogólnymi zjawiskami, takimi jak przepuszczalność błon.

Powszechna oporność na prawie wszystkie antybiotyki stosowane obecnie do zwalczania infekcji bakteryjnych stworzyła natychmiastową potrzebę nowych kategorii antybiotyków. Raport z 2019 r. wykazał, że infekcje oporne na antybiotyki spowodowały utratę 1,27 miliona istnień ludzkich, przyczyniając się do ogólnego wyniku 4,95 miliona zgonów, biorąc pod uwagę powikłania po zakażeniach opornymi bakteriami1. Chociaż nadal są skuteczne w praktyce klinicznej, obecny arsenał antybiotyków jest ukierunkowany głównie na wąskie spektrum procesów komórkowych, koncentrując się przede wszystkim na syntezie ścian komórkowych, DNA i białek. W ciągu ostatniego półwiecza mniej niż 30 białek zostało komercyjnie wykorzystanych jako cele do opracowania nowych środków przeciwbakteryjnych2,3. Ten ograniczony zakres realnych celów znacznie utrudnia odkrywanie nowych antybiotyków lub ich pochodnych do zwalczania bakterii opornych na antybiotyki. W związku z tym, aby przezwyciężyć pojawiający się problem oporności na antybiotyki, konieczne jest opracowanie nowych antybiotyków o nowych celach i mechanizmach działania.
Idealnie byłoby, gdyby cel przeciwbakteryjny był niezbędnym składnikiem wzrostu komórek bakteryjnych, był zachowany we wszystkich filogenetycznie zróżnicowanych gatunkach, wykazywał najmniejszą homologię eukariotyczną i był dostępny dla antybiotyków4. Od czasu odkrycia bakteryjnych białek cytoszkieletu biorących udział w podziale komórek i utrzymaniu ich kształtu, stały się one obiecującym punktem centralnym dla rozwoju związków przeciwbakteryjnych5. Białka te są niezbędne do żywotności bakterii i odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu kształtu komórki (MreB, CreS), podziale (FtsZ, FtsA) i segregacji DNA (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), podobnie jak cytoszkielet w komórkach eukariotycznych. Warto zauważyć, że FtsZ wykazuje niezwykle wysoki poziom konserwacji w szerokim zakresie organizmów prokariotycznych, podczas gdy MreB znajduje się w prawie wszystkich bakteriach w kształcie pałeczek. Tak szerokie rozpowszechnienie i znaczenie dla żywotności komórek sprawiają, że białka te są fascynującym celem badań nad antybiotykami5,6,7.
Kluczowe jest przyjęcie wielotorowego podejścia, które łączy obserwacje in vivo, interakcje in vitro i eksperymenty enzymatyczne, aby dokładnie zweryfikować białka cytoszkieletu bakteryjnego jako główny cel potencjalnego inhibitora7. Pracochłonne procedury lub znaczne koszty obciążają wiele dostępnych w tym celu testów. Są to znaczące przeszkody w ich powszechnym wykorzystaniu w badaniach przesiewowych związków ołowiu, które mogą wpływać na cytoszkielet bakteryjny. Wśród nich mikroskopia wyróżnia się jako wyjątkowo skuteczna i szybka metoda oceny skuteczności związków poprzez bezpośrednie badanie zmian w morfologii komórek. Jednak heteroasocjacja białka docelowego z innymi kompleksami cytoszkieletu, pośrednie efekty wynikające z wiązania poza celem i zmian potencjału błony, trudności w efektywnej penetracji komórki oraz obecność pomp wypływowych, zwłaszcza u bakterii Gram-ujemnych, sprawiają, że określenie dokładnej przyczyny deformacji komórek bakteryjnych jest wspólnie złożone8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, lub drożdże rozszczepienia, jak to jest powszechnie znane, to jednokomórkowy organizm eukariotyczny w kształcie pręcika. Drożdże rozszczepieniowe są szeroko stosowane jako organizm modelowy w biologii komórkowej i molekularnej ze względu na niezwykłą ochronę procesów komórkowych, takich jak cykl i podział komórkowy, organizacja komórkowa i replikacja chromosomów u wyższych eukariontów, w tym ludzi11,12. Co więcej, Errington i współpracownicy wyrazili ekspresję zlokalizowanego na biegunie bakteryjnego białka cytoszkieletu DivIVA w drożdżach rozszczepienia, aby wykazać, że DivIVA gromadzi się na ujemnie zakrzywionych powierzchniach13. Ponownie, Balasubramanian i grupa po raz pierwszy ustanowili drożdże rozszczepienia jako system modelu komórkowego, aby uzyskać nowe informacje na temat mechanizmu, składania i dynamiki białka cytoszkieletu aktynowego E. coli, takiego jak MreB14 i homolog tubuliny FtsZ15. Wykazują również zdolność A22 do skutecznego hamowania polimeryzacji MreB za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, gdy ulega ekspresji w drożdżach14. Następnie inne grupy z powodzeniem wykorzystały drożdże rozszczepieniowe do zbadania właściwości składania białek chloroplastowych FtsZ1 i FtsZ2 16. Niedawno udało nam się udowodnić słuszność koncepcji wykorzystania drożdży rozszczepialnych jako platformy komórkowej do specyficznych badań przesiewowych w kierunku inhibitorów cytoszkieletu bakteryjnego, przeprowadzając kompleksową ocenę wpływu trzech znanych inhibitorów FtsZ - sangwinaryny, berberyny i PC190723 - na białka FtsZ pochodzące z dwóch bakterii chorobotwórczych, a mianowicie Staphylococcus aureus i Helicobacter pylori17. Ponadto ten jednoetapowy test oparty na komórkach okazuje się kluczowy w minimalizowaniu ryzyka identyfikacji związków, które mogą być potencjalnie toksyczne dla komórek eukariotycznych.
W tym raporcie, wykorzystując system rozszczepienia drożdży, proponujemy systematyczny przepływ pracy przy użyciu standardowej płytki 96-dołkowej do półautomatycznego badania przesiewowego i kwantyfikacji wpływu inhibitorów małych cząsteczek ukierunkowanych na FtsZ ze Staphylococcus aureus i MreB z Escherichia coli. W tym przypadku konfigurujemy i optymalizujemy półautomatyczny przepływ pracy przy użyciu uznanych inhibitorów PC190723 i A22, które są ukierunkowane odpowiednio na FtsZ i MreB. Ten przepływ pracy wykorzystuje mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w zmotoryzowany, precyzyjny stolik i automatyczną akwizycję obrazu na standardowej 96-dołkowej płytce, aby poprawić obecną standaryzację. W związku z tym może być stosowany zarówno do średnio-, jak i wysokoprzepustowych ekranów bibliotek syntetycznych substancji chemicznych i pozwala ominąć niektóre z wymienionych powyżej wyzwań.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowy CC2 Optical CVG sterylny, z pokrywką. Black</td><td>Thermo Naukowo-Handlowy;</td><td></td><td></td>160376</tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Corning&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>CLS3370</tr><tr><td>A22 Chlorowodorek</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>SML0471</td><td>rozpuszczony w DMSO</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0229</td><td>225 mg/L podłoża&nbsp;</td></tr><tr><td>Concanavalin A&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C5275-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>317275</tr><tr><td>Minimalny nośnik w Edynburgu (EMM Agar lub EMM Broth)</td><td>FormediumTM</td><td>PMD0210</td><td>Poniżej znajduje się skład</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>epMotion&reg; 96 z 2-pozycyjnym suwakiem</td><td>Eppendorf</td><td>5069000101</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0144</td><td>225 mg/L podłoża&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop odwróconej fluorescencji Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Niemiecka firma</td></tr><tr><td>Leucine</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0157</td><td>225 mg/L podłoża&nbsp;</td></tr><tr><td>Octan litu&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>517992-100G</td><td></td></tr><tr><td>PC190723</td><td>Merck&nbsp;</td><td>344580</td><td>Rozpuszczony w DMSO</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>202398</tr><tr><td>Thiamine</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td>Filtr sterylizowany</td></tr><tr><td>Tris-Chlorowodorek</td><td>MP</td><td>194855</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0214</td><td>225 mg/L podłoża, Przechowywać roztwór w temperaturze 36&; C</td></tr><tr><td>TAK (Ekstrakt drożdżowy + suplementy) Agar</td><td>FormediumTM</td><td>PCM0410</td><td>Poniżej znajduje się skład</td></tr><tr><td>TAK (Ekstrakt drożdżowy + suplementy) Bulion</td><td>FormediumTM</td><td>PCM0310</td><td>Poniżej znajduje się skład</td></tr><tr><td><mocny>Drożdże (S. pombe) Media&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy + suplementy (TAK)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Skład</td><td>g/L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dekstroza</td><td>30</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agar</td><td>17</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Adenina</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-histydyna</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-leucyna</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-lizyna HCl</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Uracyl</td><td>0,05</td><td></td></tr><tr><td>Edinburg minimal medium (EMM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Skład</mocny></td><td><silny>g/L</mocny></td><td><silny>stężenie</mocny></td></tr><tr><td></td><td>ftalan potasu&nbsp;</td><td>3</td><td>14,7 mM</td></tr><tr><td></td><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>2,2</td><td>15,5 mM</td></tr><tr><td></td><td>NH4Cl&nbsp;</td><td>5</td><td>93,5 mM</td></tr><tr><td></td><td>glukozy</td><td>2% (w/v) lub 20 g/L</td><td>&nbsp; 111 mM</td></tr><tr><td></td><td>Sole (magazynowe x 50)</td><td>20 ml/L (v/v)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Witaminy (stock x 1000)</td><td>1 mL/L (v/v)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Minerały (Stock x 10 000)</td><td>0,1 mL/L (v/v)</td><td></td></tr><tr><td>Sole x 50&nbsp; </mocny></td><td>52,5 g/l MgCl2,6H20 (0,26 M)&nbsp;</td><td>52,5</td><td>0,26 M</td></tr><tr><td></td><td>0,735 mg/l CaCl2,2H20 (4,99 mM)&nbsp;</td><td>0,000735</td><td>4,99 mM</td></tr><tr><td></td><td>50 g/l KCl (0,67 m)&nbsp;</td><td>50</td><td>0,67 M</td></tr><tr><td></td><td>2 g/l Na2SO4 (14,l mM)</td><td>2</td><td>14,1 mM</td></tr><tr><td><silny>Witaminy x 1000&nbsp; </mocny></td><td>1 g/l kwas pantotenowy&nbsp;</td><td>1</td><td>4,20 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 g/l kwasu nikotynowego&nbsp;</td><td>10</td><td>81,2 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 g/l inozytolu&nbsp;</td><td>10</td><td>55,5 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 mg/l biotyny&nbsp;</td><td>0,01</td><td>40,8 i mikro; M</td></tr><tr><td>Minerals x 10 000&nbsp; </mocny></td><td>kwas borowy</td><td>5</td><td>80,9 mM</td></tr><tr><td></td><td>MnSO4&nbsp; &nbsp;</td><td>4</td><td>23,7 mM</td></tr><tr><td></td><td>ZnSO4,7H2O</td><td>4</td><td>13,9 mM</td></tr><tr><td></td><td>FeCl2,6H2O&nbsp; &nbsp;</td><td>2</td><td>7,40 mM</td></tr><tr><td></td><td>kwas molibdenowy&nbsp;</td><td>0,4</td><td>2,47 mM</td></tr><tr><td></td><td>KI&nbsp;</td><td>1</td><td>6,02 mM</td></tr><tr><td></td><td>CuSO4,5H2O&nbsp;</td><td>0,4</td><td>1,60 mM</td></tr><tr><td></td><td>kwas cytrynowy&nbsp;</td><td>10</td><td>47,6 mM</td></tr><tr><td><silne>Szczepy/ Plazmidy</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silne>Szczepy</silne></td><td><silne>Opis</silne></td><td><silne>Odniesienie</silne></td><td></td></tr><tr><td>CCD190</td><td>Escherichia coli DH10&beta; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>CCDY4&nbsp;</td><td>MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB</td><td>Srinivasan i wsp., 2007</td><td></td></tr><tr><td>CCDY340</td><td>CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP</td><td>Sharma i wsp., 2023</td><td></td></tr><tr><td>CCDY346</td><td>MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]</td><td>Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCCD3</td><td>pREP42-GFP-EcMreB</td><td>Srinivasan i wsp., 2007</td><td></td></tr><tr><td>pCCD713</td><td>pREP42-SaFtsZ-GFP</td><td>Sharma i wsp., 2023</td><td></td></tr></tbody></table>

drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Bakteryjne białka cytoszkieletu, takie jak FtsZ i MreB, pełnią podstawowe funkcje, takie jak podział komórek i utrzymanie ich kształtu. Co więcej, FtsZ i MreB okazały się ważnymi celami dla nowych odkryć przeciwdrobnoustrojowych. Opracowano kilka testów w celu identyfikacji związków ukierunkowanych na wiązanie nukleotydów i polimeryzację tych białek cytoszkieletu, koncentrując się głównie na FtsZ. Co więcej, wiele testów jest albo pracochłonnych, albo kosztownych, a ustalenie, czy te białka są celem komórkowym leku, często wymaga wielu metod. Wreszcie, toksyczność leków dla komórek eukariotycznych również stanowi problem. W tym miejscu opisujemy jednoetapowy test oparty na komórkach w celu odkrycia nowych cząsteczek ukierunkowanych na cytoszkielet bakteryjny i zminimalizowania trafień, które mogą być potencjalnie toksyczne dla komórek eukariotycznych. Drożdże rozszczepieniowe są podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe oparte na mikroskopii, a wizualne badanie przesiewowe może łatwo zidentyfikować dowolną cząsteczkę, która zmienia polimeryzację FtsZ lub MreB. Nasz test wykorzystuje standardową 96-dołkową płytkę i opiera się na zdolności bakteryjnych białek cytoszkieletu do polimeryzacji w komórce eukariotycznej, takiej jak drożdże rozszczepienia. Chociaż opisane tutaj protokoły dotyczą drożdży rozszczepialnych i wykorzystują FtsZ ze Staphylococcus aureus i MreB z Escherichia coli, można je łatwo dostosować do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu, które łatwo łączą się w polimery w dowolnych eukariotycznych gospodarzach ekspresyjnych. Opisana tu metoda powinna ułatwić dalsze odkrywanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych ukierunkowanych na bakteryjne białka cytoszkieletu.

Przygotowanie płytki 96-dołkowej do przesiewania leków 
Zastosowanie S. pombe do ekspresji białka FtsZ z S. aureus z GFP przyłączonym do końca C-końcowego z wektora (pREP42) zawierającego represowalny tiaminą promotor nmt41 o średniej sile zostało wcześniej opisane17; podobnie białko MreB z E. coli z GFP przyłączonym do końca N-końcowego było również ekspresjonowane w S. pombe14. Wykazaliśmy również, że PC190723, specyficzny inhibitor SaFtsZ, oraz A22, inhibitor MreB, mogą wywierać swój wpływ na odpowiednie bakteryjne białka cytoszkieletowe w sposób specyficzny podczas ich ekspresji w drożdżach14,17.
W niniejszej pracy proponujemy wykorzystanie systemu ekspresyjnego drożdży do opracowania średnio- lub wysokoprzepustowego przesiewania leków przeciwbakteryjnych celujących w białka cytoszkieletu bakteryjnego. Mikroskop epifluorescencyjny z zmotoryzowanym stolikiem może zostać zautomatyzowany w celu obrazowania płytek 96-dołkowych, a komercyjne biblioteki leków są również łatwo dostępne w formacie płytek 96-dołkowych. Dlatego preferujemy użycie płytki 96-dołkowej do proponowanego przesiewania leków. Układ płytek przedstawiono na Rysunku 1. Pierwszy rząd (Rysunek 1A) składa się z kultur drożdży eksprymujących SaFtsZ-GFP. Drugi rząd (Rysunek 1B) składa się z kultur drożdży eksprymujących GFP-EcMreB. Pierwsze dwie kolumny pierwszych dwóch rzędów (A1:B2) służą jako ślepa próba medium. Następne sześć kolumn pierwszych dwóch rzędów (A3:B12) stanowi kontrolę DMSO w trzech różnych stężeniach, zgodnie z rozcieńczeniami leków, w układzie dubletów. Następnie do komórek drożdży eksprymujących SaFtsZ-GFP lub GFP-EcMreB dodaje się PC190723 (56.2 µM) oraz A22 (72.6 µM). PC190723 i A22 służą odpowiednio jako kontrole pozytywne dla FtsZ i MreB. Wszystkie pozostałe dołki (C1:F12) są wykorzystywane do dodawania różnych leków (w trzech różnych stężeniach i w dubletach) używanych w przesiewaniu w celu identyfikacji efektorów białek cytoszkieletu bakteryjnego, SaFtsZ lub EcMreB. Kultury drożdży eksprymujących SaFtsZ lub MreB znakowane GFP są dozowane do tych płytek 96-dołkowych i hodowane do momentu, aż efekty działania leków na montaż polimerów zostaną zwizualizowane.
Ocena wpływu na wzrost komórek drożdży 
Po inkubacji płytki 96-dołkowej zawierającej subkulturę komórek w temperaturze 30 °C przez okres od 6 do 10 h, gęstość optyczna (OD) kultury drożdży jest mierzona za pomocą czytnika mikroplatek. Pomiar OD pomaga ocenić ewentualny hamujący wpływ leków na wzrost eukariotycznych komórek drożdży, a potencjalnie również szkodliwe efekty dla komórek ludzkich. Dzięki temu test ten może być wykorzystany do przesiewowej eliminacji wielu leków na podstawie ich toksyczności w systemie drożdżowym. Jednak ani PC190723, ani A22 nie wykazują żadnego wpływu na wzrost ani toksyczności wobec komórek drożdży, a OD600 kultur eksponujących SaFtsZ-GFP traktowanych DMSO, PC190723 lub A22 wyniosły odpowiednio 0,38 ± 0,03, 0,44 ± 0,02 oraz 0,43 ± 0,06 (N ≥ 4). Podobnie, OD600 kultur eksponujących GFP-EcMreB traktowanych DMSO, PC190723 lub A22 wyniosły odpowiednio 0,38 ± 0,04, 0,44 ± 0,07 oraz 0,41 ± 0,08 (N ≥ 4).
Wizualizacja wpływu leków na struktury polimeryczne tworzone przez SaFtsZ i EcMreB ekspresowane w S. pombe 
Aby ocenić wpływ leków na polimeryzację SaFtsZ lub EcMreB, alikwot komórek drożdży z wyżej wspomnianej płytki 96-dołkowej zawierającej leki przenosi się do innej płytki 96-dołkowej z optycznie przezroczystym szklanym dnem, odpowiedniej do obrazowania fluorescencyjnego. Ta płytka 96-dołkowa jest również powlekana konkanawaliną A, aby umożliwić adhezję komórek drożdży ekspresujących SaFtsZ lub EcMreB z tagiem GFP. Płytka 96-dołkowa jest obrazowana przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego, obejmując wszystkie 96 dołków płytki w określonych pozycjach kontrolowanych przez oprogramowanie do akwizycji obrazów (Ryc. 2). W dołkach kontrolnych (traktowanych DMSO), komórki drożdży ekspresujące SaFtsZ-GFP wykazywały struktury polimeryczne w formie punktów lub plam rozmieszczonych w całych komórkach po 16 - 18 h wzrostu w warunkach braku tiaminy. Jednak w 10 - 12 h po wzroście w braku tiaminy, komórki wykazywały jedynie fluorescencję rozproszoną lub nieliczne plamy, co sugeruje, że ekspresja FtsZ-GFP nie osiągnęła krytycznej stężenia wymaganego do polimeryzacji (Ryc. 3A). Przeciwnie, lek stabilizujący FtsZ, PC190723, wykazał znaczny wzrost liczby struktur polimerycznych (punktów lub plam) SaFtsZ-GFP w porównaniu z kontrolą DMSO po 12 h wzrostu (Ryc. 3B), służąc jako kontrola pozytywna. W przeciwieństwie do tego, komórki traktowane A22 nie wykazały różnic w tworzonych strukturach SaFtsZ-GFP (Ryc. 3C). Jednak w przeciwieństwie do kultur traktowanych PC190723, SaFtsZ-GFP tworzył plamy w kulturach nietraktowanych tylko przy dłuższym czasie indukcji, co pokazuje, że PC190723 działał obniżając krytyczne stężenie polimeryzacji SaFtsZ (Ryc. 3D). Analogicznie, GFP-EcMreB ekspresowany w S. pombe tworzył liniowe układy długich filamentów wzdłuż osi podłużnej drożdży dzielących się (Ryc. 4A). Podczas gdy stwierdzono, że PC190723 nie wpływa na polimeryzację EcMreB (Ryc. 4B), traktowanie komórek A22 doprowadziło do rozproszonej fluorescencji w całej cytoplazmie komórek drożdży (Ryc. 4C). Obrazy z pozostałych płytek 96-dołkowych są poddawane inspekcji wizualnej w celu wykrycia ewentualnych efektów stabilizujących lub hamujących leków na SaFtsZ lub EcMreB, w zależności od przypadku.
Wpływ leków na montaż bakteryjnych białek cytoszkieletu można następnie określić ilościowo przy użyciu narzędzi do analizy obrazu i wtyczek w programach ImageJ lub Fiji, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami dla SaFtsZ17 oraz EcMreB21. Zautomatyzowana akwizycja obrazów w formacie płytki 96-dołkowej oraz wdrożenie niestandardowych makr i skryptów do przetwarzania obrazów mogą przyspieszyć czas obrazowania i kwantyfikację efektów działania leków. Zatem, wykorzystując jednokomórkowe eukariotyczne drożdże S. pombe jako system gospodarza, proponujemy, że średnio- lub wysokoprzepustowe przesiewanie małych cząsteczek celujących w bakteryjne białka cytoszkieletu może zostać pomyślnie przeprowadzone, co w efekcie doprowadzi do odkrycia nowych antybiotyków.
<img alt="Ekspresja i analiza białek FtsZ/MreB w S. pombe; badanie toksyczności leków; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający wykorzystanie komórek drożdży rozszczepialnych do przesiewania leków ukierunkowanych na montaż bakteryjnych białek cytoszkieletu SaFtsZ lub EcMreB. Białko FtsZ z S. aureus oraz MreB z E. coli sklonowano do wektora ekspresyjnego drożdżowego pREP42, posiadającego odpowiednio znacznik GFP na końcu C i N, a następnie przekształcono do S. pombe w celu przeprowadzenia badań fenotypowych i analizy wpływu leków. Kultury hodowano przez 8 - 12 h. Następnie kultury przeniesiono do płytek 96-dołkowych z odpowiednimi kontrolami oraz testowanymi lekami. Płytki inkubowano w temperaturze 30 °C przez 6 - 8 h, aż do osiągnięcia OD600 na poziomie 0.5-0.6, po czym zmierzono gęstość optyczną za pomocą czytnika mikropłytek, aby ocenić toksyczność leków wobec komórek drożdży. Inną optycznie przezroczystą płytkę 96-dołkową z szklanym dnem powleczono uprzednio konkanawaliną A w celu adhezji komórek drożdży. Płytka ta służyła do wizualizacji i akwizycji obrazów za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Uzyskane obrazy poddano następnie analizie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat konfiguracji obrazowania mikroskopowego; wyrównanie studzienek, zakres pokrycia, parametry autofokusu do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat oprogramowania do akwizycji obrazów służącego do zautomatyzowanego obrazowania płytki 96-dołkowej. Przy użyciu nawigatora w oprogramowaniu do akwizycji obrazów płytkę 96-dołkową wyrównano poprzez zaznaczenie krawędzi. Wybrano żądane parametry pokrycia studzienek, takie jak liczba obrazów, które należy pobrać z każdej studzienki, oraz ich lokalizacja (losowa lub ze środka studzienki). Na koniec ustawiono parametry obrazowania, takie jak zestaw filtrów do użycia (DIC i filtr FITC; Ex 475/28 nm i Em 525/48 nm), procentową intensywność światła oświetlającego, autofokus oraz czas ekspozycji dla przechwytywania obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Podział komórek bakteryjnych, mikroskopia fluorescencyjna; DIC i ekspresja SaFtsZ-GFP w różnych wariantach traktowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Wizualizacja wpływu leków PC190723 i A22 na ekspresję SaFtsZ-GFP w S. pombe. S. pombe kulturę wykazującą ekspresję SaFtsZ-GFP hodowano bez dodatku tiaminy przez 8–9 h w temperaturze 30 °C przed zastosowaniem DMSO i leku. Kulturę dalej inkubowano w płytce 96-dołkowej przez 7–9 h w temperaturze 30 °C w obecności lub przy braku leków. (A) W grupie kontrolnej z DMSO, do której dodano równoważną ilość DMSO, w komórkach zaobserwowano kilka struktur polimerycznych. (B) W obecności PC190723 (56.2 µM), komórki drożdży wykazujące ekspresję SaFtsZ wykazują znaczny wzrost struktur polimerycznych w porównaniu z kontrolą DMSO. (C) Inhibitor MreB, A22 (72.6 µM), nie wpłynęło na struktury SaFtsZ-GFP. (D) Dłuższy czas ekspresji białek był konieczny do zgromadzenia kompleksów SaFtsZ-GFP wobec braku PC190723, w związku z czym kultury kontrolne hodowano w 30 °C po 12–15 h od subkultury na płytce 96-dołkowej zawierającej DMSO wykazują również polimery FtsZ. Pasek skali wynosi 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wizualizacja komórek bakteryjnych przy użyciu mikroskopii DIC i fluorescencyjnej GFP-MreB, różne traktowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wizualizacja wpływu leków PC190723 i A22 na GFP-EcMreB eksprymowane w S. pombe. Kulturę S. pombe eksprymującą GFP-EcMreB hodowano w obecności tiaminy przez 9-11 h w temperaturze 30 °C przed dodaniem DMSO lub leków (A22 lub PC190723). Kulturę następnie hodowano na płytce 96-dołkowej przez 8-10 h w temperaturze 30 °C z dodatkiem leków oraz bez nich, jako kontrolę. (A) W kulturach, w których jako kontrolę dodano równoważną ilość DMSO, komórki wykazywały liniowe filamenty EcMreB zorientowane wzdłuż osi podłużnej komórek drożdży. (B) Montaż GFP-EcMreB nie został zaburzony w kulturach traktowanych PC190723 (56.2 µM). (C) Mała cząsteczka A22 (72.6 µM), znany inhibitor polimeryzacji MreB, zapobiegła montażowi GFP-EcMreB w komórkach drożdży rozszczepialnych. Pasek skali wynosi 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Szczepy i plazmidy użyte w niniejszym badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/Table%201%20_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Skład pożywek i buforów użytych w tej badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB ...

Nasze laboratorium jest zainteresowane zrozumieniem, w jaki sposób białka cytoszkieletu łączą dynamiczne struktury w celu regulacji funkcji, takich jak partycjonowanie DNA i podział komórek u bakterii. Jesteśmy również zainteresowani odkrywaniem związków, które są ukierunkowane na te białka cytoszkieletu w celu opracowania nowych antybiotyków. Nasz protokół to test komórkowy, w którym białko cytoszkieletu bakteryjnego polimeryzuje w molekularnie zatłoczonym środowisku w drożdżach eukariotycznych, schizosaccharomyces pombe.Dzięki takiemu podejściu możemy jednocześnie zidentyfikować cząsteczki, które bezpośrednio wpływają na białka cytoszkieletu bakteryjnego, polimeryzację i są potencjalnie toksyczne. Korzystając z tej platformy drożdży rozszczepialnych, planujemy przesiewać biblioteki związków makrocyklicznych, w szczególności ukierunkowanych na FtsZ bakterii chorobotwórczych, takich jak helicobacter pylori i Pseudomonas aeruginosa. Planujemy również rozszerzyć badania przesiewowe, aby celować w białka aktynopodobne z Clostridium perfringens biorących udział w segregacji plazmidu.Na początek aseptycznie rozprowadź plaster pombe schizosaccharomyces z bulionu glicerolu na świeżą płytkę specyficzną dla drożdży, aby uzyskać wystarczającą ilość posiewu. Inkubować płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po 48 godzinach, gdy kolonie pojawią się na płytce, zaszczepij małą pętlę inokulum z prążkowanej łaty do pięciu milimetrów specyficznej dla drożdży EMM tiaminy i inkubuj przez 10 do 12 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Po okresie inkubacji należy użyć półautomatycznego 96-dołkowego, wielokanałowego urządzenia do pipetowania i przenieść 50 mikrolitrów wyhodowanej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 150 mikrolitrów świeżych drożdży EMM. Podczas pipetowania w celu prawidłowego wymieszania, powoli wprowadzaj różne rosnące stężenia leków do studzienek z dodanymi kulturami, każdy w trzech egzemplarzach. Następnie dodaj znane bakteryjne białka cytoszkieletu, kierując leki jako kontrolę pozytywną i DMSO jako kontrolę rozpuszczalnika.Inkubować kontrole i płytkę hodowlaną potraktowaną lekiem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez sześć do 10 godzin. Rozpocząć powlekanie studzienek optycznie przezroczystej dolnej płytki 96-dołkowej 20 mikrolitrami konkanawaliny A i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zassaj płyn i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.Przenieść 20 mikrolitrów komórek z inkubowanej płytki hodowlanej do każdej odpowiedniej studzienki płytki pokrytej konkanawaliną A i odstawić na 10 minut. Następnie usuń kulturę z płytki i umyj studzienki trzy do czterech razy sterylnym EMM. I umieść płytkę w odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym, kontrolowanym przez oprogramowanie do obrazowania.Aby zobrazować komórki, wybierz żądaną soczewkę obiektywu. Użyj trybu nawigatora w panelu akwizycji oprogramowania do wyrównania płytki 96-dołkowej i pokrycia studzienki. Wybierz opcję nośnika, a następnie wyrównaj krawędzie studzienki płytki 96-dołkowej.Następnie należy wybrać parametry pokrycia odwiertu, które obejmują wielopozycyjny wybór obszaru zainteresowania w odwiercie. Użyj adaptacyjnej kontroli ostrości z trybem na żądanie, aby utrzymać ostrość próbki podczas obrazowania. Następnie uzyskaj obrazy, używając różnicowego kontrastu interferencyjnego i fluorescencji.Ustaw filtry wzbudzenia i emisji, aby zobrazować białka bakteryjne znakowane GFP. Uzyskaj obrazy stosu Z w kroku o wielkości 0,2 mikrometra przez komórki drożdży o grubości pięciu mikrometrów. Następnie uzyskaj obrazy w wybranych miejscach w poprzek studni.W studzienkach kontrolnych z traktowaniem DMSO komórki drożdży eksprymujące S.aureus FtsZ-GFP utworzyły struktury polimerowe w postaci plam lub plam w komórkach po 20 do 24 godzinach. Jednak po 15 do 18 godzinach komórki wykazywały rozproszoną fluorescencję lub kilka plam, co wskazuje na niewystarczającą ekspresję FtsZ-GFP do polimeryzacji. Lek stabilizujący FtsZ-GFP PC190723, znacznie zwiększył struktury polimerowe po 17 godzinach, służąc jako kontrola pozytywna.W przeciwieństwie do tego, leczenie A22 nie wykazało różnicy w strukturach FtsZ-GFP. Podobnie E. coli MreB-GFP tworzyły liniowe układy długich włókien wzdłuż osi podłużnej drożdży rozszczepialnych, przy czym nie wpływało PC190723 na polimeryzację. Leczenie komórek A22 spowodowało rozproszoną fluorescencję w cytoplazmie komórek drożdży.

fission-yeast-as-platform-for-antibacterial-drug-screens-targeting

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Poznaj metodę badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego FtsZ i MreB z wykorzystaniem drożdży rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego (Wideo) | JoVE Journal

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Przeglądaj więcej filmów