Name: Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę przygotowania preparatów histologicznych siatkówki szczurów i myszy. Ten protokół umożliwia szczegółową ocenę morfologii siatkówki w mikroskopie świetlnym z mniejszą liczbą artefaktów niż inne techniki obrazowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca, w tym szczury, została sfinansowana w ramach projektu CZAS 2 WUM - doskonałość dydaktyczna szansą na rozwój Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego współfinansowanego przez Europejski Fundusz Społeczny w ramach Programu Operacyjnego Wiedza Edukacja Rozwój na lata 2014-2020, numer umowy o dofinansowanie: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. Prace, w tym na myszach, zostały przeprowadzone w ramach projektu realizowanego w latach 2020-2022, finansowanego z dotacji na naukę uzyskanej przez Warszawski Uniwersytet Medyczny.

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji. Gałki oczne wykorzystane w tym badaniu uzyskano od zwierząt włączonych do eksperymentu przeprowadzonego na podstawie zatwierdzenia badania o numerze WAW2/122/2020 wydanego przezII Lokalną Komisję Etyczną Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Nasz protokół został opracowany na podstawie badań myszy w wieku od 11 do 44 tygodni oraz szczurów w wieku 6, 12 i 16 tygodni.
1. Przygotowanie gałek ocznych myszy
UWAGA: Ten protokół przedstawia metodę przygotowania fragmentów gałek ocznych myszy i został opracowany przy użyciu gałek ocznych pobranych od: samic myszy C57Bl/6 w wieku 11 tygodni (średnia waga 21 g), samic myszy C57Bl/6 w wieku 44 tygodni (średnia waga 25 g), samic DBA/2 myszy w wieku 11 tygodni (średnia waga 21,5 g), oraz samice myszy DBA/2 w wieku 44 tygodni z jaskrą (średnia waga 25 g).
<ol>
	<li>Wyłuszczenie
	<ol>
		<li>Użyj małych kleszczy, aby otworzyć powieki. Dociśnij powieki, aby gałka oczna wypadła.</li>
		<li>Wypreparuj gałkę oczną z oczodołu, odcinając tkankę za gałką oczną małymi, ostrymi nożyczkami. Po usunięciu gałki ocznej z oczodołu odetnij wystającą tkankę łączną i mięśnie okołogałkowe.
		<ol>
			<li>Zaznacz gałki oczne dla lepszej orientacji, na przykład zawiązując mały szew na kikutu ścięgna mięśnia prostego bocznego gałki ocznej, aby zaznaczyć skroniową stronę gałki ocznej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie tkanek
	<ol>
		<li>Umieścić wyłuszczoną gałkę oczną w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i pozostawić na 24 godziny w 4 % roztworze paraformaldehydu (PFA) rozpuszczonego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS).</li>
		<li>Następnie leczyć gałkę oczną przez 24 godziny w 10% roztworze sacharozy, następnie usunąć i umieścić na 24 godziny w 20% roztworze sacharozy, a na koniec usunąć i umieścić na 24 godziny w 30% roztworze sacharozy. 
		UWAGA: Przez cały czas trwania procesu utrzymuj gałkę oczną w niskiej temperaturze 4 °C. Należy unikać nakłuć igłą w celu infiltracji sacharozy, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia gałki ocznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie i przechowywanie tkanek
	<ol>
		<li>Wyjmij gałkę oczną z roztworu sacharozy i osusz ją, delikatnie przecierając ją ręcznikiem papierowym.</li>
		<li>Umieścić gałkę oczną w czystej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania. 
		UWAGA: W przypadku przechowywania w temperaturze -80 °C gałka oczna może zachować żywotność do 12 miesięcy do czasu późniejszego przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów
	<ol>
		<li>Rozmrozić gałkę oczną w temperaturze pokojowej. Przenieś go z probówki mikrowirówki do kasety i płucz pod bieżącą wodą przez 20 minut, aby wypłukać sacharozy.</li>
		<li>Odwodnić gałkę oczną, umieszczając ją w następujących roztworach pod wyciągiem, a następnie wyjmując je z następujących roztworów: 70% roztwór alkoholu etylowego (EtOH) przez 10 min, 80% roztwór EtOH przez 10 min, 96% roztwór EtOH przez 10 min, 99,9% roztwór EtOH przez 10 min i aceton przez 5 min.</li>
		<li>Oczyść gałkę oczną, umieszczając ją w ksylenie na 5 minut pod wyciągiem.</li>
		<li>Stopić parafinę, umieszczając trochę stałej parafiny w zlewce i umieszczając ją w inkubatorze laboratoryjnym ustawionym na temperaturę wyższą niż temperatura topnienia określona przez producenta parafiny (temperatura topnienia parafiny wynosi od 46 °C do 68 °C). Po całkowitym stopieniu parafiny (czas zależy od ilości użytej parafiny) przenieś gałkę oczną do zlewki z parafiną i trzymaj w cieple w inkubatorze przez 1 godzinę. W ciągu 1 godziny infiltracji parafiny do tkanki należy mieszać parafinę co 10 - 15 min. 
		UWAGA: Na tym etapie można użyć procesora tkankowego, który umożliwia infiltrację parafiny podczas mieszania roztworu.</li>
		<li>Osadź gałkę oczną w bloku parafiny, jak opisano poniżej.
		<ol>
			<li>Otwórz kasetę i zdejmij górną pokrywę. Wybierz metalową formę i wlej niewielką ilość parafiny, aby pokryć spód formy. Wyjmij gałkę oczną z kasety za pomocą kleszczyków i umieść ją na parafinie w formie. Umieść gałkę oczną na boku, aby zapewnić cięcie w płaszczyźnie strzałkowej. 
			UWAGA: Ułożenie gałki ocznej na boku (z przednim biegunem po jednej stronie i tylnym biegunem po drugiej) umożliwi cięcie w płaszczyźnie strzałkowej. W ten sposób uzyskane zostaną przekroje przez rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe, źrenicę, siatkówkę obwodową i centralną.</li>
			<li>Krótko schłodzić formę na płycie chłodzącej ustawionej na -15 °C, aby parafina lekko zastygła i zakotwiczyła tkankę na miejscu. Ostrożnie przykryj tkankę parafiną, a dno kasety uformować blok. Umieść blok na płycie chłodzącej, aby całkowicie zastygł. Następnie wyjmij blok z metalowej formy i umieść bloki parafiny z powrotem na płycie chłodzącej na co najmniej 15 minut, aby ostygły przed cięciem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zabezpiecz blok parafiny w mikrotomie. Ustaw mikrotom tak, aby odciął nadmiar parafiny z bloku (ustawiamy go na cięcie 15 μm) i przycinaj aż do środka gałki ocznej. Zmień ustawienia mikrotomu, aby przyciąć cieńsze sekcje (ustawiamy go na cięcie 3,5 μm) i umieść sekcję na szkiełku. W przypadku korzystania z mikrotomu z przylegającą kąpielą wodną należy usunąć nadmiar wody ze szkiełka za pomocą wilgotnej chusteczki. 
		UWAGA: Celem jest uzyskanie co najmniej 3 przekrojów przez źrenicę. Im mniej doświadczony badacz, tym więcej sekcji powinien uzyskać, aby zapewnić podział na sekcje na poziomie ucznia. Umieść kilka sekcji na jednym slajdzie. Również dla mniej doświadczonych badaczy należy pociąć tkankę grubszą, na przykład na odcinki o grubości 4 μm lub 5 μm. Zastosowanie mikrotomu z przylegającą kąpielą wodną sprawia, że proces przenoszenia skrawków tkanek na szkiełka jest znacznie łatwiejszy w porównaniu do stosowania mikrotomów bez kąpieli wodnych. Kolejną kwestią, na którą warto zwrócić uwagę, jest to, że obiektyw może być trudny do przecięcia. Aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia tkanek przez kruchą soczewkę, należy używać wyłącznie ostrych ostrzy mikrotomów przeznaczonych do przecinania twardych tkanek. Rozważ użycie jednego ostrza do przycinania, a drugiego do cięcia sekcji, aby zminimalizować stępienie ostrza.</li>
		<li>Umieścić szkiełko w inkubatorze laboratoryjnym ustawionym na 56 °C na 30 minut.</li>
		<li>Wyjąć szkiełko z inkubatora i rozpocząć barwienie go hematoksyliną i eozyną (H&E) ręcznie, kolejno wkładając i wyjmując szkiełko do i z następujących roztworów. Zacznij od 7 min ksylenu, 5 min ksylenu (kolejna zlewka z czystym roztworem) i 5 min ksylenu (kolejna zlewka z czystym roztworem). Następnie należy dodać 2 min 96% EtOH, 1 min 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 1 min 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem).</li>
		<li>Umyć w 5 min bieżącą wodą, następnie 2 min hematoksyliną Mayera, 2 min hematoksyliną Mayera (kolejna zlewka z czystym roztworem), 5 min bieżącą wodą, 5 min bieżącą wodą (kolejna, czysta zlewka).</li>
		<li>Dodać 1% eozyny przez 2 minuty, a następnie 1 min 96% EtOH, 30 s 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 30 s 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 2 min ksylen, 1 min ksylen (kolejna zlewka z czystym roztworem), 2 min ksylen (kolejna zlewka z czystym roztworem). 
		UWAGA: Alternatywnie użyj automatycznego barwienia szkiełek.</li>
		<li>Uszczelnij szkiełko za pomocą automatycznej zgrzewarki do suwaków. Tak przygotowany preparat jest gotowy do przechowywania i oceny pod mikroskopem świetlnym. 
		UWAGA: Alternatywnie, należy wykonać uszczelnienie szkiełkowe ręcznie, nakładając cienką warstwę styropianu na poplamioną tkankę i przykrywając ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym. 
		UWAGA: Czynności obejmujące PFA, EtOH, aceton i ksylen należy wykonywać pod laboratoryjnym wyciągiem wyciągowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie sekcji gałek ocznych szczura i montażu zjeżdżalni
UWAGA: Ten protokół przedstawia metodę przygotowania skrawków gałek ocznych szczurów i został opracowany przy użyciu gałek ocznych pobranych od: samców szczurów SHR w wieku 6 tygodni (średnia waga 115,5 g), samców szczurów SHR w wieku 12 tygodni z nadciśnieniem tętniczym (średnia waga 262,5 g), samców szczurów WKY w wieku 6 tygodni (średnia waga 143,5 g), samce szczurów WKY w wieku 12 tygodni (średnia waga 265 g), samce szczurów Lewisa w wieku 12 tygodni (średnia waga 310 g) i samce szczurów Lewis w wieku 16 tygodni z indukowaną cukrzycą (średnia waga 259 g).
<ol>
	<li>Wyłuszczenie
	<ol>
		<li>Użyj małych kleszczy, aby otworzyć powieki. Naciśnij powieki, aby odsłonić gałkę oczną.</li>
		<li>Wypreparuj gałkę oczną z oczodołu, odcinając tkankę za gałką oczną małymi, ostrymi nożyczkami. 
		UWAGA: Zaznacz gałki oczne dla lepszej orientacji, na przykład zawiązując mały szew na kikutu ścięgna mięśnia prostego bocznego gałki ocznej, aby zaznaczyć skroniową stronę gałki ocznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie tkanek
	<ol>
		<li>Umieścić wyłuszczoną gałkę oczną w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i pozostawić na 24 godziny w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) rozpuszczonego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS).</li>
		<li>Następnie należy traktować gałkę oczną przez 24 godziny w 10% roztworze sacharozy, następnie wyjąć i umieścić na 24 godziny w 20% roztworze sacharozy, a na koniec usunąć i umieścić na 24 godziny w 30% roztworze sacharozy. 
		UWAGA: Przez cały czas trwania procesu utrzymuj gałkę oczną w niskiej temperaturze 4 °C. Należy unikać nakłuć igłą w celu infiltracji sacharozy, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia gałki ocznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie i przechowywanie tkanek
	<ol>
		<li>Wyjmij gałkę oczną z roztworu sacharozy i osusz ją, delikatnie przecierając ją ręcznikiem papierowym.</li>
		<li>Umieścić gałkę oczną w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zamrozić ją w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania. 
		UWAGA: W przypadku przechowywania w temperaturze -80 °C gałka oczna może pozostać żywa przez okres do 12 miesięcy, aż do przyszłego przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów
	<ol>
		<li>Wyjmij gałkę oczną z zamrażarki i z probówki mikrowirówkowej. Przetnij gałkę oczną na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej ostrym skalpelem. Wyjmij i wyrzuć obiektyw. 
		UWAGA: Ten krok najłatwiej wykonać na zamrożonej gałce ocznej, świeżo wyjętej z zamrażarki. Podczas przecinania gałki ocznej soczewka może uszkodzić otaczającą tkankę. Aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia, używaj bardzo ostrego skalpela i zachowaj ostrożność.</li>
		<li>Rozmrozić gałkę oczną w temperaturze pokojowej. Przenieś dwie połówki do kasety i płucz pod bieżącą wodą przez 20 minut, aby wypłukać sacharozy.</li>
		<li>Odwodnić gałkę oczną, umieszczając ją w następujących roztworach pod wyciągiem, a następnie wyjmując z nich: 70% roztwór alkoholu etylowego (EtOH) przez 15 min, 80% roztwór EtOH przez 15 min, 96% roztwór EtOH przez 15 min, 99,9% roztwór EtOH przez 15 min i aceton przez 7 min.</li>
		<li>Oczyść gałkę oczną, umieszczając ją w ksylenie na 7 minut pod wyciągiem.</li>
		<li>Stopić parafinę, umieszczając trochę stałej parafiny w zlewce i umieszczając ją w inkubatorze laboratoryjnym ustawionym na temperaturę wyższą niż temperatura topnienia określona przez producenta parafiny (temperatura topnienia parafiny wynosi od 46 °C do 68 °C). Po całkowitym stopieniu parafiny (czas zależy od ilości użytej parafiny) przenieś gałkę oczną do zlewki z parafiną i trzymaj w cieple w inkubatorze przez 1 godzinę. W ciągu 1 godziny infiltracji parafiny do tkanki należy mieszać parafinę co 10 - 15 min. 
		UWAGA: Na tym etapie można użyć procesora tkankowego, który umożliwia infiltrację parafiny podczas mieszania roztworu.</li>
		<li>Osadź gałkę oczną w bloku parafiny, jak opisano poniżej.
		<ol>
			<li>Otwórz kasetę i zdejmij górną pokrywę. Wybierz metalową formę i wlej niewielką ilość parafiny, aby pokryć spód formy. Wyjmij gałkę oczną z kasety za pomocą kleszczyków i umieść ją na parafinie w formie. Umieść jedną połowę gałki ocznej dnem kubka do góry, a drugą - w dół. 
			UWAGA: Ułożenie połówek gałki ocznej z jedną połową dnem miseczki do góry, a drugą - do dołu, umożliwi przecięcie tkanki w płaszczyźnie strzałkowej. W ten sposób uzyskane zostaną przekroje przez rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe, źrenicę, siatkówkę obwodową i centralną.</li>
			<li>Krótko schłodzić formę na płycie chłodzącej ustawionej na -15 °C, aby parafina lekko zastygła i zakotwiczyła gałkę oczną na miejscu. Ostrożnie przykryj gałkę oczną parafiną i dno kasety, aby utworzyć blok. Umieść blok na płycie chłodzącej, aby całkowicie zastygł. Następnie wyjmij blok z metalowej formy i umieść bloki parafiny z powrotem na płycie chłodzącej na co najmniej 15 minut, aby ostygły przed cięciem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zabezpiecz blok parafiny w mikrotomie. Ustaw mikrotom tak, aby odciął nadmiar parafiny z bloku (ustawiamy go na cięcie 15 μm) i przycinaj, aż dotrzesz do środka gałki ocznej. Zmień ustawienia mikrotomu, aby przyciąć cieńsze sekcje (ustawiamy go na cięcie 3,5 μm) i umieść sekcję na szkiełku. Jeśli używasz mikrotomu z przylegającą kąpielą wodną, usuń nadmiar wody ze szkiełka wilgotną chusteczką. 
		UWAGA: Celem jest uzyskanie co najmniej 3 przekrojów przez źrenicę. Im mniej doświadczony badacz, tym więcej sekcji powinien uzyskać, aby zapewnić podział na sekcje na poziomie ucznia. Umieść kilka sekcji na jednym slajdzie. Również dla mniej doświadczonych badaczy należy pociąć tkankę grubszą, na przykład na odcinki o grubości 4 μm lub 5 μm. Zastosowanie mikrotomu z przylegającą kąpielą wodną sprawia, że proces przenoszenia skrawków tkanek na szkiełka jest znacznie łatwiejszy w porównaniu do stosowania mikrotomów bez kąpieli wodnych.</li>
		<li>Zdjąć szkiełko i rozpocząć barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) ręcznie, kolejno wkładając i wyjmując szkiełko do i z następujących roztworów. Zacznij od 7 min ksylenu, 5 min ksylenu (kolejna zlewka z czystym roztworem) i 5 min ksylenu (kolejna zlewka z czystym roztworem). Następnie należy dodać 2 min 96% EtOH, 1 min 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 1 min 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem).</li>
		<li>Umyć w 5 min bieżącą wodą, następnie 2 min hematoksyliną Mayera, 2 min hematoksyliną Mayera (kolejna zlewka z czystym roztworem), 5 min bieżącą wodą, 5 min bieżącą wodą (kolejna, czysta zlewka).</li>
		<li>Dodać 1% eozyny przez 2 minuty, a następnie 1 min 96% EtOH, 30 s 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 30 s 96% EtOH (kolejna zlewka z czystym roztworem), 2 min ksylen, 1 min ksylen (kolejna zlewka z czystym roztworem), 2 min ksylen (kolejna zlewka z czystym roztworem). 
		UWAGA: Alternatywnie użyj automatycznego barwienia szkiełek.</li>
		<li>Uszczelnij szkiełko za pomocą automatycznej zgrzewarki do suwaków. Przygotowane preparaty są gotowe do przechowywania i oceny pod mikroskopem świetlnym. 
		UWAGA: Alternatywnie, należy wykonać uszczelnienie szkiełkowe ręcznie, nakładając cienką warstwę polistyrenowego środka mocującego na poplamioną tkankę i przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym. 
		UWAGA: Czynności obejmujące PFA, EtOH, aceton i ksylen należy wykonywać pod laboratoryjnym wyciągiem wyciągowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena przekrojów gałki ocznej
<ol>
	<li>Skanowanie slajdów
	<ol>
		<li>Włóż szkiełko do skanera preparatów histopatologicznych i zeskanuj skrawki w trybie skanowania: 40x. Zapisz obrazy jako pliki cyfrowe o wysokiej rozdzielczości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza slajdów
	<ol>
		<li>Otwórz zeskanowany plik za pomocą oprogramowania do przeglądania obrazów. Znajdź przekroje poprzeczne źrenic i przeanalizuj trzy kolejne sekcje.</li>
		<li>Znajdź najgrubszą część siatkówki i powiększ obraz do 20x, naciskając pole powiększenia w prawym górnym rogu i wybierając 20x. Przesuń mysz na poziom wiązu w najgrubszej części siatkówki i naciśnij prawy przycisk myszy, wybierz Adnotacja i Linijka.</li>
		<li>Przesuń wskaźnik myszy w stronę programu ILM i kliknij przycisk po lewej stronie. Nazwij pomiar RT i zaznacz pola pokaż tytuł i pokaż długość. W ten sposób zostanie zmierzona grubość siatkówki (RT), a pomiar zostanie pokazany w μm. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
		<li>Użyj linijki, zmierz grubość każdej warstwy siatkówki, w tym ONL, OPL, INL i IPL, i oznacz je. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 4 i Rysunek 5.</li>
		<li>Aby policzyć liczbę komórek w GCL, ustal z góry określoną długość siatkówki. Na przykład w przypadku siatkówki myszy użyj jednego odcinka 500 μm, a w przypadku siatkówki szczura użyj pięciu odcinków 100 μm.</li>
		<li>Za pomocą linijki zmierz wybraną odległość wzdłuż GCL. Naciśnij prawy przycisk myszy i wybierz Adnotuj > Zapisane > 1x RBC. Kliknij każdą komórkę zidentyfikowaną jako okrągłe, barwione hematoksyliną ciało wzdłuż GCL na określonej długości siatkówki. Policz liczbę zakreślonych komórek. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 6 i <silna klasa="xfig">Rysunek 7.</li>
		<li>Po przeanalizowaniu trzech kolejnych sekcji narysuj średnią ze wszystkich pomiarów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Assessing Retinal Thickness and Ganglion Cell Layer Counts in Rodent Eyeballs

<ol><li>Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ocular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human ocular anatomy.</a> Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Gupta, M. P., Herzlich, A. A., Sauer, T., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+anatomy+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal anatomy and pathology.</a> Dev Ophthalmol. 55, 7-17 (2016).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity in the retina.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).</li>
<li>Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-neuron+interactions+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Glia-neuron interactions in the mammalian retina.</a> Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).</li>
<li>Boulton, M., Dayhaw-Barker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium%3A+Topographical+variation+and+ageing+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The role of the retinal pigment epithelium: Topographical variation and ageing changes.</a> Eye (Lond). 15 (Pt 3), 384-389 (2001).</li>
<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).</li>
<li>Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+retinal+layers%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of retinal layers.</a> C R Biol. 337 (3), 153-159 (2014).</li>
<li>Adams, T., Chernoff, E., Wilson, J., Dharmarajan, S. Reactive muller glia as potential retinal progenitors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+T+%22InTech%22">InTech</a>. , (2013).</li>
<li>Salman, A., Mcclements, M. E., Maclaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+the+regeneration+potential+of+m%C3%BCller+glia+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Insights on the regeneration potential of müller glia in the mammalian retina.</a> Cells. 10 (8), 1957(2021).</li>
<li>Marchesi, N., Fahmideh, F., Boschi, F., Pascale, A., Barbieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+neurodegenerative+diseases%3A+Interconnection+between+retina+and+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Ocular neurodegenerative diseases: Interconnection between retina and cortical areas.</a> Cells. 10 (9), 2394(2021).</li>
<li>Enoch, J., Mcdonald, L., Jones, L., Jones, P. R., Crabb, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+whether+sight+is+the+most+valued+sense%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Evaluating whether sight is the most valued sense.</a> JAMA Ophthalmol. 137 (11), 1317-1320 (2019).</li>
<li>Struebing, F. L., Geisert, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+animal+models+can+tell+us+about+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">What animal models can tell us about glaucoma.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 365-380 (2015).</li>
<li>Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of glaucoma.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 692609(2012).</li>
<li>Wilding, L. A., Uchihashi, M., Bergin, I. L., Nowland, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+for+treating+rodent+ocular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Enucleation for treating rodent ocular disease.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (3), 328-332 (2015).</li>
<li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+to+inject+ocular+drug+implants+into+mouse+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol to inject ocular drug implants into mouse eyes.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101143(2022).</li>
<li>Lozano, D. C., Twa, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rat+schematic+eye+from+in+vivo+biometry+and+the+correction+of+lateral+magnification+in+sd-oct+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).</li>
<li>Castro, G., Navajas, E., Farah, M. E., Maia, M., Rodrigues, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration%2C+integration%2C+survival%2C+and+differentiation+of+stem+cell-derived+neural+progenitors+in+the+retina+in+a+pharmacological+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Migration, integration, survival, and differentiation of stem cell-derived neural progenitors in the retina in a pharmacological model of retinal degeneration.</a> ISRN Ophthalmol. 2013, 752161(2013).</li>
<li>Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+protects+against+diabetic+retinopathy+in+rats+by+inducing+heme+oxygenase-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression.</a> Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).</li>
<li>Igarashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+triple+mutated+aav2-bdnf+gene+therapy+in+a+rat+model+of+transient+iop+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation.</a> Mol Vis. 22, 816-826 (2016).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+efficacy+of+neural+stem+cells+originating+from+umbilical+cord-derived+mesenchymal+stem+cells+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy.</a> Sci Rep. 7 (1), 408(2017).</li>
<li>Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environment+protects+the+optic+nerve+from+early+diabetes-induced+damage+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats.</a> PLoS One. 10 (8), e0136637(2015).</li>
<li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).</li>
<li>Steinle, J. J., Kern, T. S., Thomas, S. A., Mcfadyen-Ketchum, L. S., Smith, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+basement+membrane+thickness%2C+pericyte+ghosts%2C+and+loss+of+retinal+thickness+and+cells+in+dopamine+beta+hydroxylase+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Increased basement membrane thickness, pericyte ghosts, and loss of retinal thickness and cells in dopamine beta hydroxylase knockout mice.</a> Exp Eye Res. 88 (6), 1014-1019 (2009).</li>
<li>Polley, E. H., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+flat+embedding+and+en+face+sectioning+of+the+mammalian+retina+for+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Method%22%5BJournal%5D)">A technique for flat embedding and en face sectioning of the mammalian retina for autoradiography.</a> J Neurosci Method. 12 (1), 57-64 (1984).</li>
<li>Turner, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+toluidine+blue-phloxinate+staining+of+glycol+methacrylate+sections+of+retina+and+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues.</a> Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+optical+coherence+tomography+and+retinal+histology+in+normal+and+pro23his+retinal+degeneration+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig.</a> Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18(2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badanie histologiczne gałki ocznej myszy i szczura jest potężnym narzędziem w dziedzinie okulistyki eksperymentalnej. Może dostarczyć nowych informacji związanych ze zmianami w strukturach oka w przebiegu chorób okulistycznych, które w przeciwnym razie nie zostałyby zaobserwowane w warunkach klinicznych. Opisane protokoły przedstawiają prostą metodę przeprowadzenia analizy histologicznej siatkówki. Subtelności procedury potrzebnej do przetworzenia tkanek przednich, takich jak rogówka, nie są tutaj opisane.
W prezentowanym badaniu enukleację przeprowadzono po eutanazji zwierząt, ponieważ oprócz gałek ocznych do celów badawczych pobrano inne tkanki (krew, nerki). Jednak enukleację można również przeprowadzić na żywych zwierzętach w znieczuleniu. Wilding i wsp. opisali procedurę14 i chcielibyśmy odesłać czytelników do tej pracy, aby zobaczyli zdjęcia procedury enukleacji.
Chociaż protokoły przygotowania szkiełek ocznych myszy i szczurów są podobne, główną różnicą między gałkami ocznymi myszy i szczura, którą należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania szkiełek, jest ich rozmiar. Gałki oczne szczurów mają 8x - 10x większą objętość w porównaniu do myszy, podczas gdy średnia długość osiowa gałki ocznej myszy wynosi około 3,2 mm, a długość osiowa gałki ocznej szczura zwykle oscyluje wokół 6,91 mm15,16. Ułatwia to konieczność przecięcia gałek ocznych szczurów na pół, aby lepiej wniknąć odczynnik do tkanki podczas przetwarzania. Ponadto czas potrzebny do wniknięcia odczynnika do tkanki szczura jest dłuższy niż w przypadku gałek ocznych myszy. Podczas przecinania gałek ocznych szczura na pół ważne jest, aby użyć ostrego ostrza, ponieważ twarda, zamarznięta soczewka może okazać się przeszkodą.
Kolejną kwestią, którą warto omówić, jest utrwalenie tkanek po pobraniu od zwierząt. W przedstawionym protokole gałki oczne po enukleacji unieruchomiono PFA i zanurzono w roztworach sacharozy. Sacharoza działa jako krioprotektant, ponieważ chroni komórki dużych tkanek przed uszkodzeniem przez kryształki lodu, które tworzą się podczas zamrażania17. Zamrożenie tkanki umożliwia naukowcom dłuższe przechowywanie tkanki, a także wykorzystanie jej do różnych badań w przyszłości, w tym analizy histopatologicznej za pomocą mikrotomu (jak poniżej), analizy histopatologicznej za pomocą kriotomu oraz znakowania immunologicznego do oceny za pomocą mikroskopii konfokalnej. Na przykład, podczas przecinania gałki ocznej szczura na pół (krok 2.4.1), jeśli cięcie zostanie wykonane sprawnie i szybko (w ciągu 5 - 10 s), a oko nie ma czasu na rozmrożenie, wówczas jedna połowa gałki ocznej może być wykorzystana do histopatologii, a druga może zostać włożona z powrotem do zamrażarki w celu przyszłego znakowania immunologicznego. Nie zalecamy wykonywania znakowania immunologicznego na tkankach uprzednio naciekanych parafiną ze względu na możliwe zmiany w konformacji epitopów białkowych po utrwaleniu parafiny. Jeśli jednak grupa badaczy planuje jedynie wykonanie analizy histopatologicznej za pomocą mikrotomu, można zastosować prostszą, standardową metodę utrwalania tkanek do zatapiania parafiny - na przykład zamiast wykonywania kroków 1.2.1 - 1.4.1 dla myszy lub kroków 2.2.1 - 2.4.2 dla szczurów, umieść tkanki w 10% roztworze PFA na 24 godziny, a następnie przechowywać je w PBS w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. Sacharoza nie będzie wtedy potrzebna jako krioprotektant, ponieważ tkanki nie zostaną zamrożone. Stosując tę proponowaną metodę, uniknie się procesu zamrażania, co może okazać się korzystne i prowadzić do uzyskania preparatów o wyższej jakości. Zamrożenie gałek ocznych, choć daje badaczom większą swobodę w wyborze czasu wykonania badania histopatologicznego, jest krokiem, który może potencjalnie obniżyć jakość próbki i doprowadzić do odwarstwienia siatkówki. Należy jednak pamiętać, że w przypadku przechowywania tkanek w temperaturze 4 °C ich stabilność biologiczna będzie krótsza, a tkanki powinny zostać poddane analizie w ciągu 4 tygodni. Również podczas pracy z gałkami ocznymi szczura krok 2.4.1 (przecięcie gałek ocznych na pół) będzie znacznie trudniejszy do wykonania na niezamrożonej gałce ocznej.
Prezentowana metodologia została opracowana w oparciu o metodologię opisaną przez Chai i wsp.18, Igarashi i wsp.19, Zhang i wsp.20 oraz Dorfman i wsp.21, na podstawie osobistych doświadczeń oraz metody prób i błędów. Sposób pomiaru grubości siatkówki oraz poszczególnych warstw opisano w oparciu o metodykę przedstawioną przez Chai i wsp.16 oraz Barbera i wsp.18,22. Metoda liczenia RGC siatkówki została opracowana na podstawie przeglądu prac Chai i wsp.16, Zhang i wsp.18, Steinle i wsp.19 oraz Dorfman i wsp.18,20,21,23. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowanie preparatów histopatologicznych gałek ocznych różni się od standardowego preparatu tkankowego zatopionego w parafinie utrwalonego w formalinie, ponieważ gałka oczna jest kulista, a zatem trudniejsza do przenoszenia, cięcia i cięcia. Twardówka stanowi również barierę dla infiltracji odczynników do tkanki. Przygotowując preparaty histologiczne gałek ocznych, należy pracować delikatniej i precyzyjniej, uważając, aby nie uszkodzić delikatnych struktur wewnętrznej części gałki ocznej. Modyfikacje tego protokołu mogą obejmować zastosowanie techniki zatapiania metakrylanu zamiast zatapiania parafiny, co podobno może zapewnić lepsze wyniki morfologiczne. Jednak bardzo niewielu badaczy zastosowało tę metodę do oceny siatkówki24,25.
Protokół ten nie jest wolny od uprzedzeń. Największym problemem, z którym zmagał się nasz zespół, było rozdarcie i odwarstwienie siatkówki. Szczególnie podatna na rozdarcie była siatkówka gałek ocznych szczurów, ponieważ przed przygotowaniem preparatu trzeba było je przeciąć na pół, a zatem siatkówka była bardziej podatna na uszkodzenia. Ze względu na odwarstwienie siatkówki protokół ten nie może być stosowany do oceny naczyniówki, nabłonka barwnikowego siatkówki lub warstwy segmentu fotoreceptora. Jednak nasz zespół uważa, że protokół ten może być wykorzystany do oceny wewnętrznej siatkówki (od ILM do ELM). Aby zminimalizować ilość rozdarcia i odwarstwienia siatkówki, każdy krok protokołu powinien być wykonywany ostrożnie, powoli i precyzyjnymi ruchami.
Analiza histopatologiczna siatkówki nie jest częścią standardowej diagnostyki człowieka, ale jest szeroko stosowaną metodą w badaniach przedklinicznych. Wyniki oceny histopatologicznej siatkówki w badaniach przedklinicznych mogą być powiązane i omówione z wynikami optycznej koherentnej tomografii (OCT)26, która jest badaniem pokazującym przekrój przez siatkówkę podczas badania in vivo , które można wykonać w warunkach klinicznych, wśród ludzi w badaniach klinicznych. KTZ jest jednak mniej szczegółowym badaniem. Dlatego informacje, które możemy czerpać z badań histologicznych prowadzonych w ramach badań przedklinicznych, są niezastąpione i niezbędne do rozwoju wiedzy medycznej.

Gałka oczna to struktura przypominająca kulę, stanowiąca narząd wzroku. Wnętrze gałki ocznej można podzielić na dwa segmenty: odcinek przedni, który obejmuje rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe, soczewkę, komorę przednią i komorę tylną oraz odcinek tylny, który obejmuje ciało szkliste, siatkówkę, naczyniówkę, twardówkę, głowę nerwu wzrokowego. Przednia komora znajduje się między rogówką a tęczówką1,2. Tęczówka jest okrągłą strukturą z otworem pośrodku zwanym źrenicą. Na styku rogówki i tęczówki znajduje się kąt drenażu, w którym wyspecjalizowany system beleczków odprowadza ciecz wodnistą z gałki ocznej do układu żylnego. Tylna komora jest ograniczona przez tęczówkę, ciało rzęskowe i soczewkę, a także więzadła wieszadłowe, które utrzymują soczewkę na miejscu. Za soczewką znajduje się ciało szkliste, które jest największą strukturą gałki ocznej. Ciało szkliste przylega do siatkówki i stabilizuje swoje położenie. Siatkówka jest otoczona przez naczyniówkę i twardówkę1. Anatomia gałki ocznej jest podsumowana w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
Ściana gałki ocznej składa się z trzech warstw. Najbardziej zewnętrzną warstwą jest twardówka, która chroni gałkę oczną przed urazami i utrzymuje jej kształt. Na przednim biegunie gałki ocznej twardówka zamienia się w przezroczystą rogówkę. Pod twardówką znajduje się struktura naczyniowa zwana błoną naczyniową oka, której podstawową funkcją jest odżywianie struktur oka. Błona naczyniowa tworzy błonę naczyniówkową, a w obrębie bieguna przedniego ciało rzęskowe i tęczówka1. Najbardziej wewnętrzną warstwą jest siatkówka, która jest wysoce wyspecjalizowaną strukturą oka, składającą się z neuronów, komórek glejowych i komórek nabłonka barwnikowego. Neurony siatkówki obejmują komórki fotoreceptorowe (pręciki i czopki), komórki poziome, komórki dwubiegunowe, komórki amakrynowe i komórki zwojowe siatkówki (RGC). Komórki te są zorganizowane w złożone warstwy, a ich rolą jest odbieranie i przetwarzanie bodźców świetlnych2,3. Komórki glejowe siatkówki składają się z komórek Müllera, astrocytów i mikrogleju, które są obecne we wszystkich warstwach siatkówki. Wiele funkcji komórek glejowych obejmuje odżywianie neuronów, wspieranie bariery krew-siatkówka, strukturalne wsparcie neuronów w celu utrzymania warstwowej struktury siatkówki, regulację metabolizmu neuronów, wydzielanie biologicznie aktywnych białek regulujących funkcjonowanie, wzrost i przeżycie neuronów oraz regulację procesów immunologicznych w siatkówce4. Komórki nabłonka barwnikowego tworzą najbardziej zewnętrzną warstwę siatkówki i działają jako bariera między naczyniówką a fotoreceptorami. Komórki te regulują dwukierunkowy transport produktów przemiany materii i składników odżywczych, a także chronią siatkówkę przed nadmiernymi uszkodzeniami wywołanymi światłem poprzez pochłanianie energii świetlnej i neutralizację wytwarzanych przez światło reaktywnych form tlenu5.
Siatkówkę można podzielić na dziesięć warstw: (i) nabłonek barwnikowy siatkówki, (ii) warstwa segmentu fotoreceptora (pręciki i czopki), (iii) zewnętrzna błona ograniczająca (ELM), (iv) zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL), (v) zewnętrzna warstwa splotowata (OPL), (vi) wewnętrzna warstwa jądrowa (INL), (vii) wewnętrzna warstwa splotowata (IPL), (viii) warstwa komórek zwojowych (GCL), (ix) warstwa włókien nerwowych siatkówki (RNFL), oraz (x) wewnętrzna membrana ograniczająca (ILM)2. Jądrzaste warstwy siatkówki obejmują ONL, INL i GCL, podczas gdy warstwy z połączeniami synaptycznymi między komórkami obejmują OPL i IPL6. Jądra pręcików i czopków tworzą ONL, a ich aksony rozciągają się do OPL, gdzie łączą się z dendrytami komórek dwubiegunowych i poziomych. W INL znajdują się poziome, dwubiegunowe i amakrynowe jądra komórkowe. W obrębie IPL zakończenia aksonów komórek dwubiegunowych i amakrynowych łączą się z dendrytami RGC. W obrębie GCL RGC stanowią większość ciał komórkowych, ale można tam również znaleźć niektóre zwichnięte komórki amakrynowe. Aksony RGC tworzą RNFL i dalej - nerw wzrokowy7,8,9.
Wiele chorób okulistycznych, takich jak neurodegeneracyjne zaburzenia siatkówki, prowadzi do nieodwracalnej i nieuleczalnej ślepoty10. Wzrok jest uważany za jeden z najważniejszych zmysłów11, a trwała ślepota znacznie obniża jakość życia pacjenta. Aby lepiej zrozumieć patomechanizmy wielu chorób, szeroko przeprowadza się badania przedkliniczne z wykorzystaniem kultur komórkowych lub modeli zwierzęcych. Badania przedkliniczne z wykorzystaniem zwierząt doświadczalnych dają możliwość oceny patomechanizmów leżących u podstaw chorób oczu oraz opracowania nowych strategii terapeutycznych. Choroby oczu można modelować zarówno u dużych zwierząt (małpy, krowy, psy i koty), jak i u małych zwierząt (króliki, szczury, myszy i danio pręgowane). Wykorzystanie większych zwierząt pozwala na lepszy dostęp do oka ze względu na jego wielkość. Z kolei eksperymenty przeprowadzone na gryzoniach, ze względu na ich stosunkowo szybki rozród, pozwalają na hodowlę szczepów wsobnych charakteryzujących się podatnością na niektóre choroby12,13.
W modelach zwierzęcych możliwe jest wyłuszczenie, które umożliwia przeprowadzenie szczegółowego badania histopatologicznego gałki ocznej, z oceną drobnych patologii, które pojawiają się w poszczególnych strukturach oka podczas rozwoju choroby - badanie, które może być bardzo rzadko wykonywane u ludzi. Ocena histopatologiczna jest niezwykle cennym narzędziem podczas badania patomechanizmów zaburzeń narządu wzroku. W opublikowanym piśmiennictwie opisy metodyki badania histologicznego gałek ocznych są bardzo ograniczone, brakuje też przewodników krok po kroku, co utrudnia odtworzenie go przez osoby początkujące. Badanie to ma na celu przedstawienie prostej i zwięzłej metody przygotowania preparatów histologicznych i oceny siatkówki szczura i myszy.

<table><tbody><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>Chempur&nbsp;</td><td></td><td></td>111024800</tr><tr><td>Dumont Pęseta #5, 11cm, 0,05 x 0,01mm Końcówki</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td>małe kleszczyki mikrochirurgiczne</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Mar-Four</td><td>4P.05.2001/L</td><td>Roztwór wodny</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 96 %</td><td>Chempur&nbsp;</td><td>CH.ET. AL.96%CZDA. CH</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 99,9 %</td><td>Chempur&nbsp;</td><td>Ch. ETYL. ALK.99,9%BW</td><td>Służy do przygotowania 70% i 80% roztworów EtOH</td></tr><tr><td>Glacier - 86 &deg; C Zamrażarka ultraniskotemperaturowa NU-9483E</td><td>NuAire</td><td>13027D0034</td><td>Temperatura zamarzania - 80 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Mar-Four</td><td>MI.15.01673</td><td>Szlifowane szkiełka szkiełowe z dwustronnym matowym polem do opisu</td></tr><tr><td>Leica CV5030 W pełni zautomatyzowane szkiełko nakrywkowe</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>14,04,78,80,101</td><td>Automatyczna zgrzewarka do szkiełek&nbsp;</td></tr><tr><td>Hematoksylina Mayera</td><td>Chempur&nbsp;</td><td></td><td></td>124687402</tr><tr><td>Formy z metalową podstawą 15 mm&nbsp; x 15 mm</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>3803081</tr><tr><td>Microme HM 340 E</td><td>Thermo Scientific</td><td>90-519-0</td> Żyletki <td>Microtome</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Mar-Four</td><td>HI. N.35</td><td>Kąt cięcia 35&deg;</td></tr><tr><td>Kaseta do biopsji Micro-Twin</td><td>Mar-Four</td><td>LN.13874550</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofalowy hybrydowy procesor tkanek</td><td>Milestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multistainer Leica ST5020</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td></td><td>Automatyczna wiatarka do szkiełek&nbsp;</td></tr><tr><td>Skaner slajdów NanoZoomer 2.0-HT</td><td>Hamamatsu</td><td>C9600</td><td>Skaner szkiełek histopatologicznych</td></tr><tr><td>NDP.view2 Oprogramowanie do przeglądania obrazów</td><td>Hamamatsu</td><td>U12388-01</td><td>Oprogramowanie do przeglądania obrazów</td></tr><tr><td>Paraffin Pathowax Plus</td><td>Mar-Four</td><td>4P. PWP.010</td><td>Temperatura topnienia 56 &deg; C - 58 & C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td>Przygotuj 4% roztwór w tabletkach PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck Millipore</td><td>524650-1EA</td><td>Służy do przygotowania roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym, zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Pierce, 1,5 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>Chłodziarko-zamrażarka EN14000AW</td><td>Electrolux</td><td>925032562-00</td><td>Chłodzenie 4 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Swann-Morton</td><td>T.OST. SKAL00.024</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Chempur&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>427720906 Nożyczki sprężynowe SuperCut, 12,5 cm, zakrzywione</td><td>World Precision Instruments</td><td>501925</td><td>zakrzywione, małe nożyczki mikrochirurgiczne</td></tr><tr><td>Taśma do automatycznych zgrzewarek</td><td>Mar-Four</td><td>KP-3020/SMRH001</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Chempur&nbsp;</td><td>Ch. KSYL.5l.METAL.OP&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki

Preparation and Analysis of Histological Slides of Rat and Mouse Eyeballs to Evaluate the Retina

Gałka oczna gryzonia jest potężnym narzędziem do badania patomechanizmów wielu chorób okulistycznych, takich jak jaskra, retinopatia nadciśnieniowa i wiele innych. Eksperymenty przedkliniczne umożliwiają naukowcom zbadanie skuteczności nowych leków, opracowanie nowych metod leczenia lub poszukiwanie nowych patomechanizmów zaangażowanych w początek lub postęp choroby. Badanie histologiczne dostarcza wielu informacji niezbędnych do oceny efektów przeprowadzonych eksperymentów i może ujawnić zwyrodnienia, przebudowę tkanek, infiltrację i wiele innych patologii. W badaniach klinicznych rzadko kiedy istnieje szansa na uzyskanie tkanki oka nadającej się do badania histologicznego, dlatego badacze powinni skorzystać z możliwości, jaką daje badanie gałek ocznych od gryzoni. W pracy przedstawiono protokół przygotowania histologicznego przekrojów gałek ocznych gryzoni. Procedura jest przedstawiona dla gałek ocznych myszy i szczurów i składa się z następujących etapów: (i) pobranie gałki ocznej, (ii) zachowanie gałki ocznej do dalszej analizy, (iii) przetwarzanie tkanki w parafinie, (iv) przygotowanie preparatów, (v) barwienie hematoksyliną i eozyną, (vi) ocena tkanki pod mikroskopem świetlnym. Dzięki proponowanej metodzie siatkówkę można łatwo zobrazować i szczegółowo ocenić.

Dzięki zastosowaniu przedstawionego protokołu można szczegółowo ocenić anatomię i morfologię konkretnych struktur gałki ocznej. Nasz zespół koncentruje się na badaniu patomechanizmów neurodegeneracji w schorzeniach siatkówki, takich jak jaskra, retinopatia cukrzycowa i retinopatia nadciśnieniowa. Aby ocenić cechy neurodegeneracji siatkówki, przeanalizowano RT (gałka oczna myszy -Rycina 2, gałka oczna szczura -Rycina 3), ONL, OPL, INL i IPL (gałka oczna myszy -Rycina 4, gałka oczna szczura -Rycina 5) oraz liczbę komórek GCL (gałka oczna myszy -Rycina 6, gałka oczna szczura -Rycina 7). Przewiduje się, że RT oraz liczba komórek GCL będą najwyższe w centralnej części siatkówki, a najniższe na obwodzie. Poprzez przecięcie gałki ocznej na poziomie źrenicy, na jednym preparacie uzyskuje się przekroje przez centralną (w obrębie bieguna tylnego gałki ocznej) i obwodową (blisko ciała rzęsistego) część siatkówki.
Chociaż liczenie komórek GCL można uznać za dość obiektywne, błąd wynikający z ukośnego cięcia może wpłynąć na wyniki pomiaru poszczególnych warstw siatkówki. Aby uniknąć tego błędu, pomiary można przedstawić jako stosunek grubości danej warstwy do wartości RT: ONL/RT, OPL/RT, INL/RT oraz IPL/RT.
<img alt="Anatomia ludzkiego oka, podpisany schemat z siatkówką, soczewką, nerwem wzrokowym i rogówką; do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Anatomia gałki ocznej. Przekrój strzałkowy gałki ocznej z oznaczeniami jej największych struktur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histologia przekroju siatkówki, schemat; grubość 125 µm; warstwy komórkowe; analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Grubość siatkówki u myszy. Pomiar grubości siatkówki (RT) od zewnętrznej błony ograniczającej do wewnętrznej błony ograniczającej w najszerszym punkcie, zaznaczonej zielonym paskiem. Gałka oczna myszy (szczep: C57Bl/6, wiek: 44 tygodnie). Pasek skali w lewym dolnym rogu wskazuje długość 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przekrój histologiczny, struktura siatkówki, obraz mikroskopowy, warstwy komórkowe, pomiar grubości, mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Grubość siatkówki u szczura. Pomiar grubości siatkówki (RT) od zewnętrznej błony ograniczającej do wewnętrznej błony ograniczającej w najszerszym punkcie, zaznaczonej zielonym paskiem. Gałka oczna szczura (szczep: Lewis, wiek: 16 tygodni). Pasek skali w lewym dolnym rogu wskazuje długość 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat przekroju siatkówki z opisanymi warstwami; histologia, analiza mikroskopowa, OPL, ONL, INL." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Warstwy siatkówki myszy. Pomiar grubości poszczególnych warstw siatkówki: zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL), zewnętrznej warstwy splotowej (OPL), wewnętrznej warstwy jądrowej (INL) oraz wewnętrznej warstwy splotowej (IPL), zaznaczonych zielonymi paskami. Gałka oczna myszy (szczep: C57Bl/6, wiek: 44 tygodnie). Pasek skali w lewym dolnym rogu wskazuje długość 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przekrój tkanki siatkówki, obraz mikroskopowy, pokazuje warstwy OPL, IPL, ONL, INL wraz z pomiarami grubości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Warstwy siatkówki u szczura. Pomiar grubości poszczególnych warstw siatkówki: zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL), zewnętrznej warstwy splotowej (OPL), wewnętrznej warstwy jądrowej (INL) oraz wewnętrznej warstwy splotowej (IPL), zaznaczone zielonymi paskami. Gałka oczna szczura (szczep: Lewis, wiek: 16 tygodni). Pasek skali w lewym dolnym rogu wskazuje długość 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig05large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy przekroju siatkówki ukazujący strukturę warstwową, z naniesioną skalą wskazującą rozmiar." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Liczenie komórek warstwy komórek zwojowych u myszy. Metoda liczenia komórek warstwy komórek zwojowych (GCL) wzdłuż siatkówki na odcinku 500 µm. Pojedyncze ciała komórkowe zidentyfikowano jako okrągłe, zabarwione hematoksyliną struktury znajdujące się w obrębie warstwy komórek zwojowych. Komórki zaznaczono czarnymi okręgami. Gałka oczna myszy (szczep: DBA/2, wiek: 44 tygodnie). Pasek skali w lewym dolnym rogu wskazuje długość 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przekrój histologiczny, obraz z mikroskopii świetlnej; warstwy tkanki, skala 100 µm, cel edukacyjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66663/66663fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Liczenie komórek warstwy komórek zwojowych u szczura. Metoda liczenia komórek warstwy komórek zwojowych (GCL) wzdłuż siatkówki na odcinku 100 µm. Pojedyncze ciała komórkowe zidentyfikowano jako okrągłe, barwione hematoksyliną struktury zlokalizowane w warstwie komórek zwojowych. Komórki zaznaczono czarnymi okręgami. Gałka oczna szczura (szczep: Lewis, wiek: 16 tygodni). Pasek skali w lewym dolnym rogu wskazuje długość 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66663/66663fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten rękopis przedstawia protokół histologicznego przygotowania preparatów z gałek ocznych gryzoni. Dzięki proponowanej metodzie wewnętrzną siatkówkę można łatwo zobrazować i ocenić pod mikroskopem świetlnym. Procedura jest przedstawiona dla gałek ocznych myszy i szczurów.

Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki

A rodent eyeball is a powerful tool for researching the pathomechanisms of many ophthalmic diseases, such as glaucoma, hypertensive retinopathy, and many ...

Nasze badania koncentrowały się na opracowaniu prostej metodologii przygotowania preparatów histologicznych i oceny siatkówki gryzoni. Wyniki badania histologicznego siatkówki mogą być wykorzystane do badań nad wieloma chorobami okulistycznymi, w tym chorobami neurodegeneracyjnymi i naczyniowymi. W opublikowanym piśmiennictwie opis metodyki badania histologicznego gałek ocznych gryzoni jest bardzo ograniczony.Brakuje przewodników krok po kroku, co utrudnia początkującym odtworzenie. Wierzymy, że ten protokół będzie przydatny dla innych badaczy. Mimo że istnieją inne metody, które można wykorzystać do oceny morfologii siatkówki, w tym optyczna tomografia koherentna, badanie histopatologiczne pozwala na ocenę pojedynczych komórek i dostarcza mniej artefaktów.Dzięki temu może okazać się bardziej przydatny do badania patomechanizmów chorób okulistycznych. Na początek wyjmij z zamrażarki gałki oczne szczura z paraformaldehydem i sacharozą. Przeciąć gałkę oczną na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej ostrym skalpelem.Następnie wyjmij i wyrzuć soczewkę. Rozmrozić gałkę oczną w temperaturze pokojowej. Przenieś dwie połówki do kasety i płucz pod bieżącą wodą przez 20 minut, aby wypłukać sacharozy.Odwodnić gałkę oczną w zwiększaniu stężenia etanolu przez 15 minut pod wyciągiem, a końcowe odwodnienie w acetonie przez siedem minut. Aby oczyścić gałkę oczną, umieść ją w ksylenie na siedem minut pod wyciągiem. Dodaj trochę stałej parafiny do zlewki i umieść ją w inkubatorze ustawionym na temperaturę wyższą niż temperatura topnienia określona przez producenta parafiny.Po całkowitym stopieniu parafiny przenieś gałkę oczną do zlewki i pozostaw zlewkę w inkubatorze na jedną godzinę. Mieszaj zlewkę co 10 do 15 minut podczas inkubacji w celu infiltracji parafiny do tkanki. Następnie otwórz kasetę i zdejmij górną pokrywę.Wybierz metalową formę i wlej niewielką ilość parafiny, aby pokryć spód formy. Następnie wyjmij gałkę oczną z kasety za pomocą kleszczyków i umieść jedną połowę gałki ocznej dnem kubka do góry, a drugą w dół na parafinie w formie. Gdy tkanka zostanie zakotwiczona na miejscu, ostrożnie przykryj gałkę oczną parafiną, a dno kasety uformować blok.Przenieś blok na płytę chłodzącą, aby całkowicie zastygł. Po zestaleniu wyjmij blok z metalowej formy i umieść bloki parafiny z powrotem na płycie chłodzącej na 15 minut. Zabezpiecz blok parafiny w mikrotomie.Ustaw mikrotom tak, aby odciął nadmiar parafiny z bloku i przycinaj, aż dojdziesz do środka gałki ocznej. Po zmianie ustawień mikrotomu wytnij cieńsze odcinki o wielkości 3,5 mikrometra. Umieść wycięty fragment na szkiełku.Umieść szkiełko w inkubatorze na 15 minut, aby parafina się rozpuściła. Następnie umieść szkiełko w ksylenie. Następnie przenieś szkiełko w 96% etanolu.Po obróbce etanolem umyj szkiełko pod bieżącą wodą przez pięć minut. Umieść szkiełko na dwie minuty w hematoksylinie Mayera, a następnie dwie minuty w hematoksylinie Mayera z czystym roztworem. Umyj szkiełko dwukrotnie pod bieżącą wodą przez pięć minut każde.Dodaj 1% eozyny przez dwie minuty, a następnie etanol przez jedną minutę i 30 sekund każdy. Umieścić szkiełko na dwie minuty w ksylenie, a następnie na jedną minutę ksylen w kolejnej zlewce z czystym roztworem. Uszczelnij szkiełko za pomocą automatycznej zgrzewarki do suwaków.Aby rozpocząć, na komputerze otwórz zeskanowany obraz gałki ocznej szczura w wysokiej rozdzielczości i znajdź przekroje poprzeczne źrenic. Powiększ wybrany przekrój poprzeczny, przewijając go myszą. Następnie obróć kropkę w prawym rogu, aby dostosować orientację obrazu tak, aby siatkówka była pozioma.Kliknij pole powiększenia w prawym górnym rogu i wybierz 20 razy, aby znaleźć najgrubszą część siatkówki. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję Adnotacja i Linijka. Umieść kursor myszy na zewnętrznej błonie ograniczającej w najgrubszej części siatkówki i kliknij lewym przyciskiem, aby rozpocząć pomiar.Następnie przesuń kursor prostopadle do wewnętrznej membrany ograniczającej i ponownie kliknij lewy przycisk, aby zakończyć pomiar. Nazwij pomiar jako Grubość siatkówki i zaznacz pola, aby pokazać tytuł i długość. Następnie za pomocą linijki zmierz grubość każdej warstwy siatkówki, w tym zewnętrznej warstwy jądrowej, zewnętrznej warstwy pleksi, wewnętrznej warstwy jądrowej i wewnętrznej warstwy splotowatej i odpowiednio je oznacz.Aby policzyć liczbę komórek w warstwie komórek zwojowych, wybierz jedną sekcję siatkówki i za pomocą linijki zmierz wybraną odległość wzdłuż warstwy komórek zwojowych. Aby zaznaczyć treści komórek, naciśnij prawy przycisk myszy i wybierz Adnotacja, Zapisane i 1 x RBC. Kliknij każdą komórkę zidentyfikowaną jako okrągłe, jądrzaste ciało barwione hematyną wzdłuż warstwy komórek zwojowych na określonej długości siatkówki.Policz liczbę otoczonych komórek, Grubość siatkówki, grubość poszczególnych warstw oraz liczbę komórek w warstwie komórek zwojowych zostały zmierzone i porównane u różnych osób w celu oceny cech neurodegeneracji siatkówki gryzonia.

preparation-analysis-histological-slides-rat-mouse-eyeballs-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

B7-H1 (PD-L1) oraz jego wiązanie z PD-1 stanowią główny indukowany przez nowotwór sygnał immunosupresyjny w mikrośrodowisku guza. W niniejszym materiale opisano technikę barwienia immunohistochemicznego służącą do charakterystyki ekspresji i lokalizacji B7-H1 w gruczolakoraku trzustki.

Barwienie immunohistochemiczne B7-H1 (PD-L1) na preparatach z tkanki gruczolakoraka trzustki zatopionej w parafinie

Poznaj metodę przygotowania preparatów histologicznych siatkówki szczurów i myszy. Ten protokół umożliwia szczegółową ocenę morfologii siatkówki w mikroskopie świetlnym z mniejszą liczbą artefaktów niż inne techniki obrazowania.

Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki

Przeglądaj więcej filmów