Name: MiR-15a pochodzący z łez egzosomowy jako nowe narzędzie diagnostyczne retinopatii cukrzycowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji egzosomów i detekcji miR-15a z łez jako nieinwazyjnego biomarkera retinopatii cukrzycowej. Technika ta wykorzystuje cyfrowe PCR w kroplach do wczesnej diagnostyki chorób oczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały wsparte przez Alcon Research Institute (IF011-2020) oraz FOM UMSC Care Postdoctoral Research Grant 2021.

Badanie zostało przeprowadzone za zgodą Komitetu Etycznego ds. Badań Medycznych Universiti Malaya Medical Centre (numer referencyjny: 20165-2446). Przed rekrutacją uzyskano pisemną zgodę wszystkich ludzi. Łącznie 135 osób z pacjentów uczęszczających do kliniki okulistycznej Universiti Malaya Medical Centre (UMMC) w Kuala Lumpur zostało włączonych łącznie 135 osób. Kryteria włączenia obejmowały pacjentów, którzy korzystali z usług w ramach UMMC i byli w wieku od 20 do 80 lat. Pacjenci poddawani aktywnemu leczeniu insuliną, z historią leczenia laserowego lub anty-VEGF w ciągu ostatnich 3 miesięcy, lub stosującymi regularne leki przeciwpłytkowe lub leki przeciwzakrzepowowe zostały wykluczone z badania. Osoby podzielono następnie na trzy grupy: (1) zdrowa kontrola (kontrola), (2) cukrzyca bez retinopatii (DM bez DR) oraz (3) cukrzyca z retinopatią (DR). Podsumowanie protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66687/66687fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66687/66687fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotuj sterylny podstawowy zestaw opatrunków zawierający dwie kleszcze, sześć wacików, cztery gazy, tacę i worek na ochronę biologiczną.</li>
	<li>Wlej 5 ml roztworu nawadniania chlorkiem sodu o stężeniu 0,9% w/v do tacy.</li>
	<li>Otwórz paczkę chusteczek oczyszczających powieki i połóż je na sterylnym polu.</li>
	<li>Przygotuj probówkę zawierającą 250 μL roztworu konserwującego.</li>
	<li>Złóż pasek Schirmera na poziomie klina, będąc jeszcze w opakowaniu, zanim położysz sterylny pasek na sterylnym polu.</li>
	<li>Załóż rękawice chirurgiczne w sposób aseptyczny.</li>
	<li>Używając sterylnych kleszczy, zwilż waciki roztworem 0,9% w/v sterylnym chlorkiem sodu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie osób ludzkich
<ol>
	<li>Pozwól osobie wygodnie usiąść i poproś o zamknięcie oczu.</li>
	<li>Cztery razy przetrzyj skórę okooczodołu watą nasączoną w roztworze irygacyjnym.</li>
	<li>Przetrzyj skórę okooczodołu chusteczką oczyszczającą powieki.</li>
</ol>
3. Zbieranie ludzkiego płynu łezowego
<ol>
	<li>Zbieraj płyny łzowe za pomocą paska Schirmersa umieszczonego na dolnym forniksie skroniowym.</li>
	<li>Zakładając częściowo złożony pasek na prawe oko, poproś badanego, by patrzył w lewo. Opuszczaj dolną pokrywkę, aby odsłonić dolny forniks.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy umieść pasek Schirmera na zewnętrznych dwóch trzecich dolnej części spojówki forniksowej. Unikaj kontaktu paska ze skórą, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki potem lub innymi substancjami na skórze.</li>
	<li>Pod paskiem umieść gazę, aby zapobiec kontaktu ze skórą.</li>
	<li>Pozwól, by łzy wchłonęły się w pasek do 20 mm lub maksymalnie 5 minut, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.</li>
	<li>Jeśli poziom 20 mm nie zostanie osiągnięty, dokumentuj poziom rozdarć na podstawie oznaczeń, aby umożliwić standaryzację objętości płynu łzowego.      </li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie usuń pasek Schirmera i umieść go w probówce zawierającej 1x roztwór soli fosforanowej (PBS).</li>
	<li>Włóż rurkę do chłodzenia, aby przetransportować ją do laboratorium.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię okooczodołu, wycierając wszelkie pozostałości ze skóry.</li>
</ol>
4. Wstępne przetwarzanie próbek łez
<ol>
	<li>Vortex, rurka zawierająca pasek Schirmera, została namoczona w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Mieszaj rurką na dźwigni przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wiruj rurkę w 2000 x g przez 15 minut w 4 °C.</li>
	<li>Przelej roztwór do nowej rurki, oznacz i utrzymuj w temperaturze -80 °C aż do dalszego przetwarzania.  </li>
	<li>Usuń pozostały pasek.</li>
</ol>
5. Izolacja egzosomów
UWAGA: Izolacja RNA przeprowadza się przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Rozmraź roztwór łez na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Wyrównaj kolumnę spinową na 15 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem.      </li>
	<li>Usuń dolny wylot kolumny i umieść go na dostarczonej płytce do zbierania odpadów.</li>
	<li>Usuń górną matę uszczelniającą i pozwól, by bufor magazynowy przeszedł przez kolumnę pod wpływem siły grawitacji.</li>
	<li>Dodaj 250 μL PBS i pozwól mu przechodzić przez kolumnę.      </li>
	<li>Powtórz krok 5.5.</li>
	<li>Na górę każdej kolumny nałóż próbkę o pojemności 110 μL i pozwól jej wejść do kolumny.      </li>
	<li>Przenieś kolumnę na dostarczoną płytkę do pobierania próbek.</li>
	<li>Dodaj 100 μL PBS i pozwól mu przejść przez kolumnę do płytki pobierającej próbki.</li>
	<li>Przenieś kolumnę na płytę do zbierania odpadów.</li>
	<li>Dodaj 4x 200 μL PBS do kolumny i pozwól jej wejść do kolumny, aby usunąć wolną frakcję białek z pierwszego załadunku.      </li>
	<li>Dodaj do kolumny 110 μL próbki. Pozwól na wejście do kolumny.</li>
	<li>Umieść kolumnę na płycie do pobierania próbek. Dodaj 100 μL PBS i pozwól mu przejść przez kolumnę.</li>
	<li>Krótko wiruj płytkę pobierającą próbkę w 100 x g przez 30 sekund. Izolowane egzosomy są teraz gotowe do izolacji RNA.</li>
</ol>
6. Izolacja RNA
UWAGA: Izolacja RNA przeprowadza się przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Uczestnik 200 μL izolowanych egzosomów do izolacji RNA.      </li>
	<li>Dodaj 60 μL buforu lizyzowego do izolowanych egzosomów. Vortex przez 5 sekund.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Dodaj 20 μL buforu opadowego inhibitora, zachowuj wir przez 20 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Wiruj w 12 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś przezroczysty, bezbarwny supernatant do nowej rurki.</li>
	<li>Dodaj 1 objętość izopropanolu.</li>
	<li>Wiruj przez 5 sekund i przelej roztwór do mini kolumny obrotowej dołączonej do zestawu.</li>
	<li>Wirówka w temperaturze pokojowej przez 15 sekund przy 8000 x g. Usuń przepływ przez niego.</li>
	<li>Przemyj kolumnę 700 μL bufora RWT.</li>
	<li>Wirówka przez 15 sekund przy 8000 x g. Usuń przepływ.</li>
	<li>Przemyj kolumnę 500 μL bufora płukania RPE.</li>
	<li>Wirówka przez 15 sekund przy 8000 x g. Usuń przepływ.</li>
	<li>Dodaj 500 μL etanolu 80% do mini kolumny spinowej próbki.</li>
	<li>Wirówka przez 2 minuty przy 8000 x g. Usuń przewód i rurkę zbiorczą.</li>
	<li>Włóż mini kolumnę obrotową do nowej probówki zbiorczej 2 mL.      </li>
	<li>Wiruj kolumnę i rurkę w ilości 18 000 x g przez 5 minut. Usuń przepływ i probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Umieść mini kolumnę spinową w nowej rurce 1,5 mL i dodaj 15 μL wody wolnej od RNazy w centrum błony spinowej.</li>
	<li>Inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wiruj w 18 000 x g przez 1 minutę, aby wyludzić RNA. RNA jest gotowe do dalszego przetwarzania.      </li>
	<li>Przeprowadz analizę śledzenia nanocząstek w celu kontroli jakości i weryfikacji wydajności RNA.</li>
</ol>
7. Synteza cDNA
<ol>
	<li>Syntezę cDNA wykonuj przy użyciu komercyjnie dostępnych zestawów, zgodnie z protokołami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotuj mieszankę główną zgodnie z Tabelą 1 w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Pipeta 5,1 μL głównej mieszanki do lamp PCR o pojemności 0,1 μL.</li>
	<li>Dodaj 9,9 μL próbki do przydzielonej probówki zawierającej mieszankę master.</li>
	<li>Włóż rurki PCR do termocyklera i uruchom zgodnie z Tabelą 2. UWAGA: cDNA jest gotowe do dalszej analizy.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Objętość/reakcja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor RT 10x</td>
			<td>1,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100M mieszanka dNTP</td>
			<td>0,15 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor RNAse (200U/μL)</td>
			<td>0,19 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzym RT Multiscribe (50U/μl)</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x RT Primer</td>
			<td>0,75 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od RNAe</td>
			<td>1,51 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przykład</td>
			<td>9,9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowity wolumen</td>
			<td>15 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przygotowanie mieszanki głównej PCR używanej do syntezy cDNA z izolowanego RNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas trwania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transkrypcja wsteczna</td>
			<td>16 °C</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>42 °C</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop</td>
			<td>85 °C</td>
			<td>5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zatrzymaj</td>
			<td>4 °C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Warunki termocykliczne dla syntezy cDNA.
8. Cyfrowe kropelki PCR 
UWAGA: Cyfrowe krople PCR (ddPCR) wykonywane jest przy użyciu komercyjnie dostępnych zestawów zgodnie z protokołami producenta (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę główną do ddPCR w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zgodnie z Tabelą 3.</li>
	<li>Pipeta 19,8 μL mieszanki głównej do lamp PCR o pojemności 0,1 μL. Dodaj 2,2 μL próbek i dobrze wymieszaj, pipetując mieszankę w górę i w dół przez 10 razy.</li>
	<li>Przelej 20 μL mieszaniny próbki do tora próbek wkładu ddPCR.      </li>
	<li>Dodaj 50 μL oleju do toru olejowego wkładu.      </li>
	<li>Przymocuj uszczelkę do wkładu za pomocą haczyka na płycie.</li>
	<li>Włóż wkład do maszyny generującej krople. Dźwięk kliknięcia oznacza prawidłowe włożenie wkładu do maszyny do generowania kropel.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś wszystkie wygenerowane krople do dołków płyty z 96 dołkami. Dodaj przynajmniej jedną studnię bez kontroli szablonu jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Uszczelnij płytę za pomocą folii przebijającej w maszynie do uszczelniania płyt (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Włóż płytę do termocyklera i uruchom zgodnie z Tabelą 4.</li>
	<li>Przełóż płytkę do maszyny do odczytu kropel, aby policzyć krople dodatnie i ujemne.</li>
	<li>Ilościowo określ liczbę kopii/mL, używając liczby kopii/wartości 20 μL wygenerowanej z przebiegu.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Objętość/reakcja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x ddPCR supermix dla sond (bez dUTP)</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Zapalniki/sonda</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przykład</td>
			<td>7 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od RNAe</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowity wolumen</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Przygotowanie miksu PCR używanego do ddPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas trwania</td>
			<td>Rampa</td>
			<td>Cykl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aktywacja enzymów</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td rowspan="5">~2 °C/s na każdy krok</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>Lata 30</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaktywacja enzymów</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zatrzymaj</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Nie ma</td>
			<td>Nie ma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Warunki termocykliczne dla ddPCR.

Autorzy deklarują, że nie mają ze sobą rywalizujących interesów.

Badanie dna dna, optyczna tomografia koherencji oraz angiografia fluoresceinowa to obecnie dostępne techniki wykrywania retinopatii cukrzycowej. Te trzy techniki są często stosowane razem, aby zapewnić kompleksową ocenę różnych chorób siatkówki i naczyniówki. Funduskopia to badanie kliniczne rutynowo wykonywane podczas oceny retinopatii cukrzycowej. Metoda ta jest stosowana przez wykwalifikowanych okulistów i stanowi złoty standard w diagnozowaniu retinopatii cukrzycowej. Metoda ta umożliwia szczegółową ocenę siatkówki i...

Retinopatia cukrzycowa (DR) jest jednym z najczęstszych powikłań mikronaczyniowych cukrzycy, zagrażając wzroku milionów osób na całym świecie. Globalna częstość występowania DR na podstawie danych populacyjnych IDP Atlas 2019 została oszacowana na 22,7% spośród całej populacji diabetyków na świecie, przy czym liczba nowych przypadków stale rośnie, szczególnie w krajach rozwiniętych i rozwijającychsię 1. Klinicznie DR charakteryzuje się wczesnym stadium DR lub nieproliferacyjnym retinopatią cukrzycową (NPDR), późnym stadium DR lub proliferacyjnym retinopatią cukrzycową (PDR) oraz obecnością obrzęku plamki żółtej. Zwiększona przepuszczalność naczyń i zablokowanie naczyń to dwie najczęstsze zmiany patologiczne obserwowane w NPDR, a nieprawidłowa neowaskularyzacja tęczówki, plamki, dysku wzrokowego lub siatkówki obserwuje się w przypadku PDR 2,3. Przejście w PDR, które może potencjalnie prowadzić do krwotoku szklistego i odwarstwienia siatkówki, może powodować poważne zaburzenia widzenia3. We wszystkich przypadkach zmiany patologiczne można wykryć za pomocą funduskopii lub badania fotografii dna dna przez wykwalifikowanych okulistów4. Stosując standardową metodę fotografii dna dna, retinopatię cukrzycową można wykryć z czułością 78%-96% i specyficznością 86%-97%5. Jednak ta metoda wykrywa ją dopiero po uszkodzeniu siatkówki. Istnieje niezaspokojona potrzeba wczesnego wykrywania DR przed pojawieniem się klinicznie widocznych objawów siatkówki, takich jak krwotok z blot, mikrotętniaki, wysięki oraz proliferacja nowych naczyń.
Rozwój narzędzi molekularnych doprowadził do odkrycia egzosomów jako potencjalnego narzędzia diagnostycznego dla różnych chorób, w tym nowotworów i chorób sercowo-naczyniowych 6,7. Egzosomy to nanowielkości cząstki związane membraną dwuwarstwową lipidową, wydzielane przez większość komórek do przestrzeni pęcherzyków zewnętrznych (EV). Egzosomy te mogą być transportowane przez biopłyny, takie jak krew, łzy, ślina i mocz, co czyni je łatwo dostępnymi do nieinwazyjnych lub minimalnie inwazyjnych procedur diagnostycznych8. Zawierają różne markery komórek pochodzenia, w tym białka, lipidy i kwasy nukleinowe. Szczególnie interesujące są małe, niekodujące RNA przenoszone w elektrowniach elektrycznych. Chociaż te RNA nie są kodowane dla białek, odgrywają kluczowe role w regulacji genów i są powiązane z wieloma procesami fizjologicznymi i patologicznymi, w tym w komórkach β trzustki, które odgrywają duże znaczenie w rozwoju cukrzycy 9,10.
Konkretnie, miR-15a wykazano silny związek z rozwojem cukrzycy, głównie poprzez regulację produkcji insuliny i funkcji komórek beta-trzustkowych11. Nasza grupa niedawno wykazała, że miR-15a jest zmieniony w osoczu retinopatii cukrzycowej. Ponadto wykazano, że miR-15a jest wydzielany przez beta-komórki trzustki i przemieszcza się przez krwiobieg do siatkówki12. Płyn łzowy jest uważany za łatwo dostępny płyn, łatwo dostępny z oka w sposób nieinwazyjny i opłacalny13. Zawiera mieszaninę różnych białek, lipidów, elektrolitów i innych cząsteczek, co odzwierciedla stan fizjologiczny powierzchni oka i otaczających tkanek, w tym siatkówki. Więcej miRNA wykryto w płynie łzowym niż w surowicy i roztworze humoru wodnego15,16. Skład łzy zmienia się w odpowiedzi na różne schorzenia ogólnoustrojowe, w tym cukrzycę17. W rzeczywistości analiza płynu łzowego wykazuje obiecujący potencjał do monitorowania i diagnozowania innych chorób niezwiązanych z oczami, takich jak stwardnienie rozsiane i rak piersi18,19. Przy bezpośrednim powiązaniu retinopatii cukrzycowej z okiem, bardziej istotne byłoby poszukiwanie potencjalnych właściwości diagnostycznych płynu łzowego w tej chorobie. Poziomy IL-1RA, IL-8, IL-6 i TNF-α w płynach łzowych pacjentów z retinopatią cukrzycową zaobserwowano zmiany, które również zmieniają się w zależności od ciężkości choroby20,21. W porównaniu z tradycyjnym badaniem funduskopią, analiza płynu łzowego w retinopatii cukrzycowej oferuje potencjalne korzyści pod względem dostępności, nieinwazyjnej i swoistości oraz umożliwia wczesne wykrycie przed rozwojem choroby22.
Dlatego głównym celem tego badania jest zbadanie potencjału egzosomalnego miR-15a pochodzącego z płynu łzowego jako nowego markera diagnostycznego retinopatii cukrzycowej poprzez izolację miRNA oraz ilościowe określenie z płynów łzowych populacji z retinopatią cukrzycową. Dzięki temu powstałaby nowa metoda wykrywania retinopatii cukrzycowej za pomocą przesiewu płynu łzowego, którą można wykryć jeszcze przed pojawieniem się powikłań siatkówki, umożliwiając wczesne działania zapobiegawcze lub terapeutyczne.

<table><tbody><tr><td>0,9% chlorku sodu w otoczeniu</td><td>Ain Medicare Sdn Bhd</td><td>GB16165967618</td><td></td></tr><tr><td>1x fosforanowa sól buforowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Biosystemy stosowane&nbsp; Zestaw do transkrypcji odwrotnej mikroRNA TaqMan</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix dla sond (brak dUTP)</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>Płyty ddPCR 96-dołkowe</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>Naboje DG8</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki DG8</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Olej generujący krople dla sond</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw izolacyjny egzosomów egzospin-96</td><td>Systemy naprowadzania komórek</td><td>EX07-96</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Zaawansowany Zestaw Plazmowy</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp; 217204</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz płyt PX1 PCR</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy system PCR QX100 z kroplami</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>QX100</td><td></td></tr><tr><td>QXDx Generator kropli &nbsp;</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>12001049</td><td></td></tr><tr><td>Pas Schirmera</td><td>Optitech</td><td>SCH-100</td><td></td></tr><tr><td>Termiczny cykler T100</td><td>Laboratoria BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Test mikroRNA Taqmana MTOMED 20 (ID testu: 000389 )</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4440887</td><td>Sekwencja celu: UAGCAGCAUAAUGGUUUGUG</td></tr></tbody></table>

mir-15a pochodzący z łez egzosomowy jako nowe narzędzie diagnostyczne retinopatii cukrzycowej

Tear-Derived Exosomal miR-15a as New Diagnostic Tool for Diabetic Retinopathy

Retinopatia cukrzycowa (DR) jest poważnym powikłaniem cukrzycy, dotykającym znaczny odsetek populacji diabetyków. Wczesna diagnoza i interwencja są kluczowe dla zapobiegania nieodwracalnej utracie wzroku. Obecne metody diagnostyczne, choć skuteczne, mają swoje ograniczenia. miRNA, małe niekodujące RNA, które hamuje stabilność i/lub translację mRNA poprzez wiązanie się z 3'-nieprzetłumaczonymi regionami (3'-UTR) docelowych mRNA, jest coraz częściej uznawane za istotnie powiązane z cukrzycą i może być uzyskane z łez. Badanie to badało potencjał egzosomalnego miR-15a pochodzącego z płynu łzowego jako nowego markera diagnostycznego dla DR. Pobrano próbki łez od 135 pacjentów z cukrzycą (36 z retinopatią cukrzycową [DR] i 50 bez DR) oraz 49 zdrowych kontrolnych osób. Izolowano egzosomy, a poziomy ekspresji miR-15a zmierzono za pomocą cyfrowego PCR kroplowego (ddPCR). Wyniki wykazały, że ekspresja miR-15a egzosomów była zmieniona u pacjentów z cukrzycą i DR w porównaniu z osobami zdrowymi. Wyniki te wskazują, że egzosomalny miR-15a pochodzący z płynu łezowego może odgrywać rolę w molekularnych mechanizmach leżących u podstaw cukrzycy i jej powikłań. Ponadto ma potencjał jako nieinwazyjny i wiarygodny biomarker diagnostyczny retinopatii cukrzycowej, oferując wysoką czułość i swoistość.

Krzywa standardowa Stworzono standardową krzywą, aby określić dokładną ilość łez pobranych od każdego pacjenta. Zasadniczo różne objętości konserwantów w zakresie od 3 μL do 25 μL były wystawione na działanie pasków Schirmera. Obserwowano także odległość mokrego obszaru na Schirmerze. Procedurę powtarzano trzy razy dla każdej procedury, a średni odczyt był obliczany. Utworzono standardową krzywą objętości zebranych łez względem odległości mokrych obszarów Schirmera (Rysunek 2</s...

W tym artykule opisano protokół pobierania i wykrywania miR-15a z łez jako nowego narzędzia diagnostycznego retinopatii cukrzycowej.

MiR-15a pochodzący z łez egzosomowy jako nowe narzędzie diagnostyczne retinopatii cukrzycowej

Diabetic retinopathy (DR) is a major complication of diabetes mellitus, affecting a significant percentage of the diabetic population. Early diagnosis and ...

Nasze badania analizują potencjał mikroRNA-15a pochodzącego z łz, egzosomowego mikroRNA-15a jako nieinwazyjnego biomarkera retinopatii cukrzycowej, z celem poprawy wczesnej diagnozy i wyników leczenia chorób oczu związanych z cukrzycą. Obecne badania wykorzystują cyfrowe PCR kropelki, izolację egzosomów oraz profilowanie molekularne mikroRNA opartych na łzach, aby zwiększyć dokładność diagnostyczną i odkrywać biomarkery retinopatii cukrzycowej. Obecne wyzwania obejmują ograniczoną objętość łz, brak specjalistycznych zestawów do izolacji łez oraz brak zweryfikowanego endogennego referencyjnego mikroRNA, co komplikuje normalizację i spójną ilościową identyfikację w diagnostyce opartej na łzach.Identyfikujemy biomarkery pęcherzykowe lub egzosomalne pochodzące z łez jako nieinwazyjne narzędzie w retinopatii cukrzycowej, choć grupy DR i nieDR się pokrywają, co wskazuje na wsparcie płynów łzowych umożliwiających wczesne wykrywanie choroby. Skupimy się na tym, jak inne mikroRNA regulują retinopatię cukrzycową, zbadamy ich zastosowanie jako nieinwazyjnego biomarkera oraz badamy ich rolę w innych chorobach w zapobieganiu utracie wzroku. Na początek weź rurkę zawierającą pasek Schirmera nasączoną PBS i poddaj ją przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Umieść rurkę na dźwigni i mieszaj ją przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Teraz wiruj rurkę w 2 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej roztwór do nowej oznaczonej probówki i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego przetwarzania.Do izolacji egzosomów rozmroz roztwór łez na lodzie przez 10 minut. Wyrównaj kolumnę spinową na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zdejmij dolny wylot kolumny i umieść go nad dostarczoną płytą do zbierania odpadów.Usuń górną matę sufitową i pozwól, by bufor magazynowy przeszedł przez kolumnę pod wpływem grawitacji. Następnie dodaj 250 mikrolitrów PBS i pozwól mu przejść przez kolumnę. Nałóż 110 mikrolitrów próbki na wierzch każdej kolumny i pozwól jej wejść do kolumny.Przenieś kolumnę na dostarczoną płytę do pobierania próbek. Dodaj 100 mikrolitrów PBS na wierzch i pozwól mu przejść przez kolumnę do płytki pobierającej próbkę. Umieść kolumnę z powrotem na płytce do zbierania odpadów.Dodaj 200 mikrolitrów PBS cztery razy do kolumny i pozwól jej wejść do kolumny, aby usunąć wolną frakcję białka z pierwszego załadunku. Następnie dodaj 110 mikrolitrów próbki do kolumny i pozwól jej wejść. Umieść kolumnę na płycie do pobierania próbek.Dodaj 100 mikrolitrów PBS i pozwól mu przejść przez kolumnę. Krótko wiruj płytkę pobierającą próbkę przy 100 G przez 30 sekund. Izolowane egzosomy są teraz gotowe do izolacji RNA.Weź 200 mikrolitrów izolowanych egzosomów i dodaj do nich 60 mikrolitrów buforu lizy. Wiruj przez pięć sekund i inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodaj 20 mikrolitrów buforu wydzielającego inhibitor.Ponownie zawiruj przez 20 sekund, a następnie inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wiruj rurkę w 12 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Przelej przezroczysty, bezbarwny supernatant do nowej rurki i dodaj do niej jedną objętość izopropanolu.Po pięciu sekundach wirowania przelej roztwór do mini kolumny obrotowej dołączonej do zestawu. Wiruj kolumnę w temperaturze pokojowej przez 15 sekund przy mocy 8 000 G i odrzucaj przepływ. Przemyj kolumnę 700 mikrolitrami buforu RWT.Po 15 sekundach wirowania odrzuć przepływ. Następnie przemyj kolumnę 500 mikrolitrami buforu RPE przed ponownym wirowaniem przez 15 sekund. Usuń przepływ i dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu do mini kolumny spinowej próbki przed ponownym wirowaniem.Po odrzuceniu przepływu i probówki zbiorczej, umieść mini kolumnę spinową w nowej, dwumililitrowej probówce zbiorczej. Wirówka przy 18 000 G przez pięć minut i wyrzuć przewód przepływowy i probówkę zbiorczą. Umieść mini kolumnę obrotową w nowej rurce o pojemności 1,5 mililitra.Następnie dodaj 15 mikrolitrów wody wolnej od RNAse w centrum błony spinowej. Po trzech minutach inkubacji w temperaturze pokojowej wiruj probówkę w 18 000 G przez minutę, aby wyluć RNA. Analiza śledzenia nanocząstek została wykorzystana do oceny rozkładu rozmiarów i stężenia egzosomów izolowanych z próbek łez.Średni rozmiar egzosomów odizolowanych z łez wynosił około 142,4 nanometra. Łączna liczba egzosomów w próbce rozcieńczonej do 1:20 wynosiła 3,9 razy 10 do 10 cząstek na mililitr. Liczba kopii mikroRNA-15a znacząco wzrosła u pacjentów z cukrzycą bez retinopatii w porównaniu do zdrowych grup kontrolnych, co sugeruje wczesne podwyższenie tego biomarkera przy początku cukrzycy.Dalszy istotny wzrost liczby kopii mikroRNA-15a zaobserwowano u pacjentów z retinopatią cukrzycową w porównaniu z grupą kontrolną, co wzmacnia jej związek z chorobami cukrzycowymi. Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w poziomach mikroRNA-15a między grupami z cukrzycą bez retinopatii a retinopatią cukrzycową, co wskazuje, że choć miR-15a odzwierciedla obecność cukrzycy, nie rozróżnia stopni retinopatii.

tear-derived-exosomal-mir-15a-as-new-diagnostic-tool-for-diabetic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj prezentujemy protokół do badania patofizjologii proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej za pomocą pobranych od pacjenta, chirurgicznie wyciętych tkanek włóknisto-naczyniowych do trójwymiarowej charakterystyki tkanek natywnych i hodowli ex vivo. Ten model hodowli ex vivo jest również podatny na testowanie lub opracowywanie nowych metod leczenia.

Model hodowli tkankowej ex vivo powikłań włóknisto-naczyniowych w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Test ochronny został opracowany do monitorowania odporności układu krwionośnego siatkówki na śmierć z powodu urazów związanych z cukrzycą/retinopatią cukrzycową, takich jak stres oksydacyjny i cytokiny.

Test do wykrywania ochrony naczyń krwionośnych siatkówki przed śmiercią związaną z cukrzycą u myszy

Demonstrujemy metodę oznaczania ścian układu krwionośnego siatkówki i przylegających leukocytów. Te przylegające leukocyty można następnie policzyć pod mikroskopem fluorescencyjnym jako parametr stanu zapalnego lub odpowiedź tego zapalenia na terapie.

Kwantyfikacja adherentnych leukocytów wywołanych cukrzycą w unaczynieniu siatkówki

Przedstawiamy prostą platformę z nakładką z agarozy do hodowli trójwymiarowych wielokomórkowych sferoidów z wykorzystaniem linii komórkowych raka neuroendokrynnego. Metoda ta stanowi bardzo wygodny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na komórki nowotworów neuroendokrynnych. Może ona również pomóc w tworzeniu ludzkich sferoidów nowotworów neuroendokrynnych do celów terapii antynowotworowej.

Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Zapalenie płuc jest jedną z dziesięciu głównych przyczyn zgonów w USA. Osteopatyczne techniki manipulacyjne (OMT) mogą być stosowane jako terapia wspomagająca w leczeniu zapalenia płuc w celu poprawy funkcji biomechanicznych i immunologicznych; i ostatecznie, w celu zmniejszenia pobytu w szpitalu, czasu trwania antybiotyków, częstości występowania niewydolności oddechowej i śmiertelności. W tym artykule wideo dokonamy przeglądu randomizowanych, kontrolowanych badań nad stosowaniem OMT u...

Osteopatyczne leczenie manipulacyjne jako użyteczne narzędzie wspomagające zapalenie płuc

Analiza obrazu siatkówki to dyskretna procedura wizualizacji mikrokrążenia. Wpływ czynników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych może powodować zmiany kalibrów naczyń siatkówki. Opisano procedury pozyskiwania obrazów dna oka oraz etapy obliczania kalibrów statków.

Fotografia dna oka jako wygodne narzędzie do badania odpowiedzi mikronaczyniowych na czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych w badaniach epidemiologicznych

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Poznaj metodę izolacji egzosomów i detekcji miR-15a z łez jako nieinwazyjnego biomarkera retinopatii cukrzycowej. Technika ta wykorzystuje cyfrowe PCR w kroplach do wczesnej diagnostyki chorób oczu.

MiR-15a pochodzący z łez egzosomowy jako nowe narzędzie diagnostyczne retinopatii cukrzycowej

Przeglądaj więcej filmów