Name: Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę generowania wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Protokół ten pozwala badać selektywną cytotoksyczność w warunkach hipoksji w mikrośrodowisku nowotworowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (2016YFC1303402), Narodowego Megaprojektu Kluczowych Chorób Zakaźnych (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) oraz Programu Ogólnego Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (201740194).

W niniejszym badaniu HER2-BBz-ODD, wrażliwy na hipoksję CAR nakierowany na HER2 (Gene ID: 2064), został porównany z jego standardowym odpowiednikiem, HER2-BBz. Schematy obu CAR przedstawiono na Rysunku 1A, który pokazuje, że HER2-BBz-ODD pochodzi z HER2-BBz poprzez dodanie sekwencji ODD do końca C-terminalnego CD3ξ. Konstrukcja wektorów lentiwirusowych ekspresujących oba CAR oraz generowanie odpowiedniego lentiwirusa poprzez transfekcję komórek 293T zostały opisane wcześniej31.
1. Generowanie komórek CAR-T wrażliwych na hipoksję poprzez infekcję lentiwirusową
<ol>
	<li>Szybko rozmroź kriokonserwowane ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś rozmrożone PBMCs do probówki 15 mL zawierającej 9 mL bezserwatkowej pożywki do hodowli limfocytów uzupełnionej o 400 IU IL-2, 5&#160;ng/mL IL-7 oraz 10 ng/mL IL-15 (pożywka do wzrostu ludzkich limfocytów T, w dalszej części określana jako TGM).</li>
	<li>Po pobraniu alikwotu do policzenia komórek, odwiruj probówkę przy 300 × g przez 5 min. Resuspenduj osad PBMCs w TGM do gęstości 4 × 106 komórek/mL i przenieś zawiesinę do płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Przygotuj immunikule powlekane przeciwciałami anty-hCD3/hCD28.
	<ol>
		<li>Przenieś 100 µL magnetycznych kulek z IgG mysim do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przemyj je 2 razy&#160;przy użyciu statywu magnetycznego w PBS.</li>
		<li>Resuspenduj kulki w 100 µL PBS i dodaj 0,2 µg przeciwciała mysiego anty-Human CD3 oraz 2 µg przeciwciała mysiego anty-Human CD28. Delikatnie wymieszaj zawiesinę pipetą i inkubuj na wytrząsac revealingu przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyj kulki 2 razy&#160;przy użyciu statywu magnetycznego w PBS i resuspenduj je w 100 µL PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj immunikule powlekane anty-hCD3/hCD28 do płytki z kroku 1.2 w stosunku kulek do komórek 1:1. Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 48 h inkubacji, delikatnie wymieszaj komórki pipetą i przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL. Umieść probówkę na statywie magnetycznym przez 3 min, a następnie ostrożnie przenieś nadsącz do nowej probówki 15 mL, aby oddzielić immunikule od PBMCs.</li>
	<li>Pobierz alikwot do policzenia komórek, a następnie wysiej PBMCs w gęstości 5 × 105 komórek/dołek w 300 µL TGM do płaskiej płytki 48-dołkowej. Do odpowiednich dołków dodaj 200 µL zapasu lentiwirusa oraz siarczan protaminy do stężenia końcowego 10 µg/mL.</li>
	<li>Odwiruj płytkę przy 1 000 × g w temperaturze 32 °C przez 1,5 h, a następnie ostrożnie usuń pipetą 300 µL nadsączu z każdego dołka. Następnie dodaj 1 mL świeżej TGM za pomocą pipety i umieść płytkę w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Co 2-3 dni dodawaj świeżą TGM, aby dostosować gęstość komórek do poziomu 0,5-2 × 106 komórek/mL. Zacznij od przeniesienia komórek najpierw do płytki 12-dołkowej, a następnie do płytki 6-dołkowej. Kontynuuj hodowlę komórek, aż całkowita liczba osiągnie 6 × 106 w objętości 4 mL. 
	UWAGA: Równolegle przeprowadź transdukcję CAR limfocytów T Jurkat zgodnie z opisanymi powyżej procedurami, z wyjątkiem tego, że TGM zastępuje się pożywką RPMI1640 zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
</ol>
2. Ocena ekspresji CAR zależnej od tlenu w komórkach CAR-T przy użyciu cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przenieś CAR-transdukowane limfocyty T z kroku 1.8 do dwóch płytek 12-dołkowych w gęstości 2,5 × 106 komórek/dołek w 2 mL TGM. Jedną płytkę umieść bezpośrednio w uwilgotnionym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C (warunki normoksji, ponieważ standardowe warunki hodowli komórek obejmują 21% O2), a drugą płytkę umieść w mobilnej komorze inkubacyjnej CO2/O2/N2 z ustawionym poziomem O2 na 1% (warunki hipoksji), a następnie umieść komorę w uwilgotnionym inkubatorze z 5% CO2/94% N2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Co 24 h zbieraj 5 × 105 komórek z płytek w warunkach hipoksji lub normoksji do probótek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Wirować probótki przy 500 × g przez 5 min, usunąć nadosad i delikatnie resuspendować komórki w 1 mL PBS poprzez pipetowanie. Powtórz płukanie w PBS jeszcze raz.</li>
	<li>Resuspenduj osad komórkowy w 50 µL buforu FACS (PBS uzupełniony o 2% FBS) w każdej probótce. Dodaj 50 µL rozcieńczenia 1:100 przeciwciała anty-Flag sprzężonego z PE (0,2 µg/mL) i dokładnie wymieszaj poprzez pipetowanie. Inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 min.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji dodaj 1 mL buforu FACS do każdej probótki. Dokładnie wymieszaj poprzez pipetowanie, a następnie wiruj przy 500 × g przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie usuń i odrzuć nadosad za pomocą pipety i powtórz krok 2.4 jeszcze raz.</li>
	<li>Ostrożnie usuń i odrzuć nadosad za pomocą pipety. Resuspenduj komórki w 200 µL buforu FACS, a następnie przenieś otrzymaną zawiesinę komórkową do probótek przepływowych o pojemności 5 mL.</li>
	<li>Wykonaj cytometrię przepływową zawiesiny komórkowej z kroku 2.6 w celu oznaczenia ekspresji CAR na powierzchni. Jako kontrolę negatywną wykorzystaj nietransdukowane limfocyty T.
	<ol>
		<li>Użyj bram FSC/SSC oraz FSC-A/FSC-H do selekcji żywych pojedynczych komórek. Zbierz 1 × 104 żywych pojedynczych zdarzeń dla każdej próbki. Wyznacz bramkę dla komórek pozytywnych pod kątem EGFP (konstytutywnego markera zawartego w wektorze lentiwirusowym jako wskaźnika pomyślnie transdukowanych limfocytów T), a następnie dla komórek pozytywnych pod kątem fikoerytryny (PE) (komórek wykazujących ekspresję CAR), aby zmierzyć pozytywność PE oraz medianę intensywności fluorescencji (MFI).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza zależności ekspresji CAR od tlenu w zmodyfikowanych komórkach T Jurkat z CAR metodą western blot
<ol>
	<li>Przenieś CAR-transdukowane komórki T Jurkat z sekcji 1 do dwóch płytek 48-dołkowych z gęstością 5 × 105 komórek na dołek (objętość hodowli 500 µL) w pożywce RPMI1640 z dodatkiem 10% FBS.</li>
	<li>Do jednej płytki dodaj CoCl2 do dołków eksperymentalnych do końcowego stężenia 0 µM, 50 µM lub 200 µM. Następnie umieść płytkę w inkubatorze z wilgotną komorą, 5% CO2 w temperaturze 37 °C (warunki normoksji). Do drugiej płytki nie dodawaj CoCl2 i umieść ją w mobilnej komorze inkubatora CO2/O2/N2 z poziomem O2 ustawionym na 1% (warunki hipoksji) przed przeniesieniem jej do tego samego inkubatora.</li>
	<li>Po 24 h inkubacji przenieś zawiesiny komórkowe do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Centryfuguj probówki przy 500 × g przez 5 min. Całkowicie usuń i odrzuć nadsączniki, najpierw używając pipety 1-mL, a następnie pipety 100 µL, i resuspenduj osady komórkowe w 50 µL 1x buforu do próbek SDS-PAGE.</li>
	<li>Ogrzewaj próbki w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia przez 10 min. Natychmiast umieść probówkę na lodzie na 30 s, a następnie centryfuguj przy 16 000 × g przez 30 s.</li>
	<li>Nanieś 30 µL oczyszczonych próbek do każdego otworu 10% żelu SDS PAGE z 10 dołkami i grubością 1,5 mm. Prowadź elektroforezę przy 80 V przez 30 min, a następnie zwiększ napięcie do 100 V i prowadź przez 1,5 h.</li>
	<li>Po zakończeniu elektroforezy przenieś białka z żelu na membranę PVDF, stosując standardową metodę transferu mokrego, przy natężeniu prądu 400 mA i czasie transferu 1 h.</li>
	<li>Blokuj membranę w buforze blokującym (5% mleka (w/v) w PBST (PBS + 0,05% Tween-20)) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Następnie wytnij fragment między 30 kD a 40 kD do detekcji kontroli ładowania GAPDH oraz fragment między 50 kD a 70 kD do detekcji cząsteczek CAR.</li>
	<li>Inkubuj fragmenty 30-40 kD i 50-70 kD odpowiednio z mysim przeciwciałem anty-GAPDH (rozcieńczenie 1:2 000) i mysim przeciwciałem anty-Flag (rozcieńczenie 1:2 000) w 3 mL buforu blokującego, albo w temperaturze pokojowej przez 2 h, albo w 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przemywaj membrany PBST w temperaturze pokojowej na wstrząsarce platformowej 3 x 5 min.</li>
	<li>Inkubuj membrany z kozim przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z HRP (rozcieńczenie 1:5 000) w 3 mL buforu blokującego w temperaturze pokojowej przez 1 h; następnie przemyj membranę PBST 5 x 10 min.</li>
	<li>Wywołaj membrany, inkubując je z substratem HRP, a następnie zwizualizuj wykryte prążki białkowe za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazu.</li>
</ol>
4. Ocena in vitro zależności cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki CAR-T wrażliwe na hipoksję od poziomu tlenu
<ol>
	<li>W dniu 0 wysiać 1 × 104 komórek docelowych (komórki SKOV3-Luc) na studzienkę eksperymentalną w 200 µL pożywki DMEM zawierającej 10% FBS w dwóch czarnych 96-dołkowych płytkach hodowlanych z płaskim dnem.</li>
	<li>W dniu 1 ostrożnie usunąć 100 µL supernatantu z górnej części każdej studzienki. Dodać komórki CAR-T lub nieprzetransformowane komórki T w stosunkach efektor do celu 1:1, 2:1 i 4:1 w 100 µL pożywki DMEM zawierającej 10% FBS.</li>
	<li>Jedną płytkę umieścić w atmosferze 21% O2&#160;, a drugą w atmosferze 1% O2&#160; przy użyciu mobilnej komory inkubacyjnej CO2/O2/N2, zgodnie z opisem w kroku 2.1. 
	UWAGA: W przypadku braku mobilnej komory inkubacyjnej CO2/O2/N2, w celu symulacji warunków hipoksji można zastosować dodatek CoCl2 do pożywki hodowlanej.</li>
	<li>W dniu 2, po 24 h kokultury, ostrożnie przenieść cały supernatant (około 150-200 µL) do nowej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U za pomocą pipety. Przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej detekcji cytokin, zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 5.</li>
	<li>Do każdej studzienki eksperymentalnej czarnych 96-dołkowych płytek z płaskim dnem z kroku 4.4 dodać 60 µL 1x buforu do lizy pasywnej. Następnie umieścić płytki na wytrząsarce i inkubować przez 30 min w celu zapewnienia efektywnej lizy komórek.</li>
	<li>Do każdej studzienki eksperymentalnej dodać 60 µL substratu lucyferazy świetlikowej i natychmiast zmierzyć aktywność lucyferazy za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Obliczyć znormalizowaną cytotoksyczność (%) korzystając z równania (1): 
	Znormalizowana cytotoksyczność (%) = 100 - <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;" /> ×100&#160; &#160; (1)</li>
</ol>
5. Wykrywanie sekrecji IL-2 i IFN-γ przez komórki CAR-T wrażliwe na hipoksję
<ol>
	<li>W dniu 0 przygotować rozcieńczenie 1:250 przeciwciała wychwytującego IL-2 lub IFN-γ w buforze do powlekania. Do każdej studni płytki ELISA do 96 próbek dodać 100 µL rozcieńczonego przeciwciała i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Bufor do powlekania przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 7,13 g NaHCO3 i 1,59 g Na2CO3 w 1 L wody destylowanej i dostrojenie pH do 9,5.</li>
	<li>W dniu 1 usunąć niezaabsorbowane przeciwciało wychwytujące poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 3x za pomocą 200 µL buforu do mycia (PBS zawierający 0,05% Tween 20).</li>
	<li>Do każdej studni dodać 200 µL rozcieńczalnika do analizy (PBS zawierający 10% FBS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.</li>
	<li>Usunąć roztwór poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 3x za pomocą 200 µL buforu do mycia.</li>
	<li>Rozmrozić w temperaturze pokojowej mrożone próbki supernatantu/płytkę z kroku 4.4. Po całkowitym rozmrożeniu rozcieńczyć próbki i standardy rozcieńczalnikiem do analizy. Do każdej studni powlekanej płytki ELISA dodać 100 µL rozcieńczonych próbek lub standardów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 h. 
	UWAGA: W przypadku detekcji IL-2 zaleca się 10-krotne rozcieńczenie, natomiast dla detekcji IFN-γ preferowane jest 50-krotne rozcieńczenie.</li>
	<li>Usunąć próbki i standardy poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 5x za pomocą 200 µL buforu do mycia na studnię.</li>
	<li>Przygotować roboczy roztwór detekcyjny, rozcieńczając przeciwciało detekcyjne IL-2 lub przeciwciało detekcyjne IFN-γ/streptawidynę-HRP (SAv-HRP) w stosunku 1:250 w rozcieńczalniku do analizy. Do każdej studni dodać 100 µL roboczego roztworu detekcyjnego i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 h przy łagodnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Usunąć roztwór i przemyć studnie 7x za pomocą 200 µL buforu do mycia.</li>
	<li>Do każdej studni dodać 100 µL odczynnika substratowego i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min w ciemności.</li>
	<li>Do każdej studni dodać 50 µL roztworu zatrzymującego (1 M H2SO4). Bezzwłocznie zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikroplatek.</li>
</ol>

Functional Validation of Hypoxia-Sensitive CAR-T Cells for Selective Tumors

<ol><li>Boardman, A. P., Salles, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+in+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma.</a> Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).</li>
<li>Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T%3A+What+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CAR-T: What is next.</a> Cancers. 15 (3), 663(2023).</li>
<li>Barsan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+utilisation+and+outcomes+across+refractory%2C+first+relapse+and+multiply+relapsed+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+retrospective+analysis+of+real-world+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22eClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns.</a> eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+delivery+of+dual+CAR+targets+of+CD19+and+BCMA+as+well+as+immunomodulators+to+enhance+therapeutic+efficacy+in+solid+tumors+combined+with+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy.</a> Front Oncol. 12, 1037934(2022).</li>
<li>Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speed+and+location+both+matter%3A+Antigen+stimulus+dynamics+controls+CAR-T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response.</a> Front Immunol. 12, 748768(2021).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+anti-solid+tumor+efficacy+of+CAR-T+cells+by+inhibiting+adenosine+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).</li>
<li>Derenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+strategies+to+enhance+CAR+T+cell+persistence+for+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors.</a> Front Immunol. 10, 218(2019).</li>
<li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+techniques+for+enhancing+CAR+T+cell+therapy+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors.</a> Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).</li>
<li>Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+immunosuppression%3A+A+roadblock+to+CAR+T-cell+advancement+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors.</a> Cells. 11 (22), 3626(2022).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+tumor+immune+microenvironment+and+its+optimization+from+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy.</a> Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+physical+microenvironment+for+fueling+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).</li>
<li>Martinez, M., Moon, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+for+solid+tumors%3A+New+strategies+for+finding%2C+infiltrating%2C+and+surviving+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment.</a> Front Immunol. 10, 128(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunosuppressive+microenvironment+and+immunotherapy+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma.</a> Front Immunol. 13, 1003651(2022).</li>
<li>Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+cells+in+cancer%3A+Mechanisms+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR+T+cells+for+enhanced+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety.</a> APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).</li>
<li>Al-Haideri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+combination+therapy%3A+The+next+revolution+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment.</a> Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).</li>
<li>Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+chimeric+antigen+receptor+T-cell+efficacy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+-+assessment+and+management+of+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities.</a> Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).</li>
<li>Mi, J., Ye, Q., Min, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+nanotechnology+development+to+overcome+current+roadblocks+in+CAR-T+therapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors.</a> Front Immunol. 13, 849759(2022).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+Current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+Safety+strategies+to+overcome+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity.</a> Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+Early+successes+in+blood+cancer+and+challenges+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors.</a> Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).</li>
<li>Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+to+overcome+current+challenges+in+multiple+myeloma+CAR+T-cell+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment.</a> Front Oncol. 10, 1362(2020).</li>
<li>Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+next-generation+car-t+cells+for+better+toxicity+management%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management.</a> Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).</li>
<li>Flugel, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+on-target%2C+off-tumour+toxicity+of+CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).</li>
<li>Rababah, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+therapy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors.</a> Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).</li>
<li>Masoud, G. N., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif-1alpha+pathway%3A+Role%2C+regulation+and+intervention+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy.</a> Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+hif-1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting hif-1 for cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia--a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).</li>
<li>Juillerat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+sensitive+self-decision+making+engineered+CAR+T-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell.</a> Sci Rep. 7, 39833(2017).</li>
<li>Liao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+T+cells+with+hypoxia-inducible+chimeric+antigen+receptor+%28HiCAR%29+for+selective+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing.</a> Biomark Res. 8 (1), 56(2020).</li>
<li>Ivan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif%CE%B1+targeted+for+vhl-mediated+destruction+by+proline+hydroxylation%3A+Implications+for+o2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing.</a> Science. 292 (5516), 464-468 (2001).</li>
<li>Wang, G. L., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).</li>
<li>D'alonzo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+preclinical+tumor+hypoxia+imaging+methods%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review.</a> Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+car-t+cells+by+hypoxia-inducible+transcription+amplification+%28hita%29+system+significantly+enhances+systemic+safety+and+retains+antitumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy.</a> J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).</li>
<li>Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+hypoxia-mediated+escape+from+adaptive+immunity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells.</a> Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).</li>
<li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+metabolism%3A+Cancer%27s+achilles%27+heel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel.</a> Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Obawy dotyczące bezpieczeństwa są istotnymi kwestiami, które należy rozwiązać, aby jakakolwiek terapia komórkami CAR-T mogła przejść do użytku klinicznego. Wykorzystanie unikalnych właściwości komórek nowotworowych lub TME stało się głównym kierunkiem badań koncentrujących się na rozwoju komórek CAR-T, które selektywnie atakują tkanki nowotworowe. Zaprojektowanie wrażliwego na niedotlenienie CAR-T jest atrakcyjną strategią w tym kierunku, z kilkoma badanymi podejściami, w tym tym tym przedstawionym w tym badaniu - fuzją ugrupowania CAR z naturalnie występującą domeną białka ODD wykrywającą hipoksję. Alternatywne podejście polega na zastąpieniu konstytutywnego promotora powszechnie stosowanego do napędzania ekspresji CAR elementem odpowiedzi na hipoksję (HRE), który okazał się obiecujący w poprzednich badaniach. Uważa się, że połączenie elementów HRE i ODD (wersje typu dzikiego lub inżynieryjnego, które oferują ściślejszą kontrolę ekspresji) stanowi optymalną konstrukcję dla CAR indukowanego hipoksją.
Protokół ten przedstawia procedury eksperymentalne generowania i walidacji wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T. Implementacja tego protokołu wiąże się z kilkoma kluczowymi kwestiami. Podstawową kwestią jest stworzenie warunków niedotlenienia. Pomiędzy tymi dwoma podejściami, dodanie CoCl2 do pożywki hodowlanej było powszechnie stosowane w poprzednich badaniach związanych z hipoksją, głównie dzięki swojej wygodzie32,33. Niemożliwe jest jednak zmierzenie stopnia niedotlenienia naśladowanego przez to podejście. Natomiast zastosowanie mobilnej komory inkubacyjnej CO2 / O2 / N2 2 jest korzystne, ponieważ poziomy O2 można precyzyjnie ustawić, a tym samym nadaje się do dokładnej analizy wrażliwości komórek CAR-T na hipoksję. Pod tym względem poziom niedotlenienia w guzach różni się między różnymi typami guzów litych i różnymi okresami progresji guza34, podczas gdy w protokole przedstawiono zaledwie 1% O2 . Jest to optymalna praktyka dla badaczy, aby dostosować poziom tlenu do rzeczywistego zapotrzebowania. Jeśli metoda CoCl2 jest jedynym dostępnym podejściem, zalecamy włączenie do testu zakresu stężeń CoCl2 w celu symulacji różnych poziomów tlenu.
Kolejną kluczową kwestią jest wybór odpowiedniej metody badania ekspresji CAR zależnej od hipoksji. Podczas gdy analiza immunoblottyczna limfocytów T Jurkat transdukowanych przez CAR jest wygodną opcją podczas optymalizacji konstrukcji CAR, analiza wpływu poziomów tlenu na powierzchniową ekspresję CAR w ludzkich PBMC transdukowanych przez CAR za pomocą cytometrii przepływowej służy jako ostateczna walidacja. Optymalne jest zbadanie dynamiki ekspresji CAR w odpowiedzi na przejście z warunków hipoksyjnych do normoksyjnych, tak jak zrobiliśmy to wcześniej z ulepszoną wersją CAR wrażliwej na hipoksję, a mianowicie HiTA-CAR35. To jeszcze bardziej zademonstrowałoby ekspresję CAR ograniczoną hipoksją.
W celu weryfikacji funkcjonalnej wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T test cytotoksyczności opisany w protokole obejmuje użycie komórek docelowych przenoszących lucyferazy świetlika. Ten test reporterowy można zastąpić innymi metodami oceny zabijania, takimi jak metoda CCK8 i metoda analizy komórkowej w czasie rzeczywistym (RTCA), w której można stosować niezmodyfikowane komórki nowotworowe. Analiza RTCA jest również korzystna dla pomiaru kinetyki zabijania komórek CAR-T w czasie rzeczywistym. W celu zmierzenia swoistej cytotoksyczności powodowanej przez komórki CAR-T, jako grupę kontrolną należy włączyć nietransdukowane PBMC. Wysoka skuteczność transdukcji PBMC jest pożądana, aby uniknąć obaw, że różnice w wykrytej cytotoksyczności między grupami doświadczalnymi i kontrolnymi wynikają z niespecyficznego zabijania, w którym pośredniczą różne ilości dodanych komórek efektorowych.
Istnieje kilka ograniczeń w tym protokole. Warunki niedotlenienia mogą wpływać na żywotność zarówno komórek docelowych, jak i limfocytów T36,37, co wprowadza obawę, że śmierć komórki niezwiązana z cytotoksycznością za pośrednictwem komórek CAR-T może zakłócić interpretację wyników testu. Sugeruje się, aby upewnić się, że zarówno komórki CAR-T, jak i komórki docelowe mają doskonałą żywotność bezpośrednio przed testem, aby uniknąć lub zminimalizować takie problemy. Należy również zauważyć, że walidacja in vitro nie gwarantuje udanej translacji in vivo. Oceny in vivo są zawsze potrzebne, aby potwierdzić, czy wrażliwy na niedotlenienie kandydat CAR-T może uniknąć celowania w normalne tkanki, które wykazują ekspresję docelowego antygenu

Terapia limfocytami T z wykorzystaniem chimerycznego receptora antygenowego (CAR-T) stanowi znaczący przełom w leczeniu raka. Odkąd Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła pierwszą terapię CAR-T do leczenia zaawansowanego/opornego chłoniaka i ostrej białaczki limfoblastycznej w 2017 roku1,2,3, 10 terapii CAR-T ukierunkowanych na CD19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA) otrzymało zatwierdzenie na całym świecie4. Jednak pomimo szeroko zakrojonych badań, odtworzenie niezwykłej skuteczności terapii CAR-T w leczeniu nowotworów hematologicznych pozostaje wyzwaniem ze względu na jej zastosowanie w guzach litych5,6,7,8.
Immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do słabej skuteczności CAR-T w leczeniu guzów litych. TME utrudnia aktywność i przetrwanie komórek CAR-T z powodu niewystarczającej ilości składników odżywczych, niedotlenienia, kwaśnego pH i nagromadzenia odpadów metabolicznych9,10,11,12. Dalsza wrogość wynika z infiltracji komórek immunosupresyjnych, takich jak limfocyty T regulatorowe (Treg), komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC) i makrofagi związane z nowotworem (TAM), które wraz z komórkami nowotworowymi wydzielają cytokiny immunosupresyjne, które powodują dodatkowe hamowanie komórek CAR-T po wejściu do guza13,14.
Oprócz niezadowalającej skuteczności terapeutycznej, kwestie bezpieczeństwa są kolejną piętą achillesową komórek CAR-T w przypadku guzów litych15,16. Obawy dotyczące bezpieczeństwa wynikają z faktu, że żaden z dotychczas zidentyfikowanych antygenów specyficznych dla nowotworu (TSA) nie jest ściśle ograniczony do komórek nowotworowych. Innymi słowy, antygeny związane z nowotworem (TAA) wybrane jako cel CAR, chociaż wykazują wyższą ekspresję w komórkach nowotworowych, często są również wyrażane przez normalne tkanki17. Nieoczekiwana aktywacja komórek CAR-T po skutecznym rozpoznawaniu normalnych tkanek przez CAR może zatem powodować efekty pozanowotworowe, co prowadzi do zespołu uwalniania cytokin (CRS), zespołu encefalopatii związanej z CAR-T (CRES)18 i innych niekorzystnych wyników19.
Rozważano wiele strategii unikania takich efektów, w tym zmniejszenie powinowactwa CAR, aby umożliwić komórkom CAR-T odróżnianie komórek nowotworowych od normalnych komórek na podstawie poziomów ekspresji docelowego TAA; wyposażenie komórek CAR-T w wyłącznik, taki jak gen samobójczy lub marker eliminacji, aby promować ich eliminację po nieoczekiwanej aktywacji; podział sygnałów CD3ζ i sygnałów kostymulujących na dwie grupy CAR, których równoczesne zaangażowanie jest w związku z tym wymagane do skutecznej aktywacji komórek CAR-T; wykorzystując syntetyczny obwód oparty na Notch (synNotch), który ogranicza aktywność komórek CAR-T do komórek docelowych wykazujących współekspresję dwóch różnych TAA; oraz inżynieria komórek CAR-T w celu osiągnięcia czułości TME poprzez implementację mechanizmu dostrajania ekspresji CAR do zmieniających się sygnałów środowiskowych20,21,22,23,24,25,26.
Kluczowym czynnikiem w opcji czułości TME opisanej powyżej jest niski poziom tlenu w TME spowodowany szybką proliferacją komórek nowotworowych. Akomodacja komórek nowotworowych do niedotlenienia zależy od aktywacji czynnika indukowanego hipoksją-1 (HIF-1), heterodimerycznego czynnika transkrypcyjnego składającego się z indukowalnej podjednostki, HIF-1α i konstytutywnie wyrażonej podjednostki, HIF-1β27. W warunkach normoksyjnych białko HIF-1α ulega ubikwitynacji i szybkiej degradacji proteasomalnej, w zależności od jego zależnej od tlenu domeny degradacji (ODD)28. Kiedy komórkowy dopływ tlenu staje się ograniczony, HIF-1 jest stabilizowany i aktywuje transkrypcję swoich dalszych genów docelowych poprzez wiązanie się z elementami odpowiedzi na niedotlenienie (HRE)29. Biorąc pod uwagę naturę ODD i HRE jako elementów wrażliwych na tlen, zbadano je w celu realizacji warunkowej ekspresji CAR w hipoksyjnym TME30. W tym miejscu przedstawiamy protokół skupiający się na metodach charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T, poprzedzony krótkim opisem konstrukcji CAR i procedur przygotowania tych komórek. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do wykorzystania CAR reagującego na niedotlenienie do generowania komórek CAR-T o ograniczonej toksyczności poza guzem.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml Probówka wirówkowa</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>Supernatanty i cellekcja komórek Protokół Krok 2,3,4</td></tr><tr><td>10% ExpressCast STRONA</td><td>NCM biotech</td><td>P2012</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM biotech</td><td>20220812</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Pipeta 10 ml</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>Pipetowanie Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>10xTRIS-Glycine-SDS bufor do elektroforezy</td><td>Epizyme</td><td>3673020</td><td>Immunoblotting Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Supernatanty i cellekcja komórek Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>25 cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 3,4</td></tr><tr><td>4x Białko SDS PAGE Bufor ładujący</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>Protokół immunoblottingu Krok 3</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkanek płaskodennych</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>T Cell Culture Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>96-dołkowe czarne płaskodenne płytki do hodowli tkankowych</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Test cytotoksyczności Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki ELISA</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>Protokół ELISA Krok 5</td></tr><tr><td>96-dołkowa wytrząsarka do płytek</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>Shake Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z dnem w kształcie litery U</td><td>Thermo Scientific</td><td>268200</td><td>Supernatants cellection Protokół Krok 4,5</td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>Immunoblotting Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>Karbinol</td><td>Protokół Sinopharm</td><td>10010061</td><td>Immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Inkubator dwutlenku węgla</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,2,3,4</td></tr><tr><td>Płytka do liczenia komórek</td><td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>Zliczanie komórek Protokół Krok 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan Mouse IgG Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>Koraliki magnetyczne Mouse IgG Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,3,4</td></tr><tr><td>System obrazowania żelem chemiluminescencyjnym</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku kobaltu (0,5 M)</td><td>bioleaper</td><td>BR4000203</td><td>Stan niedotlenienia Protokół Krok 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103- CV</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Sartorius</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>ważenie Protokół Krok 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 3,4</td></tr><tr><td>GAPDH MAb myszy</td><td>ABklonalny</td><td>AC002</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy żelowej</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>Protokół immunoblottingu Krok 3</td></tr><tr><td>Czytniki mikropłytek GloMax</td> Pomiar aktywności lucyferazy <td>Promega</td><td>GM3000</td><td> Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Yeasen</td><td>P1126151</td><td>Immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Wirówka do mikrozamrażania o dużej prędkości</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp; R</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Ludzki IFN-&gamma; Zestaw ELISA</td><td>BD</td><td>555142</td><td>ELISA Protokół Krok 5 Pozycje: Rekombinowany ludzki IFN-&gamma; Liofilizowany standardowy, wykrywający przeciwciało biotyny anty-ludzkiej IFN-&gamma; , Oczyszczony anty-ludzki IFN-&gamma odczynnik do wychwytywania przeciwciał, koniugat enzymatyczny Streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (SAv-HRP)</td></tr> <tr><td>Ludzki zestaw testów ELISA IL-2</td><td>BD</td><td>555190</td><td>ELISA Krok protokołu 5 Elementy: Rekombinowany ludzki liofilizowany wzorzec IL-2, przeciwciało wykrywające biotyna anty-ludzka IL-2, przeciwciało wychwytujące oczyszczone anty-ludzkie IL-2, odczynnik enzymatyczny koniugat streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>R& Systemy D</td><td>P40933</td><td>Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CC45</td><td>Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& Systemy D</td><td>P13232</td><td>Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>CAR-Jurkat construction Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>Cytometria przepływowa Protokół Krok 2</td></tr><tr><td>System</td> <td>oznaczania lucyferazyTest reporterowy lucyferazy Promega</td><td>E1501</td><td> Protokół Krok 4 Przedmioty: Pasywny bufor do lizyzy, substrat lucyferazy świetlika</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Protokół BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA Krok 5</td></tr><tr><td>mobilny CO2/O2/N2 Komora inkubatora</td> China <td>Innovation Instrument Co., Ltd.</td><td>Smartor118</td><td>Stan niedotlenienia Protokół Krok 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Hexa Histidine tag</td><td>Sigma</td><td>SAB2702218</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Bufor szybkiego transferu NcmBlot</td><td>NCM biotech</td><td>WB4600</td><td>Immunoblotting</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM biotech</td><td>P10300</td><td>Protokół immunoblottingu Krok 3 Elementy: Odczynnik NcmECL Ultra Luminol/Enhancer (A), Ultra stabilizowany odczynnik nadtlenkowy NcmECL (B)&nbsp;</td></tr><tr><td>Powlekane NovoNectin 48-dołkowe płaskie płytki</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CH38</td><td>Budowa komórek CAR-T Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Zestaw tabletek OPD (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy)</td><td>Sigma</td><td>P9187</td><td>Odczynnik substratowy Protokół Krok 5 Przedmioty: Tabletka OPD (srebrna folia), tabletka nadtlenku wodoru mocznika (złota folia)</td></tr> <tr><td>Anty-DYKDDDDK anty-sprzężony z PE</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>Cytometria przepływowa Protokół Krok 2</td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma</td><td>P3369-1OG</td><td>Zakażenie lentiwirusem Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Marker białkowy 10 Kda-250 KDa</td><td>Epizyme</td><td>WJ102</td><td>Immunoblotting Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>&nbsp; Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>566685</td> Protokół hodowli <td>limfocytów T Krok 1</td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td>Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>168627</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>Protokół immunoblottingu Krok 3</td></tr><tr>Test cytotoksyczności<td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td> Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>NCM biotech</td><td>C125C1</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Animacja 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3 Łaźnia</td></tr><tr><td>wodna</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>Heating Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>Pożywka do hodowli limfocytów bez surowicy Protokół Krok 1</td></tr></tbody></table>

generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek t receptora antygenowego

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

Obszerne badania dowiodły obietnicy terapii komórkami T (Car-T) z chimerycznym receptorem antygenowym w leczeniu nowotworów hematologicznych. Jednak leczenie guzów litych pozostaje wyzwaniem, czego przykładem są obawy dotyczące bezpieczeństwa, które pojawiają się, gdy komórki CAR-T atakują normalne komórki wykazujące ekspresję docelowych antygenów. Naukowcy badali różne podejścia mające na celu zwiększenie selektywności nowotworów w terapii komórkami CAR-T. Jedną z reprezentatywnych strategii w tej linii jest budowa wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T, które są zaprojektowane przez fuzję zależnej od tlenu domeny degradacji z ugrupowaniem CAR i są opracowane tak, aby osiągnąć wysoką ekspresję CAR tylko w niedotlenionym środowisku - mikrośrodowisku guza (TME). W pracy przedstawiono protokół generowania takich komórek CAR-T i ich charakterystykę funkcjonalną, w tym metody analizy zmian ekspresji CAR i zdolności zabijania w odpowiedzi na różne poziomy tlenu ustalone przez mobilną komorę inkubatora. Oczekuje się, że skonstruowane komórki CAR-T wykażą ekspresję CAR i cytotoksyczność w sposób wrażliwy na tlen, wspierając w ten sposób ich zdolność do odróżniania niedotlenionych TME od normalnych tkanek normoksyjnych w celu selektywnej aktywacji.

Połączenie domeny ODD białka HIF-1α z częścią CAR stanowi główną strategię generowania CAR wrażliwego na hipoksję. Analizowany w niniejszym badaniu CAR skierowany przeciwko HER2, wrażliwy na hipoksję i nazwany HER2-BBz-ODD, został skonstruowany przy użyciu tej strategii poprzez zintegrowanie sekwencji ODD z konwencjonalnym HER2-BBz (Rysunek 1A). W badaniu tym zastosowano transdukcję lentiwirusową w celu ekspresji CAR HER2-BBz-ODD lub CAR HER2-BBz, a następnie zbadano ich wrażliwość na tlen w dwóch typach komórek: ludzkich PBMC oraz limfocytach T Jurkat.
Pierwszym badaniem była analiza ekspresji CAR w warunkach hipoksji w porównaniu z warunkami normoksji, którą przeprowadzono zarówno w limfocytach T pochodzących z PBMC przetransdukowanych CAR za pomocą cytometrii przepływowej, jak i w limfocytach T Jurkat przetransdukowanych CAR za pomocą western blotu. W przypadku limfocytów T pochodzących z PBMC przetransdukowanych CAR zaobserwowano, że HER2-BBz-ODD CAR wykazywał znacząco wyższą ekspresję przy 1% O2 niż przy 21% O2, zarówno pod względem odsetka komórek CAR-dodatnich, jak i mediany intensywności fluorescencji (MFI) (Rysunek 1B). Analiza immunoblottingu limfocytów T Jurkat przetransdukowanych CAR potwierdziła również zależną od hipoksji indukcję HER2-BBz-ODD.
Warto zauważyć, że w tym kontekście warunki hipoksji można łatwo naśladować poprzez dodanie do pożywki hodowlanej CoCl2, który jest chemicznym induktorem hipoksji. Jak pokazano na Rysunku 1C, wyniki immunoblottingu wykazały, że ekspozycja na 50 lub 200 µM CoCl2 odtworzyła efekt ekspozycji na 1% O2, znacząco indukując ekspresję HER2-BBz-ODD CAR, ale nie HER2-BBz CAR. Funkcjonalna charakterystyka CAR wrażliwego na hipoksję została przeprowadzona z wykorzystaniem komórek CAR-T pochodzących z PBMC. W badaniu jako linię komórek docelowych wykorzystano linię komórkową SKOV-3 niosącą lucyferazę świetlikową. Taki układ pozwolił na pomiar aktywności lucyferazy związanej z komórkami docelowymi jako wskaźnika do oceny cytotoksyczności pośredniczonej przez współhodowane komórki CAR-T.
Jak pokazano na Rysunku 1D, pomiary wykazały, że komórki CAR-T HER2-BBz skutecznie zabijają komórki docelowe, niezależnie od tego, czy atmosfera była normoksyczna, czy hipoksyczna. W przeciwieństwie do nich, komórki CAR-T HER2-BBz-ODD wykazały znacznie słabszą cytotoksyczność w warunkach normoksji dla wszystkich trzech badanych stosunków E:T. Jednak ich cytotoksyczność uległa znacznemu zwiększeniu po wystawieniu na warunki hipoksji. Po 24 h współhodowli komórek CAR-T z komórkami docelowymi metodą ELISA zmierzono również poziomy IL-2 i IFN-γ w supernatancie. Dla obu cytokin w przypadku komórek CAR-T HER2-BBz-ODD zaobserwowano wyższą sekrecję przy 1% O2 w porównaniu do 21% O2, co jest zgodne z danymi dotyczącymi cytotoksyczności. Z kolei komórki CAR-T HER2-BBz wykazały niższą sekrecję obu cytokin przy 1% O2 w porównaniu do 21% O2, co wskazuje na niekorzystny wpływ hipoksji na aktywność komórkową (Rysunek 1E). Podsumowując, wyniki te przekonująco potwierdziły wrażliwość HER2-BBz-ODD CAR na hipoksję.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Konstrukcja i charakterystyka komórek CAR-T wrażliwych na hipoksję. (A) Schematyczne przedstawienie projektów CAR wrażliwego na hipoksję, HER2-BBz-ODD, oraz jego konwencjonalnego odpowiednika, HER2-BBz. Oba CAR składają się z N-końcowego peptydu sygnałowego CD8α, znacznika FLAG, ludzkiego scFv celującego w HER2, zawiasu i domeny transbłonowej CD8 oraz części wewnątrzkomórkowej obejmującej domenę kostymulującą 4-1BB, domenę sygnałową CD3ξ, IRES i EGFP. HER2-BBz-ODD różni się od HER2-BBz fuzją domeny ODD z C-końcem domeny sygnałowej CD3ξ, co umożliwia zależną od hipoksji ekspresję poprzez promowanie degradacji zależnej od ubikwityny w warunkach normoksji. (B,C) Ocena ekspresji CAR HER2-BBz-ODD zależnej od poziomu tlenu. (B) Jedna ocena została przeprowadzona na ludzkich komórkach CAR-T pochodzących z PBMC po hodowli w 1% lub 21% O2 przez 24, 48 lub 72 h przy użyciu cytometrii przepływowej. (C) Druga ocena dotyczyła transdukowanych CAR komórek T Jurkat, w których lizaty komórkowe pobrano 24 h po hodowli w 21% O2, 50 lub 200 µM CoCl2 lub 1% O2 i analizowano ekspresję CAR za pomocą western blottingu, przy uwzględnieniu komórek transdukowanych CAR HER2-BBz jako kontroli. (D,E) Cytotoksyczność in vitro i sekrecja cytokin przez komórki CAR-T w różnych warunkach tlenowych. (D) Komórki CAR-T współhodowano z komórkami SKOV3 wykazującymi ekspresję lucyferazy świetlikowej przy wskazanych stosunkach E:T w 1% lub 21% O2. Po 24 h współhodowli określono efektywność zabijania komórek docelowych poprzez pomiar zmiany aktywności lucyferazy świetlikowej związanej z komórkami w stosunku do komórek z nietransdukowanymi komórkami T. (E) Nadnadkrytki zebrano w celu wykrycia wydzielanych IL-2 i IFN-γ. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3 zdrowych dawców) (****p &#60; 0.0001). Skróty: scFv = jednocząstkowy fragment zmienny przeciwciała; CAR = chimeryczny receptor antygenowy. Panele C i D zostały zaadaptowane z Liao et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy protokół generowania i funkcjonalnej weryfikacji wrażliwych na niedotlenienie komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T. Protokół ten przedstawia generację wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T opartą na lentiwirusie i ich charakterystykę, w tym walidację zależnej od hipoksji ekspresji CAR i selektywnej cytotoksyczności.

Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Extensive studies have proven the promise of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy in treating hematological malignancies. However, treating ...

Nasze badania koncentrują się przede wszystkim na immunoterapii nowotworów, w szczególności na immunoterapii opartej na limfocytach T CAR. W ciągu ostatnich 10 lat badaliśmy nowe strategie, aby umożliwić limfocytom T CAR specyficzne celowanie w guz przy minimalizacji skutków ubocznych lub nawet braku skutków ubocznych. Nieustannie badano nowatorskie strategie mające na celu poprawę bezpieczeństwa i skuteczności immunoterapii opartej na limfocytach T CAR, w szczególności poprzez celowanie w mikrośrodowisko guza, takie jak CAR kondycjonowany hipoksją, czego przykładem jest niniejszy protokół.Co ciekawe, ostatnie badania wykazały, że CAR T w warunkach niedotlenienia nie tylko znacznie poprawił profil bezpieczeństwa, ale także zmniejszył wyczerpanie CAR T i zwiększył skuteczność w guzach litych. Niedotlenienie jest charakterystyczną cechą mikrośrodowiska guza. Nasze badania mają na celu pomóc naukowcom zajmującym się immunoterapią nowotworów w zrozumieniu koncepcji limfocytów T CAR wrażliwych na niedotlenienie, ich budowy oraz sposobu tworzenia modeli hipoksji do oceny.Nasze laboratorium będzie nadal badać nowe strategie konstruowania limfocytów T CAR w celu zwiększenia ich skuteczności leczenia nowotworu, profilu bezpieczeństwa i opłacalności.

generation-functional-verification-hypoxia-sensitive-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Ten protokół opisuje proces transdukcji pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą interesującego genu, zapewniając zgodność ze standardami Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP).

Zgodna z GMP procedura wytwarzania limfocytów T modyfikowanych genetycznie

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Aneuploidia prowadzi do niestabilności genomu, co ostatecznie prowadzi do powstania komórek o skomplikowanych kariotypach. W artykule przedstawiono prostą i wygodną metodę izolowania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które przestają się dzielić.

Wytwarzanie i izolacja komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami

Poznaj metodę generowania wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Protokół ten pozwala badać selektywną cytotoksyczność w warunkach hipoksji w mikrośrodowisku nowotworowym.

Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Przeglądaj więcej filmów