Name: Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę generowania wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Protokół ten pozwala badać selektywną cytotoksyczność w warunkach hipoksji w mikrośrodowisku nowotworowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (2016YFC1303402), Narodowego Megaprojektu Kluczowych Chorób Zakaźnych (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) oraz Programu Ogólnego Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (201740194).

W niniejszym badaniu HER2-BBz-ODD, wrażliwy na hipoksję CAR nakierowany na HER2 (Gene ID: 2064), został porównany z jego standardowym odpowiednikiem, HER2-BBz. Schematy obu CAR przedstawiono na Rysunku 1A, który pokazuje, że HER2-BBz-ODD pochodzi z HER2-BBz poprzez dodanie sekwencji ODD do końca C-terminalnego CD3ξ. Konstrukcja wektorów lentiwirusowych ekspresujących oba CAR oraz generowanie odpowiedniego lentiwirusa poprzez transfekcję komórek 293T zostały opisane wcześniej31.
1. Generowanie komórek CAR-T wrażliwych na hipoksję poprzez infekcję lentiwirusową
<ol>
	<li>Szybko rozmroź kriokonserwowane ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś rozmrożone PBMCs do probówki 15 mL zawierającej 9 mL bezserwatkowej pożywki do hodowli limfocytów uzupełnionej o 400 IU IL-2, 5&#160;ng/mL IL-7 oraz 10 ng/mL IL-15 (pożywka do wzrostu ludzkich limfocytów T, w dalszej części określana jako TGM).</li>
	<li>Po pobraniu alikwotu do policzenia komórek, odwiruj probówkę przy 300 × g przez 5 min. Resuspenduj osad PBMCs w TGM do gęstości 4 × 106 komórek/mL i przenieś zawiesinę do płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Przygotuj immunikule powlekane przeciwciałami anty-hCD3/hCD28.
	<ol>
		<li>Przenieś 100 µL magnetycznych kulek z IgG mysim do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przemyj je 2 razy&#160;przy użyciu statywu magnetycznego w PBS.</li>
		<li>Resuspenduj kulki w 100 µL PBS i dodaj 0,2 µg przeciwciała mysiego anty-Human CD3 oraz 2 µg przeciwciała mysiego anty-Human CD28. Delikatnie wymieszaj zawiesinę pipetą i inkubuj na wytrząsac revealingu przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyj kulki 2 razy&#160;przy użyciu statywu magnetycznego w PBS i resuspenduj je w 100 µL PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj immunikule powlekane anty-hCD3/hCD28 do płytki z kroku 1.2 w stosunku kulek do komórek 1:1. Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 48 h inkubacji, delikatnie wymieszaj komórki pipetą i przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL. Umieść probówkę na statywie magnetycznym przez 3 min, a następnie ostrożnie przenieś nadsącz do nowej probówki 15 mL, aby oddzielić immunikule od PBMCs.</li>
	<li>Pobierz alikwot do policzenia komórek, a następnie wysiej PBMCs w gęstości 5 × 105 komórek/dołek w 300 µL TGM do płaskiej płytki 48-dołkowej. Do odpowiednich dołków dodaj 200 µL zapasu lentiwirusa oraz siarczan protaminy do stężenia końcowego 10 µg/mL.</li>
	<li>Odwiruj płytkę przy 1 000 × g w temperaturze 32 °C przez 1,5 h, a następnie ostrożnie usuń pipetą 300 µL nadsączu z każdego dołka. Następnie dodaj 1 mL świeżej TGM za pomocą pipety i umieść płytkę w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Co 2-3 dni dodawaj świeżą TGM, aby dostosować gęstość komórek do poziomu 0,5-2 × 106 komórek/mL. Zacznij od przeniesienia komórek najpierw do płytki 12-dołkowej, a następnie do płytki 6-dołkowej. Kontynuuj hodowlę komórek, aż całkowita liczba osiągnie 6 × 106 w objętości 4 mL. 
	UWAGA: Równolegle przeprowadź transdukcję CAR limfocytów T Jurkat zgodnie z opisanymi powyżej procedurami, z wyjątkiem tego, że TGM zastępuje się pożywką RPMI1640 zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
</ol>
2. Ocena ekspresji CAR zależnej od tlenu w komórkach CAR-T przy użyciu cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przenieś CAR-transdukowane limfocyty T z kroku 1.8 do dwóch płytek 12-dołkowych w gęstości 2,5 × 106 komórek/dołek w 2 mL TGM. Jedną płytkę umieść bezpośrednio w uwilgotnionym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C (warunki normoksji, ponieważ standardowe warunki hodowli komórek obejmują 21% O2), a drugą płytkę umieść w mobilnej komorze inkubacyjnej CO2/O2/N2 z ustawionym poziomem O2 na 1% (warunki hipoksji), a następnie umieść komorę w uwilgotnionym inkubatorze z 5% CO2/94% N2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Co 24 h zbieraj 5 × 105 komórek z płytek w warunkach hipoksji lub normoksji do probótek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Wirować probótki przy 500 × g przez 5 min, usunąć nadosad i delikatnie resuspendować komórki w 1 mL PBS poprzez pipetowanie. Powtórz płukanie w PBS jeszcze raz.</li>
	<li>Resuspenduj osad komórkowy w 50 µL buforu FACS (PBS uzupełniony o 2% FBS) w każdej probótce. Dodaj 50 µL rozcieńczenia 1:100 przeciwciała anty-Flag sprzężonego z PE (0,2 µg/mL) i dokładnie wymieszaj poprzez pipetowanie. Inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 min.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji dodaj 1 mL buforu FACS do każdej probótki. Dokładnie wymieszaj poprzez pipetowanie, a następnie wiruj przy 500 × g przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie usuń i odrzuć nadosad za pomocą pipety i powtórz krok 2.4 jeszcze raz.</li>
	<li>Ostrożnie usuń i odrzuć nadosad za pomocą pipety. Resuspenduj komórki w 200 µL buforu FACS, a następnie przenieś otrzymaną zawiesinę komórkową do probótek przepływowych o pojemności 5 mL.</li>
	<li>Wykonaj cytometrię przepływową zawiesiny komórkowej z kroku 2.6 w celu oznaczenia ekspresji CAR na powierzchni. Jako kontrolę negatywną wykorzystaj nietransdukowane limfocyty T.
	<ol>
		<li>Użyj bram FSC/SSC oraz FSC-A/FSC-H do selekcji żywych pojedynczych komórek. Zbierz 1 × 104 żywych pojedynczych zdarzeń dla każdej próbki. Wyznacz bramkę dla komórek pozytywnych pod kątem EGFP (konstytutywnego markera zawartego w wektorze lentiwirusowym jako wskaźnika pomyślnie transdukowanych limfocytów T), a następnie dla komórek pozytywnych pod kątem fikoerytryny (PE) (komórek wykazujących ekspresję CAR), aby zmierzyć pozytywność PE oraz medianę intensywności fluorescencji (MFI).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza zależności ekspresji CAR od tlenu w zmodyfikowanych komórkach T Jurkat z CAR metodą western blot
<ol>
	<li>Przenieś CAR-transdukowane komórki T Jurkat z sekcji 1 do dwóch płytek 48-dołkowych z gęstością 5 × 105 komórek na dołek (objętość hodowli 500 µL) w pożywce RPMI1640 z dodatkiem 10% FBS.</li>
	<li>Do jednej płytki dodaj CoCl2 do dołków eksperymentalnych do końcowego stężenia 0 µM, 50 µM lub 200 µM. Następnie umieść płytkę w inkubatorze z wilgotną komorą, 5% CO2 w temperaturze 37 °C (warunki normoksji). Do drugiej płytki nie dodawaj CoCl2 i umieść ją w mobilnej komorze inkubatora CO2/O2/N2 z poziomem O2 ustawionym na 1% (warunki hipoksji) przed przeniesieniem jej do tego samego inkubatora.</li>
	<li>Po 24 h inkubacji przenieś zawiesiny komórkowe do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Centryfuguj probówki przy 500 × g przez 5 min. Całkowicie usuń i odrzuć nadsączniki, najpierw używając pipety 1-mL, a następnie pipety 100 µL, i resuspenduj osady komórkowe w 50 µL 1x buforu do próbek SDS-PAGE.</li>
	<li>Ogrzewaj próbki w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia przez 10 min. Natychmiast umieść probówkę na lodzie na 30 s, a następnie centryfuguj przy 16 000 × g przez 30 s.</li>
	<li>Nanieś 30 µL oczyszczonych próbek do każdego otworu 10% żelu SDS PAGE z 10 dołkami i grubością 1,5 mm. Prowadź elektroforezę przy 80 V przez 30 min, a następnie zwiększ napięcie do 100 V i prowadź przez 1,5 h.</li>
	<li>Po zakończeniu elektroforezy przenieś białka z żelu na membranę PVDF, stosując standardową metodę transferu mokrego, przy natężeniu prądu 400 mA i czasie transferu 1 h.</li>
	<li>Blokuj membranę w buforze blokującym (5% mleka (w/v) w PBST (PBS + 0,05% Tween-20)) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Następnie wytnij fragment między 30 kD a 40 kD do detekcji kontroli ładowania GAPDH oraz fragment między 50 kD a 70 kD do detekcji cząsteczek CAR.</li>
	<li>Inkubuj fragmenty 30-40 kD i 50-70 kD odpowiednio z mysim przeciwciałem anty-GAPDH (rozcieńczenie 1:2 000) i mysim przeciwciałem anty-Flag (rozcieńczenie 1:2 000) w 3 mL buforu blokującego, albo w temperaturze pokojowej przez 2 h, albo w 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przemywaj membrany PBST w temperaturze pokojowej na wstrząsarce platformowej 3 x 5 min.</li>
	<li>Inkubuj membrany z kozim przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z HRP (rozcieńczenie 1:5 000) w 3 mL buforu blokującego w temperaturze pokojowej przez 1 h; następnie przemyj membranę PBST 5 x 10 min.</li>
	<li>Wywołaj membrany, inkubując je z substratem HRP, a następnie zwizualizuj wykryte prążki białkowe za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazu.</li>
</ol>
4. Ocena in vitro zależności cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki CAR-T wrażliwe na hipoksję od poziomu tlenu
<ol>
	<li>W dniu 0 wysiać 1 × 104 komórek docelowych (komórki SKOV3-Luc) na studzienkę eksperymentalną w 200 µL pożywki DMEM zawierającej 10% FBS w dwóch czarnych 96-dołkowych płytkach hodowlanych z płaskim dnem.</li>
	<li>W dniu 1 ostrożnie usunąć 100 µL supernatantu z górnej części każdej studzienki. Dodać komórki CAR-T lub nieprzetransformowane komórki T w stosunkach efektor do celu 1:1, 2:1 i 4:1 w 100 µL pożywki DMEM zawierającej 10% FBS.</li>
	<li>Jedną płytkę umieścić w atmosferze 21% O2&#160;, a drugą w atmosferze 1% O2&#160; przy użyciu mobilnej komory inkubacyjnej CO2/O2/N2, zgodnie z opisem w kroku 2.1. 
	UWAGA: W przypadku braku mobilnej komory inkubacyjnej CO2/O2/N2, w celu symulacji warunków hipoksji można zastosować dodatek CoCl2 do pożywki hodowlanej.</li>
	<li>W dniu 2, po 24 h kokultury, ostrożnie przenieść cały supernatant (około 150-200 µL) do nowej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U za pomocą pipety. Przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej detekcji cytokin, zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 5.</li>
	<li>Do każdej studzienki eksperymentalnej czarnych 96-dołkowych płytek z płaskim dnem z kroku 4.4 dodać 60 µL 1x buforu do lizy pasywnej. Następnie umieścić płytki na wytrząsarce i inkubować przez 30 min w celu zapewnienia efektywnej lizy komórek.</li>
	<li>Do każdej studzienki eksperymentalnej dodać 60 µL substratu lucyferazy świetlikowej i natychmiast zmierzyć aktywność lucyferazy za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Obliczyć znormalizowaną cytotoksyczność (%) korzystając z równania (1): 
	Znormalizowana cytotoksyczność (%) = 100 - <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;" /> ×100&#160; &#160; (1)</li>
</ol>
5. Wykrywanie sekrecji IL-2 i IFN-γ przez komórki CAR-T wrażliwe na hipoksję
<ol>
	<li>W dniu 0 przygotować rozcieńczenie 1:250 przeciwciała wychwytującego IL-2 lub IFN-γ w buforze do powlekania. Do każdej studni płytki ELISA do 96 próbek dodać 100 µL rozcieńczonego przeciwciała i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Bufor do powlekania przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 7,13 g NaHCO3 i 1,59 g Na2CO3 w 1 L wody destylowanej i dostrojenie pH do 9,5.</li>
	<li>W dniu 1 usunąć niezaabsorbowane przeciwciało wychwytujące poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 3x za pomocą 200 µL buforu do mycia (PBS zawierający 0,05% Tween 20).</li>
	<li>Do każdej studni dodać 200 µL rozcieńczalnika do analizy (PBS zawierający 10% FBS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.</li>
	<li>Usunąć roztwór poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 3x za pomocą 200 µL buforu do mycia.</li>
	<li>Rozmrozić w temperaturze pokojowej mrożone próbki supernatantu/płytkę z kroku 4.4. Po całkowitym rozmrożeniu rozcieńczyć próbki i standardy rozcieńczalnikiem do analizy. Do każdej studni powlekanej płytki ELISA dodać 100 µL rozcieńczonych próbek lub standardów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 h. 
	UWAGA: W przypadku detekcji IL-2 zaleca się 10-krotne rozcieńczenie, natomiast dla detekcji IFN-γ preferowane jest 50-krotne rozcieńczenie.</li>
	<li>Usunąć próbki i standardy poprzez energiczne odwrócenie płytki do góry dnem, a następnie przemyć studnie 5x za pomocą 200 µL buforu do mycia na studnię.</li>
	<li>Przygotować roboczy roztwór detekcyjny, rozcieńczając przeciwciało detekcyjne IL-2 lub przeciwciało detekcyjne IFN-γ/streptawidynę-HRP (SAv-HRP) w stosunku 1:250 w rozcieńczalniku do analizy. Do każdej studni dodać 100 µL roboczego roztworu detekcyjnego i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 h przy łagodnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Usunąć roztwór i przemyć studnie 7x za pomocą 200 µL buforu do mycia.</li>
	<li>Do każdej studni dodać 100 µL odczynnika substratowego i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 min w ciemności.</li>
	<li>Do każdej studni dodać 50 µL roztworu zatrzymującego (1 M H2SO4). Bezzwłocznie zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikroplatek.</li>
</ol>

Functional Validation of Hypoxia-Sensitive CAR-T Cells for Selective Tumors

<ol><li>Boardman, A. P., Salles, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+in+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma.</a> Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).</li>
<li>Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T%3A+What+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CAR-T: What is next.</a> Cancers. 15 (3), 663(2023).</li>
<li>Barsan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+utilisation+and+outcomes+across+refractory%2C+first+relapse+and+multiply+relapsed+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+retrospective+analysis+of+real-world+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22eClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns.</a> eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+delivery+of+dual+CAR+targets+of+CD19+and+BCMA+as+well+as+immunomodulators+to+enhance+therapeutic+efficacy+in+solid+tumors+combined+with+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy.</a> Front Oncol. 12, 1037934(2022).</li>
<li>Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speed+and+location+both+matter%3A+Antigen+stimulus+dynamics+controls+CAR-T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response.</a> Front Immunol. 12, 748768(2021).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+anti-solid+tumor+efficacy+of+CAR-T+cells+by+inhibiting+adenosine+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).</li>
<li>Derenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+strategies+to+enhance+CAR+T+cell+persistence+for+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors.</a> Front Immunol. 10, 218(2019).</li>
<li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+techniques+for+enhancing+CAR+T+cell+therapy+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors.</a> Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).</li>
<li>Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+immunosuppression%3A+A+roadblock+to+CAR+T-cell+advancement+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors.</a> Cells. 11 (22), 3626(2022).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+tumor+immune+microenvironment+and+its+optimization+from+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy.</a> Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+physical+microenvironment+for+fueling+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).</li>
<li>Martinez, M., Moon, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+for+solid+tumors%3A+New+strategies+for+finding%2C+infiltrating%2C+and+surviving+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment.</a> Front Immunol. 10, 128(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunosuppressive+microenvironment+and+immunotherapy+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma.</a> Front Immunol. 13, 1003651(2022).</li>
<li>Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+cells+in+cancer%3A+Mechanisms+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR+T+cells+for+enhanced+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety.</a> APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).</li>
<li>Al-Haideri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+combination+therapy%3A+The+next+revolution+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment.</a> Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).</li>
<li>Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+chimeric+antigen+receptor+T-cell+efficacy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+-+assessment+and+management+of+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities.</a> Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).</li>
<li>Mi, J., Ye, Q., Min, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+nanotechnology+development+to+overcome+current+roadblocks+in+CAR-T+therapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors.</a> Front Immunol. 13, 849759(2022).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+Current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+Safety+strategies+to+overcome+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity.</a> Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+Early+successes+in+blood+cancer+and+challenges+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors.</a> Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).</li>
<li>Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+to+overcome+current+challenges+in+multiple+myeloma+CAR+T-cell+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment.</a> Front Oncol. 10, 1362(2020).</li>
<li>Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+next-generation+car-t+cells+for+better+toxicity+management%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management.</a> Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).</li>
<li>Flugel, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+on-target%2C+off-tumour+toxicity+of+CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).</li>
<li>Rababah, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+therapy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors.</a> Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).</li>
<li>Masoud, G. N., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif-1alpha+pathway%3A+Role%2C+regulation+and+intervention+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy.</a> Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+hif-1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting hif-1 for cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia--a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).</li>
<li>Juillerat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+sensitive+self-decision+making+engineered+CAR+T-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell.</a> Sci Rep. 7, 39833(2017).</li>
<li>Liao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+T+cells+with+hypoxia-inducible+chimeric+antigen+receptor+%28HiCAR%29+for+selective+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing.</a> Biomark Res. 8 (1), 56(2020).</li>
<li>Ivan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif%CE%B1+targeted+for+vhl-mediated+destruction+by+proline+hydroxylation%3A+Implications+for+o2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing.</a> Science. 292 (5516), 464-468 (2001).</li>
<li>Wang, G. L., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).</li>
<li>D'alonzo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+preclinical+tumor+hypoxia+imaging+methods%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review.</a> Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+car-t+cells+by+hypoxia-inducible+transcription+amplification+%28hita%29+system+significantly+enhances+systemic+safety+and+retains+antitumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy.</a> J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).</li>
<li>Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+hypoxia-mediated+escape+from+adaptive+immunity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells.</a> Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).</li>
<li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+metabolism%3A+Cancer%27s+achilles%27+heel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel.</a> Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Obawy dotyczące bezpieczeństwa są istotnymi kwestiami, które należy rozwiązać, aby jakakolwiek terapia komórkami CAR-T mogła przejść do użytku klinicznego. Wykorzystanie unikalnych właściwości komórek nowotworowych lub TME stało się głównym kierunkiem badań koncentrujących się na rozwoju komórek CAR-T, które selektywnie atakują tkanki nowotworowe. Zaprojektowanie wrażliwego na niedotlenienie CAR-T jest atrakcyjną strategią w tym kierunku, z kilkoma badanymi podejściami, w tym tym tym przedstawionym w tym badaniu - fuzją ...

Terapia limfocytami T z wykorzystaniem chimerycznego receptora antygenowego (CAR-T) stanowi znaczący przełom w leczeniu raka. Odkąd Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła pierwszą terapię CAR-T do leczenia zaawansowanego/opornego chłoniaka i ostrej białaczki limfoblastycznej w 2017 roku1,2,3, 10 terapii CAR-T ukierunkowanych na CD19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA) otrzymało zatwierdzenie na całym świecie4. Jednak pomimo szeroko zakrojonych badań, odtworzenie niezwykłej skuteczności terapii CAR-T w leczeniu nowotworów hematologicznych pozostaje wyzwaniem ze względu na jej zastosowanie w guzach litych5,6,7,8.
Immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do słabej skuteczności CAR-T w leczeniu guzów litych. TME utrudnia aktywność i przetrwanie komórek CAR-T z powodu niewystarczającej ilości składników odżywczych, niedotlenienia, kwaśnego pH i nagromadzenia odpadów metabolicznych9,10,11,12. Dalsza wrogość wynika z infiltracji komórek immunosupresyjnych, takich jak limfocyty T regulatorowe (Treg), komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC) i makrofagi związane z nowotworem (TAM), które wraz z komórkami nowotworowymi wydzielają cytokiny immunosupresyjne, które powodują dodatkowe hamowanie komórek CAR-T po wejściu do guza13,14.
Oprócz niezadowalającej skuteczności terapeutycznej, kwestie bezpieczeństwa są kolejną piętą achillesową komórek CAR-T w przypadku guzów litych15,16. Obawy dotyczące bezpieczeństwa wynikają z faktu, że żaden z dotychczas zidentyfikowanych antygenów specyficznych dla nowotworu (TSA) nie jest ściśle ograniczony do komórek nowotworowych. Innymi słowy, antygeny związane z nowotworem (TAA) wybrane jako cel CAR, chociaż wykazują wyższą ekspresję w komórkach nowotworowych, często są również wyrażane przez normalne tkanki17. Nieoczekiwana aktywacja komórek CAR-T po skutecznym rozpoznawaniu normalnych tkanek przez CAR może zatem powodować efekty pozanowotworowe, co prowadzi do zespołu uwalniania cytokin (CRS), zespołu encefalopatii związanej z CAR-T (CRES)18 i innych niekorzystnych wyników19.
Rozważano wiele strategii unikania takich efektów, w tym zmniejszenie powinowactwa CAR, aby umożliwić komórkom CAR-T odróżnianie komórek nowotworowych od normalnych komórek na podstawie poziomów ekspresji docelowego TAA; wyposażenie komórek CAR-T w wyłącznik, taki jak gen samobójczy lub marker eliminacji, aby promować ich eliminację po nieoczekiwanej aktywacji; podział sygnałów CD3ζ i sygnałów kostymulujących na dwie grupy CAR, których równoczesne zaangażowanie jest w związku z tym wymagane do skutecznej aktywacji komórek CAR-T; wykorzystując syntetyczny obwód oparty na Notch (synNotch), który ogranicza aktywność komórek CAR-T do komórek docelowych wykazujących współekspresję dwóch różnych TAA; oraz inżynieria komórek CAR-T w celu osiągnięcia czułości TME poprzez implementację mechanizmu dostrajania ekspresji CAR do zmieniających się sygnałów środowiskowych20,21,22,23,24,25,26.
Kluczowym czynnikiem w opcji czułości TME opisanej powyżej jest niski poziom tlenu w TME spowodowany szybką proliferacją komórek nowotworowych. Akomodacja komórek nowotworowych do niedotlenienia zależy od aktywacji czynnika indukowanego hipoksją-1 (HIF-1), heterodimerycznego czynnika transkrypcyjnego składającego się z indukowalnej podjednostki, HIF-1α i konstytutywnie wyrażonej podjednostki, HIF-1β27. W warunkach normoksyjnych białko HIF-1α ulega ubikwitynacji i szybkiej degradacji proteasomalnej, w zależności od jego zależnej od tlenu domeny degradacji (ODD)28. Kiedy komórkowy dopływ tlenu staje się ograniczony, HIF-1 jest stabilizowany i aktywuje transkrypcję swoich dalszych genów docelowych poprzez wiązanie się z elementami odpowiedzi na niedotlenienie (HRE)29. Biorąc pod uwagę naturę ODD i HRE jako elementów wrażliwych na tlen, zbadano je w celu realizacji warunkowej ekspresji CAR w hipoksyjnym TME30. W tym miejscu przedstawiamy protokół skupiający się na metodach charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T, poprzedzony krótkim opisem konstrukcji CAR i procedur przygotowania tych komórek. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do wykorzystania CAR reagującego na niedotlenienie do generowania komórek CAR-T o ograniczonej toksyczności poza guzem.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml Probówka wirówkowa</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>Supernatanty i cellekcja komórek Protokół Krok 2,3,4</td></tr><tr><td>10% ExpressCast STRONA</td><td>NCM biotech</td><td>P2012</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM biotech</td><td>20220812</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Pipeta 10 ml</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>Pipetowanie Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>10xTRIS-Glycine-SDS bufor do elektroforezy</td><td>Epizyme</td><td>3673020</td><td>Immunoblotting Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Supernatanty i cellekcja komórek Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>25 cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 3,4</td></tr><tr><td>4x Białko SDS PAGE Bufor ładujący</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>Protokół immunoblottingu Krok 3</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkanek płaskodennych</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>T Cell Culture Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>96-dołkowe czarne płaskodenne płytki do hodowli tkankowych</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Test cytotoksyczności Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki ELISA</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>Protokół ELISA Krok 5</td></tr><tr><td>96-dołkowa wytrząsarka do płytek</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>Shake Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z dnem w kształcie litery U</td><td>Thermo Scientific</td><td>268200</td><td>Supernatants cellection Protokół Krok 4,5</td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>Immunoblotting Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>Karbinol</td><td>Protokół Sinopharm</td><td>10010061</td><td>Immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Inkubator dwutlenku węgla</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,2,3,4</td></tr><tr><td>Płytka do liczenia komórek</td><td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>Zliczanie komórek Protokół Krok 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan Mouse IgG Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>Koraliki magnetyczne Mouse IgG Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,3,4</td></tr><tr><td>System obrazowania żelem chemiluminescencyjnym</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku kobaltu (0,5 M)</td><td>bioleaper</td><td>BR4000203</td><td>Stan niedotlenienia Protokół Krok 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103- CV</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Sartorius</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>ważenie Protokół Krok 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 3,4</td></tr><tr><td>GAPDH MAb myszy</td><td>ABklonalny</td><td>AC002</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy żelowej</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>Protokół immunoblottingu Krok 3</td></tr><tr><td>Czytniki mikropłytek GloMax</td> Pomiar aktywności lucyferazy <td>Promega</td><td>GM3000</td><td> Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Yeasen</td><td>P1126151</td><td>Immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Wirówka do mikrozamrażania o dużej prędkości</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp; R</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Ludzki IFN-&gamma; Zestaw ELISA</td><td>BD</td><td>555142</td><td>ELISA Protokół Krok 5 Pozycje: Rekombinowany ludzki IFN-&gamma; Liofilizowany standardowy, wykrywający przeciwciało biotyny anty-ludzkiej IFN-&gamma; , Oczyszczony anty-ludzki IFN-&gamma odczynnik do wychwytywania przeciwciał, koniugat enzymatyczny Streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (SAv-HRP)</td></tr> <tr><td>Ludzki zestaw testów ELISA IL-2</td><td>BD</td><td>555190</td><td>ELISA Krok protokołu 5 Elementy: Rekombinowany ludzki liofilizowany wzorzec IL-2, przeciwciało wykrywające biotyna anty-ludzka IL-2, przeciwciało wychwytujące oczyszczone anty-ludzkie IL-2, odczynnik enzymatyczny koniugat streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>R& Systemy D</td><td>P40933</td><td>Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CC45</td><td>Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& Systemy D</td><td>P13232</td><td>Hodowla limfocytów T Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>CAR-Jurkat construction Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>Cytometria przepływowa Protokół Krok 2</td></tr><tr><td>System</td> <td>oznaczania lucyferazyTest reporterowy lucyferazy Promega</td><td>E1501</td><td> Protokół Krok 4 Przedmioty: Pasywny bufor do lizyzy, substrat lucyferazy świetlika</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Protokół BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA Krok 5</td></tr><tr><td>mobilny CO2/O2/N2 Komora inkubatora</td> China <td>Innovation Instrument Co., Ltd.</td><td>Smartor118</td><td>Stan niedotlenienia Protokół Krok 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Hexa Histidine tag</td><td>Sigma</td><td>SAB2702218</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>Bufor szybkiego transferu NcmBlot</td><td>NCM biotech</td><td>WB4600</td><td>Immunoblotting</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM biotech</td><td>P10300</td><td>Protokół immunoblottingu Krok 3 Elementy: Odczynnik NcmECL Ultra Luminol/Enhancer (A), Ultra stabilizowany odczynnik nadtlenkowy NcmECL (B)&nbsp;</td></tr><tr><td>Powlekane NovoNectin 48-dołkowe płaskie płytki</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CH38</td><td>Budowa komórek CAR-T Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Zestaw tabletek OPD (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy)</td><td>Sigma</td><td>P9187</td><td>Odczynnik substratowy Protokół Krok 5 Przedmioty: Tabletka OPD (srebrna folia), tabletka nadtlenku wodoru mocznika (złota folia)</td></tr> <tr><td>Anty-DYKDDDDK anty-sprzężony z PE</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>Cytometria przepływowa Protokół Krok 2</td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma</td><td>P3369-1OG</td><td>Zakażenie lentiwirusem Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Marker białkowy 10 Kda-250 KDa</td><td>Epizyme</td><td>WJ102</td><td>Immunoblotting Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>&nbsp; Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>566685</td> Protokół hodowli <td>limfocytów T Krok 1</td></tr><tr><td>Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td>Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>168627</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 3</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>Protokół immunoblottingu Krok 3</td></tr><tr>Test cytotoksyczności<td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td> Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>NCM biotech</td><td>C125C1</td><td>Hodowla komórkowa Protokół Krok 4</td></tr><tr><td>Animacja 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Protokół immunoblotting Krok 3 Łaźnia</td></tr><tr><td>wodna</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>Heating Protokół Krok 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>Pożywka do hodowli limfocytów bez surowicy Protokół Krok 1</td></tr></tbody></table>

generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek t receptora antygenowego

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

Obszerne badania dowiodły obietnicy terapii komórkami T (Car-T) z chimerycznym receptorem antygenowym w leczeniu nowotworów hematologicznych. Jednak leczenie guzów litych pozostaje wyzwaniem, czego przykładem są obawy dotyczące bezpieczeństwa, które pojawiają się, gdy komórki CAR-T atakują normalne komórki wykazujące ekspresję docelowych antygenów. Naukowcy badali różne podejścia mające na celu zwiększenie selektywności nowotworów w terapii komórkami CAR-T. Jedną z reprezentatywnych strategii w tej linii jest budowa wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T, które są zaprojektowane przez fuzję zależnej od tlenu domeny degradacji z ugrupowaniem CAR i są opracowane tak, aby osiągnąć wysoką ekspresję CAR tylko w niedotlenionym środowisku - mikrośrodowisku guza (TME). W pracy przedstawiono protokół generowania takich komórek CAR-T i ich charakterystykę funkcjonalną, w tym metody analizy zmian ekspresji CAR i zdolności zabijania w odpowiedzi na różne poziomy tlenu ustalone przez mobilną komorę inkubatora. Oczekuje się, że skonstruowane komórki CAR-T wykażą ekspresję CAR i cytotoksyczność w sposób wrażliwy na tlen, wspierając w ten sposób ich zdolność do odróżniania niedotlenionych TME od normalnych tkanek normoksyjnych w celu selektywnej aktywacji.

Połączenie domeny ODD białka HIF-1α z częścią CAR stanowi główną strategię generowania CAR wrażliwego na hipoksję. Analizowany w niniejszym badaniu CAR skierowany przeciwko HER2, wrażliwy na hipoksję i nazwany HER2-BBz-ODD, został skonstruowany przy użyciu tej strategii poprzez zintegrowanie sekwencji ODD z konwencjonalnym HER2-BBz (Rysunek 1A). W badaniu tym zastosowano transdukcję lentiwirusową w celu ekspresji CAR HER2-BBz-ODD lub CAR HER2-BBz, a następnie zbadano ich wrażliwość na tlen w...

Tutaj prezentujemy protokół generowania i funkcjonalnej weryfikacji wrażliwych na niedotlenienie komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T. Protokół ten przedstawia generację wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T opartą na lentiwirusie i ich charakterystykę, w tym walidację zależnej od hipoksji ekspresji CAR i selektywnej cytotoksyczności.

Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Extensive studies have proven the promise of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy in treating hematological malignancies. However, treating ...

Nasze badania koncentrują się przede wszystkim na immunoterapii nowotworów, w szczególności na immunoterapii opartej na limfocytach T CAR. W ciągu ostatnich 10 lat badaliśmy nowe strategie, aby umożliwić limfocytom T CAR specyficzne celowanie w guz przy minimalizacji skutków ubocznych lub nawet braku skutków ubocznych. Nieustannie badano nowatorskie strategie mające na celu poprawę bezpieczeństwa i skuteczności immunoterapii opartej na limfocytach T CAR, w szczególności poprzez celowanie w mikrośrodowisko guza, takie jak CAR kondycjonowany hipoksją, czego przykładem jest niniejszy protokół.Co ciekawe, ostatnie badania wykazały, że CAR T w warunkach niedotlenienia nie tylko znacznie poprawił profil bezpieczeństwa, ale także zmniejszył wyczerpanie CAR T i zwiększył skuteczność w guzach litych. Niedotlenienie jest charakterystyczną cechą mikrośrodowiska guza. Nasze badania mają na celu pomóc naukowcom zajmującym się immunoterapią nowotworów w zrozumieniu koncepcji limfocytów T CAR wrażliwych na niedotlenienie, ich budowy oraz sposobu tworzenia modeli hipoksji do oceny.Nasze laboratorium będzie nadal badać nowe strategie konstruowania limfocytów T CAR w celu zwiększenia ich skutecznośc

generation-functional-verification-hypoxia-sensitive-chimeric-antigen

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Aneuploidia prowadzi do niestabilności genomu, co ostatecznie prowadzi do powstania komórek o skomplikowanych kariotypach. W artykule przedstawiono prostą i wygodną metodę izolowania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które przestają się dzielić.

Wytwarzanie i izolacja komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Poznaj metodę generowania wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Protokół ten pozwala badać selektywną cytotoksyczność w warunkach hipoksji w mikrośrodowisku nowotworowym.

Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Przeglądaj więcej filmów