Name: Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T12:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Poznaj model myszy do badania przedwczesnych porodów wywołanych wznoszącą się infekcją bakteryjną pochwy. Metoda umożliwia analizę zachorowalności i śmiertelności noworodków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Escherichia coli K1 A192PP-luxABCDE został uprzejmie podarowany przez profesora Petera Taylora z University College London. Rysunek 1 i Rysunek 3 zostały stworzone w BioRender.com. Badania te zostały wsparte przez Wellcome Clinical Research Career Development Fellowship 222970/Z/21/Z (N.S.), Action Medical Research oraz grant Borne GN2647 (N.S., S.N.W. i D.P.); oraz grant na dobrostan kobiet RG2365 (A.K.B., N.S., M.H., S.N.W. i D.P.).

Autorzy nie mają żadnych istotnych ujawnień.

Tutaj opisujemy indukcję nowego modelu mysiego przedwczesnego porodu i noworodkowej zachorowalności poprzez bakteryjną ascensję pochwy. Wybraliśmy E. coli K1, ponieważ jest to częsta przyczyna sepsy noworodkowej i zapalenia opon mózgowych, a następnie jest pionowo przenoszona z matki na płód 38,39,40. Kluczem do sukcesu tego modelu jest zastosowanie żelu termosensulnego plurona, który zapobiega wyciekowi zawiesiny bakteryjnej z pochwy, umożliwiając rozprzestrzenianie się infekcji do macicy. Ponieważ ten model wykorzystuje żywe bakterie pochodzące z izolatu sepsy, kluczowe jest uważne monitorowanie tam. Jeśli zwierzęta odmawiają ruchu lub jedzenia lub nie dbają o swoje szczenięta (np. zaniedbują gniazdowanie i karmienie), muszą być natychmiast humanitarnie złożone w ofierze.
Przeważnie objawy związane z infekcją ustępują w ciągu 24 godzin od porodu. Ważne jest również, aby pamiętać, że różne serotypy E. coli i innych szczepów bakterii mają różny wpływ na długość ciąży, zakres infekcji/stanu zapalnego oraz wyniki neonatologiczne. Sugerujemy przeprowadzenie wstępnych eksperymentów dawkowych z różnymi CFU przy użyciu nowych serotypów/szczepów bakterii, aby określić minimalne stężenie potrzebne dla pożądanego fenotypu oraz ustalić ścisłe, humanitarne punkty końcowe, aby zapobiec cierpieniu. Należy zachować szczególną ostrożność przy dostarczaniu żywego patogenu; pozwól literaturze wskazać właściwe wykorzystanie tych organizmów przy modelowaniu infekcji wstępnej.
Szczep myszy jest również istotny, ponieważ ich układ odpornościowy różni się. Na przykład pomiar czasu i CFU użyte w tym modelu nie dają takich samych rezultatów u myszy C57BL/6. Wybraliśmy myszy C57BL/6 Tyrc-2J , ponieważ eksperymenty z przebiegiem czasu wykazały istotnie więcej infekcji w tym szczepie w porównaniu do CD-1, BALB/c i C57BL/6. Ponadto istnieją dowody na to, że sierść tłumi sygnały bioluminescencyjne, co jest użytecznym mierzalnym wynikiem w tym modelu29. Optymalny dzień ciążowy do podawania bakterii może się również różnić w zależności od patogenu i szczepu myszy. W przedklinicznych modelach PTB występuje ogromna heterogeniczność; dlatego ważne jest, aby uwzględnić te zmienne, aby uzyskać powtarzalne wyniki17.
Kolejnym czynnikiem jest długość ekspozycji zwierząt na znieczulenie. Ponieważ nadmierna ekspozycja w ciąży wiąże się z neurotoksycznością u szczeniąt, kluczowe jest ograniczenie czasu spędzonego pod narkozą do minimum (np. maksymalnie 5 minut) oraz zawsze uwzględnianie kontroli wystawionych na działanie tego samego środowiska i poddanych substancji pojazdowej 41,42,43. Dodatkowe grupy kontrolne przydatne dla tego modelu to osoby nieleczone, podawane dopochwowe wyłącznie żel pluronowy oraz wyłącznie znieczulenie.
Immunohistochemia jest szeroko wykorzystywana jako narzędzie eksperymentalne do identyfikacji różnych białek i komórek, a także może służyć do charakteryzowania struktury i łączności w mózgu. Tutaj opisujemy, jak analizować kluczowe komórki ośrodkowego układu nerwowego związane z neurozapaleniem i uszkodzeniami neurologicznymi. Przedstawiamy także metody oceny apoptozy komórkowej i barwienia histologicznego, które są przydatne do pomiaru morfologii mózgu i płuc. Ważne kwestie, które mają zapewnić sukces tych protokołów, zaczynają się od ostrożnego używania pióra PAP; jeśli pióro PAP dotknie tkanki, barwienie nie zadziała, ale jeśli parametr jest zbyt szeroki, przekroje mogą wyschnąć przez noc. Podobnie komora wilgotności musi być utrzymywać wilgotną, aby nie wysuszać sekcji.
Podczas barwienia Nissl najbardziej krytyczny jest krok kwasu octowego lodowcowego; Sekcje trzeba regularnie sprawdzać. Gdy główne struktury mózgu stają się widoczne, sekcje należy natychmiast przenieść do EtOH, aby zatrzymać reakcję. Zdecydowaliśmy się ocenić korę i hipokamp, ponieważ u ludzkich wcześniaków i innych modeli zwierzęcych zgłaszano zmniejszenie grubości kory i zmniejszonej objętości hipokampa, ale inne regiony można ocenić pod kątem zmian morfologicznych 44,45,46,47. Należy również zwrócić szczególną uwagę na rozwój barwienia DAB. Powinno to być zamierzone w czasie i utrzymywane w regularnym czasie między eksperymentami.
Analiza danych jest najczęstszym ograniczeniem immunohistochemii ze względu na trudności w ilościowym określeniu wyników, które często są uznawane za subiektywne. Chociaż analiza GFAP przeprowadza się za pomocą komputerowych pomiarów optycznej jasności, niespójne barwienia mogą wpływać na te pomiary. Ponadto oceny morfologii mózgu i płuc obejmują ręczne, odręczne pomiary, oparte na ocenie obserwatora. Aby uniknąć niespójności, powtarzamy te oceny dwukrotnie i w krótkim czasie. Aby jeszcze bardziej ograniczyć wszelkie uprzedzenia, ważne jest, aby oceniający był ślepy na grupy leczenia. Niska immunoreaktywność może być również czynnikiem ograniczającym. Brak sygnału może sugerować, że antygen jest nieobecny lub może być spowodowany awarią protokołu. Aby temu zaradzić, włączamy próbkę tkanki, która może działać jako dodatnia kontrola, gdzie to możliwe, oraz powtarzamy procedurę barwienia przy zaobserwowaniu niskiego lub brakującego sygnału, aby upewnić się, że nie był to wynik błędu eksperymentalnego.
Oprócz opisanych protokołów, analizy immunologiczne tkanek matczynej, płodowej i noworodkowej mogą być wykonywane za pomocą qPCR i ELISA. Zaobserwowaliśmy podwyższone poziomy mRNA i białka zapalnych u zwierząt narażonych nainfekcję 25,31,48. Hipotezujemy, że neuropatologia noworodkowa, którą wykazujemy histologicznie, może być wynikiem zapalenia mózgu, płuc i jelit płodu25,31. Inne badania neuropatologiczne, które przeprowadzaliśmy, obejmują białko zasadowe mieliny (MBP) do badania mielinizacji oraz NeuN do barwienia jąder neuronalnych25,31. Ponadto można ocenić inne markery neutrofilów i mikroglej, aby lepiej zrozumieć fenotyp i zachowanie tych komórek po ekspozycji na zakażenie w łonie macicy49,50. Dodatkowo można przeprowadzić testy behawioralne, aby określić długoterminowy wpływ na potomstwo.
Ten model nie jest pozbawiony ograniczeń. Na przykład obserwujemy zróżnicowanie patologii zarówno pomiędzy, jak i wewnątrz miotów. Może to być efekt użycia żywej bakterii, gdzie nie da się kontrolować rozprzestrzeniania się infekcji. W konsekwencji wzór i zasięg zakażenia wchodzącego do rogów macicy są zróżnicowane i często asymetryczne. Kolejnym ograniczeniem jest patogenność E. coli, która czasem może powodować zbyt duże chorość matek w opiece nad młodymi. Myszy nie są też najlepszym modelem urazu płuc, ponieważ alveologeneza zachodzi po urodzeniu, a nie prenatalis, jak u ludzi51. Nie napompowaliśmy tkanek płuc podczas pobierania próbek, co mogło wpłynąć na nasze wyniki. Jednak nasze wyniki są zgodne ze zmianami obserwowanymi w noworodkowych modelach BPD 52,53.
Model ten powtarza postulowaną ludzką kondycję, w której infekcja bakteryjna rozprzestrzenia się z pochwy do macicy, stymulując wczesny poród. Po naszej pierwszej publikacji tego modelu inni powielali lub stworzyli podobne modele, co dodatkowo podkreśla powtarzalność i znaczenie tej metodologii19,54. Co istotne, model ten wykazuje typowe zachorowania doświadczane przez przedwczesne noworodki, podczas gdy inne modele zawiodły. Może to wynikać z zastosowania szczepu bakteryjnego, który jest szczególnie związany z sepsą noworodkową. LPS, najczęściej stosowany do wywoływania przedwczesnego porodu w modelach zwierzęcych, jest śmiertelny dla młodych, więc wyników neonatologicznych nie można zmierzyć18. Inne modele infekcji wznoszącej również miały trudności z płodnością młodych lub wykazywaniem zachorowalności noworodkowej 19,20,21,22,23,24,55,56. Klinicznie istotne modele zwierzęce, takie jak opisany przez nas, są kluczowe dla zrozumienia patofizjologii wcześniaków oraz opracowania innowacyjnych interwencji poprawiających wyniki noworodków.

Wcześniaki (PTB; poród < 37. tygodniu) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do śmiertelności noworodków na świecie 1,2. Odpowiadając za 11% wszystkich urodzeń, jest to poważny globalny problem zdrowotny o złożonej etiologii, która jest słabo poznana, co utrudnia przewidywanie i zapobieganie 3,4,5. Noworodkowie po PTB mogą doświadczać niekorzystnych skutków neurorozwojowych, w tym porażenia mózgowego, zaburzeń układu oddechowego, takich jak dysplazja oskrzelowo-monowodła (BPD) oraz zaburzeń przewodu pokarmowego, takich jak martwicze zapalenie jelit (NEC)6,7,8. Dlatego pilnie potrzebne są klinicznie istotne, powtarzalne modele zwierzęce, które pomogą uwzględnić biologiczne szlaki przyczyniające się do PTB i opracować innowacyjne interwencje.
Istnieje wiele możliwych mechanizmów leżących u podstaw spontanicznego PTB, takich jak starzenie dziedziczątne, załamanie tolerancji matki i płodu, stres, skrócona długość szyjki macicy lub uszkodzenie szyjkimacicy 9. Jednak co najmniej 40% spontanicznych PTB jest zgłaszanych jako powiązanych z infekcją mikrobiologiczną10,11. Hipoteza się, że mikroorganizmy przemieszczające się z kanału pochwy przez szyjkę macicy do macicy są powszechnie akceptowane jako powszechna droga zakażenia ze względu na korelację między mikroorganizmami wyizolowanymi z płynu owodniowego a tymi zamieszkującymi mikrobiotę pochwy 12,13,14. Mikroorganizmy często kojarzone z przedwczesnym porodem to gatunki Mycoplasma, Ureaplasma, Fusobacterium i Streptococcus, a większość przypadków to polimikrobiologiczne15,16.
Myszy są często wykorzystywane do modelowania PTB, a najczęstszym podejściem jest podawanie bakteryjnej toksyny lipopolisacharydowej (LPS), która może być podawana drogą wewnątrzmaciczną, wewnątrzotrzewnową lub wewnątrzowodniową, aby wywołać poziom zapalny niezbędny do rozpoczęcia porodu17. Jednak LPS nie modeluje żywej infekcji mikroorganizmów, a co istotne, wyniki noworodków nie mogą być mierzone w tych modelach, ponieważ LPS powoduje śmierć płodu18. W ostatnich latach opracowano modele zwierzęce wznoszącego się zakażenia bakteryjnego pochwy, ale powtórzenie zarówno przedwczesnych porodów, jak i związanych z nimi wyników noworodkowych stanowiło wyzwanie 19,20,21,22,23,24.
Nasza grupa opracowała nowy model wspinającej się infekcji bakteryjnej pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności, który odzwierciedla patofizjologię ludzkiego PTB25. Tutaj pokazujemy, jak ocenić neuropatologię noworodków i uszkodzenia płuc u młodych narażonych na wznoszącą infekcję pochwy matki z patogennym szczepem Escherichia coli (E. coli), który został powiązany z zapaleniem opon mózgowych u ludzi u ludzi. Model ten daje wyjątkową możliwość zbadania patofizjologii infekcji wstępującej, a także umożliwia ocenę skuteczności interwencji przedwczesnych w leczeniu wyników noworodków.

<table><tbody><tr><td>Anty-GFAP, króliczku</td><td>Agilent Technologies</td><td>Z033429-2</td><td></td></tr><tr><td>Anty-IBA1, rabbit&nbsp;</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G, myszka</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td></td></tr><tr><td>Kamera AVT-Horn 184 3CCD</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-DUTP</td><td>Merck</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>Prostokątne pokrywki z borosilikatowego szkła</td><td>FisherScientific</td><td>12363128</td><td></td></tr><tr><td>Octan fioletu krezylskiego</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>405760100</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat CM1900</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklana kuweta &nbsp;</td><td>Merck</td><td>BR472700</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzydyna (DAB)</td><td>Generon</td><td>40480004-3</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do rozcinania, stal nierdzewna, 10 cm, ząbkowane, zakrzywione</td><td>World Precision Instruments Ltd</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do rozcinania, stal nierdzewna, 10 cm, ząbkowane, proste</td><td>World Precision Instruments Ltd</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do sekcji, 10 cm długości, proste</td><td>World Precision Instruments Ltd</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>DPX&nbsp;</td><td>Merck</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 4% buforowany</td><td>Merck</td><td>100496</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw IgG dla kóz (H+L), biotinylowane</td><td>Laboratoria Vector</td><td>BP-9100-50</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw IgG dla kóz (H+L), biotynowo</td><td>Laboratoria Vector</td><td>BA-9400-1.5</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.8&nbsp;</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (IsoFlo)</td><td>Zoetis</td><td>50019100</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II System obrazowania in vivo/Oprogramowanie do obrazów żywych</td><td>Perkin Elmer/Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroslajdy</td><td>VWR</td><td>ISO8037/I</td><td></td></tr><tr><td>Optimas 6.51&nbsp;</td><td>Media Cybernetics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS) &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Chinina</td><td>Zaopatrzenie laboratoryjne naukowe</td><td>Q0132</td><td></td></tr><tr><td>ReadyProbes Hydrofobowy barierowy Pap Pen</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>R3777</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Honeywell</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny</td><td>FisherScientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Transferaza końcowa&nbsp;</td><td>Merck</td><td>3333574001</td><td></td></tr><tr><td>ZESTAW VECTASTAIN ABC-HRP, PEROKSYDAZA</td><td>Laboratoria Vector</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny (stopień histologiczny) &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Modeling Ascending Vaginal Infection, Preterm Birth, and Neonatal Morbidity in Mice

Przedwczesne porody nadal są główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności noworodków na całym świecie, z ograniczonymi terapiami profilaktycznymi. Istnieje konieczność klinicznej istotne i powtarzalne modele zwierzęce do przenoszenia innowacyjnych interwencji by stać się rzeczywistością. Istnieje wiele myszowych modeli przedwczesnych porodów. Jednak nie powtarzają one ludzkich zachorowań noworodkowych, w tym zmian neuropatologicznych i urazy płuc, które są charakterystycznymi konsekwencjami infekcji wstępującej i przedwczesnego porodu. Scharakteryzowaliśmy model, który, o ile nam wiadomo, jest jedynym, który naśladuje scenariusz ludzki, w którym te noworodkowe zachorowania występują po wywołaniu przedwczesnego porodu przez żywą bakterię wychodzącą z pochwy. Niniejszy artykuł demonstruje dopochwowe podanie bioluminescencyjnego szczepu Escherichia coli oraz szczegółowo opisuje ocenę neuropatologicznych wyników i uszkodzeń płuc z wykorzystaniem technik immunohistochemii i histologii.

Protokół ten przedstawia myszy model wznoszącej się infekcji pochwy oraz opisuje metody oceny neuropatologii noworodków oraz wyników układu oddechowego. Zabieg wywołania infekcji pochwy powinien być szybki (w ciągu 5 minut), a myszy powinny wrócić do zdrowia w ciągu kilku minut. Dams rozwinął objawy infekcji po około 24 godziniei 25. Obejmuje to powolne ruchy, piloerekcję i pochyloną postawę. Przybliżony średni czas porodu u zakażonych myszy wynosił 40,3 godziny po podaniu E. coli (średnia w grupie kontrolnej PBS 52,7 godzin), w porównaniu do terminu dostawy grupy kontrolnej PBS w E19,531. Odsetek żywo urodzonych młodych w miocie został zmniejszony (z 100% do 71,4%) z powodu infekcji, podobnie jak ich przeżywalność przez 7 dni po urodzeniu (Rysunek 5)25. Gdy stosuje się bioluminescencyjne bakterie, obrazowanie może śledzić rozprzestrzenianie się infekcji u samic i młodych. Bakterie zaobserwowano w macicy, błonach płodowych, łożysku oraz u niektórych płodów w ciągu 18 godzin od podania (Rysunek 6), a mediatory zapalne, mierzone za pomocą qPCR i ELISA, zostały zwiększone w tych tkankach, a także w tkankach okołoporodowych, takich jak mózg, płuca i jelita 25,29,31.
Przeprowadzono szereg ocen neuropatologicznych, takich jak morfologia, śmierć komórek, aktywacja mikrogleju i aktywacja astrocytów, na płodach i noworodkach z wykorzystaniem histologii i immunohistochemii 25,31,33. Można również ocenić tkankę płucną (Rysunek 4 i Rysunek 7). Pozytywne barwienie dla TUNEL sugeruje degradację DNA, późniejszy etap śmierci komórki34. Obserwujemy znaczący wzrost barwienia TUNEL w korze, korze piryformatej, torebce zewnętrznej, hipokampie oraz wzgórzu w mózgach młodych narażonych na zakażenie E. coli w czasie ciąży (rysunek 8A,B)31. Mikroglej znakowany IBA-1, czyli rezydentne komórki odpornościowe mózgu, można sklasyfikować według stanu morfologicznego, gdzie rozgałęzienie sugeruje fenotyp spoczynkowy, podczas gdy aktywowane i fagocytowe komórki stają się ameboidalne lub zaokrąglone w kształcie35. Dlatego zamiast ilościowo określać komórki mikroglejowe, przedstawiamy strategię oceny ich fenotypu jako wskaźnika ich stanu. Obserwujemy wzrost rozgałęzienia IBA1+ w korze zewnętrznej i pręciku E. coli w porównaniu do grupy PBS (rysunek 8C,D)31. GFAP-znakowane reaktywne astrocyty, które mogą być powiązane ze stanem zapalnym i uszkodzeniami neurologicznymi, zostały zwiększone w korze piryformnej oraz w torebce zewnętrznej u młodych E. coli (Rysunek 8E,F)31,36,37. Barwienie Nissl pozwala ocenić grube zmiany morfologiczne struktury mózgu; Fiolet kresylowy jest standardowym barwieniem histologicznym dla neuronów i oznaczającym zarówno dodatkowe granulki RNA, jak i jądra komórkowe. W grupie E. coli obserwujemy zmniejszoną grubość kory (Rysunek 9)31. Podobnie H&E, które odpowiednio barwią jądro i cytoplazmę komórek, umożliwiają ocenę morfologii płuc (Rysunek 4)31. Widzimy zwiększone przestrzenie powietrzne u myszy narażonych na E. coli, a także wzrost liczby neutrofilów Ly6G+, co wskazuje na stan zapalny (Rysunek 7)31.
W analizach danych czas do dostarczenia analizowano za pomocą niesparowanego testu t, jeśli dane były normalnie rozłożone. Dla danych procentowych dla żywo urodzonych młodych, najpierw wymagana była transformacja pierwiastka kwadratowego łukowatego, aby przekształcić rozkład proporcji (ograniczony zakresem od 0 do 1) w rozkład normalny, co jest jednym z wymagań do przeprowadzenia testu t-test. Przeżywalność szczeniąt została przeanalizowana za pomocą testu rangi logaritmicznego (Mantel-Cox). W histologii i immunohistochemii stosowano albo test Mann-Whitney U, albo wiele testów t z korekcją Welsh, w zależności od rodzaju danych i tego, czy były one rozkładane prawidłowo. Aby uzyskać wystarczającą moc statystyczną, zalecamy stosowanie co najmniej pięciu tam na grupę oczyszczającą.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Podawanie Escherichia coli dopochwowe i harmonogram leczenia wywołającego przedwczesny poród oraz zachorowalność noworodkową u myszy. (A) E. coli [1], a następnie 20% żel pluronowy F127 [2], podaje się do pochwy myszy za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μL. Do introitusa dodaje się proszek chininy [3]. (B) E. coli jest dostarczana do pochwy w dniu zarodku 16.5. Tkanki, takie jak płuca i mózg, mogą być pobierane w okresie płodowym lub noworodkowym. Skrót: EN = dzień embrionalny N; PN = dzień poporodowy N; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Obszary mózgu oceniane pod kątem neuropatologii. Przykład barwienia Nissl mózgu noworodka i obszarów, które można ocenić pod kątem neuropatologii. Wszystkie obszary mózgu można ocenić pod kątem TUNEL, IBA-1 i GFAP. Zdecydowaliśmy się ocenić morfologię kory i hipokampa za pomocą Nissl. Powiększenie: 1x. Pasek skalowy = 1,5 mm. Skróty: TUNEL = końcowe oznakowanie końcówek deoksynukleotydylazy transferazy dUTP; IBA-1 = czynnik zapalny przeszczepu 1; GFAP = białko kwaśne włókniste w kształcie włókna glejowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Pozytywna ocena IBA-1 barwienia i wskaźnika rozgałęzienia. Aby określić współczynnik ramifikacji komórek IBA-1+ , policz liczbę ciał komórek w siatce oraz średnią liczbę rozgałęzień przecinających poziome i pionowe linie siatki. Skrót: IBA-1 = czynnik zapalny przeszczepu allagraftu 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Pomiary przestrzeni powietrznej w płucach młodych (barwienie H&E). (A) Wyznacz przestrzeń powietrzną i zmierz za pomocą narzędzia odręcznego na Obrazku J. (B) Średnia powierzchnia przestrzeni powietrznej jest zwiększona u młodych narażonych na E. coli w porównaniu do PBS. (C) Reprezentatywne obrazy H&E płuc szczeniąt wystawionych na PBS i E. coli in utero. Powiększenie: 40x. Pasek skali = 59,5 μm. Skróty: H = hematoksylina; E = eosyna. n = 2 z 4 miotów. *p < 0,05. Ta figura została zaadaptowana z Boyle i in.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Wpływ dopochwowe E. coli na czas porodu i przeżywalność szczeniąt. (A) Czas do porodu jest skrócony w obecności E. coli. (B) Odsetek żywych młodych jest znacząco zmniejszony, a (C) przeżywalność młodych u młodych narażonych na E. coli jest zmniejszona. Czas do porodu: n = 8-10 miotów na grupę; żywo urodzone szczenięta: n = 10-17 miotów na grupę; Przeżywalność młodych: n = 10-12 miotów na grupę. *p < 0,05, ***p < 0,001. Ta figura została zaadaptowana z Boyle i in.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig6.jpg" /> 
Rysunek 6: Obrazowanie bioluminescencji do monitorowania rozprzestrzeniania się E. coli . (A) Bioluminescencyjna E. coli wznosi się z pochwy do rogów macicy w ciągu 48 godzin. (B) Rozcięte rogi macicy wykazują zakażenie E. coli w ciągu 18 godzin, (C) podobnie jak łożysko i błony płodowe. Ta figurka została zaadaptowana z Suff i in.25 oraz Boyle i in.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig7.jpg" /> 
Rysunek 7: Barwienie Ly6G na neutrofile w płucach płodu. (A) Barwienie dla Ly6G (pozytywnie: groty strzał), w celu oceny napływu neutrofili, u płodów narażonych na PBS i E. coli . (B) Średnia liczba komórek Ly6G+ jest istotnie zwiększona u płodów E. coli . Powiększenie: 40x. Pasek skali = 59,5 μm. n = 10 z 5 miotów na grupę. *p < 0,05. Skróty: Ly6G = Złożony locus antygenu limfocytu 6 G6D. Ta figura została zaadaptowana z Boyle i in.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig7large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig8.jpg" /> 
Rysunek 8: Przykłady barwienia TUNEL, IBA1 i GFAP. (A) Barwienie TUNEL w celu śmierci komórek w mózgu młodego po porodzie wystawionym na PBS lub E. coli. (B) Średnia liczba komórek TUNEL+ wzrasta w korze, korze pirolistej, torebce zewnętrznej, hipokampie i wzgórzu. (C) Immunohistochemia IBA1 dla mikrogleju w grupach PBS i E. coli . (D) Wskaźnik ramienia, jako miara aktywacji mikrogleju, jest zwiększony w zewnętrznej torebce i prążku u młodych E. coli . (E) Barwienie GFAP dla astrocytów, (F), która jest zwiększona w korze pieriformowatej i zewnętrznej torebce u młodych E. coli . Pasek skali = 59,5 μm. Skróty: GFAP = kwaśne białko włókniste glejowe; TUNEL = końcowe oznakowanie deoksynukleotydylowej transferazy dUTP na końcu; Pyr = kora pireowata; EC = kapsuła zewnętrzna; Str = prążkowie; Biodro = hipokamp; thal = wzgórze; łącznie = wszystkie regiony; CA = cornu ammonis; OLV = wartości jasności optycznej. Analizy immunohistochemii: n = 5-7 z 5 miotów w grupie. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n.s. - nieistotne. Ta figura została zaadaptowana z Boyle i in.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig8large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66723/66723fig9.jpg" /> 
Rysunek 9: Przykład pozytywnego i negatywnego barwienia i oceny morfologii Nissl. (A) Barwienie Nissl mózgu młodego potomka poporodowego w celu oceny struktury tkanek i morfologii. (B) Nie wpływa to na szerokość mózgu, ale (C) grubość kory mózgowej zmniejsza się u młodych narażonych na E. coli. (D) Nie ma różnicy w objętości hipokampa. Powiększenie: 1x. Pasek skali = 1,5 mm. n = 5-7 z 5 miotów w grupie. **p < 0,01. Ta figura została zaadaptowana z Boyle i in.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66723/66723fig9large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przeciwciała pierwotne</td>
			<td>Rozcieńczenie</td>
			<td>Przeciwciała/rozcieńczenie wtórne</td>
			<td>Rozcieńczenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Króliczy anty-GFAP</td>
			<td>   1:6000 </td>
			<td>Antykrólikowy anty-koziczy</td>
			<td>   1:100  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Króliczy anty-IBA1</td>
			<td>   1:1000 </td>
			<td>Antyszczur z kozami</td>
			<td>   1:100  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mysz anty-Ly6G</td>
			<td>   1:1000 </td>
			<td>Antykrólikowy anty-koziczy</td>
			<td>   1:100  </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przeciwciała do immunohistochemii.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Czas (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Bejca NISSL</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Świeża woda destylowana</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Świeża woda destylowana</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>70% EtOH</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>90% EtOH</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>96% EtOH</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>96% EtOH z 3-5 kroplami kwasu octowego lodowcowego</td>
			<td>2-5 (SPRAWDZAM CIĄGLE)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Izopropanol</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Ksylen</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Ksylen</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Ksylen</td>
			<td>2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Procedura Nissl.

Wcześniaki (poród < 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Preterm birth continues to be a primary cause of neonatal mortality and morbidity globally, with limited preventative therapies. There is an imperative ...

Na początek dodaj 10 mililitrów antybiotykowego bulionu Luria-Bertani, czyli bulionu LB, do sterylnego uniwersalnego pojemnika o pojemności 30 mililitrów. Pobierz zamrożony zapas glicerolu Escherichia coli do przechowywania w temperaturze poniżej 80 stopni Celsjusza. Używając sterylnej końcówki pipety, zeskrobaj powierzchnię zamrożonego bulionu, aby lekko pokryć końcówkę bakteriami, a następnie wyrzuć końcówkę bezpośrednio do uniwersalnego pojemnika zawierającego bulion LB.Zamknąć pojemnik parafilmem, oznaczyć jako zagrożenie biologiczne i umieścić w orbitalnym wstrząsie ustawionym na 200 obr./min i 37 stopni Celsjusza na noc. Następnego ranka rozcieńcz nocną hodowlę bakteryjną w zakresie 1 do 100, dodając 0,1 mililitra hodowli do 9,9 mililitra świeżego bulionu LB. Zwróć rozcieńczoną hodowlę do orbitalnego wstrząsania przy 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza na 1,5 do trzech godzin.Następnie podaj 100 mikrolitrów hodowli i zduplikuj na przezroczystą, płaską płytkę z 96 dołkami i zmierz absorpcję spektrofotometrem z aktywną korekcją długości ścieżki. Gdy gęstość optyczna w odległości 600 nanometrów osiągnie od 0,5 do 0,7, usuń 100 mikrolitrów z hodowli bakteryjnej. Rozcieńcz go w 900 mikrolitrach sterylnego PBS.Wiruj próbkę w stężeniu 14 000g przez minutę, aby przemyć granulat bakteryjny i usunąć bulion. Usuń supernatant, ponownie zawiesij pellet w sterylnym PBS, a następnie rozcieńcz zawiesina od 1 do 10 000 w sterylnym PBS, aby uzyskać od 100 do 1000 jednostek formujących kolonie. Po znieczuleniu myszy podaj 20 mikrolitrów zawiesiny E.coli w średniej fazie logarytmicznej do pochwy za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Następnie, używając świeżej sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, podaj do pochwy 20 mikrolitrów żelu pluronowego F-127, aby zapobiec wycieku bakterii. Nastrój proszek chininy na introitus sterylną gazą, aby zapobiec myszy przed czyszczeniem tego obszaru. Po uruchomieniu oprogramowania do obrazowania kliknij Inicjalizuj i poczekaj, aż aparat osiągnie temperaturę pracy wskazaną przez zielony i zablokowany pasek temperatury.Po 48 godzinach umieść zwierzę w pozycji leżącej na podgrzewanej scenie aparatu do obrazowania bioluminescencji, utrzymując jednocześnie znieczulenie. Sprawdź luminescencyjne pole obrazowania. Upewnij się, że filtr wzbudzający jest ustawiony na blok, a filtr emisyjny na otwarcie.Następnie wybierz czas automatycznej ekspozycji. Ten rysunek ilustruje zależny od czasu przebieg bioluminescencyjnego zakażenia E. coli z przewodu pochwy do tkanek macicy i płodu u ciężarnych myszy. Bioluminescencyjna E. coli dotarła do rogów macicy w ciągu 48 godzin po zakażeniu, a silne sygnały luminescencji wykryto w dniu embrionalnym 18,5, w przeciwieństwie do braku sygnału w dniu embrionalnym 16,5.Rozczłonkowane rogi macicy ujawniają wyraźne sygnały bioluminescencji już 18 godzin po zakażeniu, co wskazuje na szybką kolonizację wewnątrzmaciczną. Zakażenie dotarło także do przedziałów płodu w ciągu 18 godzin, co potwierdzają luminescencyjne sygnały w łożysku, błonach płodowych i płynie owodniowym.

modeling-ascending-vaginal-infection-preterm-birth-neonatal-morbidity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Seman, B. G. i in. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Film prezentuje model noworodkowej myszy do badania infekcji ogólnoustrojowej z użyciem zamkniętych bakterii bioluminescencyjnych. Noworodki są wstrzykiwane wysokodawkowymi lub niskodawkowymi zawiesinami bakteryjnymi i zwracane matce na opiekę poporodową. Otoczone bakterie unikają wczesnego wykrywania odpornościowego, rozprzestrzeniają się systemowo i są wizualizowane w czasie za pomocą...

Modelowanie infekcji u noworodkowych myszy z użyciem kapsulowanych bioluminescencyjnych bakterii

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Encefalopatia wcześniaków obejmuje nieprawidłowości ośrodkowego układu nerwowego związane z uszkodzeniem spowodowanym przedwczesnym porodem. W niniejszym raporcie opisano klinicznie istotny szczurzy model przejściowego ogólnoustrojowego niedotlenienia i niedokrwienia w macicy oraz podawania lipopolisacharydów owodniowych (LPS), który naśladuje zapalenie błon płodowych i związanego z tym wpływu bodźców zakaźnych i niedostatecznej perfuzji łożyska na rozwój OUN.

Modelowanie encefalopatii wcześniaków za pomocą prenatalnej hipoksji-niedokrwienia lipopolisacharydem wewnątrzowodniowym u szczurów

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

To badanie szczegółowo opisuje proces podawania precyzyjnych ilości probiotyków noworodkom myszy. Konfiguracja eksperymentalna została zoptymalizowana tak, aby obejmowała między innymi dawkowanie probiotyków, metody podawania i oznaczanie ilościowe bakterii w jelitach.

Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Zakażenie noworodków myszy bioluminescencyjnym E. coli O1:K1:H7 powoduje infekcję septyczną ze znacznym zapaleniem płuc i patologią płuc. W tym miejscu opisano procedury modelowania i dalszego badania sepsy noworodków za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego równolegle z wyliczaniem ogólnoustrojowych obciążeń bakteryjnych, profilowaniem stanu zapalnego i histopatologią płuc.

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

Protokół przedstawia mysi model kolonizacji pochwy za pomocą beztlenowo hodowanych ludzkich bakterii pochwy. Skupiamy się na Gardnerella vaginalis, jednocześnie zamieszczając sugestie dotyczące Prevotella bivia i Fusobacterium nucleatum. Protokół ten może być również stosowany jako przewodnik do inokulacji dopochwowych i realnego odzyskiwania innych bakterii hodowanych beztlenowo.

Modele kolonizacji pochwy myszy przez bakterie hodowane beztlenowo

Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.

Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych

Artykuł zawiera kompleksowy protokół do wygenerowania modelu mysiego aktywacji immunologicznej matki (MIA) w celu zbadania wpływu wczesnego zapalenia w czasie ciąży na neurorozwój, w tym kluczowe wskaźniki, aby zapewnić niezawodność i powtarzalność.

Generowanie wczesno-ciążowego modelu aktywacji odporności matczynej u myszy w celu oceny prenatalnego stanu zapalnego na neurorozwój

Poznaj model myszy do badania przedwczesnych porodów wywołanych wznoszącą się infekcją bakteryjną pochwy. Metoda umożliwia analizę zachorowalności i śmiertelności noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Przeglądaj więcej filmów