Name: Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj metodę perfuzji wątrobowej in situ do oceny klirensu insuliny u myszy. Ta technika pozwala bezpośrednio mierzyć dynamikę metabolizmu insuliny w wątrobie w modelach chorób metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82200948, 82270921, 82170882).

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (IACUC-2105018) i przestrzegał wytycznych Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych. Wszystkie myszy C57BL/6N utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Sześciotygodniowe myszy zostały losowo podzielone na grupę diety Chow (CD) i grupę diety wysokotłuszczowej (HFD). Grupa HFD była karmiona dietą wysokotłuszczową w 60% i kontynuowała tę dietę do 10 tygodnia życia. Średnia masa ciała wynosiła 28,55 g ± 1,2 g dla grupy HFD i 24,3 g ± 0,48 g dla grupy kontrolnej. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wykonaj wymaganą sterylizację narzędzi chirurgicznych i materiałów eksploatacyjnych poprzez autoklawowanie.</li>
	<li>Na stole operacyjnym należy odpowiednio umieścić narzędzia chirurgiczne, szew jedwabny 6-0, sterylny mały bawełniany aplikator, wstrzykiwanie chlorku sodu (500 ml), waciki i gąbki.</li>
	<li>Przygotować 30 ml heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej o końcowym stężeniu 200 j.m./ml.</li>
	<li>Przygotować dwie silikonowe rurki o średnicy wewnętrznej 0,31 mm i średnicy zewnętrznej 0,64 mm; jedna o długości 4 cm do użycia jako cewnik do żyły wrotnej, a druga o długości 10 cm do użycia jako cewnik do żyły głównej dolnej.</li>
	<li>Przygotować bufor perfuzyjny Krebsa-Henseleita (KRBH) zawierający 5,0 mmol/l glukozy i 0,25% masy ciała.</li>
	<li>Przygotować bufor perfuzyjny Krebs-Henseleit (KRBH) zawierający 5,0 mmol/l glukozy, 0,25% BSA i 4,0 ng/ml insuliny ludzkiej.</li>
	<li>Skonfiguruj system perfuzji wątroby. Rysunek 1 pokazuje główne elementy systemu perfuzji wątroby.</li>
</ol>
2. Cewnikowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę znieczulającą, wykonując poniższe czynności:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć Zoletil 50 (250 mg/5 ml) 10 razy 0,9% roztworem chlorku sodu.</li>
		<li>Rozcieńczyć chlorowodorek ksylazyny (200 mg/2 ml) 10 razy 0,9% roztworem chlorku sodu.</li>
		<li>Zmieszać 0,5% roztwór Zoletil 50 z 1% roztworem chlorowodorku ksylazyny w stosunku 1:1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulij myszy.
	<ol>
		<li>Sprawdź i zapisz masę ciała myszy. Mieszaninę środków znieczulających podaje się we wstrzyknięciu dootrzewnowym w dawce 5 ml/kg masy ciała (2,5 mg/ml Zoletil 50; 5 mg/ml chlorowodorku ksylazyny). Początek znieczulenia następuje zwykle w ciągu 5-10 minut po wstrzyknięciu, co wskazuje na utratę odruchu prostowania i zmniejszoną reakcję na bodźce zewnętrzne.</li>
		<li>Przenieś mysz na stół operacyjny. Zabezpiecz kończyny za pomocą taśmy klejącej. Podawać 2,5 U/g heparyny dootrzewnowo w celu uzyskania heparynizacji.</li>
		<li>Użyj golarki elektrycznej, aby przyciąć sierść na skórze brzucha i zdezynfekuj obszar roztworem jodu powidonu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj cewnikowanie żyły wrotnej.
	<ol>
		<li>Wykonaj 4 cm podłużne nacięcie od dolnej części brzucha w kierunku wyrostka mieczykowatego wzdłuż linii środkowej części brzucha. Ostrożnie przeciąć otrzewną nożyczkami, aby uniknąć uszkodzenia narządów trzewnych. Włóż retraktor jamy brzusznej myszy, aby odsłonić pole operacyjne.</li>
		<li>Przesuń jelita w prawo, aby odsłonić żyłę wrotną, prawą nerkę i żyłę główną dolną (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Użyj kleszczyków tętniczych, aby zacisnąć żyłę główną na górnej krawędzi nerki.</li>
		<li>Odizoluj żyłę wrotną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A) i podwiąż dystalny koniec za pomocą jedwabnego szwu 6-0. Luźno zawiąż kolejny szew na bliższym końcu odsłoniętego naczynia.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w pobliżu podwiązanego końca nożyczkami sprężynowymi i włóż cewnik. Przeprowadź cewnik przez nacięcie do poziomu rozwidlenia wrotnego.</li>
		<li>Zabezpiecz obie ligatury wokół cewnika i potwierdź prawidłowe pobieranie próbek, łącząc wolny koniec cewnika ze strzykawką do pobierania próbek. Przepłukać heparynizowaną solą fizjologiczną i zacisnąć cewnik (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Usuń urządzenie trakcyjne i zresetuj jelita. Przykryj obszar operacyjny sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną lub bawełną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj cewnikowanie żyły głównej nadwątrobowej dolnej.
	<ol>
		<li>Wykonaj nacięcie wzdłuż mostka od wyrostka mieczykowatego, odsłaniając mostek.</li>
		<li>Rozetnij pionowo mostek i przetnij przeponę wzdłuż brzegu żeber, aby odsłonić klatkę piersiową.</li>
		<li>Odsłoń i wyizoluj żyłę główną nadwątrobową dolną (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B). Ostrożnie podwiąż dystalny koniec za pomocą jedwabnego szwu 6-0. Luźno zawiąż kolejny szew na bliższym końcu naczynia.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie tuż pod podwiązanym końcem nożyczkami sprężynowymi i wprowadź cewnik o długości 10 cm. Przesuń cewnik, aż końcówka cewnika znajdzie się blisko wątroby i bezpiecznie zawiąż obie ligatury. Potwierdź prawidłowe pobieranie próbek i zaciśnij wolny koniec cewnika (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Spłucz obszar operacyjny roztworem soli fizjologicznej. Przykryj powierzchnię sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Perfuzja wątroby
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji poprzez przedawkowanie środka znieczulającego i torakotomię zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, zapewniając, że wszystkie procedury są wykonywane w sposób minimalizujący cierpienie.</li>
	<li>Skonfiguruj system perfuzji wątroby, który zawiera oksygenator, urządzenie do modulacji temperatury, pompę infuzyjną i rurki infuzyjne, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
	<li>Zapewnij ciągły przepływ gazu składającego się w 95% z tlenu i 5% dwutlenku węgla do natleniacza.</li>
	<li>Włączyć łaźnię wodną i rozgrzać komorę organową do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor perfuzyjny KRBH z insuliną i bez insuliny. Zalać system przewodów buforem perfuzyjnym inkubowanym w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: KRBH jest wolny od BSA i glukozy. Bufor perfuzyjny KRBH bez insuliny ludzkiej zawiera 5,0 mmol/L glukozy i 0,25% BSA, natomiast bufor perfuzyjny KRBH z insuliną ludzką zawiera 5,0 mmol/L glukozy, 0,25% BSA i 4,0 ng/ml insuliny ludzkiej.</li>
	<li>Umieść mysz w pojemniku, w którym temperatura otoczenia utrzymuje się na poziomie około 37 °C. Użyj podkładki rozgrzewającej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Wlej bufor KRBH przez cewnik do żyły wrotnej. Ustawić szybkość infuzji na 0,2 ml/min za pomocą minipompki.</li>
	<li>Obserwuj, że wątroba blednie w ciągu kilku sekund, co wskazuje, że bufor perfuzyjny przepływa przez wątrobę. Aby wypłukać więcej pozostałych krwinek w wątrobie, należy wstrzymać infuzję na 1 minutę w punktach czasowych 4 i 8 minut, rozpoczynając czas od początku perfuzji.</li>
	<li>Perfuzję wątroby za pomocą buforu KRBH przez łącznie 10 minut (z wyłączeniem dwóch 1-minutowych przerw), co odpowiada okresowi równowagi. Pobrać próbkę podstawową z cewnika żyły głównej dolnej.</li>
	<li>Perfuzję wątroby tym samym roztworem wzbogaconym o insulinę (4,0 ng/ml insuliny ludzkiej) przez dodatkowe 30 minut.</li>
	<li>Pobieraj wszystkie próbki z rurki żyły głównej dolnej co 2 minuty.</li>
	<li>Zapisz masę wątroby po perfuzji. Pobrać próbki wątroby z różnych płatów, natychmiast zamrozić je w ciekłym azocie, a następnie przenieść do temperatury -80 °C w celu przechowywania.</li>
	<li>Wszystkie pobrane próbki perfuzyjne odwirować w temperaturze ~1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty i przenieść je do temperatury -80 °C w celu przechowywania. 
	UWAGA: Stężenie insuliny w próbkach perfuzyjnych mierzy się za pomocą zestawów do testów immunoenzymatycznych (ELISA) dla ludzi z insuliną.</li>
	<li>Po zabiegu upewnij się, że wszystkie odpady biologiczne są usuwane zgodnie z przepisami bezpieczeństwa.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Przedstaw dane na wykresach XY przedstawiających wyjściowe stężenie insuliny w czasie.</li>
	<li>Obliczyć średni wskaźnik klirensu insuliny wątrobowej (HICRAVE) za pomocą następującego wzoru: 
	HICRAVE = (1−Cf/Ci) × 100% 
	gdzie Ci = początkowe stężenie insuliny w buforze infuzyjnym, Cf = końcowe średnie stężenie insuliny w ciągu ostatnich 10 minut z żyły głównej nadwątrobowej dolnej.</li>
</ol>

Mice Liver Perfusion for Accurate Evaluation of Hepatic Insulin Clearance

<ol><li>Najjar, S. M., Perdomo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+insulin+clearance%3A+Mechanism+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Hepatic insulin clearance: Mechanism and physiology.</a> Physiology (Bethesda). 34 (3), 198-215 (2019).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+clearance+as+the+initial+regulator+of+obesity-associated+hyperinsulinemia%3A+Novel+insight+into+the+underlying+mechanism+based+on+serum+bile+acid+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin clearance as the initial regulator of obesity-associated hyperinsulinemia: Novel insight into the underlying mechanism based on serum bile acid profiles.</a> Diabetes Care. 45 (2), 425-435 (2022).</li>
<li>Koh, H. E., Cao, C., Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+clearance+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin clearance in obesity and type 2 diabetes.</a> Int J Mol Sci. 23 (2), 596(2022).</li>
<li>Bril, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+disease+severity%2C+hyperinsulinemia%2C+and+impaired+insulin+clearance+in+patients+with+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Relationship between disease severity, hyperinsulinemia, and impaired insulin clearance in patients with nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 59 (6), 2178-2187 (2014).</li>
<li>Herman, R., Sikonja, J., Jensterle, M., Janez, A., Dolzan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+metabolism+in+polycystic+ovary+syndrome%3A+Secretion%2C+signaling%2C+and+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin metabolism in polycystic ovary syndrome: Secretion, signaling, and clearance.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3140(2023).</li>
<li>Najjar, S. M., Caprio, S., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+clearance+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insulin clearance in health and disease.</a> Annu Rev Physiol. 85, 363-381 (2023).</li>
<li>Polidori, D. C., Bergman, R. N., Chung, S. T., Sumner, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+and+extrahepatic+insulin+clearance+are+differentially+regulated%3A+Results+from+a+novel+model-based+analysis+of+intravenous+glucose+tolerance+data%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatic and extrahepatic insulin clearance are differentially regulated: Results from a novel model-based analysis of intravenous glucose tolerance data.</a> Diabetes. 65 (6), 1556-1564 (2016).</li>
<li>Castillo, M. J., Scheen, A. J., Letiexhe, M. R., Lefebvre, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+insulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Rev%22%5BJournal%5D)">How to measure insulin clearance.</a> Diabetes Metab Rev. 10 (2), 119-150 (1994).</li>
<li>Rubenstein, A. H., Pottenger, L. A., Mako, M., Getz, G. S., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+proinsulin+and+insulin+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The metabolism of proinsulin and insulin by the liver.</a> J Clin Invest. 51 (4), 912-921 (1972).</li>
<li>Terris, S., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+degradation+of+125i-insulin+by+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding and degradation of 125i-insulin by rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 250 (21), 8389-8398 (1975).</li>
<li>Ooms, H. A., Arnould, Y., Rosa, U., Pennisi, G. F., Franckson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+metabolic+clearance+of+crystalline+insulin+and+radio-iodide+substitued+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Biol%22%5BJournal%5D)">Total metabolic clearance of crystalline insulin and radio-iodide substitued insulin.</a> Pathol Biol. 16 (5), 241-245 (1968).</li>
<li>Defronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+clamp+technique%3A+A+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose clamp technique: A method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).</li>
<li>Asare-Bediako, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+hepatic+insulin+extraction+from+in+vivo+surrogate+methods+of+insulin+clearance+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Assessment of hepatic insulin extraction from in vivo surrogate methods of insulin clearance measurement.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 315 (4), E605-E612 (2018).</li>
<li>Kim, S. P., Ellmerer, M., Kirkman, E. L., Bergman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+%26%2334%3Brest%26%2334%3B+accompanies+reduced+first-pass+hepatic+insulin+extraction+in+the+insulin-resistant%2C+fat-fed+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Beta-cell &#34;rest&#34; accompanies reduced first-pass hepatic insulin extraction in the insulin-resistant, fat-fed canine model.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 292 (6), E1581-E1589 (2007).</li>
<li>Kotsis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+metabolism+and+assessment+of+hepatic+insulin+extraction+during+liver+regeneration.+A+study+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Insulin metabolism and assessment of hepatic insulin extraction during liver regeneration. A study in a rat model.</a> J Invest Surg. 33 (1), 69-76 (2020).</li>
<li>Mondon, C. E., Olefsky, J. M., Dolkas, C. B., Reaven, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+insulin+by+perfused+rat+liver%3A+Effect+of+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Removal of insulin by perfused rat liver: Effect of concentration.</a> Metabolism. 24 (2), 153-160 (1975).</li>
<li>Tamaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes-susceptible+gene+SLC30A8%2FZnT8+regulates+hepatic+insulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The diabetes-susceptible gene SLC30A8/ZnT8 regulates hepatic insulin clearance.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4513-4524 (2013).</li>
<li>Ghadieh, H. E., Gastaldelli, A., Najjar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+insulin+clearance+in+insulin+action+and+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of insulin clearance in insulin action and metabolic diseases.</a> Int J Mol Sci. 24 (8), 7156(2023).</li>
<li>Winther-Sorensen, M., Kemp, I. M., Bisgaard, H. C., Holst, J. J., Wewer Albrechtsen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glucose+production%2C+ureagenesis%2C+and+lipolysis+quantified+using+the+perfused+mouse+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hepatic glucose production, ureagenesis, and lipolysis quantified using the perfused mouse liver model.</a> J Vis Exp. 200, e65596(2023).</li>
<li>Rydell-Tormanen, K., Johnson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applicability+of+mouse+models+to+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The applicability of mouse models to the study of human disease.</a> Methods Mol Biol. 1940, 3-22 (2019).</li>
<li>Zaidi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+ceacam1+in+hepatocytes+causes+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Loss of ceacam1 in hepatocytes causes hepatic fibrosis.</a> Eur J Clin Invest. 54 (7), e14177(2024).</li>
<li>Piccinini, F., Bergman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+insulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">The measurement of insulin clearance.</a> Diabetes Care. 43 (9), 2296-2302 (2020).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Krytyczne kroki w protokole Opisane powyżej zabiegi chirurgiczne należy wykonywać z delikatną ostrożnością, aby uniknąć powstania jakichkolwiek zmian w wątrobie. Co więcej, delikatna struktura ściany naczynia żylnego wątroby sprawia, że jest ona podatna na przebicie i późniejsze krwawienie, jeśli nie obchodzi się z nią ostrożnie podczas kaniulacji. W tym protokole stosuje się bardziej miękkie rurki silikonowe, aby zminimalizować uszkodzenia naczyń krwionośnych. Zaleca się, aby cewnikowanie było wyko...

Odkrycie insuliny stało się jednym z kamieni milowych ubiegłego stulecia. Wiele wiadomo na temat regulacji syntezy, wydzielania i jej funkcji fizjologicznych w tkankach metabolicznych. Mniej uwagi poświęcono jednak degradacji insuliny i jej mechanizmom regulacyjnym. Metabolizm insuliny można rozumieć jako wzajemne oddziaływanie między funkcją komórek beta, insulinoopornością (IR) lub wrażliwością oraz klirensem insuliny. Oprócz wydzielania insuliny, wątrobowy klirens insuliny odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostatycznego poziomu insuliny niezbędnego do dotarcia do obwodowych tkanek docelowych i ułatwienia prawidłowego działania insuliny1. Wiele badań zidentyfikowało upośledzony klirens insuliny jako kluczowy czynnik w patogenezie hiperinsulinemii w zespole metabolicznym, a także w innych stanach, takich jak cukrzyca typu 2<klasa SUP='xref'>2,<klasa SUP='xref'>3, niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby<klasa SUP='xref'>4 i zespół policystycznych jajników<klasa SUP='xref'>5. Tak więc hiperinsulinemia wtórna do zmniejszonego klirensu może odgrywać rolę w patogenezie choroby metabolicznej. Strategie, które poprawiają klirens insuliny, mogą potencjalnie odwrócić niekorzystne skutki hiperinsulinemii u tych osób.
Insulina ma unikalny wzór dystrybucji. Poziom insuliny w osoczu krążącym zależy od równowagi między wydzielaniem insuliny a jej usuwaniem. Trzustka pulsacyjnie wydziela insulinę do żyły wrotnej, kierując ją do hepatocytów. Jako pierwszy narząd, który napotyka wydzielanie insuliny, wątroba rozkłada większość insuliny podczas pierwszego pasażu, stanowiąc 60%-70% całkowitej insuliny6. Pozostała insulina opuszcza wątrobę przez żyłę wątrobową, wchodząc do krążenia ogólnoustrojowego, gdzie jest częściowo wykorzystywana przez tkanki obwodowe (głównie mięśnie, tkankę tłuszczową i nerki), zanim zostanie dalej wyekstrahowana przez wątrobę podczas drugiego przejścia przez tętnicę wątrobową7.
Precyzyjny pomiar klirensu insuliny jest kluczowy. Bezpośredni pomiar klirensu insuliny wątrobowej w badaniach na ludziach jest trudny, ponieważ uzyskanie próbek krwi z żył wrotnych i wątrobowych jest trudne. Do oszacowania klirensu insuliny w modelach ludzkich i zwierzęcych stosuje się zarówno metody bezpośrednie, jak i pośrednie. Do pośredniego pomiaru klirensu insuliny stosuje się około trzech strategii. Oceny najczęściej stosowane w praktyce klinicznej obejmują metody oparte na stosunku molowym peptydu C do insuliny<klasa sup='xref'>8. Podejście to opiera się na równomolowym wydzielaniu obu peptydów i braku ekstrakcji peptydu C przez wątrobę9. Druga grupa metod opiera się na matematycznej analizie krzywych rozpadu insuliny w osoczu po znanym i specyficznym wprowadzeniu hormonu do krążenia2,10,11. Trzecia metoda opiera się na fakcie, że wlew insuliny ze stałą szybkością prowadzi do stabilnego poziomu hormonu we krwi, gdzie szybkość usuwania odpowiada szybkości podawania12. Te pośrednie metody odzwierciedlają przede wszystkim ogólny klirens insuliny w organizmie. Biorąc pod uwagę, że wątroba jest głównym miejscem klirensu insuliny i odgrywa kluczową rolę w tym procesie, niezbędna jest bezpośrednia ocena klirensu insuliny w wątrobie.
Poprzednie badania bezpośrednio mierzyły ekstrakcję insuliny wątrobowej u zdrowych psów13,14. W badaniach wykorzystano również izolowany perfundowany model wątroby szczura do oceny ekstrakcji insuliny z klasy wątroba15,16. Ze względu na wysoką dostępność genetycznie modyfikowanych szczepów, myszy służą jako cenne modele do badania szlaków molekularnych. W kilku badaniach17 wykorzystano perfuzję wątroby do bezpośredniej oceny klirensu insuliny w wątrobie w modelu mysim. W tych badaniach perfuzat zawierający insulinę ludzką jest podawany do żyły wrotnej i pobierany z żyły głównej dolnej. Proporcja insuliny wchłoniętej przez wątrobę wskazuje na jej klirens. Technika perfuzji wątroby utrzymuje wątrobę w warunkach zbliżonych do fizjologicznych poprzez krążenie ciepłego, natlenionego i wzbogaconego w składniki odżywcze perfuzatu przez naczynia krwionośne wątroby. Nie ma jednak wystarczających praktycznych wskazówek i podstawowych wskazówek dotyczących rozwoju i rozpowszechniania tej techniki.
Tak więc, mimo że klirens insuliny wątrobowej cieszy się coraz większym zainteresowaniem, jego rola w zaburzeniach, jak również mechanizmy molekularne, pozostają niejasne18. Dlatego w dziedzinie badań naukowych bardzo potrzebne są zaawansowane techniki. Protokół ten ustanawia szczegółową zmodyfikowaną procedurę perfuzji wątrobowej u myszy w celu oceny klirensu insuliny wątrobowej. Dodatkowo metoda ta może być również stosowana do badania wpływu leków na wątrobę, w tym efektu pierwszego przejścia, procesów transportu leków i różnych innych aspektów.

<table><tbody><tr><td>Dieta 60% wysokotłuszczowa</td><td>Research Diets, USA</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania aminotransferazy alaninowej</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td><td>C009-2-1</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodna glukoza</td><td>Sangon Biotech</td><td>50-99-7</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania aminotransferazy asparaginianowej</td><td>Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng</td><td>C010-2-1</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>GeminiBio</td><td>700-107P</td><td>Glukometr bez kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>Contour TS Glukometr</td><td>Bayer</td><td>PH220800019</td><td></td></tr><tr><td>Paski testowe do pomiaru stężenia glukozy we krwi Contour TS</td><td>Bayer</td><td>DP38M3F05A</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa&nbsp;</td><td>Changzhou Qian hong Bio-pharma</td><td>H32022088</td><td>12500 U/2 ml</td></tr><tr><td>Insulina ludzka</td><td>Novo Nordisk</td><td>S20191007</td><td>300 U/3 ml</td></tr><tr><td>Zestaw do testowania immunologicznego insuliny ludzkiej</td><td>Bufor Ezassay Biotechnology</td><td>HM200</td><td></td></tr><tr><td>KRBH (bez cukru, BSA)</td> <td>coolaber</td><td>SL65501</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Natleniacz membranowy</td><td>Xi'an Xijing Appliance</td><td>5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopijne nożyczki</td><td>Shanghai Jinzhong</td><td>YBC020</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk mikro-serrefine</td><td>Igła medyczna Ningbo</td><td>180709</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze mikrochirurgiczne</td><td>Shanghai Jinzhong</td><td>WA3010, WA3020</td><td></td></tr><tr><td>Filtr igłowy</td><td>N-buliv</td><td>LG05-133-2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu powidonu</td><td>Szanghaj likang Środek dezynfekujący Hi-Tech</td><td>20231016J</td><td></td></tr><tr><td>pompa 11 Elite</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PC5&nbsp; 70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Retraktor</td><td>Globalebio (Pekin) Technologia</td><td>GEKK-10mm</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>Towary naukowe</td><td>#BB518-12</td><td>0,31 mm i razy 0,64 mm</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>#11-189-15A</td><td>ID 0,5 mm</td></tr><tr><td>Chlorek sodu do wstrzykiwań</td><td>Baxter</td><td>S2402023</td><td>4,5 g/500 ml</td></tr><tr><td>Jedwabny szew</td> <td>chirurgicznySprzęt medyczny Yangzhou Huanyu</td><td>6-0</td><td></td></tr><tr><td>Modulacja temperatury</td><td>Xi'an Xijing Appliance</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Termostatyczna łaźnia wodna</td><td>Jiaxing Junsi Electronics</td><td>HIH-1</td><td>220 V 50 HZ</td></tr><tr><td>Trójdrożny łącznik</td><td>YISAI</td><td>AQTCY1.6</td><td>ID 0,4 mm</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny do wstrzykiwań</td><td>ShengXin</td><td>20240106</td><td>200 mg / 2 ml</td></tr><tr><td>Zoletil 50</td><td>Virbac</td><td>WK001</td><td>250 mg/5mL</td></tr></tbody></table>

ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

Assessing Insulin Clearance in Mice via In Situ Liver Perfusion

Klirens insuliny w wątrobie jest niezbędny do utrzymania homeostazy glukozy i jest ściśle związany z zaburzeniami metabolicznymi, takimi jak otyłość, insulinooporność i cukrzyca. Dokładny pomiar klirensu insuliny jest niezbędny do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw tych schorzeń. Protokół ten przedstawia prostą i przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby u myszy, zaprojektowaną specjalnie do bezpośredniej oceny szybkości klirensu insuliny w wątrobie. Metoda polega na precyzyjnej kaniulacji żyły wrotnej i żyły głównej dolnej nadwątrobowej w celu stworzenia systemu perfuzji in situ, który naśladuje warunki fizjologiczne. Protokół prowadzi badaczy przez każdy etap procedury, od przygotowania chirurgicznego i konfiguracji systemu perfuzji po pobieranie i analizę próbek. Dostarczane są szczegółowe instrukcje wraz z reprezentatywnymi wynikami i ważnymi wskazówkami dotyczącymi optymalizacji procedury. Do pisemnego protokołu dołączony jest film instruktażowy, zawierający szczegółowe instrukcje i ilustracje, dzięki czemu jest on przystępnym i wyczerpującym źródłem informacji dla naukowców badających mechanizmy molekularne stojące za metabolizmem i klirensem insuliny w wątrobie.

Niniejszy protokół opisuje procedurę infuzji wątrobowej w celu bezpośredniego obliczenia wątrobowego klirensu insuliny. Model ten jest wiarygodny i powtarzalny. Przykład wyników uzyskanych z eksperymentu przedstawiono na Rysunku 3. Po 10-minutowym okresie równoważenia, przez żyłę wrotną przez 30 min perfundowano bufor KRBH uzupełniony o 4,0 ng/mL ludzkiej insuliny. Płyn perfuzyjny zbierano z cewnika w nadwątrobowym odcinku żyły głównej dolnej w odstępach 2-minutowych, a następnie mierzono st...

Klirens insuliny wątrobowej jest kluczowy dla regulacji homeostazy glukozy. W tym artykule opisano przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby do bezpośredniej oceny szybkości klirensu insuliny w wątrobie in situ u myszy.

Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

Hepatic insulin clearance is essential for maintaining glucose homeostasis and is closely linked to metabolic disorders such as obesity, insulin ...

Klirens insuliny odgrywa kluczową rolę w regulacji metabolizmu glukozy i jest powiązany z zaburzeniami metabolicznymi, takimi jak otyłość, insulinooporność i cukrzyca. Dokładna ocena klirensu insuliny ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby, mającą na celu bezpośrednią ocenę szybkości klirensu insuliny w wątrobie.Klirens insuliny szacuje się na modelach ludzkich i zwierzęcych zarówno metodą bezpośrednią, jak i pośrednią. Jednak w niewielu badaniach wykorzystano perfuzję wątroby w celu uzyskania dostępu do klirensu insuliny wątrobowej bezpośrednio w modelu mysim. Technika perfuzji wątroby utrzymuje wątrobę pod większymi warunkami poprzez krążenie ciepłego, natlenionego i wzbogaconego w składniki odżywcze płynnego przez naczynia krwionośne wątroby.Powodzenie cewnikowania chirurgicznego ma kluczowe znaczenie dla układu rozlewu wątroby ze względu na masowe oczernianie naczyń krwionośnych. Szczególnie ważne jest dokładne umieszczenie cewników w żyle wrotnej i pokrywie żyły dolnej. Jeśli cewnik zostanie wprowadzony zbyt głęboko, może to spowodować nierównomierne przenikanie między płatami wątroby, co może wpłynąć na wyniki test

assessing-insulin-clearance-in-mice-via-in-situ-liver-perfusion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem oceny funkcji nerek. Tutaj opisujemy metodę wysokoprzepustową, która umożliwia określenie GFR u przytomnych myszy za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia bolusa, oznaczenie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-inuliny w osoczu i obliczenie GFR za pomocą dwufazowego modelu rozpadu wykładniczego.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

Wywołane insuliną rozszerzenie naczyń krwionośnych reguluje perfuzję mięśni i zwiększa powierzchnię mikrokrążenia (rekrutację mikronaczyniową) dostępną do wymiany substancji rozpuszczonej między krwią a śródmiąższem tkankowym. Przedstawiono połączoną mikroskopię przyżyciową i ultrasonografię ze wzmocnieniem kontrastowym w celu jednoczesnej oceny działania insuliny na większe naczynia i mikrokrążenie in vivo.

Połączona mikroskopia przyżyciowa i ultrasonografia tylna myszy ze wzmocnieniem kontrastowym w celu zbadania rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji mięśni wywołanego insuliną

Tutaj prezentujemy wyrafinowane procedury chirurgiczne dotyczące skutecznego przeprowadzenia przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrz portalu, klinicznie istotnej, ale technicznie trudnej procedury chirurgicznej u myszy.

Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

To badanie opisuje bezpośredni pomiar produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników przy użyciu stabilnego izotopowego znacznika glukozy przez żyłę ogonową zarówno na czczo, jak i w stanie bogatym w glukozę w tandemie.

Ocena produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Zewnątrzkomórkowe wyczerpanie fluorescencyjnie znakowanej glukozy koreluje z wychwytem glukozy i może być wykorzystane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych wychwytu glukozy w wyciętych organach i hodowlach komórkowych.

Zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Poznaj metodę perfuzji wątrobowej in situ do oceny klirensu insuliny u myszy. Ta technika pozwala bezpośrednio mierzyć dynamikę metabolizmu insuliny w wątrobie w modelach chorób metabolicznych.

Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

Przeglądaj więcej filmów