Name: Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Naucz się strategii montażu zarodków danio pręgowanego w mikroskopii świetlnej. Ta metoda pozwala uzyskać obrazy komórkowej rozdzielczości na etapie 70% epibolii i stadium pąka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Kalidasowi Kohale'owi i jego zespołowi za utrzymanie obiektu rybackiego oraz KV Boby za utrzymanie mikroskopu z blachą świetlną. SRN przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe ze strony Departamentu Energii Atomowej (DAE), rządu Indii (nr identyfikacyjny projektu. RTI4003, DAE OM nr 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 z dnia 11.02.2020 r.), program Max Planck Society Partner Group (M.PG. A MOZG0010) oraz grant badawczy dla start-upów Rady ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (SRG/2023/001716).

Refined Multiview Light Sheet Microscopy Protocol for Zebrafish Embryos

<ol><li>Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+and+its+potential+for+understanding+developmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Keller, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis%3A+Technological+advances+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168(2013).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+Light+sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+Light+sheet+microscope+for+imaging+mouse+pre-implantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development.</a> Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+Light+sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+image+fusion+improves+resolution+in+three-dimensional+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy.</a> Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).</li>
<li>Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+imaging+axis+microscopy+improves+resolution+for+thick-sample+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications.</a> Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+for+long-term+light+sheet+microscopy+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+symmetry+of+zebrafish+embryos+requires+somite+surface+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension.</a> Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).</li>
<li>Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+imaging+and+analysis+identify+pan-embryo+cell+dynamics+of+germlayer+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish.</a> Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hörl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigStitcher%3A+Reconstructing+high-resolution+image+datasets+of+cleared+and+expanded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples.</a> Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).</li>
<li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Icha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+sheet+fluorescence+microscopy+to+image+zebrafish+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development.</a> J Vis Exp. (110), e53966(2016).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+Light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).</li>
<li>Aigouy, B., Prud'homme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantitative+analysis+of+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues.</a> Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).</li>
<li>Mancini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+size+and+deltaA+expression+predict+adult+neural+stem+cell+decisions+along+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression.</a> Science Adv. 9, 7519(2023).</li>
<li>Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+timing+of+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis+to+external+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+remodeling+of+extracellular+matrix+orients+epithelial+sheet+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding.</a> Science Adv. 9, 2154(2023).</li>
<li>Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multicellular+specimens+with+real-time+optimized+tiling+Light+sheet+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy.</a> Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+Light+sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>York, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+early+endosomal+maturations+emerge+from+a+stochastic+trigger-and-convert+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism.</a> Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathfinding+by+identified+zebrafish+motoneurons+in+the+absence+of+muscle+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers.</a> J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).</li>
<li>Rohde, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+timing+drives+the+vertebrate+segmentation+clock%27s+wave+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern.</a> eLife. , 13:RP93764 (2024).</li>
<li>Haynes, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLC4+shapes+axon+arbors+during+development+and+mediates+adult+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior.</a> eLife. 11, e74270(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Ustawienie zarodka we właściwej orientacji w celu zobrazowania obszaru zainteresowania jest jednym z kroków ograniczających szybkość, które często skutkują nieudaną sesją mikroskopową dla użytkownika. Jest to szczególnie widoczne w mikroskopie z wieloma arkuszami świetlnymi, gdzie ręczna manipulacja orientacją jest trudna, ponieważ próbki są osadzone w probówce. Aby pomóc w tym procesie, badanie to przedstawia statystyki dotyczące różnych pozycji, w których zarodek danio pręgowanego zajmuje od 70% epibolii do wczesnych stadiów somitowych w kosmówce, gdy polimerowa probówka z zarodkami jest utrzymywana w pozycji pionowej w probówce mikrowirówkowej.
Przy 70% epibolii zarodki zorientowane pionowo lub poziomo dostarczają uzupełniających informacji o zdarzeniach w całym zarodku. Podczas gdy orientacja pozioma pozwala na wizualizację dynamiki komórkowej w biegunie zwierzęcym, a także dynamiki komórek przechodzących epibolię oglądanych z bieguna roślinnego, orientacja pionowa pozwala na wizualizację grzbietowej i brzusznej strony zarodka, w tym dynamiki komórkowej w organizatorze grzbietowym, internalizacji komórek podczas gastrulacji i przepływów konwergencji-rozciągnięcia. Badanie to pokazuje, że istnieje duże prawdopodobieństwo uzyskania zarodka w orientacji pionowej wyłącznie przypadkowo, jeśli próbki są przygotowywane na kilka godzin przed obrazowaniem; Jednak orientacja pozioma wydaje się być znacznie mniej powszechna na tych etapach. W przypadku etapów poprzedzających 70% epibolii zaleca się, aby użytkownicy udokumentowali podobne statystyki orientacji zarodka w kosmówce przed przystąpieniem do obrazowania poklatkowego, ponieważ posiadanie tych informacji z wyprzedzeniem oszczędza czas na dłuższą metę.
Od stadium pączka najlepszą orientacją do obrazowania jest zarodek ustawiony poziomo, ponieważ pozwala to na śledzenie dynamiki komórkowej wzdłuż całej przednio-tylnej osi ciała zarodków15. Uzyskanie zarodka w tej orientacji jest stosunkowo proste, ponieważ około 25% zarodków wpada w tę stabilną pozycję niezależnie od tego, kiedy próbka jest przygotowywana. Ogólnie rzecz biorąc, do obrazowania dowolnego etapu zainteresowania zaleca się przygotowanie około 15 probówek z dwoma do trzech zarodków w każdej probówce, co zapewni wysokie prawdopodobieństwo uzyskania zarodków w pożądanej orientacji, a co za tym idzie, udaną sesję mikroskopową w danym dniu. Ponadto zaleca się, aby jajowody zostały posortowane na około godzinę przed etapem zainteresowania, aby wybrać zarodek o odpowiedniej orientacji do obrazowania poklatkowego.
Po uzyskaniu zarodka w odpowiedniej orientacji ważne jest, aby wziąć pod uwagę liczbę widoków i odstęp kątów między widokami do obrazowania. Zależy to od minimalnej wymaganej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Im więcej kątów, z których obrazowana jest dana struktura lub obszar zarodka, tym lepsza rozdzielczość przestrzenna (jak pokazano na rycinie 6), ale prowadzi to do kompromisu w zakresie rozdzielczości czasowej. W tym protokole, przy systemie z dwoma ramionami oświetleniowymi i jednym dozorowym, obrazowanie dwóch kanałów w pełnym 360° z interwałem kątowym 30° i około 100 z-slice'ami pod każdym kątem z odstępem między warstwami 2 μm, zajęło około 3 minut dla jednego punktu czasowego. Chociaż jest to wystarczające do śledzenia komórek we wczesnych stadiach embrionalnych, jeśli mają zostać uchwycone zdarzenia o szybszej dynamice, należy uzyskać mniejszą liczbę kątów, zapewniając lepszą rozdzielczość czasową, ale z kompromisem w zakresie rozdzielczości przestrzennej, zwłaszcza jeśli drobniejsze struktury, takie jak granice komórek, muszą zostać podzielone na segmenty. Drugą opcją, którą należy rozważyć w celu poprawy rozdzielczości czasowej, jest użycie systemu multiview z dwoma ramionami detekcji, co znacznie zwiększy szybkość akwizycji, jak ostatnio stosowaną do śledzenia ruchów komórek podczas gastrulacji w zarodkach danio pręgowanego16. Ponadto, chociaż w tym protokole przetestowano tylko obiektyw 20x/1 NA, w zależności od obrazowanej próbki, wymaganej rozdzielczości przestrzennej i pola widzenia, należy wziąć pod uwagę właściwy obiektyw. Podsumowując, w oparciu o wymagane dalsze przetwarzanie i kwantyfikację dla danej próbki i pola widzenia, należy starannie dobrać liczbę widoków i przedział kątowy. Jednak do obrazowania całych wczesnych zarodków danio pręgowanego, szczególnie z rozdzielczością w skali komórkowej pod różnymi kątami, obiektyw 20x/1 NA wydaje się być optymalny, ponieważ obiektyw o mniejszym powiększeniu i NA (np. obiektyw 10x/0,5 NA) będzie miał znacznie niższą rozdzielczość, co prawdopodobnie doprowadzi do większej liczby błędów segmentacji, podczas gdy obiektyw o większym powiększeniu i NA nie będzie w stanie objąć całego zarodka w polu widzenia kamery.
W tym badaniu, w celu omówienia strategii montowania i obrazowania, wykorzystano marker aktynowy, który może być używany jako wskaźnik zastępczy do śledzenia granic komórek, oraz marker histonowy, do wykrywania i śledzenia jąder. W rzeczywistości większość wcześniej opublikowanych badań, w których wykorzystano system wielowidokowych arkuszy świetlnych, preferencyjnie używała podobnych markerów 5,7,15,16,27. Głównym powodem wyboru tych markerów jest to, że mikroskopia z wieloma arkuszami świetlnymi jest głównie stosowana do śledzenia dynamiki skali komórkowej (np. kształtu komórki i rearanżacji komórek) zarówno w skali tkankowej, jak i w całym zarodku przez długi czas trwający od kilku godzin do kilku dni. Z drugiej strony, jeśli istnieje potrzeba uzyskania rozdzielczości subkomórkowej, można zastosować inną transgeniczną linię wyznaczającą obszar zainteresowania, ale w tym scenariuszu mikroskop z wieloma arkuszami świetlnymi może nie być najlepszym wyborem instrumentu, a raczej konfokalny, system superrozdzielczy lub nawet mikroskop siatkowy z arkuszami świetlnymi28, 29 może lepiej odpowiadać badanemu problemowi.
Omawiany protokół działa dobrze od gastrulacji do 15-somitowych zarodków daniopręgowanego 30 (około 17 hpf) bez żadnych modyfikacji i chociaż nie został tutaj przetestowany, prawdopodobnie zadziała również w przypadku wcześniejszych zarodków przed etapem gastrulacji. Po przekroczeniu etapu 15-somitowego rozpoczynają się spontaniczne skurcze mięśni30,31, które można stłumić poprzez dodanie trykainy, środka znieczulającego, zarówno w probówce, jak i w komorze próbki. Ponadto przy około 18 hpf odchylenie ogona od żółtka zaczyna się30, co odsuwa zarodek od pola widzenia. Aby się tym zająć, należy zastosować algorytm śledzący, który śledzi wydłużający się koniec, aby utrzymać zarodek w ostrości32. Co więcej, w przypadku obrazowania zarodków w późniejszym stadium, gdy są one pozbawione kosmówki, na przykład w celu śledzenia rozwoju neuronalnego, należy zastosować alternatywną strategię montowania, tak jak ostatnio wykonano33.
W przypadku obrazowania zarodków danio pręgowanego z nienaruszoną kosmówką uchwycenie zarówno koralików, które działają jako znaczniki rejestracyjne, jak i zarodka w tym samym polu widzenia nie jest możliwe przy użyciu obiektywu 20x/1 NA. Badanie to stanowi prostą alternatywę polegającą na zarejestrowaniu różnych widoków z informacjami z koralików, które są obecne powyżej lub poniżej próbki, a następnie przeniesieniu rejestracji z koralików na zarodek podczas przetwarzania. Po zarejestrowaniu próbki zarodka w ten sposób można przeprowadzić drugą rundę rejestracji z wykorzystaniem jąder jako markerów rejestracyjnych, które są obecne w próbce, w celu dalszego dostrojenia początkowej rejestracji. Podczas wykonywania obrazowania poklatkowego informacje o jądrach mogą być z kolei wykorzystane do rejestracji kolejnych punktów czasowych, jak to opisano wcześniej21. Jedną z alternatyw dla tego protokołu jest rezygnacja z koralików i zamiast tego wykorzystanie informacji o jądrach do początkowej rejestracji. Jednak rejestracja często się nie powiodła (nie pokazano tutaj) we wtyczce BigStitcher, prawdopodobnie z powodu kombinacji wielu jąder, które nie zostały wykryte głębiej w zarodku podczas przetwarzania, a także z powodu stosunkowo mniejszej liczby jąder, które są obecne w zarodku, gdy patrzy się na nie pod pewnymi kątami (na przykład, gdy ogląda się je brzusznie w późnych stadiach epibolii).
W tym protokole, ponieważ informacje o koralikach z góry lub z dołu próbki są wykorzystywane do rejestracji i nie ma potrzeby obrazowania koralików w tym samym widoku, co obrazowanie próbki, można użyć tego protokołu do obrazowania tylko określonych obszarów zainteresowania, ale w dużym powiększeniu pod różnymi kątami, a nie całego zarodka. Co więcej, łatwo jest dostosować ten protokół do obrazowania wielu próbek ułożonych pionowo w probówce, wykorzystując informacje o kulkach spomiędzy próbek do rejestracji.

Zapewnienie minimalnej fototoksyczności jest głównym wymogiem dla obrazowania żywych embrionów z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez długi czas. W ciągu ostatniej dekady mikroskopia arkuszy świetlnych stała się metodologią z wyboru w celu spełnienia tego wymogu1,2,3,4,5,6,7. Krótko mówiąc, w tej technice, która została po raz pierwszy użyta w 2004 roku do uchwycenia procesów rozwojowych8, dwa wyrównane cienkie arkusze lasera przechodzą przez zarodek z przeciwnych końców, oświetlając tylko płaszczyznę zainteresowania. Obiektyw detekcyjny jest umieszczany prostopadle, a następnie emitowane światło fluorescencyjne ze wszystkich oświetlonych punktów w próbce jest zbierane jednocześnie. Obraz 3D uzyskuje się następnie poprzez sekwencyjne przesuwanie zarodka przez statyczny arkusz świetlny.
Ponadto, w specyficznej formie tej metodologii, określanej jako mikroskopia z wieloma arkuszami świetlnymi, próbki mogą być zawieszone w polimerowej rurce, która może być obracana za pomocą wirnika, umożliwiając obrazowanie tego samego zarodka pod wieloma kątami9,10,11. Po obrazowaniu obrazy pod różnymi kątami są łączone na podstawie markerów rejestracyjnych, które są zazwyczaj globularnymi markerami fluorescencyjnymi w zarodku (np. jądrach) lub w probówce (np. kulki fluorescencyjne). Obrazowanie wielowidokowe i fuzja znacznie poprawiają rozdzielczość osiową, zapewniając rozdzielczość izotropową we wszystkich trzech wymiarach12. Chociaż jest to duża zaleta, głównym wyzwaniem związanym z metodologią multiview jest montowanie próbek, w którym zarodki muszą być montowane i utrzymywane na miejscu w probówkach przez cały czas trwania obrazowania.
Do wykonywania obrazowania wielowidokowego, aby utrzymać zarodki na miejscu i zapobiec ruchom podczas obrazowania, zarodki mogą być osadzone w agarozie. Jednak często prowadzi to do szkodliwego wzrostu i rozwoju, szczególnie w przypadku zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju13, systemu modelowego, który jest tutaj omawiany. Drugą strategią montażu jest użycie cienkiej rurki, która jest tylko nieznacznie większa niż średnica zarodka, gdzie zarodek może zostać wciągnięty do probówki wraz z pożywką zarodkową, a następnie zamknięcie dna probówki za pomocą zatyczki agarozowej14. W tej metodzie, ponieważ probówka jest wypełniona pożywką zarodkową, markery rejestracyjne, takie jak koraliki fluorescencyjne, nie mogą być używane do fuzji różnych widoków, a zatem rejestracja jest zależna od markerów w zarodku. Ogólnie rzecz biorąc, koraliki działają jako lepsze markery rejestracyjne, ponieważ sygnał markerów w zarodku ulega degradacji po wejściu w głąb próbki ze względu na ograniczenia zarówno oświetlenia, jak i wykrywania dowolnego mikroskopu.
Tak więc, trzecie podejście, które zostanie tutaj szczegółowo opisane i używane wcześniej5,13,14,15,16, obrazuje wczesne zarodki danio pręgowanego z nienaruszoną kosmówką i wypełnia probówkę minimalnym procentem agarozy, która zawiera koraliki jako znaczniki rejestracji. W tym scenariuszu, ponieważ ręczna interwencja w celu umieszczenia zarodków w kosmówce nie jest możliwa, badanie to dostarcza statystyk dotyczących domyślnej orientacji, w jaką wpadają wczesne zarodki danio pręgowanego, koncentrując się w szczególności na 70% epibolii i stadiach pąków. Następnie omówiono optymalną liczbę widoków wymaganych do obrazowania zarodków we wczesnym stadium w rozdzielczości w skali komórkowej i szczegółowo opisano proces fuzji za pomocą BigStitcher, wtyczki opartej na FIDŻI10,17,18. Łącznie ten protokół, który wykorzystuje obiektyw 20x/1 NA, ma na celu ułatwienie embriologom danio pręgowanego korzystania z wielowidokowych systemów arkuszy świetlnych do obrazowania zarodków z jądrami i markerami błonowymi od gastrulacji do wczesnych stadiów somitów.

<table><tbody><tr><td>Agaroza, niska temperatura żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12022</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Wersja: ImageJ 1.54f</td></tr><tr><td>Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany karboksylanem, czerwień fluorescencyjna, 0,5 &mu; m średnia wielkość cząstek, zawiesina wodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM1340</td><td>Do transkrypcji in vitro plazmidu H2A-mCherry</td></tr><tr><td>Potassium Chhloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Oplot ochronny PTFE AWG 15L - 1,58 mm średnica wewnętrzna x 0,15 mm ścianka +/-0,05&nbsp;</td><td>Innowacje Adtech w zakresie fluoroplastów</td><td>STW15</td><td>Rurki PTFE</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Labman</td><td>LMUC3</td><td>Ultradźwiękowiec</td></tr><tr><td>Zeiss LightSheet 7 System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Mikroskopia arkuszowa stała się metodologią wyboru do obrazowania na żywo zarodków danio pręgowanego w długich skalach czasowych przy minimalnej fototoksyczności. W szczególności system multiview, który umożliwia rotację próbek, umożliwia obrazowanie całych zarodków pod różnymi kątami. Jednak w większości sesji obrazowania z użyciem systemu multiview montaż próbki jest kłopotliwym procesem, ponieważ próbki są zwykle przygotowywane w probówce polimerowej. Aby pomóc w tym procesie, protokół ten opisuje podstawowe strategie montażu do obrazowania wczesnego rozwoju zebry między 70% stadiami epibolii i wczesnych somitów. W szczególności badanie dostarcza danych statystycznych na temat różnych pozycji, w których zarodki domyślnie znajdują się na 70% etapach epibolii i pąków w kosmówce. Ponadto omówiono optymalną liczbę kątów i odstęp między kątami wymagany do obrazowania całych zarodków danio pręgowanego we wczesnych stadiach rozwoju, tak aby można było uzyskać informacje w skali komórkowej poprzez połączenie różnych widoków. Wreszcie, ponieważ zarodek obejmuje całe pole widzenia kamery, które jest wymagane do uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej, protokół ten szczegółowo opisuje proces wykorzystywania informacji o koralikach z góry lub z dołu zarodka do rejestracji różnych widoków.

Precyzyjne orientowanie próbki jest kluczowym elementem efektywnego wykorzystania zestawu do mikroskopii. Jednakże ręczne orientowanie próbek jest często niemożliwe przy użyciu systemu arkusza światła o wielu widokach (multiview light sheet system), ze względu na konieczność przygotowania próbek w probówce. Aby zatem sprawdzić, czy embriony przyjmują w obrębie chorionu stereotypowe pozycje, wykonano obrazowanie embrionów zebrafish w fazie 70% epibolii (około 7 h po zapłodnieniu (hpf)), ponieważ przedmiotem niniejszego badania było obrazowanie time-lapse od gastrulacji do wczesnych stadiów somitycznych. Gdy próbki przygotowywano bezpośrednio przed obrazowaniem w fazie 70% epibolii, embriony nie wykazywały specyficznej orientacji, która byłaby często obserwowana w różnych próbkach. Ponieważ jest to zazwyczaj niepożądane, próbki przygotowywano znacznie przed gastrulacją i przechowywano w probówkach do mikrowirówki w odpowiedniej temperaturze aż do rozpoczęcia obrazowania. W tych warunkach, przy 70% epibolii (N = 3; n = 87 embrionów), orientację embrionów można było sklasyfikować jako: (1) poziomą, gdy oś zwierzęco-roślinna (AV) embrionu była prostopadła do osi podłużnej polimerowej probówki, (2) pionową, gdy oś AV była równoległa do osi podłużnej polimerowej probówki, oraz (3) ukośną, gdy oś AV była pod kątem ostrym (Rycina 3A). Pozycja pozioma była najrzadziej reprezentowana, natomiast pozycje pionowa i ukośna występowały z jednakową częstotliwością (Rycina 4).
Kiedy embriony pozostały w probówkach, były one stabilne w poszczególnych pozycjach aż do etapu 90% epibolii, po którym większość embrionów zmieniła orientację. W związku z tym konieczne było przeprowadzenie drugiej serii dokumentacji orientacji na etapie pączka embriogenezy (około 10 hpf), aby uwzględnić te zmiany. Zostało to wykonane dla niezależnie przygotowanych próbek. W przypadku obrazowania wczesnych etapów somitycznych wcześniej zgłoszono, że idealną orientacją jest taka, w której notochorda embrionu jest prostopadła do długiej osi probówki polimerowej, ponieważ pozwala to na wizualizację wielu bilateralnych somitów formujących się wzdłuż osi15. Gdy próbki przygotowywano przed gastrulacją (N = 3, n = 93 embriony), około 25% embrionów wykazywało taką orientację (Rycina 4) i pozostawały one stabilne w tej orientacji co najmniej do etapu 8 somitów, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami15. Pozostałe embriony wykazywały różne inne orientacje na etapie pączka (sklasyfikowane na Rycina 3B i Rycina 4); jednak wiele z nich zmieniło orientację na poziomą podczas wczesnego formowania somitów. Co ciekawe, podobny odsetek embrionów prezentował orientację poziomą na etapie pączka, niezależnie od tego, czy próbkę przygotowano przed gastrulacją, przy 70% epibolii, czy bezpośrednio przed etapem pączka. Zatem moment przygotowania próbek wydaje się mniej krytyczny dla poziomej orientacji istotnej dla obrazowania etapów somitycznych, w przeciwieństwie do tego, co zaobserwowano podczas obrazowania przy 70% epibolii.
Zaletą systemu wielowidokowego (multiview) jest możliwość obserwacji tej samej próbki pod wieloma kątami. Jednak w przypadku zarodków zebrafish na wymienionych etapach rozwoju nie jest jasne, ile widoków jest wymaganych do uzyskania rozdzielczości komórkowej w całym zarodku. Aby to scharakteryzować, obrazowano zarodki zebrafish przy użyciu obiektywu 20x/1 NA w ramieniu detekcyjnym z powiększeniem (zoom factor) wynoszącym 1, co odpowiadało grubości arkusza światła 4,57 µm. Przy tych ustawieniach zarodek wypełniał całe pole widzenia kamery sCMOS o rozmiarze piksela 6,5 µm i obszarze 1920 na 1920 pikseli. Mikroiniekcja mRNA dla fluoroforu znakującego histony (H2A-mCherry) do zarodków w stadium jednego komórki, uzyskanych z linii transgenicznej znakującej filamenty aktynowe (Utr-GFP), pozwoliła na wizualizację zarówno jąder komórkowych, jak i błon komórkowych w zarodku. W celu przeprowadzenia fuzji wielowidokowej zarodków przy różnych interwałach kątowych, wykonano akwizycję 360° zarodków podwójnie transgenicznych oraz kulek w probówce w odstępach co 30° (n = 3 zarodki na etapie 70% epibolii; n = 3 zarodki w stadium bud) lub 45° (n = 3 zarodki na etapie 70% epibolii; n = 3 zarodki w stadium bud), wykonując około 100 przekrojów pod każdym kątem z odstępem między przekrojami wynoszącym 2 µm. Poprzez pomijanie naprzemiennych kątów podczas przetwarzania obrazów, akwizycje co 30° i 45° dostarczyły dodatkowo zestawów danych dla kątów 60° i 90°.
Pozyskane obrazy zostały następnie zarejestrowane przy użyciu informacji o koralikach, a szczegóły rejestracji przeniesiono do zestawu danych zarodków, zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Pomyślną rejestrację za pomocą wtyczki BigStitcher osiągnięto dla różnych serii akwizycji z wyjątkiem zestawu danych z kąta 90°, co prawdopodobnie wynika z mniejszego pokrycia próbki z każdego kąta. Aby temu zaradzić, obrazy zarodków były pobierane co 90° przy około 400 przekrojach pod każdym kątem i odstępie między przekrojami wynoszącym 2 µm, zarówno w stadium 70% epibolii, jak i w stadium pączka, co pozwoliło na pomyślną rejestrację (n = 3 zarodki dla każdego stadium).
Kolejnym krokiem było przeprowadzenie fuzji wielowidokowej oraz dekonwolucji zarejestrowanych zestawów danych. Proces ten wykonano z 4-krotną podpróbkowaniem (downsampling), aby przyspieszyć obliczenia. Jak widać na reprezentacji jąder z poszczególnych widoków oraz na zrekonstruowanym wielowidokowo embrionie (Rycina 5), poszczególne widoki obejmują mniejszy obszar, co po fuzji pozwoliło uzyskać obraz całego embrionu. Do stworzenia reprezentacji wykorzystano program Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon), wtyczkę do programu FIJI, którą można dodać w sekcji „Manage Update Sites” w menu „Help” programu FIJI, a po dodaniu uzyskać do niej dostęp w menu wtyczek. W celu detekcji odpowiednie obrazy przekształcono najpierw do formatu XML/hdf5, a następnie wykonano detekcję jąder przy użyciu wtyczki „Detection” programu Mastodon z detektorem DoG (średnica 6 µm i próg jakości 80).
Spośród różnych obrazów scalonych, zestaw danych 90° wykazał bardzo wysokie tło w głębszych warstwach próbki, co czyni go nieprzydatnym do przeprowadzania jakiejkolwiek kwantyfikacji. Zatem w przeciwieństwie do mniejszych próbek, takich jak embriony Drosophila, które w innych badaniach często obrazowano w odstępach 90°9,22, takiego podejścia nie zaleca się w przypadku obrazowania wczesnych embrionów zebrafish przy użyciu obiektywu 20x/1 NA. Pomiędzy scalonymi zestawami danych 30°, 45° i 60° jakościowo nie stwierdzono istotnych różnic w informacjiach o jądrach (Rycina 6B, górny rząd); jednak drobniejsze struktury, takie jak granice komórek, wydawały się znacznie lepiej rozdzielone w scalonym zestawie danych 30° w porównaniu do pozostałych (Rycina 6C, górny rząd).
Aby potwierdzić tę obserwację, użyto oprogramowania Mastodon do wykrywania jąder komórkowych na obrazach scalonych uzyskanych z obrazowania co 30°, 45° i 60°. Do analizy wybrano trzy obszary na obrazach scalonych, jeden na każdej z głębokości 20 µm (Rysunek 6A), 50 µm i 100 µm od powierzchni embrionu. Aby porównać wydajność detekcji jąder na obrazach, detekcję przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem, stosując identyczne parametry dla obrazów scalonych z różnych interwałów kątowych. We wszystkich analizowanych obszarach każde jądro zostało wykryte niezależnie od tego, czy obrazy scalone uzyskano z obrazowania co 30°, 45° czy 60° (Rysunek 6B, dolny rząd). Zatem struktury kuliste, takie jak jądra komórkowe, można obrazować przy każdym z powyższych interwałów kątowych bez utraty informacji.
Do analizy granic komórek wykorzystano Tissue Analyzer23, wtyczkę do programu FIJI rutynowo stosowaną do segmentacji komórek24,25,26. Podobnie jak w przypadku Mastodon, wtyczkę Tissue Analyzer można dodać w sekcji „Manage Update Sites” w menu „Help” programu FIJI, a po dodaniu uzyskać do niej dostęp w menu wtyczek. Granice komórek segmentowano za pomocą algorytmu watershed z domyślnymi parametrami oraz silnym rozmyciem (strong blur) w zakresie od 1,5 do 2, zależnie od głębokości tkanki, oraz słabym rozmyciem (weak blur) o wartości 1. Parametry te pozostawały stałe we wszystkich analizach, co ułatwiło bezpośrednie porównanie. Podczas ręcznego porównania obrazów po segmentacji z oryginalnymi obrazami wejściowymi zaobserwowano błędy, polegające na tym, że oprogramowanie nie wykryło granicy komórki lub wyznaczyło nieistniejące granice komórek (Rysunek 6C, dolny rząd). Liczbę błędów popełnionych przez wtyczkę Tissue Analyzer znormalizowano do całkowitej liczby wykrytych w danym obszarze wiązań i obliczono jako „błąd segmentacji granic”. Choć błędy te występowały we wszystkich analizowanych obszarach, ich liczba drastycznie wzrosła w obrazach scalonych uzyskanych przy obrazowaniu w odstępach kątowych 45° i 60° w porównaniu do 30° (Rysunek 6D). Wskazuje to, że rozdzielczość w obrazach scalonych pogarszała się wraz ze zwiększaniem odstępu kątowego. Zatem w przypadku segmentacji drobniejszych struktur, takich jak granice komórek, mniejszy odstęp kątowy umożliwia łatwiejszą dalszą obróbkę danych.
<img alt="Etapy przygotowania i analizy próbek do oczyszczania białek przy użyciu wirówki i mikroskopii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie próbek z wykorzystaniem probówek polimerowych. (A) Za pomocą pęsety pobrano probówkę polimerową z przechowywanych probówek do mikrowirówki. (B) Mocowanie probówki do końcówki mikropipety o objętości 200 µL. (C) Aspiracja embrionów do probówki za pomocą pipety. (D,E) Probówka polimerowa z widocznymi na dnie embrionami w stadium pączkowania. (F) Probówki polimerowe umieszczone na szalce Petriego z medium E3 w celu zestalenia agarozy. (G) Przechowywanie probówek polimerowych w probówce do mikrowirówki wypełnionej medium E3. (H) Złożony uchwyt próbki z zamontowaną probówką polimerową. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Potok dekonwolucji wielowidokowej; schemat procesu i wyniki rejestracji w oprogramowaniu do obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przebieg analizy obrazów wielowidokowych i rejestracja z wykorzystaniem kulek. (A) Potok analizy obrazów wielowidokowych. (B) Obraz przedstawia okno „Multiview Explorer” w BigStitcher, wtyczce do FIJI, w której każdy widok pojawia się jako pojedynczy wiersz i zawiera informacje o kącie, kanale, rejestracji, punktach zainteresowania oraz PSF. Wszystkie polecenia omówione w protokole pojawiają się po wybraniu widoku i kliknięciu prawym przyciskiem myszy, co przedstawiono w menu rozwijanym. Wybrane widoki można zwizualizować w oknie BigDataViewer, jak pokazano na rysunku. (C) Reprezentatywny obraz kulek przed (lewo) i po rejestracji (prawo) uzyskany z obrazowania w odstępach kątowych 30°. Wszystkie widoki kątowe zostały wybrane i wyświetlone. Paski skali: 75 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Orientacje zarodków w fazie 70% epibolii i w stadium pączka; schemat osi i faz rozwojowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przegląd domyślnych orientacji zarodków. Reprezentatywne obrazy orientacji, jakie przyjmują zarodki wewnątrz chorionu w fazie 70% epibolii (A) oraz w stadiach pączka (B). Górny rząd w każdym panelu przedstawia obrazy w jasnym polu uzyskane z systemu arkusza świetlnego (light sheet), a dolny rząd przedstawia reprezentatywne schematy. Strzałki w (B) wskazują położenie notochordu, który służył do identyfikacji orientacji. Ap, biegun zwierzęcy; Vp, biegun roślinny; A, przednio; P, tylno. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procenty orientacji embrionów w 70% epibolii i w stadium pączka; wykres słupkowy; biologia rozwoju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Statystyka różnych orientacji embrionów. (A) Skumulowany słupek wskazuje procenty embrionów o określonych orientacjach w 70% epibolii, gdy próbki przygotowano przed gastrulacją. (B) Skumulowane słupki wskazują procenty embrionów o określonych orientacjach w stadium pączka, gdy próbki przygotowano przed gastrulacją (lewo), w 70% epibolii (środek) oraz w stadium pączka (prawo). N – liczba niezależnych miotów, z których pobrano embriony; n – całkowita liczba embrionów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wielowidokowe schematy rozkładu 3D jąder komórkowych embrionu, kąty 0°, 60°, 120°, orientacja osi przestrzennych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Reprezentacja jąder z embrionu zrekonstruowanego z wielu widoków. (A)Przedmiotowy Trójwymiarowy wykres punktowy przedstawia jądra wykryte w zarodku zrekonstruowanym z wielu widoków, obrazowanym pod kątem 30̛° przedział kątowy. Każde koło reprezentuje jądro komórkowe, a naniesiono centroidy pozycji jąder. Współrzędne jąder uzyskano za pomocą Mastodon, wtyczki do programu FIJI. (B) trójwymiarowe wykresy punktowe jąder z trzech reprezentatywnych widoków tego samego zarodka – przedstawienia te są 60° osobno. Kolory dla każdego jądra zostały przypisane losowo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wieloobrazowe obrazowanie zarodka; jądra komórkowe, detekcja granic (H2A-mCherry, Ut-GFP); kwantyfikacja błędów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Porównanie informacji w skali komórkowej w obrazach scalonych. (A) Obraz po lewej przedstawia ujęcie zrekonstruowanego wieloobrazowo zarodka na głębokości 20 µm od powierzchni. Żółte koło oznacza obszar wykorzystany do dalszej analizy. Paski skali: 50 µm (we wszystkich panelach). (B) Reprezentatywne surowe obrazy jąder komórkowych na głębokości 20 µm od powierzchni zarodka z trzech zestawów danych obrazowanych odpowiednio co 30°, 45° i 60° (góra). Jądra wykryte (na zielono) na tych samych obrazach przez Mastodon, wtyczkę do oprogramowania FIJI (dół). (C) Reprezentatywne surowe obrazy na głębokości 20 µm od powierzchni zarodka z trzech zestawów danych obrazowanych odpowiednio co 30°, 45° i 60°, z zastosowaniem markera aktyny, Utr-GFP (góra). Granice segmentowane przez Tissue Analyzer, wtyczkę do oprogramowania FIJI, przedstawione dla tych samych obrazów (dół). Strzałki wskazują błędy popełnione przez Tissue Analyzer podczas segmentacji granic, gdzie żółta strzałka oznacza brakującą granicę, a biała strzałka oznacza błędnie wykryte granice w miejscach, w których wizualnie nie występują żadne granice. (D) Wykres pudełkowy przedstawia procent błędów popełnionych przez Tissue Analyzer w zrekonstruowanych wieloobrazowo zarodkach obrazowanych co 30°, 45° i 60° na różnych głębokościach. Słupki błędów wskazują 1,5-krotność rozstępu międzykwartylnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Pomimo asymetrii wewnętrznej wzdłuż osi lewo-prawo, w większości organizmów wyższych struktury zewnętrzne, takie jak szkielet i mięśnie, rozwijają się w sposób symetryczny. Wykorzystując zarodki danio pręgowanego, łączymy obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości, analizę ilościową i modelowanie teoretyczne, aby zbadać zasady ustalania symetrii. Dziedzina ta w dużym stopniu zależy od różnych technik mikroskopowych do obrazowania rozwijających się zarodków z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, a następnie analizy ilościowej uzyskanych obrazów.Różne formy mikroskopii zapewniają wyjątkowe korzyści. Jednak w ostatnim czasie mikroskopia z użyciem cienkiego arkusza światła i mikroskopia superrozdzielcza na żywo znacznie poszerzyły nasze spojrzenie na dynamiczne procesy w rozwoju embrionalnym. Tradycyjna mikroskopia konfokalna i wielofotonowa często prowadzi do fotowybielania i fototoksyczności, a także do ograniczonego pola widzenia podczas obrazowania żywych zarodków.Wielowidokowy mikroskop z arkuszami świetlnymi rozwiązuje te problemy, umożliwiając dłuższe czasy obserwacji i rotację próbki. Nadal jednak istnieją wyzwania związane z przygotowaniem i montażem próbek do obrazowania przy użyciu tej techniki. Głównym ograniczeniem udanej sesji obrazowania jest odpowiednie zamontowanie i orientacja próbki.W tym miejscu opisujemy strategie montowania wczesnych zarodków danio pręgowanego do obrazowania w mikroskopie z wieloma arkuszami świetlnymi oraz ogólną procedurę pozyskiwania i rekonstrukcji obrazów wielowidokowych.

light-sheet-microscopy-imaging-mounting-strategies-for-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten artykuł opisuje przygotowanie próbki do mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych. Zademonstrowano również metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowego obrazowania, co pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Przygotowanie próbki do mikroskopii świetlnej: montaż żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Tutaj prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo do obrazowania poklatkowego przy użyciu światła przechodzącego i mikroskopii fluorescencyjnej. Kanapka z zanurzoną bibułą filtracyjną jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej1, która pozwala na hodowlę zarodków piskląt całkowicie zanurzonych w płynnej pożywce hodowlanej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

Naucz się strategii montażu zarodków danio pręgowanego w mikroskopii świetlnej. Ta metoda pozwala uzyskać obrazy komórkowej rozdzielczości na etapie 70% epibolii i stadium pąka.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów