Ekstrakcja DNA i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich

Nasza cząstka ma na celu ekstrakcję DNA krwi w prosty i wygodny sposób oraz porównanie stężeń DNA między nową i starą próbką muszek nekrofilskich. Próbujemy zbadać przypadek ekstrakcji DNA z czerwonej krwi, skutecznie ekstrahując DNA z muchy i czy istnieje zmiana między stężeniami DNA z nowej i starej próbki muszek nekrofilskich? Przedstawiliśmy metodę ekstrakcji DNA much za pomocą zwykłego zestawu do badania krwi, co rozwiązało problem drogiego i rzadkiego zestawu do ekstrakcji owadów, który toruje drogę do tworzenia zestawów do analizy biologii molekularnej.

Po rozwiązaniu problemu ekstrakcji DNA muchy, nekrofile file do czasu śmierci. Na początek należy złożyć muchy w ofierze octanem etylu i umieścić próbki w trzech fiolkach z gazem. Zważyć próbki i oznaczyć je jako świeże pierwszą, drugą i trzecią.

Następnie pobierz 2-letnie próbki przechowywane w probówkach wirówkowych wypełnionych alkoholem. Wchłonąć ciecz powierzchniową za pomocą bibuły filtracyjnej i zważyć próbki. Weź również 2-letnie próbki przechowywane w probówkach wirówkowych i zważ je.

Następnie dodaj niewielką ilość ciekłego azotu do pojemnika ze stali nierdzewnej i poczekaj, aż cały ciekły azot wyparuje. Umieść próbkę muchy w pojemniku i powoli wlewaj ciekły azot. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie i usunąć je po odparowaniu ciekłego azotu.

Oddziel klatkę piersiową indywidualnie, a następnie pokrój każdą klatkę piersiową. Umieść plastry w dwumililitrowej probówce wirówkowej. Na początek umieść przycięte próbki klatki piersiowej muchy w dwumililitrowej probówce wirówkowej.

Dodać 180 mikrolitrów buforu do lizy tkanek do probówki, a następnie 20 mikrolitrów proteinazy K.Vortex dokładnie przy 3,000 obr./min przez 10 sekund i inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza, aż tkanki zostaną poddane lizie. Po inkubacji ponownie wirować próbki przez 15 sekund. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy i dokładnie wymieszaj przez wirowanie.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów etanolu i ponownie wiruj przez 15 sekund. Następnie umieść kolumnę absorpcyjną DNA w dwumililitrowej probówce zbiorczej i odpipetuj mieszaninę do kolumny. Wirować przy 6 000 G przez jedną minutę.

Wylać przepływ do probówki zbiorczej. Umieść kolumnę w nowej probówce i dodaj 500 mikrolitrów buforu do usuwania białka. Wirować przez jedną minutę i odlać przepływ.

Przenieś kolumnę do nowej rury. Dodać 500 mikrolitrów buforu odsalającego i odwirować przy 20 000 G przez trzy minuty, aby wysuszyć membranę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu elucji DNA na membranę.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę, a następnie odwirowywać w temperaturze 6 000 G przez jedną minutę w celu elucji DNA. Przechowywać próbki DNA w zależności od potrzeb. Na początek wyekstrahuj DNA z próbek much za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, a następnie użyj czytnika mikropłytek, aby określić wartości OD260 i OD280, aby porównać czystość DNA i stężenie kwasów nukleinowych.

Następnie przygotuj roztwory wzorcowe fluorometru, dodając 190 mikrolitrów roztworu roboczego do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 0,5 mililitra. Następnie dodaj po 10 mikrolitrów do standardowych jeden i standardowych dwóch do roztworów roboczych. Trzymaj probówki z dala od światła przez co najmniej 15 minut.

Wymieszaj dwa mikrolitry testowego DNA ze 198 mikrolitrami roztworu roboczego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra i trzymaj mieszaninę w ciemności przez co najmniej 15 minut. Po 15 minutach włącz fluorometr i wybierz ustawienie dalekiego zasięgu pomiaru stężenia dsDNA. Przetestuj wzorzec pierwszy i wzorzec drugi, aby uzyskać krzywą standardową.

Następnie należy umieścić próbki do badania w dołkach testowych. Dostosuj objętość impulsu DNA do dwóch mikrolitrów i wykonaj pomiar. Aby zobrazować DNA, najpierw ustaw 20 mikrolitrów reakcji amplifikacji PCR.

Umieść probówki w termocyklerze i uruchom cykle PCR. Po PCR poddaj produkty elektroforezie w 2% żelu agarozowym, a następnie umieść żel w systemie obrazowania żelu w celu fotoanalizy. Ocena czystości wyekstrahowanego DNA za pomocą czytnika mikropłytek wykazała, że wszystkie świeże próbki i stara próbka miały stosunek OD260 do OD280 powyżej dwóch.

Z kolei stara próba druga wykazywała niższy stosunek. Stężenie DNA pochodzące z odczytów OD260 było najwyższe w świeżych próbkach, następnie w starej próbce pierwszej i najniższe w starej próbce drugiej. Analiza elektroforetyczna ujawniła prążki w zakresie od 250 do 400 par zasad, które były bardziej wyraźne w świeżych próbkach w porównaniu ze starymi.