Name: Ekstrakcja DNA i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji DNA z much nekrofilskich przy użyciu modyfikowanego zestawu do badań krwi. Porównaj stężenia DNA między świeżymi a starymi próbkami w celach biologii sądowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82060341,81560304) oraz przez Projekt Naukowo-Badawczy Platformy Innowacji Akademickich Prowincji Hainan (YSPTZX202134).

UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano łącznie pięć próbek C. megacephala: trzy próbki świeże (Fresh 1, Fresh 2 i Fresh 3), jedną próbkę przechowywaną w alkoholu przez 2 lata (Old 1) oraz jedną próbkę przechowywaną w suchym, szczelnym opakowaniu przez 2 lata wyłącznie z ochroną przed światłem (Old 2). Próbki należy oznakować zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
1. Ogólne przechowywanie i przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Wybór i przygotowanie próbek 
	UWAGA: Podczas stosowania octanu etylu w celu uśmiercenia much nekrofagicznych należy pracować pod wyciągiem (dygestorium). Przed ważeniem należy usunąć ciecz z powierzchni muchy.
	<ol>
		<li>Próbki świeże: Trzy zebrane próbki much, po uśmierceniu ich octanem etylu, umieścić w fiolkach gazowych. Zważyć i oznaczyć próbki jako Fresh 1, Fresh 2 oraz Fresh 3, a następnie niezwłocznie wykorzystać je w doświadczeniach. 
		UWAGA: Świeże próbki much w niniejszym protokole miały masy odpowiednio 56.8 mg, 49.3 mg i 52.1 mg.</li>
		<li>Próbka stara 1: Wyjąć próbki much uśmiercone octanem etylu i przechowywane w probówkach wirówkowych wypełnionych alkoholem przez 2 lata w szczelnym pojemniku, w ciemności, w temperaturze pokojowej. Zważyć próbkę po odsączeniu cieczy z powierzchni za pomocą papieru filtracyjnego; oznaczyć ją jako Old 1. 
		UWAGA: Masa próbki Old 1 w niniejszym protokole wynosiła 42.3 mg.</li>
		<li>Próbka stara 2: Wyjąć próbkę muchy uśmierconej octanem etylu i przechowywanej w probówce wirówkowej przez 2 lata w szczelnym pojemniku, w ciemności, w temperaturze pokojowej. Zważyć i oznaczyć jako Old 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie przed ekstrakcją
	<ol>
		<li>Dodać niewielką ilość ciekłego azotu, aby schłodzić stalowy pojemnik; odczekać do całkowitego odparowania ciekłego azotu.</li>
		<li>Umieścić próbkę muchy w pojemniku; powoli wlewać ciekły azot, aby zapobiec jego rozpryskiwaniu i gwałtownemu uderzeniu w próbkę owada.</li>
		<li>Zamrozić próbki w ciekłym azocie. Wyjąć próbki po odparowaniu ciekłego azotu.</li>
		<li>Oddzielić klatkę piersiową, umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 2 mL i pociąć na jak najmniejsze kawałki. 
		UWAGA: Próbkę należy pociąć na małe fragmenty, aby umożliwić jej całkowitą lize i uwolnienie znacznych ilości DNA.</li>
		<li>Powtórzyć powyższe kroki dla każdej muchy, mrożąc je osobno, a następnie przenosić do nowej probówki wirówkowej, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
UWAGA: Wszystkie etapy wirowania należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej (15-25 °C) w mikrowirówce. Wszystkie czynności muszą być wykonywane w ścisłym przestrzeganiu zasad aseptyki, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.
<ol>
	<li>Lizis tkanki
	<ol>
		<li>Do probówki do wirowania o pojemności 2 mL zawierającej pobraną próbkę dodać 180 µL buforu do lizy tkanek.</li>
		<li>Dodać 20 µL proteinazy K. Wymieszać dokładnie w wstrząsarze typu vortex z prędkością 3 000 rpm przez 10 s i inkubować w temperaturze 56 °C do całkowitej lizy tkanek owada. 
		UWAGA: Należy dodać więcej proteinazy K, jeśli tkanka nie została w pełni strawiona. Liza zazwyczaj kończy się w ciągu 1-3 h, czas lizy można również wydłużyć do całej nocy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie DNA
	<ol>
		<li>Wystrząsać w wstrząsarze typu vortex z prędkością 3 000 rpm przez 15 s. Do próbki dodać 200 µL buforu do lizy i wymieszać dokładnie w wstrząsarze typu vortex z prędkością 3 000 rpm przez 15 s.</li>
		<li>Dodać 200 µL etanolu (96-100%) i ponownie dokładnie wymieszać w wstrząsarze typu vortex z prędkością 3 000 rpm przez 15 s. 
		UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, bufor do lizy oraz etanol można dodać wspólnie w jednym kroku. Po dodaniu buforu do lizy i etanolu może wytrącić się biały osad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść mieszaninę pipetą do kolumny adsorpcyjnej do DNA umieszczonej w probówce do zbierania o pojemności 2 mL. Wirować z prędkością 6 000 × g przez 1 min. Odrzucić filtrat i probówkę do zbierania.</li>
	<li>Umieścić kolumnę adsorpcyjną do DNA z poprzedniego kroku w nowej probówce do zbierania o pojemności 2 mL, dodać 500 µL buforu do usuwania białek i wirować z prędkością 6 000 × g przez 1 min. Odrzucić filtrat i probówkę do zbierania.</li>
	<li>Przenieść kolumnę adsorpcyjną do DNA do nowej probówki do zbierania o pojemności 2 mL, dodać 500 µL buforu do odsalania i wirować z prędkością 20 000 × g przez 3 min, aby osuszyć membranę kolumny adsorpcyjnej do DNA. Odrzucić filtrat i probówkę do zbierania. 
		UWAGA: Ten etap wirowania zapewnia usunięcie wszelkich pozostałości etanolu przed następującą elucją. W przypadku pozostałości etanolu ponownie wirować z prędkością 20 000 × g przez 1 min.</li>
	<li>Umieścić kolumnę adsorpcyjną do DNA w czystej probówce do mikrowirowania o pojemności 2 mL, nanieść pipetą 100 µL buforu do elucji DNA bezpośrednio na membranę kolumny, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min, a następnie wirować z prędkością 6 000 × g przez 1 min w celu elucji. 
	UWAGA: Elucja z użyciem 100 µL (zamiast 200 µL) zwiększa końcowe stężenie DNA w eluarcie, ale zmniejsza całkowitą wydajność DNA. Aby zmaksymalizować wydajność DNA, należy powtórzyć elucję raz, zgodnie z opisem w kroku 2.8.</li>
	<li>Próbki DNA przechowywać w temperaturze 4 °C (do 1 tygodnia) lub -80 °C w przypadku przechowywania długoterminowego.</li>
</ol>
3. Oznaczanie stężenia DNA
<ol>
	<li>Wyznacz wartości OD 260 i OD 280 za pomocą czytnika mikropłytek, aby porównać czystość DNA i stężenie kwasów nukleinowych. Pomiar powtórz trzykrotnie dla każdej próbki.</li>
	<li>Wyznacz stężenie wyekstrahowanego DNA za pomocą fluorometru z użyciem dołączonego zestawu, wykonując trzy powtórzenia dla każdej próbki.
	<ol>
		<li>Odmień 190 µL roztworu roboczego do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 0,5 mL, odmień po 10 µL Standardu #1 i Standardu #2, dodaj je do roztworów roboczych i przechowuj w ciemności przez co najmniej 15 min. 
		UWAGA: Standard #1 i Standard #2 są precyzyjnie skalibrowane na określone stężenie DNA. Roztwory standardowe powinny być dokładnie przygotowane, aby zapewnić utworzenie poprawnej krzywej wzorcowej. Standard #1 to próbka dwuniciowego DNA (dsDNA) o stężeniu 0,2 ng/µL; Standard #2 to 2 000 ng/µL. Roztwór roboczy to barwnik, który wiąże się specyficznie z dsDNA.</li>
		<li>Odmień 2 µL testowego DNA i wymieszaj z 198 µL roztworu roboczego w probówce wirówkowej 0,5 mL, a następnie przechowuj w ciemności przez co najmniej 15 min. 
		UWAGA: Jeśli stężenie DNA jest niskie, dodaj 5 µL testowego DNA do 195 µL roztworu roboczego.</li>
		<li>Po 15 min włącz urządzenie i wybierz opcję dsDNA Concentration Measurement | Long Range. Najpierw przetestuj Standard #1, a następnie Standard #2, aby uzyskać krzywą wzorcową. 
		UWAGA: Roztwór standardowy należy wykorzystać w tym samym dniu, w którym został przygotowany; zbyt długie przechowywanie spowoduje wystąpienie dużego błędu krzywej wzorcowej.</li>
		<li>Umieść próbki do badania w dołkach pomiarowych jedna po drugiej, ustaw objętość dodawanego DNA na 2 µL, powtórz pomiar trzykrotnie, oblicz wartość średnią i zapisz wynik.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. PCR i detekcja elektroforetyczna
UWAGA: Sekwencję genu mitochondrialnego CO <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> o długości 278 bp wykorzystano do amplifikacji PCR z użyciem prawego primeru C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG oraz lewego primeru C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, a następnie przeprowadzono elektroforezę w 2% żelu agarozowym, aby potwierdzić efekt amplifikacji i zweryfikować długość produktów amplifikacji.
<ol>
	<li>Przygotować 20 µL mieszaniny do amplifikacji PCR, dodając 10 µL 2x Taq mix, 1 µL każdego z primerów, 5 µL ddH2O oraz 3 µL matrycy DNA; wymieszać dokładnie przez 10 s w wirówce.</li>
	<li>Zastosować następujące parametry cykli PCR: przedenaturacja 95 °C przez 10 min; denaturacja 95 °C przez 30 s, przyłączanie 48 °C przez 30 s, elongacja 72 °C przez 45 s przez łącznie 40 cykli; oraz końcowa elongacja 72 °C przez 10 min.</li>
	<li>Produkty po reakcji PCR poddać elektroforezie na 2% żelu agarozowym, a po elektroforezie umieścić je w systemie obrazowania żeli w celu analizy fotograficznej.</li>
</ol>

Assessing DNA Purity and Concentration in Fresh and Old Necrophilic Fly Samples

<ol><li>Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+entomology%3A+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">Forensic entomology: applications and limitations.</a> Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).</li>
<li>Wydra, J., Matuszewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optimal+post-eclosion+interval+while+estimating+the+post-mortem+interval+based+on+an+empty+puparium%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium.</a> Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).</li>
<li>Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+degradation+and+genetic+analysis+of+empty+puparia%3A+genetic+identification+limits+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology.</a> Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).</li>
<li>Odeniran, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+identification+and+distribution+of+Trypanosome-transmitting+Dipterans+from+cattle+settlements+in+Southwest+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria.</a> Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).</li>
<li>Wells, J. D., Stevens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+DNA-based+methods+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Application of DNA-based methods in forensic entomology.</a> Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).</li>
<li>Kotrba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+in+forensic+entomology-establishing+a+DNA+reference+library+of+potentially+forensic+relevant+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species.</a> J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).</li>
<li>Weedon, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SNP+chips+to+detect+rare+pathogenic+variants%3A+Retrospective%2C+population+based+diagnostic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation.</a> BMJ. 372, 214(2021).</li>
<li>Cai, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+availability+of+mitochondrial+DNA+cytochrome+oxidasegene+for+the+distinction+of+forensically+important+flies+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China.</a> Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).</li>
<li>Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+chitin%2C+chitosan+and+their+melanin+complexes+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects.</a> Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).</li>
<li>Guo, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+DNA+extracting+methods+from+different+parts+of+common+necrophagous+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Henan+Univ+Sci+Tech+%28Med+Sci%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies.</a> J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).</li>
<li>Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+methods+obtain+high-quality+DNA+and+RNA+from+anaerobic+activated+sludge+at+a+wide+range+of+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures.</a> J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J Vis Exp. (48), e2699(2011).</li>
<li>Masago, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+DNA+and+RNA+extracted+from+frozen+and+FFPE+tissues+from+lung+cancer+patients%3A+A+real-world+use+of+genomic+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests.</a> Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).</li>
<li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+cell-free+DNA+%28cfDNA%29+in+malignant+melanoma+and+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients.</a> Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).</li>
<li>Adams, Z. J., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+used+for+the+killing+and+preservation+of+blowfly+larvae%2C+and+their+effect+on+post-mortem+larval+length%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length.</a> Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).</li>
<li>Fliegerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+extraction+and+sample+preservation+method+on+rumen+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population.</a> Anaerobe. 29, 80-84 (2014).</li>
<li>Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+taxonomy+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29+with+emphasis+on+DNA+barcoding%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review.</a> Acta Trop. 238, 106778(2023).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ekstrakcja DNA jest najkrytyczniejszym etapem w molekularnej identyfikacji much nekrofilnych, a zastosowana metoda ekstrakcji oraz jakość wyizolowanego DNA bezpośrednio wpływają na późniejszą detekcję. W niniejszym doświadczeniu z powodzeniem wyekstrahowano DNA z much nekrofilnych przy użyciu powszechnie dostępnego zestawu do izolacji DNA z krwi, bez konieczności zakupu specjalistycznego zestawu do ekstrakcji DNA z owadów, co ułatwia proces izolacji DNA z tych organizmów.
Powierzchnia much jest bogata w chitynę, szczególnie w stadiach larwalnym i poczwarki, gdzie chityna epidermalna może stanowić 60-70%, co utrudnia ekstrakcję DNA z much nekrofilnych9. Podczas procesu ekstrakcji zauważyliśmy, że jeśli próbka była wilgotna, mimo odpowiedniego rozdrobnienia, pozostawała ona żelowata po zastosowaniu proteinazy K w celu trawienia. Uniemożliwiało to powrót dodanego płynu przez kolumnę adsorpcyjną. Aby rozwiązać ten problem, najpierw zastosowaliśmy ciekły azot, aby szybko zamrozić próbki, dzięki czemu muchy stały się kruche i łatwe do rozcierania, a także łatwiejsze do pełnego strawienia. Jeśli ciekły azot nie jest dostępny do rozcierania, a wydajność ekstrakcji DNA nadal wymaga poprawy, próbki much można umieścić w wentylowanym obszarze na około 48 h. Należy pozwolić próbkom wyschnąć przed ich odpowiednim rozdrobnieniem i późniejszą ekstrakcją DNA.
Biorąc pod uwagę, że degradacja DNA w starych próbkach stanowiła większy problem, w tym eksperymencie do ekstrakcji DNA wybrano próbki klatki piersiowej much z uwagi na wysoką zawartość DNA w tym regionie. Jednakże, wykorzystanie klatki piersiowej zbyt mocno narusza integralność morfologiczną muchy, co uniemożliwia pełne zachowanie późniejszych dowodów oraz utrudnia identyfikację morfologiczną. Próbki są trudne do wyizolowania, gdy klatka piersiowa ulega rozkładowi. W przypadku świeżych próbek korzystniejsza może być ekstrakcja DNA z odnóża i skrzydła. Odnóża i skrzydła są rozmieszczone symetrycznie i obustronnie, dzięki czemu po ekstrakcji tkanki z jednej strony można zachować pełniejsze cechy morfologiczne. Jednakże stężenie DNA ekstrahowanego ze skrzydła i odnóża jest stosunkowo niskie, co niesie ze sobą ryzyko w przypadku dalszych badań. Ponadto próbki były małe i łatwo było je zagubić10.
Podczas stosowania zestawu do ekstrakcji DNA w celu wyodrębnienia DNA, wartości OD260/OD280 zmierzone za pomocą czytnika mikropłytek były większe niż 2, z wyjątkiem starej próbki 2. Po pierwsze, można stwierdzić, że białko zostało usunięte dokładniej, jednak w starych próbkach może występować kontaminacja RNA, pęknięcia dwuniciowe DNA spowodowane wielokrotną wirówką lub degradacja DNA11. Po drugie, może to również wskazywać na to, że alkohol przedłuża konserwację RNA.
Stężenie DNA oblicza się na podstawie wartości OD260 odczytanej z czytnika mikropłytek, natomiast w przypadku fluorometru Qubit najpierw wyznacza się krzywą wzorcową, a następnie mierzy wartość absorbancji, aby obliczyć stężenie DNA. Obie metody umożliwiają pomiar śladowych stężeń DNA, lecz każda z nich ma swoje zalety i wady: czytnik mikropłytek wykorzystuje OD260 do obliczenia stężenia DNA, jednak zastosowana metoda obliczeń jest jedynie szacunkiem. Jeśli próbka jest zanieczyszczona dużą ilością nukleotydów, białek lub innych substancji absorbujących światło ultrafioletowe, błąd fotometryczny będzie większy, dlatego należy starać się usunąć je przed analizą.
Czytniki mikropłytek i spektrofotometry UV wykorzystują absorbancję w zakresie UV do detekcji, która nie pozwala na rozróżnienie między DNA, RNA, zdegradowanymi kwasami nukleinowymi, wolnymi nukleotydami a innymi zanieczyszczeniami; ponadto absorbancja jest w dużym stopniu wpływana przez zanieczyszczenia innymi substancjami, co sprawia, że odczyty są stosunkowo niewiarygodne. Podczas analizy próbek, które zazwyczaj mierzy się w ilości kropli, nanosi się je bezpośrednio bez rozcieńczania lub obróbki, co umożliwia jednoczesny pomiar wielu próbek i bezpośrednie obliczenie czystości DNA na podstawie pomiarów OD260/OD280. Z kolei fluorometr Qubit został zaprojektowany do pomiaru wyłącznie stężenia dwuniciowego DNA poprzez zastosowanie dwóch roztworów standardowych o znanym stężeniu w celu wyznaczenia krzywej wzorcowej oraz wykorzystanie właściwości barwników fluorescencyjnych, które wiążą się specyficznie z dwuniciowym DNA. Jednak każda próbka wymaga indywidualnego przygotowania i osobnego pomiaru, co jest uciążliwe przy analizie serii próbek, a dodatkowo nie można zmierzyć czystości wyizolowanego DNA. W konkretnych zastosowaniach można wybrać jedną z tych dwóch metod w zależności od własnych potrzeb w zakresie kontroli jakości DNA12,13,14.
Stężenie DNA w świeżych próbkach było wyższe niż w starych próbkach przechowywanych w alkoholu oraz wyższe niż w niepoddanych konserwacji starych próbkach, niezależnie od tego, czy stężenie DNA mierzono za pomocą czytnika mikropłytek, czy fluorometru Qubit. W celu długotrwałego przechowywania próbki można zanurzyć w alkoholu, aby zapobiec wzrostowi bakterii i grzybów15,16.
Różne metody pomiarowe miały mniejszy wpływ na pomiary DNA w starych próbkach bez żadnej obróbki, prawdopodobnie dlatego, że stare próbki były bardziej zdegradowane, a w szczególności białka i RNA mogły ulec szybszej degradacji niż DNA. W przeciwieństwie do nich, świeże próbki zawierały więcej białek i RNA, co w konsekwencji miało większy wpływ na wyniki. Jeśli porównuje się wyłącznie stężenia dwuniciowego DNA, należy stosować wyniki z fluorometru Qubit; wyniki naszych eksperymentów wykazały również istotny gradient stężenia DNA w próbkach starych i nowych.
Zawartość DNA w próbkach świeżych i starych po ekstrakcji DNA może być wykorzystana do dalszych analiz biologii molekularnej. W tym eksperymencie startery do mitochondrialnego genu CO <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> miały długość zaledwie 278 bp, a wszystkie z nich zostały pomyślnie amplifikowane z DNA. Gen mitochondrialny CO <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> jest z kolei locus rozpoznawalnym u much ze względu na potencjał w kodowaniu kreskowym DNA (DNA barcoding), co pozwala na identyfikację gatunków much nekrofilnych poprzez późniejszą analizę sekwencjonowania17. Analizy biologii molekularnej próbek przechowywanych dłużej można pomyślnie przeprowadzić, dobierając startery do innych, krótszych sekwencji DNA. Warto zauważyć, że w próbkach starych prążki elektroforetyczne pojawiły się w dwóch różnych pozycjach z krótszymi sekwencjami, co prawdopodobnie wynikało z niespecyficznej amplifikacji starterów spowodowanej degradacją DNA w połączeniu z niską temperaturą przyłączania.
Jednakże w tym eksperymencie zachowano mniej próbek przez dłuższy czas, aby zaspokoić potrzebę powtarzania doświadczeń, podczas gdy wyniki wymagały jedynie próbek reprezentatywnych. W związku z tym nie przeprowadzono testu powtarzalności, który mógłby mieć charakter badawczy w odniesieniu do przechowywania starych i nowych próbek, ale nie wpływa on na pomyślną ekstrakcję z próbek much nekrofagicznych.
Podsumowując, zastosowanie zestawu do ekstrakcji DNA z krwi może również pomóc w ekstrakcji DNA much nekrofilnych. Pomyślną ekstrakcję można przeprowadzić zarówno w przypadku próbek starych, jak i nowych, a całe wyekstrahowane DNA może zostać wykorzystane do dalszych analiz. Alkohol jest również korzystny dla długoterminowego przechowywania próbek DNA much.

<a href="https://app.jove.com/t/6604">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66737">10.3791/66737</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66737">DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples</a>. The Authors section was updated.

Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Ustalenie czasu zgonu od zawsze było jedną z kluczowych i trudnych kwestii do rozstrzygnięcia w praktyce sądowej. W praktyce medycyny sądowej, w przypadku spraw karnych, określenie odstępu pośmiertnego odgrywa kluczową rolę w dedukcji czasu popełnienia przestępstwa, wskazaniu podejrzanego oraz zawężeniu zakresu śledztwa. Tradycyjne metody ustalania czasu zgonu opierają się głównie na wczesnych zjawiskach pośmiertnych, które zazwyczaj można wykorzystać do określenia czasu zgonu w ciągu 24 h. Jednakże w przypadku dłuższego czasu od zgonu nie można go ustalić na podstawie samych zjawisk pośmiertnych. Obecnie w środowisku medycyny sądowej powszechnie uznaje się, że entomologia sądowa ma potencjał, aby stać się skuteczną metodą ustalania dłuższego czasu zgonu.
Owady nekrofagiczne biorą swoją nazwę od larw, które żywią się zwłokami. Wśród nich, w przypadku obecności ciała, dorosłe muchy nekrofilne są pierwszymi, które docierają do zwłok, aby złożyć jaja lub larwy. Larwy żywią się tkankami ciała i dojrzewają do stadium poczwarki, z której wykluwają się osobniki dorosłe. Muchy nekrofilne odgrywają ogromną rolę w praktyce kryminalistycznej ze względu na swój regularny cykl życiowy i rozmieszczenie geograficzne, co pozwala na przykład na określenie czasu i miejsca zgonu1,2. Jednakże barierą w wykorzystaniu much nekrofilnych w praktyce sądowej jest identyfikacja gatunków. Metody morfologiczne wciąż są stosowane jako autorytatywna metoda identyfikacji gatunków much nekrofilnych. Jednakże morfologiczna identyfikacja gatunków wymaga wysokiego stopnia nienaruszalności owada. Jeśli muchy znajdują się w różnych stadiach rozwojowych lub wykazują zmiany morfologiczne spowodowane czynnikami środowiskowymi, utrudnia to badanie morfologiczne. W szczególności morfologia poczwarek i łupin poczwarek, które najczęściej znajduje się na miejscu zbrodni, jest niemal nierozpoznawalna. To, w połączeniu z niedoborem ekspertów od morfologii, sprawia, że identyfikacja gatunków metodami morfologicznymi jest niezwykle trudna. Dlatego pojawiło się zastosowanie metod biologii molekularnej do identyfikacji gatunków much, co zmniejsza trudności związane z identyfikacją morfologiczną i jest niezależne od stadium rozwojowego3,4,5,6,7.
Pierwszym krokiem w identyfikacji gatunkowej much nekrofagicznych z wykorzystaniem metod biologii molekularnej jest efektywna ekstrakcja DNA, podczas gdy specjalistyczne zestawy do izolacji DNA z owadów nie są obecnie powszechnie dostępne. W związku z tym, kwestia wykorzystania powszechnie stosowanych zestawów do izolacji DNA z krwi w przypadku much nekrofagicznych nabiera większego znaczenia w kontekście kryminalistycznym. Muchy nekrofagiczne znalezione na miejscach zbrodni są często zmasakrowane lub uległy rozkładowi i degradacji DNA. Próbki much nie zawsze są dostępne do ekstrakcji DNA bezpośrednio po ich pozyskaniu, a jeśli są, konieczne może być zachowanie całych próbek ze względu na wymogi zabezpieczenia materiału dowodowego. Opierając się na powyższych wymaganiach, w niniejszym badaniu zastosowaliśmy zestaw do izolacji DNA z krwi oparty na trawieniu proteinazą K i wybraliśmy trzy świeże Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) próbki (Rysunek 1), jeden stary *C. megacephala* próbkę umieszczono w alkoholu na dwa lata oraz jedną *C. megacephala* próbkę umieszczono w warunkach przechowywania z ochroną przed światłem na dwa lata, zważono każdą z pięciu próbek i wybrano tkankę klatki piersiowej owada do ekstrakcji DNA. W celu porównania jakości i czystości DNA wyekstrahowanego z próbek starych i nowych przeprowadzono amplifikację PCR oraz elektroforezę wyekstrahowanego DNA z użyciem starterów specyficznych dla much nekrofagicznych, zlokalizowanych w mitochondrialnym genie CO1 <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> sekwencja genu

<table><tbody><tr><td>Bufor AE</td><td>Qiagen</td><td>172026832</td><td>Bufor elucyjny DNA</td></tr><tr><td>Bufor AL</td><td>Qiagen</td><td>172028374</td> bufor <td>do lizy</td></tr><tr><td>Bufor ATL</td><td>Qiagen</td><td>172028162</td><td>bufor do lizy tkanek</td></tr><tr><td>Bufor AW1</td><td>Qiagen</td><td>172028760</td> do <td>usuwania białek</td></tr><tr><td>Bufor AW2</td><td>Qiagen</td><td>57203108</td><td>odsalania</td></tr><tr><td>C1-J-2495</td><td>Podkład do przedmówek</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109216</td></tr><tr><td>C1-N-2800</td><td>Podkład odwrócony</td><td>Taihe Biotechnology</td><td></td></tr><tr><td>TW21109217 Drabinka DNA D2000</td><td>Czas rzeczywisty (Pekin) Biotechnologia</td><td>RTM415</td><td>Zmierz położenie pasm elektroforetycznych</td></tr><tr><td>DNeasy Mini kolumna wirowa</td><td>Qiagen</td><td>166050343</td><td>kolumna adsorpcyjna DNA</td></tr><tr><td>Inkubator do suchej kąpieli</td><td>Miulab</td><td>DKT200-2D</td><td>używany do podgrzewania</td></tr><tr><td>MIX-30S Mini mikser</td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td><td>działanie oscylacyjne</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>172026218</td><td>Inaktywacja wewnątrzkomórkowych nukleaz i innych białek</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 3.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2321611188</td><td></td></tr><tr><td>Szybka mikrowirówka</td><td>Scilogex</td><td>9013001121</td><td>Wirówka</td></tr><tr><td>Standard#1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Standard#2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 3500R Gel Imager</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>Obrazowanie żelem</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Mix</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Mix</td></tr><tr><td>Thermo Cycler</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td> zwykłym roztworem roboczym <td>do PCR</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja dna i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich

DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Łącznie pięć próbek próbek Chrysomya megacephala - trzy świeże próbki, jedna próbka przechowywana w alkoholu przez 2 lata i jedna próbka przechowywana w suchym, zamkniętym magazynie przez 2 lata chronionym tylko przed światłem - zostały wybrane do zbadania, czy zestaw do ekstrakcji DNA krwi może wyekstrahować DNA od nekrofilskich muszek i określić, czy alkohol może przedłużyć zachowanie DNA nekrofilskich muszek. Po pierwsze, zestaw do ekstrakcji DNA krwi został użyty do ekstrakcji DNA z tkanek klatki piersiowej. Następnie badano czystość i stężenie DNA za pomocą czytnika mikropłytek i fluorometru. Na koniec amplifikację PCR i elektroforezę wyekstrahowanego DNA przeprowadzono za pomocą nekropilicznych starterów specyficznych dla much, zlokalizowanych w mitochondrialnej sekwencji genu CO I. Wyniki wykazały, że czystość DNA wszystkich próbek była większa niż 2,0. Zaobserwowano, że stężenie DNA jest następującego: świeże próbki > stare próbki zakonserwowane alkoholem > niepoddane obróbce, stare próbki. Wszystkie próbki miały specyficzne prążki elektroforetyczne po amplifikacji PCR. Podsumowując, zestaw do ekstrakcji DNA krwi może być użyty do pomyślnego wyodrębnienia DNA z muszek nekrofilskich, a stężenie DNA w próbkach świeżych much jest większe niż w próbkach starych much. Muchy mogą być przechowywane w alkoholu przez długi czas.

Do pomiaru wartości OD260 i OD280 ekstrahowanego roztworu DNA wykorzystaliśmy czytnik mikropłytek, a następnie wyznaczyliśmy stosunki OD260/OD280 w celu oceny czystości DNA. Wartość OD260/OD280 dla wszystkich świeżych próbek oraz starej próbki 1 była większa niż 2. Wartość OD260/OD280 dla starej próbki 2 osiągnęła maksymalnie 2,187, choć średnia wynosiła 1,753, a trzy pomiary wykazywały duże wahania ze względu na niskie wartości (≤0,01) zarówno dla OD260, jak i OD280 (Tabela 1). Na podstawie uzyskanych wartości OD260 oszacowano stężenie DNA. Stężenie DNA dla trzech grup wynosiło odpowiednio: świeże próbki &gt; stara próbka 1 &gt; stara próbka 2 (pomiar czytnikiem mikropłytek), jednak różnica między próbkami świeżymi a starymi była niewielka i wynosiła jedynie ~10-20 ng/µL (Tabela 1). Jednocześnie stężenie DNA w trzech świeżych próbkach zmierzone fluorometrem Qubit było wyższe od pomiaru czytnikiem mikropłytek o 125-130 ng/µL, przy różnicy 15 ng/µL w starej próbce 1 i jedynie 1,3 ng/µL w starej próbce 2. Stężenie DNA: świeże próbki &gt; stara próbka 1 &gt; stara próbka 2 (Tabela 2).
DNA wyizolowany za pomocą obecnie stosowanej metody ekstrakcji zawiera wszystkie komponenty DNA z różnych źródeł obecnych w próbce. Oznacza to, że roztwór DNA nie był wyłącznie roztworem genomicznego DNA muchy. Primery do specyficznej amplifikacji fragmentów genu mitochondrialnego CO <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> muchy zostały wybrane na podstawie literatury i zweryfikowane za pomocą NCBI-Blast Primer. Wyniki wykazały, że primer forward C1-J-2495 oraz primer reverse C1-N-2800 genu mitochondrialnego CO <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> są primerami specyficznymi dla much, wykazują polimorfizm sekwencji i obejmują wiele gatunków much. Wyniki amplifikacji nie wykazały obecności genów ludzkich. Stanowiły one parę wiarygodnych biomarkerów DNA do identyfikacji much nekrofagicznych i zostały wybrane do weryfikacji wyników niniejszego eksperymentu.
Wszystkie badane próbki wykazały wyraźne prążki elektroforetyczne o długościach w zakresie 250 bp-400 bp. Prążki w próbkach świeżych były jaśniejsze niż w próbkach starych, a stare próbki z dodatkiem alkoholu (Rycina 2, Old1) były jaśniejsze niż niepoddane obróbce stare próbki (Rycina 2, Old2), jednak w próbkach starych pojawiły się również dwa prążki w innych pozycjach. W kontroli ujemnej nie stwierdzono obecności prążków (Rycina 2).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Zdjęcia Chrysomya megacephala pod różnymi kątami. (A) samiec; (B) samica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Elektroforegram produktów amplifikacji PCR. Pierwsze trzy prążki od lewej to produkty amplifikacji PCR DNA z próbek świeżych much. Czwarty prążek elektroforetyczny to produkt PCR DNA ze starej próbki muchy konserwowanej w alkoholu. Piąty prążek to produkt PCR DNA ze starej próbki muchy bez żadnej specjalnej konserwacji. Szósty prążek to kontrola ujemna; jest on czysty, co dowodzi, że podczas amplifikacji PCR nie doszło do kontaminacji. Po prawej stronie znajduje się drabinka DNA, w której zaznaczono pozycje DNA o długościach 250 bp i 400 bp. Prążki elektroforetyczne produktów PCR wszystkich próbek znajdowały się nieco powyżej 250 bp i poniżej prążków drabinki 400 bp. Pozycja ta odpowiada długości docelowego genu o wielkości 278 bp. Gołym okiem widać, że prążki DNA reprezentujące świeże próbki są jaśniejsze niż prążki ze starych próbek. Próbki stare zawierają inne prążki DNA, obecne w formie mniej intensywnych genów niedocelowych o różnych długościach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Próbka</td >
			<td >Fresh1</td >
			<td >Fresh2</td >
			<td >Fresh3</td >
			<td >Old1</td >
			<td >Old2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >OD260/OD280</td >
			<td >2.354±0.036</td >
			<td >2.245±0.027</td >
			<td >2.060±0.038</td >
			<td >2.143±0.012</td >
			<td >1.753±0.421</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >DNA(ng/µL)</td >
			<td >119.91±1.686</td >
			<td >116.084±4.965</td >
			<td >95.239±3.401</td >
			<td >86.845±6.14</td >
			<td >10.151±0.168</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Pomiar czystości i stężenia DNA za pomocą czytnika mikropłytek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Świeży1</td>
			<td>Świeże2</td>
			<td>Świeże3</td>
			<td>Stary1</td>
			<td>Stary2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA(ng/&#181;L)</td>
			<td>243.333&#177;1.528</td>
			<td>237.667&#177;2.082</td>
			<td>226.000&#177;2.000</td>
			<td>101.000&#177;0.000</td>
			<td>11.433&#177;0.058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Pomiar stężenia DNA za pomocą fluorometru.

Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji DNA świeżych i starych nekrofilskich much przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do ekstrakcji DNA.

Ekstrakcja DNA i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich

A total of five samples of Chrysomya megacephala samples - three fresh samples, one sample stored in alcohol for 2 years, and one sample stored in dry ...

Nasza cząstka ma na celu ekstrakcję DNA krwi w prosty i wygodny sposób oraz porównanie stężeń DNA między nową i starą próbką muszek nekrofilskich. Próbujemy zbadać przypadek ekstrakcji DNA z czerwonej krwi, skutecznie ekstrahując DNA z muchy i czy istnieje zmiana między stężeniami DNA z nowej i starej próbki muszek nekrofilskich? Przedstawiliśmy metodę ekstrakcji DNA much za pomocą zwykłego zestawu do badania krwi, co rozwiązało problem drogiego i rzadkiego zestawu do ekstrakcji owadów, który toruje drogę do tworzenia zestawów do analizy biologii molekularnej.Po rozwiązaniu problemu ekstrakcji DNA muchy, nekrofile file do czasu śmierci. Na początek należy złożyć muchy w ofierze octanem etylu i umieścić próbki w trzech fiolkach z gazem. Zważyć próbki i oznaczyć je jako świeże pierwszą, drugą i trzecią.Następnie pobierz 2-letnie próbki przechowywane w probówkach wirówkowych wypełnionych alkoholem. Wchłonąć ciecz powierzchniową za pomocą bibuły filtracyjnej i zważyć próbki. Weź również 2-letnie próbki przechowywane w probówkach wirówkowych i zważ je.Następnie dodaj niewielką ilość ciekłego azotu do pojemnika ze stali nierdzewnej i poczekaj, aż cały ciekły azot wyparuje. Umieść próbkę muchy w pojemniku i powoli wlewaj ciekły azot. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie i usunąć je po odparowaniu ciekłego azotu.Oddziel klatkę piersiową indywidualnie, a następnie pokrój każdą klatkę piersiową. Umieść plastry w dwumililitrowej probówce wirówkowej. Na początek umieść przycięte próbki klatki piersiowej muchy w dwumililitrowej probówce wirówkowej.Dodać 180 mikrolitrów buforu do lizy tkanek do probówki, a następnie 20 mikrolitrów proteinazy K.Vortex dokładnie przy 3,000 obr./min przez 10 sekund i inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza, aż tkanki zostaną poddane lizie. Po inkubacji ponownie wirować próbki przez 15 sekund. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy i dokładnie wymieszaj przez wirowanie.Następnie dodaj 200 mikrolitrów etanolu i ponownie wiruj przez 15 sekund. Następnie umieść kolumnę absorpcyjną DNA w dwumililitrowej probówce zbiorczej i odpipetuj mieszaninę do kolumny. Wirować przy 6 000 G przez jedną minutę.Wylać przepływ do probówki zbiorczej. Umieść kolumnę w nowej probówce i dodaj 500 mikrolitrów buforu do usuwania białka. Wirować przez jedną minutę i odlać przepływ.Przenieś kolumnę do nowej rury. Dodać 500 mikrolitrów buforu odsalającego i odwirować przy 20 000 G przez trzy minuty, aby wysuszyć membranę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu elucji DNA na membranę.Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę, a następnie odwirowywać w temperaturze 6 000 G przez jedną minutę w celu elucji DNA. Przechowywać próbki DNA w zależności od potrzeb. Na początek wyekstrahuj DNA z próbek much za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, a następnie użyj czytnika mikropłytek, aby określić wartości OD260 i OD280, aby porównać czystość DNA i stężenie kwasów nukleinowych.Następnie przygotuj roztwory wzorcowe fluorometru, dodając 190 mikrolitrów roztworu roboczego do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 0,5 mililitra. Następnie dodaj po 10 mikrolitrów do standardowych jeden i standardowych dwóch do roztworów roboczych. Trzymaj probówki z dala od światła przez co najmniej 15 minut.Wymieszaj dwa mikrolitry testowego DNA ze 198 mikrolitrami roztworu roboczego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra i trzymaj mieszaninę w ciemności przez co najmniej 15 minut. Po 15 minutach włącz fluorometr i wybierz ustawienie dalekiego zasięgu pomiaru stężenia dsDNA. Przetestuj wzorzec pierwszy i wzorzec drugi, aby uzyskać krzywą standardową.Następnie należy umieścić próbki do badania w dołkach testowych. Dostosuj objętość impulsu DNA do dwóch mikrolitrów i wykonaj pomiar. Aby zobrazować DNA, najpierw ustaw 20 mikrolitrów reakcji amplifikacji PCR.Umieść probówki w termocyklerze i uruchom cykle PCR. Po PCR poddaj produkty elektroforezie w 2% żelu agarozowym, a następnie umieść żel w systemie obrazowania żelu w celu fotoanalizy. Ocena czystości wyekstrahowanego DNA za pomocą czytnika mikropłytek wykazała, że wszystkie świeże próbki i stara próbka miały stosunek OD260 do OD280 powyżej dwóch.Z kolei stara próba druga wykazywała niższy stosunek. Stężenie DNA pochodzące z odczytów OD260 było najwyższe w świeżych próbkach, następnie w starej próbce pierwszej i najniższe w starej próbce drugiej. Analiza elektroforetyczna ujawniła prążki w zakresie od 250 do 400 par zasad, które były bardziej wyraźne w świeżych próbkach w porównaniu ze starymi.

dna-extraction-comparison-between-old-fresh-necrophilic-fly

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować mózg dorosłego Drosophila - procedura niezbędna do wizualizacji narządu, który w przeciwnym razie jest zasłonięty przez naskórek, oko i tkankę tchawicy. Przykładowy protokół przedstawia szczegółową demonstrację dającą wysokiej jakości preparaty, które można stosować do barwienia immunologicznego i metod obrazowania w neurobiologii Drosophila.

Drosophila Sekcja mózgu osoby dorosłej: metoda w neurobiologii much

Opisujemy tutaj procedury ekstrakcji i oczyszczania mRNA i metabolitów z głów Drosophila. Stosujemy te techniki, aby lepiej zrozumieć perturbacje komórkowe leżące u podstaw degeneracji neuronów. Metodologie te można łatwo skalować i dostosowywać do innych projektów "omicznych".

Oczyszczanie transkryptów i metabolitów z głów Drosophila

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Mózg dorosłego Drosophila jest cennym systemem do badania obwodów neuronalnych, wyższych funkcji mózgu i złożonych zaburzeń. Skuteczna metoda wycinania całej tkanki mózgowej z małej głowy muchy ułatwi badania oparte na mózgu. Tutaj opisujemy prosty, jednoetapowy protokół preparacji dorosłych mózgów o dobrze zachowanej morfologii.

Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Celem tej procedury jest wypreparowanie tkanki mięśnia podłużnego grzbietu (DLM) w celu oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych DLM (NMJs) w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy użyciu Drosophila melanogaster.

Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły zadawania penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu (PTBI) dorosłym Drosophila i badania wynikającej z tego neurogenezy.

Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila

Poznaj metodę ekstrakcji DNA z much nekrofilskich przy użyciu modyfikowanego zestawu do badań krwi. Porównaj stężenia DNA między świeżymi a starymi próbkami w celach biologii sądowej.

Ekstrakcja DNA i porównanie starych i świeżych próbek much nekrofilskich

Przeglądaj więcej filmów