Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków
May 31st, 2024
Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.
Nasza grupa badawcza zajmuje się opracowywaniem leków na chorobę Chagasa. Szukamy nowych i lepszych leków, a także próbujemy zrozumieć, w jaki sposób pasożyt Trypanosoma cruzi może przetrwać w żywicielu i przetrwać nawet po skutecznym leczeniu farmakologicznym bez rozwoju oporności na leki. Choroba Chagasa jest złożoną infekcją ogólnoustrojową, która wymaga skutecznego leczenia parazytologicznego przed wystąpieniem skomplikowanej choroby.
Choroba objawia się w różnych formach u ludzi, ale modele zwierzęce nie są jeszcze w stanie odtworzyć wszystkich ważnych aspektów choroby. Idealnie byłoby, gdyby nowe leki przeciwpasożytnicze na chorobę Chagasa sprzyjały leczeniu parazytologicznemu, czyli zwalczaniu pasożytów Trypanosoma cruzi od żywiciela. Protokoły te umożliwiają śledzenie w czasie rzeczywistym obciążenia pasożytami u myszy i odróżnianie związków, które tylko przejściowo hamują pasożytnictwo, od tych, które mogą sprzyjać leczeniu parazytologicznemu.
Ze względu na zastosowanie lucyferazy jako reportera Trypanosoma cruzi, protokół ten pozwala na nieinwazyjne, zmniejszone wykorzystanie zwierząt i podłużne monitorowanie myszy zarówno podczas ostrej, jak i przewlekłej infekcji, a także umożliwia monitorowanie infekcji trzewnej w czasie rzeczywistym. Korzystając z podobnego protokołu, opracowujemy nowe metody pozwalające zrozumieć, w jaki sposób terapia lekowa może przynieść korzyści gospodarzowi, zapobiegając wystąpieniu choroby Chagasa i lecząc skomplikowaną chorobę Chagasa. Będziemy również kontynuować badania nad czynnikami utrudniającymi unikanie leczenia farmakologicznego przez Trypanosoma cruzi.
Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do obrazowania na pulpicie. Kliknij Akwizycja, a następnie Tło i Wyświetl dostępną ciemną opłatę, aby zweryfikować automatyczne dostosowanie tła. Po dostosowaniu oprogramowania do obrazowania wstrzyknij D-lucyferynę pierwszym trzem myszom zakażonym Trypanosoma cruzi.
Umieść myszy w pojemniku, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków D-lucyferyny. Rób notatki, jeśli tak się stanie, i zarejestruj grupę myszy i czas wstrzyknięcia D-lucyferyny. Następnie znieczul myszy i przenieś je do komory obrazowania.
Przejdź do okna Akwizycja w oprogramowaniu do obrazowania i ustaw czas ekspozycji oraz binowanie. Teraz kliknij Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie. Jeśli widoczny jest znak ostrzegawczy nasyconego obrazu, zmniejsz binowanie, a następnie uzyskaj nowy obraz.
Obciążenie pasożytami wywnioskowane z bioluminescencji wzrosło w ciągu pierwszych 20 dni po zakażeniu. Po tym nastąpił gwałtowny spadek obciążenia pasożytami w ciągu następnych 30 dni, co było wynikiem ostrej infekcji. Przewlekłą infekcję obserwowano, gdy obserwowano stałą bioluminescencję między 100 a 150 dniem po zakażeniu.
Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do analizy danych na komputerze stacjonarnym. Kliknij Plik, a następnie Przeglądarka i wybierz Wybierz folder, aby otworzyć folder zawierający uzyskane dane obrazowania. Zaznacz wiele wierszy związanych z wybranymi obrazami, w tym niezainfekowane kontrolki i wykluczając obrazy przesycone.
Zapisz identyfikator obrazu w notatniku laboratoryjnym wraz z informacjami zarejestrowanymi podczas drugiej sesji obrazowania. Kliknij Załaduj jako grupę, aby złożyć wybrane obrazy. Teraz kliknij ikonę Zapisz, aby zapisać nowy obraz sekwencji w nowym folderze w celu ponownej analizy surowych danych w razie potrzeby.
Następnie kliknij Opcje, a następnie Wyświetlacz i wybierz Współczynnik kategoryzacji, aby zidentyfikować kategoryzację używaną dla każdego obrazu. Uzyskany współczynnik kategoryzacji zostanie wyświetlony u góry każdego obrazu w sekwencji. Aby skorygować wszystkie współczynniki kategoryzacji do tej samej wartości, najpierw kliknij dwukrotnie obraz, który chcesz dostosować.
W oknie Paleta narzędzi kliknij opcję Dostosuj obraz, a następnie wybierz odpowiedni współczynnik kategoryzacji. Kliknij dwukrotnie obraz niezainfekowanych myszy, a następnie wybierz opcję Liczy w polu Jednostka. Dostosuj skalę kolorów do minimalnej wartości 600.
Wybierz opcje radiancji w polu Jednostki, aby wyświetlić blask wynikowego obrazu. Gdy okno Sekwencja jest aktywne, wybierz opcję Blask w polu Jednostki. Wyłącz pojedyncze pole w obszarze Limity skali kolorów, aby dostosować skalę kolorów i tabelę kolorów w palecie narzędzi.
Zaznacz pola skali logarytmicznej i ręcznej, a następnie ustaw maksymalne liczby skali zgodnie z niezainfekowaną kontrolą i obszar o najwyższym sygnale jako maksimum. Po ustawieniu tej samej skali dla wszystkich obrazów, kliknij dwukrotnie każdy obraz, zmaksymalizuj okno i użyj opcji Eksportuj grafikę, aby wyeksportować widok obrazu w formacie obrazu. Nazwij pliki według leczenia, a następnie identyfikator myszy i punkt czasowy.
Kliknij dwukrotnie dowolny obraz z sekwencji. W oknie Paleta narzędzi kliknij sekcję Narzędzia ROI, a następnie naciśnij kwadratową ikonę. Narysuj prostokąt nad całą myszą.
Kliknij obramowanie utworzonego ROI, a następnie skopiuj i wklej ten sam ROI dla każdej myszy. Następnie nazwij ROI, które mają zostać zarejestrowane. Następnie kliknij ikonę Zapisz w sekcji Narzędzie ROI.
Zaznacz pole Zastosuj do sekwencji. Następnie zastosuj zapisane ROI dla wszystkich obrazów, klikając Załaduj. Dostosuj położenie ROI dla każdej myszy, aby lepiej dopasować je do obszaru pomiaru.
Gdy wszystkie myszy zostaną oznaczone, kliknij opcję Zmierz zwrot z inwestycji. Powinna pojawić się tabela Pomiary ROI. Ustaw typy pomiarów na Promienność, atrybuty obrazu na wszystkie możliwe wartości, a wymiary ROI na centymetry.
Następnie kliknij opcję Zaznacz wszystko, a następnie Kopiuj. Wklej dane bezpośrednio do oprogramowania do analizy tabel. Uporządkuj kolumny danych, aby prawidłowo posortować grupy.
Następnie oznacz dane kolorami według grup w arkuszu kalkulacyjnym. Ułóż całkowite wartości strumienia tak, aby odpowiadały wartościom całkowitego strumienia brzusznego i grzbietowego tej samej myszy, a następnie zsumuj je, aby uzyskać bioluminescencję całego ciała każdej myszy. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe zsumowanych wartości dla każdej grupy.
Wykreśl dane w oprogramowaniu statystycznym, aby wygenerować wykresy. Na koniec utwórz panel z obrazami bioluminescencyjnymi. Umieść każdą mysz w kolumnach, a punkty czasowe w rzędach, aby utworzyć matrycę skuteczności leku.
Gdy metoda bioluminescencji jest stosowana do oceny środków przeciwpasożytniczych, tworzona jest matryca skuteczności leku w celu porównania badanych związków, których przykładem jest pozakonazol, ze standardowym leczeniem farmakologicznym stosowanym w chorobie Chagasa, benznidazolem w dawce 100 miligramów na kilogram podawaną raz na dobę. W tym badaniu podłużnym przebieg infekcji w czasie jest zilustrowany poprzez porównanie grupy nieleczonej z grupą leczoną. Wyniki wskazują albo na zmniejszenie obciążenia pasożytami, na co wskazuje zmniejszona bioluminescencja, albo na nawrót choroby, objawiający się zwiększonym obciążeniem pasożytami i wynikającym z tego wykrywaniem światła, co sugeruje nieskuteczny związek lub schemat leczenia.
Światło określone ilościowo jest reprezentowane przez sumę całkowitego strumienia brzusznego i grzbietowego w fotonach na sekundę w funkcji czasu infekcji.
Przegląd
Ten protokół opisuje kroki prowadzenia badań nad skutecznością leków w bioluminescencyjnym modelu infekcji Trypanosoma cruzi. Skupia się na pozyskiwaniu danych, analizie i interpretacji, a także na rozwiązywaniu problemów i kontroli jakości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Choroby zakaźne
- Farmakologia
Tło
- Choroba Chagasa jest infekcją ogólnoustrojową, która wymaga leczenia pasożytologicznego dla skutecznego leczenia.
- Obecne modele zwierzęce nie w pełni odzwierciedlają złożoność choroby u ludzi.
- Zrozumienie trwałości i oporu na leki Trypanosoma cruzi jest kluczowe dla odkrywania nowych leków.
- Nowe leki przeciwpasożytnicze powinny dążyć do wyeliminowania pasożyta z organizmu gospodarza.
Cel badania
- Opracowanie protokołów do śledzenia w czasie rzeczywistym obciążenia pasożytami u myszy.
- Rozróżnienie między związkami, które tłumią pasożytokrątę a tymi, które promują wyleczenie pasożytologiczne.
- Zbadanie, jak terapia lekowa może przynieść korzyści gospodarzowi i zapobiegać powikłaniom choroby Chagasa.
Stosowane metody
- Wstrzyknięcie D-luciferiny do zakażonych myszy w celu obrazowania bioluminescencyjnego.
- Wykorzystanie oprogramowania do akwizycji i analizy danych obrazu.
- Pomiar ROI do ilościowego określania bioluminescencji.
- Analiza statystyczna do generowania wykresów i macierzy skuteczności leków.
Główne wyniki
- Bioluminescencja wskazywała na zwiększone obciążenie pasożytami podczas ostrej infekcji.
- Z czasem obserwowano spadek obciążenia pasożytami, co wskazuje na przewlekłą infekcję.
- Analiza danych ujawniła różnice w skuteczności leków między testowanymi związkami.
- Wyniki graficzne i macierze ilustrowały porównawczą skuteczność leczenia.
Wnioski
- Protokół pozwala na nieinwazyjne monitorowanie infekcji Trypanosoma cruzi.
- Dostarcza ram dla oceny nowych środków przeciwpasożytniczych.
- Kontynuacja badań jest potrzebna, aby zrozumieć mechanizmy oporu na leki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
In vivo bioluminescence imaging (BLI) in Chagas disease mouse models enables real-time, quantitative assessment of antiparasitic drug efficacy, directly supporting early discovery and lead identification. This approach provides predictive confidence in distinguishing compounds that achieve parasitological cure from those with only transient effects, informing risk-adjusted portfolio decisions. The method's non-invasive, longitudinal monitoring reduces animal use and enhances translational continuity for neglected tropical disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct, quantitative tracking of Trypanosoma cruzi burden in live animals over time.
- Supports functional validation of therapeutic hypotheses by differentiating transient suppression from true parasitological cure.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing parasite persistence and relapse dynamics post-treatment.
- Improves predictive confidence for compound triage and advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, reproducible system for evaluating compound efficacy in vivo.
- Standardizes quantitative readouts (bioluminescence flux) for cross-study comparability.
- Enables scalable, longitudinal assessment of multiple compounds and regimens within the same cohort.
- Supports robust assay development for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical efficacy endpoints with disease-relevant infection dynamics and relapse patterns.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking chronic and acute infection phases.
- Supports translational biomarker development through quantitative imaging outputs.
- Reduces late-stage biological risk by providing early, actionable efficacy data.
Pipeline & Workflow Integration
This BLI protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, supporting iterative hypothesis testing and compound prioritization.
- Discovery Biology: Quantitative imaging enables hypothesis-driven evaluation of drug action and parasite persistence.
- Screening: Standardized imaging and analysis workflows ensure reproducibility and assay readiness for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, time-resolved bioluminescence data for statistical comparison of treatment groups.
- Translational Research: Supports alignment of preclinical efficacy with clinical endpoints by modeling chronic and acute infection phases.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable to other infectious disease models using luciferase-expressing pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug efficacy studies.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible in vivo efficacy assessment.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in neglected disease portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidate compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, imaging instrumentation, and quantitative data analysis.
- Needs access to BLI-capable imaging systems and compatible analysis software.
- Demands rigorous cross-team standardization of imaging parameters and data processing.
- Adaptable to other luciferase-reporter infectious disease models with protocol adjustments.
- Potential limitations include incomplete disease recapitulation and need for quality control in imaging and analysis.
