Name: Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę bioluminescencyjnego obrazowania in vivo w mysim modelu zakażenia Trypanosoma cruzi. Protokół umożliwia śledzenie obciążenia pasożytniczego w czasie rzeczywistym oraz ocenę skuteczności leków przeciwko chorobie Chagasa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Amandzie Franscisco, Johnowi Kelly'emu i Fanny Escudié za zapewnienie szkoleń BLI i wsparcia w testach skuteczności leków, Johnowi Kelly'emu i Simone Calderano za dostarczenie pasożytów, oraz Gabrielowi Padilli za wsparcie w badaniach na zwierzętach. A.C.S otrzymał stypendium CAPES PSDE na szkolenie w London School of Hygiene and Tropical Medicine (Wielka Brytania). Autorzy pragną również podziękować Platformie Badań nad Cytometrią Przepływową i Obrazowaniem (FLUIR) w Głównym Ośrodku Badań Naukowych - Uniwersytecie w Sao Paulo (CEFAP-USP) za wsparcie techniczne w analizie sprzętu IVIS Spectrum oraz Laboratorium Genetyki i Kontroli Sanitarnej ICB-USP za testy poeksperymentalne do kontroli jakości myszy jako wolnych od określonych patogenów. Ten projekt został sfinansowany przez DNDi. DNDi jest wdzięczne swoim darczyńcom, publicznym i prywatnym, którzy zapewnili finansowanie wszystkich działań DNDi od momentu powstania w 2003 roku. Pełna lista darczyńców DNDi znajduje się na stronie https://dndi.org/about/donors/.

In Vivo Bioluminescent Model of Chagas Disease for Drug Evaluation

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Obrazowanie bioluminescencyjne to przełomowa metoda, która pozwala na wykrycie genu raportowego za pomocą widma promieniowania elektromagnetycznego w zakresie widzialnym i podczerwonym. W związku z tym nie ma potrzeby stosowania znakowanych radioizotopem, aby śledzić próbkę35. BLI nadaje się dla modeli gryzoni i innych małych gatunków. Jest bardzo przydatny w badaniach przedklinicznych, ponieważ jest bezpieczniejszy i pozwala na kilka rund obrazu, powodując minimalny dyskomfort zwierząt. Poza tym obrazowanie in vivo jest bardzo elastyczne ze względu na możliwość łączenia bioluminescencji, fluorescencji i innych technik, takich jak pozytonowa tomografia emisyjna36.
Obrazowanie optyczne zależy od optycznych właściwości fizycznych, takich jak absorpcja i rozpraszanie. Wszystkie tkanki w różny sposób absorbują i rozpraszają światło o różnych długościach fal37. Jednym z krytycznych kroków jest wybór genu reporterowego bez uwzględnienia emitowanej długości fali światła wytwarzanego w wyniku reakcji chemicznej. Podczas gdy poziom ekspresji genu reporterowego może być wysoki in vitro w testach bioluminescencyjnych, te same poziomy ekspresji mogą nie zostać osiągnięte w przypadku przejścia do warunków in vivo. W tym protokole użyliśmy przesuniętej ku czerwieni wersji kodonu Photinus pyralis lucyferazy (PpyRE9H)38 dla trypanosomatydów9, która emituje światło o długości fali 617 nm, co jest jednym z najbardziej odpowiednich do badań in vivo 39. Długości fal dłuższe niż 600 nm są mniej absorbowane i rozpraszane przez endogenne chromofory organizmu, zwłaszcza hemoglobinę i melaninę. W ten sposób czerwone światło może być przenoszone przez kilka centymetrów tkanki, dzięki czemu fotony docierają do kamery CCD nawet z wnętrza tkanek trzewnych39,40.
Jednym z obszarów budzących obawy w ustawieniach obrazowania jest brak kompleksowego zrozumienia ich funkcji i efektów. Binning, technika wstępnego przetwarzania, łączy informacje uzyskane przez sąsiadujące ze sobą detektory w większy piksel. Proces ten zwiększa stosunek sygnału do szumu, redukując szumy tła i poprawiając czułość. Zmniejsza to jednak dokładność rozdzielczości przestrzennej, co skutkuje pikselowaniem obrazu 41,42. Ten kompromis jest ważnym czynnikiem w strategii obrazowania.
Opierając się na Docelowym Profilu Produktu i Profilu Kandydata Docelowego dla choroby Chagasa34, badanie potwierdzające słuszność koncepcji koncentruje się na czułości wykrywania T. cruzi i pomaga ustalić, czy nowy kandydat na lek może osiągnąć sterylne wyleczenie (reprezentowane przez brak nawrotu po kilku rundach immunosupresji). W związku z tym BLI wykonujemy przy użyciu najwyższego współczynnika binningu bez przesycania obrazu. Gdy obraz ulega przesyceniu, wykonywana jest nowa akwizycja przy użyciu niższego współczynnika kategoryzacji. Podczas analizy do obrazów, które wymagały innego kategoryzacji, stosowana jest korekta matematyczna. W ten sposób końcowe dane powinny być prezentowane przy użyciu tego samego kategoryzacji. W tabeli 1 przedstawiono różne wartości uzyskane po zastosowaniu charakterystycznych współczynników kategoryzacji na tym samym obrazie i ROI.
Tabela 1: Wpływ ustawień kategoryzacji na kwantyfikację BLI. Kwantyfikacja trzech ROI na obrazie modelu ostrego (d13) i modelu przewlekłego (d118), analizowanych w różnych czynnikach kategoryzacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Ze względu na obecny scenariusz choroby Chagasa w klinice, wysiłki związane z odkrywaniem leków mają na celu całkowite wyeliminowanie pasożytów (leczenie parazytologiczne)27,34. W związku z tym protokół przedkliniczny in vivo obejmuje podejścia, które przezwyciężają ograniczenia technicznej wrażliwości BLI. Jednym z podejść jest leczenie myszy cyklofosfamidem w celu zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej, która kontroluje obciążenie pasożytami. Inną strategią jest zmniejszenie głębokości tkanki i usunięcie warstw mięśni, skóry i futra, które blokują drogę światła do kamery. Dzięki procedurze ex vivo można wykryć małe plamki bioluminescencyjne, ujawniające ogniska pasożyta poniżej progu BLI in vivo, jak pokazano na rycinie 5C w wyniku ex vivo myszy leczonej Posa.
Zaprojektowanie eksperymentu pilotażowego w celu oceny samego modelu i dynamiki infekcji ma kluczowe znaczenie dla ustalenia dokładnego eksperymentu do oceny skuteczności leków przeciwpasożytniczych. Dzięki temu badacz będzie mógł z wyprzedzeniem określić odpowiednie ustawienia BLI i przebieg czasu infekcji. W eksperymencie eksploracyjnym jednym z narzędzi, które może być pomocne w definiowaniu ustawień akwizycji, jest "Autoekspozycja". Za pomocą tego narzędzia badacz ustala priorytet trzech ustawień (czas ekspozycji, Binning i F/Stop), aby uzyskać najlepszy możliwy obraz. W szczególności badacz powinien upewnić się, że obrazy są rejestrowane w zakresie dynamicznym kamery CCD, bez przesycenia lub niedoświetlenia, co można sprawdzić za pomocą minimalnych i maksymalnych limitów skali oraz funkcji automatycznej ekspozycji ( Menu Edytuj > Preferencje > Tab Akwizycja > Tab Automatyczna ekspozycja). W tym protokole przysłona aparatu została ustawiona na maksymalną wartość (F/Stop: 1), a dla modeli ostrych i przewlekłych zdefiniowano różne czasy ekspozycji i współczynniki kategoryzacji. Te ustawienia zapewniają przewidywalność w czasie, aby jednocześnie wykonywać różne rundy obrazu. Biorąc pod uwagę, że metoda reporterowa opiera się na reakcji enzymatycznej, zarówno biodystrybucja substratu do myszy, jak i kinetyka lucyferazy wpływają na sygnał bioluminescencyjny, a tym samym na kwantyfikację infekcji (Figura 1B). W związku z tym pozyskiwanie obrazów w różnych momentach kinetyki enzymatycznej wprowadza zmienność danych, której nie można uwzględnić ani skorygować, i wpływa na obliczenia całkowitego strumienia (fotony/sekundę) lub radiancji (fotony/sekunda/cm2/steradian). Poza tym zakażenie T. cruzi wykazuje dynamiczne pozycjonowanie przestrzenne u myszy (różne obszary i tkanki, głębokość i obciążenie pasożytami). W związku z tym ustalenie wartości zliczeń do pozyskania może pominąć słabsze źródła sygnału (mała liczba pasożytów w określonym miejscu głębiej tkanki), jeśli źródło innego silniejszego sygnału spełnia określone kryteria automatycznej ekspozycji.
Trudną funkcją oprogramowania Living Image jest wyświetlanie uzyskanego obrazu w automatycznej skali kolorów. Nie ma możliwości wstępnego ustawienia skali, aby automatycznie wyświetlała zupełnie nowy uzyskany obraz zgodnie z wybranymi wartościami skali (patrz krok 6.2 protokołu). Taka sytuacja zmusza badacza do ręcznej zmiany obrazów jeden po drugim na wybrane wartości max i min. W konsekwencji niedoświadczeni i niezbyt dobrze przeszkoleni użytkownicy nie mają odpowiedniego odczytu podczas sesji akwizycyjnej i mogą w tym momencie wprowadzić dane w błąd lub stracić ważne informacje. W tym celu korzystny jest eksperyment pilotażowy.
Jednym z najczęstszych pytań dotyczących projektu eksperymentu potwierdzającego słuszność koncepcji jest to, jak wybrać czas trwania leczenia i dawkę. W przypadku nowych jednostek chemicznych parametry te są zwykle definiowane przez siłę działania i selektywność związku in vitro, w połączeniu z danymi wygenerowanymi przez metabolizm i farmakokinetykę leków (DMPK) oraz badania tolerancji przeprowadzone przed badaniem skuteczności in vivo. Podsumowując, po zidentyfikowaniu związków, które są w stanie selektywnie zabijać pasożyta wewnątrz komórek, pierwsze eksperymenty ADME (wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie) są przeprowadzane in vitro w celu oszacowania m.in. rozpuszczalności w wodzie, przepuszczalności komórek i stabilności metabolicznej. Jeżeli związki wykazują dobrą równowagę właściwości in vitro (zwykle definiowanych w docelowych profilach kandydujących), wówczas kandydaci ci są przechodzili do badań farmakokinetyki in vivo (PK) na zdrowych myszach, które określają ekspozycję na związek we krwi (i być może również w tkankach) i dają ogólne pojęcie o tolerancji przy różnych poziomach dawek17, Lokal mieszkalny 34,43. W idealnej sytuacji celem oceny farmakokinetycznej w większości chorób zakaźnych jest określenie możliwości osiągnięcia stężeń wolnych w osoczu (skorygowanych o wiązanie z białkami osocza), które są wyższe od stężeń EC50/EC90 44 44 - skutecznego stężenia, które zabija lub przynajmniej hamuje wzrost odpowiednio 50% lub 90% pasożytów - przez wystarczająco długi okres czasu. Jeśli przy określonym poziomie dawki zostanie osiągnięta wystarczająca ekspozycja, wówczas schemat ten może być stosowany podczas badań skuteczności z wykorzystaniem modelu Chagasa BLI. W przypadku badań repozycji leków powinny być dostępne dane dotyczące farmakokinetyki in vitro i in vivo. Dobrym początkiem do reprofilacji leków są chemiczne bazy danych, takie jak PubChem45, które dostarczają uznanych danych, które można przekształcić w myszy za pomocą skalowania allometrycznego46 w celu oszacowania bezpiecznych i nietoksycznych schematów leczenia, które mają zostać przetestowane. Jednak nie zawsze tak jest. Badania farmakokinetyczne są nadal pomijaną dziedziną w naukach akademickich, a niewiele firm farmaceutycznych publikuje swoje wyniki badań farmakokinetycznych. Społeczność naukowa zajmująca się odkrywaniem leków zaleca włączenie oceny farmakokinetyki in vivo wraz z testami skuteczności leków (farmakodynamika)47. W związku z tym obrazowanie przedkliniczne jest kompatybilne z pomiarami złożonymi jednocześnie, a to powiązane podejście zwiększa niezawodność danych.
Ponadto obchodzenie się z myszami, ich waga i stan zdrowia są monitorowane przez cały czas trwania eksperymentu. Oznaki toksyczności i skutki uboczne, takie jak garbienie się, drżenie, utrata równowagi, niechęć do poruszania się, niechęć do jedzenia lub picia, pokłony lub jakiekolwiek inne nieprawidłowości występujące w grupie lub u poszczególnych myszy, powinny być rejestrowane i zgłaszane w badaniach przedklinicznych. Jednym z celów obrazowania optycznego jest zapewnienie dobrostanu zwierząt. W związku z tym humanitarne punkty końcowe powinny być stosowane u myszy z objawami bólu opisanymi w skali grymasu48. Ponadto myszy były ważone co tydzień podczas pozyskiwania BLI i częściej podczas dawkowania leków i leczenia CTX. Zgodnie z przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, myszy, które tracą więcej niż 20% masy ciała, muszą zostać natychmiast humanitarnie poddane eutanazji.
Model bioluminescencyjny T. cruzi jest obecnie najnowocześniejszym modelem eksperymentalnym służącym do odkrywania i opracowywania nowych metod leczenia choroby Chagasa. Model, który odtwarza kluczowe cechy infekcji T. cruzi i choroby Chagasa49, umożliwiając monitorowanie parazytemii w czasie rzeczywistym i różnicowanie związków o różnych profilach skuteczności związanych ze znanymi sposobami działania. BLI to technika, która zwiększa asertywność w identyfikacji zakażonych tkanek. Umożliwia precyzyjną selekcję zakażonych tkanek do wykorzystania w szerokim zakresie podejść, w tym we wszystkich klasycznych metodach już stosowanych w badaniach nad T. cruzi 50,51. Ponadto umożliwia naukowcom odkrywanie najnowocześniejszych technologii i opracowywanie nowych33. Ponadto BLI zapewnia jednocześnie poprawę dobrostanu zwierząt i bardziej racjonalne użytkowanie zgodnie z zasadami 3R10,35.
Kilka grup badawczych zajmujących się zaniedbanymi chorobami tropikalnymi umieszcza się w krajach, w których urządzenia do obrazowania in vivo są niedostępne. Aby przezwyciężyć obecny scenariusz, nowe międzynarodowe sieci, takie jak Global BioImaging i powiązane z nimi konsorcja, promują działania mające na celu zapewnienie otwartego dostępu do podstawowych obiektów obrazowania oraz poprawę szkolenia personelu i naukowców zajmujących się obrazowaniem52,53. Inicjatywy te, wraz z przyjaznymi protokołami dla użytkowników, takimi jak ten, mogą stworzyć warunki demokratyzujące zaawansowane technologie dla wszystkich badaczy. Wdrożenie tej metody w przedklinicznym odkrywaniu leku zapewniło solidny odczyt skuteczności i wartość predykcyjną wyników klinicznych, ułatwiając odkrycie leku na chorobę Chagasa.

Choroba Chagasa jest endemiczna w Ameryce Łacińskiej i dotyka około siedmiu milionów ludzi na całym świecie1. Rocznie ponad 50 000 zgonów i straty ekonomiczne w wysokości około 7 miliardów dolarów wynikają z niepełnosprawności tej choroby2. Choroba Chagasa jest wywoływana przez pierwotniaka Trypanosoma cruzi, heteroksenicznego pasożyta hemoflagellate zdolnego do zakażania ssaków (dzikich i domowych) i wektorów triatominowych (Hemiptera, Reduviidae)3 w obu Amerykach, gdzie ustalono transmisję wektorową. Inne ważne drogi infekcji obejmują transfuzję krwi, przeszczep narządów, doustne (poprzez spożycie żywności skażonej zakażoną triatominą)4 i transmisję wrodzoną. Niewektorowe drogi transmisji przyczyniły się do rozprzestrzenienia się choroby Chagasa na obszary nieendemiczne3,5.
Choroba Chagasa objawia się w dwóch fazach klinicznych. Ostra faza przebiega w większości przypadków bezobjawowo. Zakażenia objawowe są zwykle związane z niespecyficznymi objawami, takimi jak gorączka, zmęczenie, bóle mięśni, powiększenie węzłów chłonnych, powiększenie śledziony i powiększenie wątroby. Ostra faza jest również często związana z wyraźną parazytemią i ogólnoustrojowym krążeniem pasożytów. Śmierć może nastąpić nawet w 10% zdiagnozowanych przypadków, zwłaszcza w przypadku infekcji jamy ustnej6. Faza przewlekła często charakteryzuje się długim okresem braku jakichkolwiek objawów. Z czasem około jedna trzecia pacjentów zakażonych kilkadziesiąt lat wcześniej wykazuje objawy sercowe, którym zwykle towarzyszy zwłóknienie i zapalenie mięśnia sercowego i/lub zaburzenia żołądkowo-jelitowe głównie związane z rozwojem zespołu megaesophagus i/lub megacolon3,5,6.
Etiologiczne leczenie choroby Chagasa składa się tylko z dwóch leków: benznidazolu i nifurtimoksy. Te środki przeciwpasożytnicze są dostępne od ponad 50 lat i mają znaczną toksyczność oraz ograniczoną skuteczność5,7,8. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych, bezpiecznych i skuteczniejszych metod leczenia pacjentów z chorobą Chagasa.
Bardziej wyrafinowane i dokładne techniki umożliwiają teraz uzyskanie odpowiedzi na stare pytania, które pozwalają na postęp w poszukiwaniu nowych metod leczenia choroby Chagasa. W tym sensie społeczność naukowa czerpie ogromne korzyści z genetycznie modyfikowanych pasożytów w badaniach in vivo nad przebiegiem infekcji i oceną skuteczności leków9,10,11,12. Test podłużny oparty na systemie obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) umożliwia ocenę skuteczności w trakcie i po schemacie leczenia, prowadząc do identyfikacji związków o aktywności trypanobójczej10,13. Metoda BLI zapewnia bezpośredni pomiar obciążenia pasożytami, zarówno w krążeniu, jak i w tkankach i narządach, poprzez ilościowe określenie ilości światła wytwarzanego przez genetycznie zmodyfikowany T. cruzi CL Brener Luc::Neon lineage11, który konstytutywnie wyraża przesuniętą ku czerwieni lucyferazę świetlika12.
Mimo to, prawie 10 lat po ustanowieniu zwierzęcego modelu choroby Chagasa BLI i badań nad skutecznością leków, tylko kilka grup badawczych dominuje nad tą techniką. Fakt ten wynika nie tylko z ograniczonego dostępu do odpowiedniego sprzętu do obrazowania, ale także z braku szkoleń i dostępności ustrukturyzowanych, szczegółowych protokołów. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z innymi podejściami, które opierają się na ocenie pasożyta za pomocą mikroskopii, serologii lub oceny zakażenia narządów/tkanek za pomocą qPCR w celu wykrycia DNA pasożyta, ponieważ umożliwia poprawę dobrostanu myszy i ograniczenie wykorzystywania zwierząt dzięki możliwości generowania bardziej wiarygodnych i zintegrowanych danych in vivo. Co więcej, metoda ta jest prawdopodobnie bardziej czuła, ponieważ umożliwia łatwe wykrycie ognisk pasożytniczych w narządach trzewnych po leczeniu farmakologicznym10,12. W związku z tym protokół ten ma na celu poprowadzenie grup badawczych zajmujących się parazytologią i innymi chorobami zakaźnymi w ustaleniu tej metodologii w swoich laboratoriach poprzez szczegółowe określenie procedur technicznych. W tym artykule dzielimy się doświadczeniami zdobytymi podczas wdrażania modelu BLI choroby Chagasa w Brazylii, pierwszego tego rodzaju w Ameryce Łacińskiej, w ramach działań na rzecz odkrycia leków koordynowanych przez inicjatywę Drugs for Neglected Diseases (DNDi).

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa&handel; Analizator komórek X-20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga wagowa (zakład dla zwierząt)</td><td>Dostępne u kilku dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Revvity (dawniej PerkinElmer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJ v10.7.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software dla Spectrum v4.7.1</td><td>Revvity (dawniej PerkinElmer)</td><td></td><td>Nielicencjonowane oprogramowanie analityczne o nazwie "Aura Imaging" może być używane do najbardziej podstawowych funkcji dostarczanych przez Spectral Instruments Imaging (firma Bruker) (https://spectralinvivo.com/software/)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Microsoft Office</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v8.4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Low Glucose</td><td>Vitrocell</td><td>D0025</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,5% EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>LIT pożywka</td><td>In dom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Grace&prime; s Medium dla owadów</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G9771</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>IVISBrite d-lucyferyna sól potasowa</td><td>Revvity (dawniej PerkinElmer)</td><td>122799</td><td>Można również zastosować: VivoGlo Lucyferin, klasa in vivo (Promega/P1043); D-Lucyferyna, sól monopotasowa (Thermo Scientific/88293) lub PierceD-luciferin, sól monosodowa* (Thermo Scientific/88291); D-lucyferyna, sól potasowa (GoldBio/LUCK lub eLUCK); D-lucyferyna, sól sodowa* (GoldBio/LUCNA lub eLUCNA) *Różnice w soli sodowej lub potasowej mają minimalne szanse na rozpuszczalność, jednak nie wpływają na wydajność in vivo.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Cyklofosfamid (CTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0768-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>(Hydroksypropylo)metyloceluloza (HPMC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09963-25G</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>Benznidazol</td><td>ELEA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Posaconazol (preparat handlowy Noxafil)</td><td>Schering-Phough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Dostępne u kilku dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>igła do zgłębnika (stal nierdzewna prosta) - 22GA</td><td>Aton</td><td>&nbsp; CA2003</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml i igła 31G</td><td>Dostępne u kilku dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml i wyjmowana igła 26G</td><td>Dostępne u kilku dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml i wyjmowana igła 24G X&frac34</td><td>Dostępne u kilku dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m</td><td>Dostępne u kilku dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A4 Matowy papier 120 gr lub grubszy</td><td>Kolor papieru / Canson (dostępny u kilku dostawców)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>folia aluminiowa</td><td>Dostępne u kilku dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>Dostępne u kilku dostawców</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby chagasa do badań skuteczności leków

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

Aby kontrolować i zmniejszać wpływ chorób pierwotniaków u ludzi na zdrowie publiczne, takich jak choroba Chagasa, leiszmanioza i ludzka trypanosomatoza afrykańska, konieczne jest przyspieszenie rozwoju nowych leków i szczepionek. Proces ten jest jednak pełen trudności, takich jak bardzo złożona biologia pasożytów i patogeneza chorób oraz, co typowe dla zaniedbanych chorób tropikalnych, stosunkowo ograniczone fundusze na badania i rozwój. W związku z tym modele badań in vitro i in vivo, które mogą w wystarczającym stopniu odtworzyć kluczowe cechy infekcji i choroby, zapewniając jednocześnie racjonalne wykorzystanie zasobów, mają zasadnicze znaczenie dla postępu badań nad tymi schorzeniami. Jednym z przykładów jest mysi model obrazowania bioluminescencji in vivo (BLI) dla choroby Chagasa, który zapewnia bardzo czułe wykrywanie światła o dużej długości fali generowanego przez pasożyty Trypanosoma cruzi wykazujące ekspresję lucyferazy. Pomimo tego, że technika ta stała się standardowym podejściem do badań skuteczności leków in vivo, grupy badawcze mogą nadal mieć trudności z jej wdrożeniem ze względu na brak odpowiedniego szkolenia praktycznego w zakresie obsługi sprzętu i stosowania procedur kontroli jakości, nawet jeśli odpowiedni sprzęt BLI jest łatwo dostępny. Biorąc pod uwagę ten scenariusz, protokół ten ma na celu przeprowadzenie od planowania eksperymentów do pozyskiwania i analizy danych, ze szczegółami, które ułatwiają wdrażanie protokołów w grupach badawczych z niewielkim lub żadnym doświadczeniem z BLI, zarówno dla choroby Chagasa, jak i dla innych mysich modeli chorób zakaźnych.

Wykorzystując odpowiedni model mysi oparty na pasożytach transgenicznych, które konstytutywnie wykazują ekspresję lucyferazy, możliwe jest odtworzenie kluczowych cech infekcji T. cruzi u ludzi przy minimalnym uszczerbku dla gospodarza, co pozwala na monitorowanie pasożytów w czasie rzeczywistym za pomocą BLI całego ciała gospodarza w sposób podłużny (przez całe życie), przez okres do kilku miesięcy12.
Rycina 3 przedstawia eksperyment pilotażowy obrazujący przebieg czasowy infekcji szczepem CL Brener Luc::Neon od 1. dnia po infekcji do 150 dpi u myszy BALB/c. W ciągu pierwszych 20 dpi obciążenie pasożytami wnioskowane z bioluminescencji wzrasta, co jest typowe dla szczytu parasitemii, po czym następuje gwałtowny spadek ładunku pasożytów wynikający z kontroli immunologicznej organizmu myszy. W związku z tym fazę ostrą infekcji uznaje się za pierwsze 50 dpi. Fazę przewlekłą definiuje się jako okres, w którym infekcja osiąga stałe tempo bioluminescencji, od 100 do 150 dpi.
<img alt="Badanie przewlekłej infekcji, obrazowanie bioluminescencyjne, wykres strumienia; analiza progresji infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zrozumienie modelu. Kinetyka infekcji Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neon u myszy BALB/c (n = 11). Górny panel: brzuszne i grzbietowe obrazy bioluminescencyjne z różnych punktów czasowych przez 150 dni po infekcji (dpi) przy użyciu 1 x 10³ trypomastigot krwiobiegu podanych w iniekcji domięśniowej. Skala mapy cieplnej (w Log10) sygnału bioluminescencyjnego w jednostkach promieniowania (p/s/cm2/sr). Kod kolorystyczny: fioletowy = 5 x 103; czerwony = 1 x 107. Dolny panel: kwantyfikacja sygnału bioluminescencyjnego w całkowitym strumieniu Total Flux (p/s) całego ciała myszy. Dane przedstawiono jako średnie (linie) i odchylenia standardowe (obszary zacieniowane). Okresy zdefiniowane dla fazy ostrej i przewlekłej infekcji w tym modelu mysim są wyróżnione na pomarańczowo. Średnie wartości luminescencji myszy niezinfekowanych (n = 3) przedstawiono jako próg (jasnoszara linia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Można również przewidzieć wyniki terapeutyczne, ponieważ główne fazy infekcji są dobrze odwzorowane w modelu mysim. W związku z tym BLI jest obecnie stosowane w nauce translacyjnej w ramach badań typu proof-of-concept, które wspierają podejmowanie decyzji dotyczących potencjalnej skuteczności związków i ich postępów w procesie opracowywania leków10,27. W ostrym modelu mysim leczenie doustne powinno rozpocząć się, gdy infekcja osiągnie szczyt parasytemii (około 14-21 dpi), co charakteryzuje się wysoką liczbą trypomastigotes w krwiobiegu (około 1 x 105 trypomastigotes/mL – dane nie pokazano) i infekcją systemową. W fazie przewlekłej leczenie myszy rozpoczyna się w 100 dpi, kiedy obciążenie pasożytami jest znacznie niższe, przy stabilnej subpatentnej parasytemii.
Aby zademonstrować zastosowanie opisanego powyżej protokołu w ocenie środków przeciwpasożytniczych, porównaliśmy skuteczność terapeutyczną benznidazolu (BZ), standardowego leku stosowanego w leczeniu choroby Chagasa, oraz posakonazolu (Posa), inhibitora sterolowej 14α-demetylazy (CYP51), który nie przyniósł oczekiwanych rezultatów w badaniach klinicznych nad chorobą Chagasa i który okazał się nieskuteczny jako środek przeciwpasożytniczy przeciwko T. cruzi in vitro oraz in vivo, w tym w modelu BLI opisanym w niniejszym protokole13,18,28,29,30.
W ostrym modelu mysim kohorty po 6 myszy w grupie otrzymywały doustnie przez gavage31 przez 20 dni Posa w dawce 20 mg/kg lub BZ w dawce 100 mg/kg, raz dziennie. Myszy leczono również BZ przez 5 dni w dawce 100 mg/kg raz dziennie, aby ocenić efekt krótkotrwałego leczenia. Po eliminacji związku (10 dni po zakończeniu leczenia) myszy u których nie stwierdzono sygnału BLI poddano immunosupresji – warunkowi, który sprzyja nawrotowi infekcji, gdy nie osiągnięto wyleczenia parazytologicznego (Rycina 4A). Leczenie Posa spowodowało redukcję obciążenia pasożytami wnioskowaną z bioluminescencji o 99,49% ± 0,27% (średnia ± odchylenie standardowe) na koniec leczenia; poziomy te pozostały zbliżone do poziomu myszy niezainfekowanych podczas okresu eliminacji związku (z wyjątkiem myszy nr 3, z przejściowym sygnałem w 40 dpi, oraz myszy nr 2, która wykazała słabą plamkę BLI w 44 dpi). W porównaniu z grupą nieleczoną, 20-dniowe leczenie BZ zredukowało obciążenie pasożytami wnioskowane z bioluminescencji o 100% ± 0,01% na koniec leczenia. Z kolei krótkotrwałe leczenie BZ przez 5 dni doprowadziło do redukcji o 99,98% ± 0,03% w 19 dpi (poziom zbliżony do progu detekcji). Jednak w tym przypadku redukcja BLI była przejściowa i w kolejnych pomiarach u wszystkich myszy wystąpiła reaktywacja infekcji (Rycina 4B).
<img alt="Oś czasu i dane modelu ostrego CD; zakażenie, leczenie; wyniki eksperymentalne; schemat, wykresy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Projekt eksperymentu typu proof-of-concept oraz wyniki uzyskane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego w ostrym modelu choroby Chagasa. (A) Schematyczny wykres przebiegu czasowego w mysim modelu ostrej choroby Chagasa w badaniach przedklinicznych służących do oceny skuteczności związku. Czarne kropki: punkty czasowe obrazowania. Kolba z lekiem i pomarańczowy pasek: odpowiednio początek i koniec leczenia. Ikona strzykawki: iniekcje cyklofosfamidu. dpi: dzień po zakażeniu. Kod kolorów: szary = zakażenie bez leczenia; pomarańczowy = okres leczenia; niebieski = faza eliminacji związku; żółty = okres immunosupresji. (B) Przebieg czasowy leczenia Trypanosoma cruzi. Panel lewy: brzuszne obrazy bioluminescencyjne myszy BALB/c (i) nieleczonych lub leczonych przez 20 dni za pomocą (ii) posakonazolu (Posa) w dawce 20 mg/kg, (iii) benznidazolu (BZ) w dawce 100 mg/kg przez 20 dni oraz (iv) BZ w dawce 100 mg/kg przez 5 dni (n = 6/grupa). Wszystkie preparaty podawano doustnie za pomocą zgłębników (10 mL/kg) raz dziennie. Mapa ciepła w skali Log10 wskazuje intensywność sygnału bioluminescencyjnego od poziomu niskiego (niebieski) do wysokiego (czerwony). Wykres prawy: ilościowa ocena danych z obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała. Dane przedstawiono jako średnie (linie) i odchylenia standardowe (obszary zacieniowane). Legenda: Kolba z lekiem: początek leczenia (14 dpi); pomarańczowy pasek: koniec leczenia (18 dpi/33 dpi); ikona strzykawki: iniekcje cyklofosfamidu (od 44. do 53. dnia); pomarańczowa kropka: mysz analizowana procedurą ex vivo; § dane wykluczone ze względu na wyciek D-lucyferyny z moczem. (C) Procedura ex vivo służąca do wykrywania ognisk T. cruzi w organach i tkankach. Legenda rozkładu płytek znajduje się na dole rysunku (stworzono za pomocą BioRender.com: ZY26LG8AOF). Zastosowano tę samą skalę promieniowania, co w panelu in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
W tym modelu leczenie przeciwpasożytnicze może zredukować liczbę pasożytów poniżej granicy wykrywalności BLI wynoszącej 1000 pasożytów. W związku z tym myszy wydają się BLI-ujemne10. Aby upewnić się, że osiągnięto wyleczenie parasitologiczne, konieczne jest wywołanie immunosupresji u myszy poprzez podanie cyklofosfamidu29,32. Myszy, które po leczeniu farmakologicznym nadal mają niewykrywalną liczbę pasożytów, staną się BLI-dodatnie po immunosupresji. Efekt ten jest wyraźniej widoczny przy leczeniu Posa w modelu ostrym, które sprzyja nawrotom pasożytów. W tym eksperymencie procedurę ex vivo przeprowadzono u myszy z najniższym sygnałem bioluminescencyjnym w celu oceny tropizmu tkankowego pasożytów (Rycina 4C). Myszy nieleczone wykazują silne sygnały bioluminescencyjne, zwłaszcza w przewodzie pokarmowym (TGI) i tkankach powiązanych, takich jak tłuszcz trzewny i krezka. Ponadto skóra była miejscem związanym z przetrwaniem pasożytów. Myszy leczone Posa wykazały punkty bioluminescencyjne o niższej intensywności, które były bardziej ograniczone do okrężnicy, krezki i tłuszczu trzewnego. Z kolei u myszy leczonych zgodnie z kuracyjnym schematem leczenia, takim jak BZ 100 mg/kg przez 20 dni, nie wykryto sygnału bioluminescencyjnego nawet w warunkach immunosupresji. Dlatego, biorąc pod uwagę wywołanie warunków sprzyjających wzrostowi sygnału bioluminescencyjnego powyżej poziomu progowego 1000 pasożytów10 oraz zwiększenie czułości poprzez odsłonięcie narządów trzewnych, uznaje się, że BZ 100 mg/kg przez 20 dni zapewnia całkowite wyleczenie. Ocena całkowitego wyleczenia została wcześniej zwalidowana za pomocą różnych technik10,13,17,33,34.
Podobny schemat badania zastosowano w modelu przewlekłym (Rycina 5A), w którym myszy (n = 6/grupa) zaczęto leczyć w 100. dniu po zakażeniu. W tym momencie podawano doustnie raz dziennie przez 20 dni Posa w dawce 20 mg/kg, BZ w dawce 100 mg/kg lub 10 mg/kg. Po okresie eliminacji leku myszy z ujemnym wynikiem BLI poddano immunosupresji. Ponadto, w celu oceny całkowitego wyleczenia, myszy, które nadal pozostawały BLI-ujemne po zakończeniu fazy immunosupresji, poddano analizie ex vivo.
W przypadku infekcji przewlekłej leczenie Posa w dawce 20 mg/kg doprowadziło do spadku obciążenia pasożytami, wywnioskowanego z bioluminescencji, o 95,03% ± 6,18% pod koniec leczenia, a poziomy te pozostały zbliżone do poziomu u myszy niezainfekowanych podczas okresu eliminacji leku. Po immunosupresji u większości myszy zaobserwowano zmienny poziom i rozkład sygnału BLI (Rysunek 5B). Procedura ex vivo wykazała, że jedna mysz z ujemnym wynikiem BLI całego ciała, leczzona Posa, posiadała bioluminescencyjną plamkę w jelicie grubym, którą wykryto podczas badania ex vivo (Rysunek 5C).
<img alt="Oś czasu chronicznego modelu CD, obrazowanie bioluminescencyjne, efekty leczenia, wyniki eksperymentu zakażeniowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Projekt eksperymentu oceny leków i wyniki uzyskane w chronicznym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. (A) Schemat projektu eksperymentu w mysim modelu chronicznej choroby Chagasa. Czarne kropki: punkty czasowe obrazowania. Kolba z lekiem i pomarańczowy pasek: odpowiednio początek i koniec leczenia. Ikona strzykawki: iniekcje cyklofosfamidu. Dpi: dzień po zakażeniu. Kod kolorystyczny: szary = zakażenie bez leczenia; pomarańczowy = okres leczenia; niebieski = faza eliminacji związku; żółty = immunosupresja; liliowy = nawrót. (B) Podłużna ocena skuteczności leczenia w chronicznym modelu choroby Chagasa. Panel lewy: brzuszne BLI myszy BALB/c (i) nieleczone lub leczone przez 20 dni za pomocą (ii) posakonazolu (Posa) w dawce 20 mg/kg; (iii) benznidazolu (BZ) w dawce 100 mg/kg oraz (iv) BZ w dawce 10 mg/kg (n = 6/grupa). Wszystkie leki podawano doustnie przez zgłębnik raz dziennie. Wykres prawy: suma surowych danych całkowitego strumienia z części brzusznej i grzbietowej. Legenda: kolba z lekiem: początek leczenia (102 dpi); pomarańczowy pasek: koniec leczenia (121 dpi); żółty pasek i ikona strzykawki: iniekcje cyklofosfamidu (od dnia 131-142). Pomarańczowa kropka: mysz analizowana procedurą ex vivo. ! mysz padła podczas znieczulenia. <img alt="Równowaga statyczna, diagram ΣFx=0, ilustrujący równowagę sił, kluczowy w edukacji z zakresu fizyki i inżynierii." src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> Mysz wykazuje nieprawidłowości w obrębie jamy brzusznej. Skala mapy ciepła (Log10) wskazuje intensywność bioluminescencji w jednostkach promieniowania od poziomu niskiego (3 × 105 jako kolor niebieski) do wysokiego (1 × 107 jako kolor czerwony). (C) Analiza ex vivo tropizmu T. cruzi w tkankach. Detekcja bioluminescencji w wyciętych organach od myszy z immunosupresją, u których BLI in vivo było ujemne po leczeniu Posa oraz BZ w dawce 100 mg/kg, lub od myszy z najniższym sygnałem w grupach nieleczonych i leczonych BZ w dawce 10 mg/kg. Legenda rozmieszczenia na płytce znajduje się na dole ryciny (stworzono w BioRender.com: ZY26LG8AOF). Skala promieniowania jest taka sama jak w panelu in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Leczenie BZ w dawce 100 mg/kg zredukowało bioluminescencję do poziomów progowych (93,87% ± 2,14%) w 122 dpi oraz w dalszej kolejności aż do końca eksperymentu. W analizie ex vivo BZ osiągnął wskaźnik wyleczenia na poziomie 100% (6/6 myszy), ponieważ u żadnej z myszy nie stwierdzono powrotu sygnału bioluminescencyjnego, nawet po immunosupresji i przebadaniu organów wewnętrznych. Oznacza to brak nawrotu choroby. Niemniej jednak, schemat leczenia BZ z zastosowaniem niższej koncentracji doprowadził do niewielkiej redukcji bioluminescencji (85,95% ± 18,43%), ale nie przyniósł wyleczenia, gdyż u myszy nadal wykrywalne były ogniska sygnału bioluminescencyjnego we wszystkich kolejnych punktach czasowych. Zatem model ten pozwala na ilościowe rozróżnienie między terapiami nieskutecznymi (posakonazol i podoptymalne leczenie benznidazolem) a terapiami skutecznymi (optymalne dawkowanie i czas trwania leczenia benznidazolem).
Rycina uzupełniająca 1: Analiza przedinfekcyjna ekspresji lucyferazy w populacji T. cruzi poprzez pomiar fluorescencji genu raportującego mNeonGreen. Cytometria przepływowa białka fluorescencyjnego mNeonGreen konstytutywnie ekspresowanego przez pasożyta CL Brener Luc::Neon. Znormalizowany histogram liczby pasożytów (oś Y) w zależności od intensywności fluorescencji mNeonGreen (oś X). Legenda wewnętrzna przedstawia analizowany szczep i formę, medianę fluorescencji oraz procent populacji fluorescencyjnej. Linie bramkowania określono na podstawie szczepu typu dzikiego (WT) CL Brener jako kontroli niefluorescencyjnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Przykład tabeli analizy w pomiarze BLI. Surowe dane uzyskane z kwantyfikacji obrazowania bioluminescencyjnego w 19. dniu po zakażeniu w modelu ostrym, wykorzystane w reprezentatywnych wynikach przedstawionych na Ryc. 4B. Opis grup: Kontrola jako myszy niezakażone (n = 3/grupa); nośnik jako zakażone myszy nieleczone; posakonazol (Posa) w dawce 20 mg/kg przez 20 dni; benznidazol (BZ) w dawce 100 mg/kg przez 20 dni; BZ w dawce 100 mg/kg przez 5 dni (n = 6/grupa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

To control and decrease the public health impact of human protozoan diseases such as Chagas disease, leishmaniasis, and human African trypanosomiasis, ...

Nasza grupa badawcza zajmuje się opracowywaniem leków na chorobę Chagasa. Szukamy nowych i lepszych leków, a także próbujemy zrozumieć, w jaki sposób pasożyt Trypanosoma cruzi może przetrwać w żywicielu i przetrwać nawet po skutecznym leczeniu farmakologicznym bez rozwoju oporności na leki. Choroba Chagasa jest złożoną infekcją ogólnoustrojową, która wymaga skutecznego leczenia parazytologicznego przed wystąpieniem skomplikowanej choroby.Choroba objawia się w różnych formach u ludzi, ale modele zwierzęce nie są jeszcze w stanie odtworzyć wszystkich ważnych aspektów choroby. Idealnie byłoby, gdyby nowe leki przeciwpasożytnicze na chorobę Chagasa sprzyjały leczeniu parazytologicznemu, czyli zwalczaniu pasożytów Trypanosoma cruzi od żywiciela. Protokoły te umożliwiają śledzenie w czasie rzeczywistym obciążenia pasożytami u myszy i odróżnianie związków, które tylko przejściowo hamują pasożytnictwo, od tych, które mogą sprzyjać leczeniu parazytologicznemu.Ze względu na zastosowanie lucyferazy jako reportera Trypanosoma cruzi, protokół ten pozwala na nieinwazyjne, zmniejszone wykorzystanie zwierząt i podłużne monitorowanie myszy zarówno podczas ostrej, jak i przewlekłej infekcji, a także umożliwia monitorowanie infekcji trzewnej w czasie rzeczywistym. Korzystając z podobnego protokołu, opracowujemy nowe metody pozwalające zrozumieć, w jaki sposób terapia lekowa może przynieść korzyści gospodarzowi, zapobiegając wystąpieniu choroby Chagasa i lecząc skomplikowaną chorobę Chagasa. Będziemy również kontynuować badania nad czynnikami utrudniającymi unikanie leczenia farmakologicznego przez Trypanosoma cruzi.Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do obrazowania na pulpicie. Kliknij Akwizycja, a następnie Tło i Wyświetl dostępną ciemną opłatę, aby zweryfikować automatyczne dostosowanie tła. Po dostosowaniu oprogramowania do obrazowania wstrzyknij D-lucyferynę pierwszym trzem myszom zakażonym Trypanosoma cruzi.Umieść myszy w pojemniku, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków D-lucyferyny. Rób notatki, jeśli tak się stanie, i zarejestruj grupę myszy i czas wstrzyknięcia D-lucyferyny. Następnie znieczul myszy i przenieś je do komory obrazowania.Przejdź do okna Akwizycja w oprogramowaniu do obrazowania i ustaw czas ekspozycji oraz binowanie. Teraz kliknij Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie. Jeśli widoczny jest znak ostrzegawczy nasyconego obrazu, zmniejsz binowanie, a następnie uzyskaj nowy obraz.Obciążenie pasożytami wywnioskowane z bioluminescencji wzrosło w ciągu pierwszych 20 dni po zakażeniu. Po tym nastąpił gwałtowny spadek obciążenia pasożytami w ciągu następnych 30 dni, co było wynikiem ostrej infekcji. Przewlekłą infekcję obserwowano, gdy obserwowano stałą bioluminescencję między 100 a 150 dniem po zakażeniu.Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do analizy danych na komputerze stacjonarnym. Kliknij Plik, a następnie Przeglądarka i wybierz Wybierz folder, aby otworzyć folder zawierający uzyskane dane obrazowania. Zaznacz wiele wierszy związanych z wybranymi obrazami, w tym niezainfekowane kontrolki i wykluczając obrazy przesycone.Zapisz identyfikator obrazu w notatniku laboratoryjnym wraz z informacjami zarejestrowanymi podczas drugiej sesji obrazowania. Kliknij Załaduj jako grupę, aby złożyć wybrane obrazy. Teraz kliknij ikonę Zapisz, aby zapisać nowy obraz sekwencji w nowym folderze w celu ponownej analizy surowych danych w razie potrzeby.Następnie kliknij Opcje, a następnie Wyświetlacz i wybierz Współczynnik kategoryzacji, aby zidentyfikować kategoryzację używaną dla każdego obrazu. Uzyskany współczynnik kategoryzacji zostanie wyświetlony u góry każdego obrazu w sekwencji. Aby skorygować wszystkie współczynniki kategoryzacji do tej samej wartości, najpierw kliknij dwukrotnie obraz, który chcesz dostosować.W oknie Paleta narzędzi kliknij opcję Dostosuj obraz, a następnie wybierz odpowiedni współczynnik kategoryzacji. Kliknij dwukrotnie obraz niezainfekowanych myszy, a następnie wybierz opcję Liczy w polu Jednostka. Dostosuj skalę kolorów do minimalnej wartości 600.Wybierz opcje radiancji w polu Jednostki, aby wyświetlić blask wynikowego obrazu. Gdy okno Sekwencja jest aktywne, wybierz opcję Blask w polu Jednostki. Wyłącz pojedyncze pole w obszarze Limity skali kolorów, aby dostosować skalę kolorów i tabelę kolorów w palecie narzędzi.Zaznacz pola skali logarytmicznej i ręcznej, a następnie ustaw maksymalne liczby skali zgodnie z niezainfekowaną kontrolą i obszar o najwyższym sygnale jako maksimum. Po ustawieniu tej samej skali dla wszystkich obrazów, kliknij dwukrotnie każdy obraz, zmaksymalizuj okno i użyj opcji Eksportuj grafikę, aby wyeksportować widok obrazu w formacie obrazu. Nazwij pliki według leczenia, a następnie identyfikator myszy i punkt czasowy.Kliknij dwukrotnie dowolny obraz z sekwencji. W oknie Paleta narzędzi kliknij sekcję Narzędzia ROI, a następnie naciśnij kwadratową ikonę. Narysuj prostokąt nad całą myszą.Kliknij obramowanie utworzonego ROI, a następnie skopiuj i wklej ten sam ROI dla każdej myszy. Następnie nazwij ROI, które mają zostać zarejestrowane. Następnie kliknij ikonę Zapisz w sekcji Narzędzie ROI.Zaznacz pole Zastosuj do sekwencji. Następnie zastosuj zapisane ROI dla wszystkich obrazów, klikając Załaduj. Dostosuj położenie ROI dla każdej myszy, aby lepiej dopasować je do obszaru pomiaru.Gdy wszystkie myszy zostaną oznaczone, kliknij opcję Zmierz zwrot z inwestycji. Powinna pojawić się tabela Pomiary ROI. Ustaw typy pomiarów na Promienność, atrybuty obrazu na wszystkie możliwe wartości, a wymiary ROI na centymetry.Następnie kliknij opcję Zaznacz wszystko, a następnie Kopiuj. Wklej dane bezpośrednio do oprogramowania do analizy tabel. Uporządkuj kolumny danych, aby prawidłowo posortować grupy.Następnie oznacz dane kolorami według grup w arkuszu kalkulacyjnym. Ułóż całkowite wartości strumienia tak, aby odpowiadały wartościom całkowitego strumienia brzusznego i grzbietowego tej samej myszy, a następnie zsumuj je, aby uzyskać bioluminescencję całego ciała każdej myszy. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe zsumowanych wartości dla każdej grupy.Wykreśl dane w oprogramowaniu statystycznym, aby wygenerować wykresy. Na koniec utwórz panel z obrazami bioluminescencyjnymi. Umieść każdą mysz w kolumnach, a punkty czasowe w rzędach, aby utworzyć matrycę skuteczności leku.Gdy metoda bioluminescencji jest stosowana do oceny środków przeciwpasożytniczych, tworzona jest matryca skuteczności leku w celu porównania badanych związków, których przykładem jest pozakonazol, ze standardowym leczeniem farmakologicznym stosowanym w chorobie Chagasa, benznidazolem w dawce 100 miligramów na kilogram podawaną raz na dobę. W tym badaniu podłużnym przebieg infekcji w czasie jest zilustrowany poprzez porównanie grupy nieleczonej z grupą leczoną. Wyniki wskazują albo na zmniejszenie obciążenia pasożytami, na co wskazuje zmniejszona bioluminescencja, albo na nawrót choroby, objawiający się zwiększonym obciążeniem pasożytami i wynikającym z tego wykrywaniem światła, co sugeruje nieskuteczny związek lub schemat leczenia.Światło określone ilościowo jest reprezentowane przez sumę całkowitego strumienia brzusznego i grzbietowego w fotonach na sekundę w funkcji czasu infekcji.

demystifying-vivo-bioluminescence-imaging-chagas-disease-mouse-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Obrazowanie bioluminescencyjne jest dobrze znanym narzędziem do lokalizacji guzów i przerzutów, ale kwantyfikacja tych obrazów często wymaga skomplikowanych obliczeń i specjalnych instrumentów. Opisujemy łatwą w użyciu metodę luminoscore, opartą na precyzyjnych warunkach akwizycji, niewymagającą obliczeń i umożliwiającą monitorowanie obciążenia guzem i odpowiedzi na leczenie w modelach mysich.

Metoda kwantyfikacji guza oparta na bioluminescencji do monitorowania progresji guza i efektów leczenia w modelach chłoniaka myszy

Ten manuskrypt opisuje użycie bioluminescencyjnego szczepu afrykańskich trypanosomów do śledzenia późnych stadiów infekcji i pokazuje, jak obrazowanie na żywo in vivo może być wykorzystane do wizualizacji infekcji w ośrodkowym układzie nerwowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Inokulacja Trypanosoma cruzi do zapłodnionych jaj przed inkubacją powoduje integrację minikołk kDNA pasożyta w genomie komórek embrionalnych. Krzyżowanie wykazuje pionowy transfer mutacji na potomstwo. kDNA integruje się z regionami kodującymi w kilku chromosomach, a kurczaki giną w wyniku zapalnej autoimmunologicznej choroby serca.

Indukowana przez pasożyta genetycznie sterowana autoimmunologiczna choroba serca Chagasa w modelu kurzym

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Poznaj nieinwazyjną metodę bioluminescencyjnego obrazowania in vivo w mysim modelu zakażenia Trypanosoma cruzi. Protokół umożliwia śledzenie obciążenia pasożytniczego w czasie rzeczywistym oraz ocenę skuteczności leków przeciwko chorobie Chagasa.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

Przeglądaj więcej filmów