Name: Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj skalowalny protokół produkcji wektorów AAV o wysokiej czystości przy użyciu platformy Cell Factory. Metoda zapewnia czystość powyżej 90% i umożliwia prowadzenie większych badań przedklinicznych w terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TZ zaprojektował eksperymenty. Eksperymenty przeprowadzili TZ, VD, SB i JP. TZ i VD wygenerowały dane i przeanalizowały je. TZ i YX napisali rękopis. TZ i GG zrewidowały manuskrypt. Prace te były wspierane przez Szpital Dziecięcy UPMC w Pittsburghu.

Szczegóły dotyczące odczynników, plazmidów i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Skład stosowanych jest podany w pliku uzupełniającym 1.
1. Przygotowanie plazmidu
<ol>
	<li>Transformacja plazmidów (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) w E. coli. 
	UWAGA: Do amplifikacji plazmidu można użyć dowolnego szczepu E. coli. W przypadku niektórych plazmidów specjalne kompetentne komórki, takie jak stabilny NEB, mogą poprawić wydajność plazmidu. Trzy plazmidy używane w tym protokole to pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 i pAAV-Cap: pAAV-RC6.</li>
	<li>Hodować bakterie w pożywce LB zawierającej odpowiednie selektywne antybiotyki w optymalnej objętości w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin 
	UWAGA: W przypadku stosowania stabilnych komórek NEB należy hodować w temperaturze 30 °C przez 18-20 godzin.</li>
	<li>Zebrać plazmidowe DNA przez odwirowanie pożywki hodowlanej E. coli w temperaturze 4000 x g, 4 °C, przez 15 minut.</li>
	<li>Ostrożnie wlej ciecz sklarowaną nad osadem z butelki wirówki do pojemnika na odpady i oczyść plazmidowe DNA z osadu za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu na dużą skalę bez endotoksyn. 
	UWAGA: Upewnij się, że nalewasz go powoli i unikaj rozpryskiwania.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru. 
	UWAGA: Sprawdź czystość DNA, sprawdzając stosunek OD260/OD280. Stosunek dla czystego DNA wynosi około 1,8. Stężenie DNA powinno wynosić powyżej 1 μg/μl dla późniejszego etapu kotransfekcji. Przygotować zapas glicerolu bakteryjnego, dodając 500 μl kultury na noc do 500 μl 50% glicerolu w kriowiale i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek HEK293T
<ol>
	<li>Wysiewaj HEK293T komórki z pożywką DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającą 10% FBS do 10-warstwowej fabryki komórek (CF10) i pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze przez noc. 
	UWAGA: Pasaże komórek 293T powinny być mniejsze niż 10, aby zapewnić optymalne warunki do solidnej produkcji AAV. Jeśli to możliwe, nie dodawaj w tym czasie antybiotyków do pożywki hodowlanej. CF10 ma około 42 razy większą powierzchnię wzrostu niż szalka do hodowli komórkowej o średnicy 150 mm. Zasiać tę samą gęstość komórek w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 150 mm, aby umożliwić sprawdzenie wzrostu komórek pod mikroskopem. Przygotuj zawiesinę komórek o objętości 1075 ml, dodaj 25 ml zawiesiny komórek do naczynia o średnicy 150 mm, a pozostałą część dodaj do naczynia CF10.</li>
	<li>Sprawdź zbieg komórek następnego dnia przed transfekcją. 
	UWAGA: Komórki powinny osiągnąć 80%-90% konfluencji w momencie transfekcji, obserwując pod mikroskopem.</li>
</ol>
3. Potrójna transfekcja plazmidów AAV
<ol>
	<li>Oblicz ilość każdego plazmidu potrzebną (pAAV-GOI, pHelper, serotyp pAAV), aby uzyskać stosunek molowy 1,2: 1: 1 z 2,5-5 mg całkowitego DNA na CF10, 
	UWAGA: Stosunek molowy trzech plazmidów może być zmienny dla optymalnej skuteczności transfekcji. Lepiej jest przetestować go w małej skali przed przejściem do tego ustawienia CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 i pAAV-RC6 są używane do stworzenia wirusa AAV6-CMV-GFP jako przykład. Wzór kalkulatora PEI jest wymieniony w tabeli 1.</li>
	<li>Podać 350 ml OptiMEM do sterylnej butelki o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Dodaj wszystkie trzy plazmidowe DNA do butelki zawierającej Opti-MEM. Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Dodać 15 ml roztworu polietylenininu (PEI) o stężeniu 1 mg/ml (stosunek 1:3 μg DNA do μg PEI). Potrząsaj mieszaniną OptiMEM/DNA/PEI energicznie w górę i w dół przez 30 s. 
	UWAGA: Robienie bąbelków jest w porządku.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10-15 min. 
	UWAGA: Dłuższa inkubacja może zmniejszyć wydajność transfekcji.</li>
	<li>Dodać roztwór OptiMEM/DNA/PEI do 1 litrowej butelki zawierającej 700 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy z 10 mM HEPES, 2% FBS. Dobrze wymieszaj. 
	UWAGA: W tym badaniu niski poziom glukozy w DMEM wykazał lepszą produkcję wektora AAV po kotransfekcji. Dodatek HEPES pomaga utrzymać komórki w lepszej kondycji. Wymieszaj, powoli obracając butelkę. Unikaj tworzenia zbyt wielu bąbelków.</li>
	<li>Wyjmij CF10 z inkubatora i odkurz pożywkę do pojemnika na odpady. 
	UWAGA: Połóż CF10 na powierzchni wewnątrz maski i stopniowo podnoś jedną stronę do góry, powoli odkurzaj media bez odłączania ogniw.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj mieszaninę transfektantów do CF10. Upewnij się, że wszystkie dziesięć warstw jest pokrytych mediami. 
	UWAGA: Dodać 25 ml mieszaniny transfektantów do naczynia o średnicy 150 mm. Monitoruj komórki codziennie, aż do zbiorów. Dodaj pozostałą mieszaninę transfektantów do CF10, wlewając powoli. Obróć CF10 bardzo ostrożnie i upewnij się, że każda warstwa ma równą objętość.</li>
	<li>Umieść CF10 z powrotem w inkubatorze na 72-96 godz. 
	UWAGA: Sprawdź miskę monitora 150 mm, aby zdecydować, kiedy zebrać wektory AAV. Kiedy komórki bardzo łatwo się odczepiają przy pełnym obciążeniu AAV, nadszedł czas na zbiory.</li>
</ol>
4. Zbieranie wektorów AAV
<ol>
	<li>Zbierz wirusa 3-4 dni po transfekcji, energicznie potrząsając CF10. Wlać pożywkę do stożkowych probówek o pojemności 250 ml i odwirowywać wirusa w temperaturze 4000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W przypadku serotypu AAV6 użytego w tym protokole, 80% AAV pozostanie w większości związane z materiałem komórkowym w pastylce. A 20% AAV zostało wydzielone do mediów. Proporcje te mogą się różnić dla innych serotypów AAV.</li>
	<li>Przefiltrować oczyszczony supernatant za pomocą jednostki filtrującej 0,45 μm i zachować go do wytrącenia.</li>
	<li>Przepłukać CF10 500 ml DPBS 1x buforu i odwirować przy 4000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego i pipety zasysającej. Dodać 20 ml buforu do lizy AAV na CF10 w temperaturze -80 °C do momentu oczyszczenia. 
	UWAGA: Przenieś lizat AAV do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu późniejszej ekstrakcji AAV.</li>
	<li>Wyjąć przefiltrowany supernatant, dodać 40% roztwór PEG-2,5 M NaCl do końcowego stężenia 8% PEG i inkubować w chłodnym pomieszczeniu na rotatorze orbitalnym przez co najmniej 3 godziny lub przez noc. 
	UWAGA: Do 100 ml supernatantu dodać 25 ml 40% roztworu PEG-2,5 M NaCl.</li>
	<li>Wytrącić wirusa przez odwirowanie w temperaturze 4000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Przenieść mieszaninę do probówek stożkowych o pojemności 250 ml w celu odwirowania.</li>
	<li>Odessać, aby usunąć supernatant i dodać 5-10 ml buforu do reprodukcji AAV HEPES, aby zawiesić granulki. Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu kontynuowania oczyszczania lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja AAV
<ol>
	<li>Rozmrozić osad wirusa w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10-15 minut za pomocą shakera. 
	UWAGA: Zwiruj lizat AAV, aby całkowicie się rozpuścił.</li>
	<li>Zamrażać w kąpieli 100% etanolowej w temperaturze -80 °C przez 20-30 min. 
	UWAGA: Alternatywnie cykl zamrażania można wykonać za pomocą zimnej zlewki ze 100% etanolem otoczonej suchym lodem.</li>
	<li>Wykonaj zamrażanie/rozmrażanie 3-4 razy i w razie potrzeby wirowanie pomiędzy. 
	UWAGA: Ten cykl można wstrzymać na etapie zamrażania. Przechowywać lizat AAV w temperaturze -80 °C do czasu zakończenia dalszych prac.</li>
	<li>Rozmrozić lizat AAV (od kroku 5.3) i ponownie zawiesić AAV (od kroku 4.7)" w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10-15 minut za pomocą wytrząsarki i wirować. 
	UWAGA: Upewnij się, że całkowicie się rozpuścił i wymieszaj.</li>
	<li>Dodaj nukleazę benzonazy (250 jednostek/μl) do lizatu AAV i ponownie zawiesić AAV do końcowego stężenia 50 jednostek/ml. Wiruj roztwór.</li>
	<li>Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 30 min. 
	UWAGA: Wyjmij 10% podwielokrotności deoksycholanu sodu w łaźni wodnej, aby dać czas na rozpuszczenie, rozgrzanie i dokładne wymieszanie.</li>
	<li>Dodać 10% deoksycholanu sodu do końcowego stężenia 0,5% i inkubować w temperaturze 37 °C z włączonym wytrząsarką przez 30 min. 
	UWAGA: Deoksycholan sodu zastosowano w celu zwiększenia uwalniania AAV z komórek.</li>
	<li>Rozprowadzić surowy roztwór AAV w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Do przeniesienia supernatantu należy użyć pipety o pojemności 1 ml. Wyrzuć granulki.</li>
	<li>Dodać równą ilość chloroformu i wyekstrahować AAV przez wirowanie przez 1-2 min. 
	UWAGA: Roztwór powinien stać się nieprzezroczysty, biały, mleczny.</li>
	<li>Przenieść mleczny roztwór do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i równomiernie rozprowadzić. Wirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować górną różową warstwę i przenieść ją do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Nie naruszaj warstw chloroformu/białka.</li>
	<li>Zmierz końcową objętość za pomocą pipety. Zgodnie z surową tabelą objętości siarczanu AAV-PEG (tabela 2), wymieszaj odpowiednie objętości 50% (NH4)2SO4 i 40% roztworu PEG. Wirować przez 2 min.</li>
	<li>Przenieś mieszaninę do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml w celu równomiernego rozprowadzenia. Wirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C</li>
	<li>Zebrać dolną warstwę za pomocą igły 22 G i strzykawki o pojemności 3 ml. Zebrać AAV w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego ultrawirowania gradientów jodiksanolu.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie AAV za pomocą ultrawirowania w gradinie jodiksanolu
<ol>
	<li>Gradienty jodu należy przygotować na świeżo przed załadowaniem AAV zgodnie z liczbą użytych probówek do ultrawirowania (Tabela 3). 
	UWAGA: Czerwień fenolowa została użyta do obserwacji warstw.</li>
	<li>Powoli nakładaj każdy roztwór do okrągłej probówki z szybkozamykającą się ultrawirówką polipropylenową za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml dołączonej do długiej igły o wadze 16 G. Unikaj bąbelków.</li>
	<li>Ostrożnie dodać do 17 ml roztworu AAV na wierzch gradientu za pomocą strzykawki 22 G. Użyj buforu do dializy AAV, aby uzupełnić rurkę. 
	UWAGA: Dodaj roztwór AAV, ładując krople na ścianę w probówce ultrawirówkowej. Nie zaburzaj warstw gradientu.</li>
	<li>Uszczelnij probówki ultrawirówki za pomocą zgrzewarki elektrycznej. 
	UWAGA: Zrównoważyć probówki przed wysłaniem ich do ultrawirówki z różnicą ±0,2 g.</li>
	<li>Wirować przy 350 000 x g przez 2 godziny w wirniku Ti70 w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij probówki z wirnika i umieść je w stojaku na probówki ultrawirówkowe. 
	UWAGA: Upewnij się, że gradienty nie są zakłócone.</li>
	<li>Zbierz frakcje AAV, wykonując poniższe czynności:
	<ol>
		<li>Ustabilizuj rurkę na uchwycie stojaka.</li>
		<li>Nakłuć probówki ultrawirówki nieco poniżej granicy faz 40%-60% za pomocą igły 19 G dołączonej do strzykawki o pojemności 10 ml. 
		UWAGA: Otwór igły powinien być skierowany do góry, skierowany w stronę nachylenia 40%.</li>
		<li>Przebić otwór w górnej części rurki za pomocą igły 16 G.</li>
		<li>Zbierz do 5 ml na probówkę. Unikaj gromadzenia się zanieczyszczeń białkowych na granicy faz 25%-40%.</li>
		<li>Powtórz te czynności dla każdej probówki do ultrawirówki. 
		UWAGA: Przenieś frakcje AAV do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Druga runda ultrawirowania gradientów jodiksanolu
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Ten krok ma na celu zmniejszenie współczynnika pustego AAV w celu uzyskania wyższej jakości pełnego kapsydu AAV.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć AAV >1:1 buforem do dializy AAV. 
	UWAGA: AAV pobrany z pierwszej rundy ultrawirowania zawierał 40% warstwę jodiksanolu. Należy go rozcieńczyć o co najmniej 50%, aby można go było nałożyć na warstwę 30% jodiksanolu.</li>
	<li>Nałożyć każdy roztwór (Tabela 4) do probówki do ultrawirowania za pomocą igły nakłuwanej 16 G i powoli założyć strzykawkę o pojemności 10 ml. Unikaj bąbelków.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 20 ml rozcieńczonego roztworu AAV na wierzch gradientu za pomocą strzykawki 22 G. Użyj buforu do dializy AAV, aby uzupełnić rurkę.</li>
	<li>Powtórz kroki od 6.4 do 6.7.</li>
</ol>
8. Dializa i stężenie AAV
<ol>
	<li>Przenieść wirusa AAV do kasety dializacyjnej za pomocą nowej igły 18 G i strzykawki o pojemności 10 ml. Powoli wstrzyknij wirusa do kasety i usuń z niej powietrze.</li>
	<li>Dodać mieszadło do zlewki zawierającej bufor do dializy AAV i umieścić go na płytce mieszającej.</li>
	<li>Umieścić kasetę dializacyjną w buforze dializacyjnym z boją pływakową. Mieszać w temperaturze 4 °C. Zmienić 2-3 razy bufor dializacyjny AAV. 
	UWAGA: Użyj wystarczającej ilości bufora, aby kaseta mogła się unosić i przeprowadzić wymianę bufora. Przykryj zlewkę folią aluminiową.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml dołączonej do igły 18 G, zbierz wirusa z kasety do filtra odśrodkowego.</li>
	<li>Wirować przy 4 000 x g przez 15-30 min w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Przepłukać AAV buforem dializacyjnym AAV 2-3 razy. Skoncentruj AAV, aż ~200 μl pozostałego znajdzie się na górze filtra.</li>
	<li>Zbierz skoncentrowany AAV z jednostki filtrującej. Przepłukać filtr kolejnymi 300 μl buforu do dializy AAV i przenieść go do zagęszczonego AAV.</li>
	<li>Przefiltrować wirusa przez filtr strzykawkowy 0,22 μm za pomocą 1 ml tuberkulinowej strzykawki typu luer. Aby zapewnić najmniejszą utratę objętości, użyj strzykawki o pojemności 10 ml, aby przepchnąć powietrze przez filtr 2-3 razy.</li>
	<li>Oczyszczony wirus AAV należy przechowywać tymczasowo w temperaturze 4 °C w celu miareczkowania. 
	UWAGA: Miareczkować porcję wirusa i przechowywać w temperaturze -80 °C w ciągu 1 tygodnia.</li>
</ol>
9. Miareczkowanie wirusa AAV
UWAGA: Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy TaqMan (qPCR) została użyta do miareczkowania oczyszczonego AAV.
<ol>
	<li>Potraktuj wektory AAV DNazą I i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie inkubuj w temperaturze 95 °C przez 10 minut. 
	UWAGA: Jako przykład reakcji 10 μL stosuje się 2 μL próbki wirusa AAV, 1 μL DNazy, 1 μL buforu DNazy i 6 μLH2O. Można go wykonać w termocyklerze z probówkami PCR.</li>
	<li>Przygotuj zestawy starterów przeznaczone dla regionu wstawiania AAV. 
	UWAGA: Celami mogą być promotor, transgen i reporter w konstrukcie AAV. Startery wymieniono w tabeli 5.</li>
	<li>Przygotować wzorce plazmidu DNA (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 i 0,0001 pg/μL) oraz kontrolę ujemną (H2O).</li>
	<li>Przygotuj główną mieszankę qPCR, w tym startery, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Umieścić wzorce i próbki w trzech egzemplarzach na płytce do PCR. Dodaj mieszaninę qPCR do wzorców i próbek. Uszczelnić płytkę i przeprowadzić reakcję qPCR zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Warunki reakcji zależą od materiałów/odczynników i instrumentu. Stosowane są szybkie i konwencjonalne cykle PCR.</li>
	<li>Obliczać miano wirusa AAV. 
	UWAGA: Stężenie próbki w tym protokole wynosi 1/10 rozcieńczenia od oryginalnych próbek.</li>
	<li>Wirusa AAV należy rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C przez długi czas. 
	UWAGA: Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania podczas przechowywania. W przypadku stosowania do eksperymentów in vivo nie należy stosować rozmrażania ponad dwukrotnych porcji.</li>
</ol>
10. Kontrola jakości AAV
UWAGA: Wirusy AAV zostały scharakteryzowane pod kątem czystości za pomocą srebrnego barwnika SDS-PAGE przy użyciu żelu SDS-PAGE i barwione za pomocą dostępnego na rynku zestawu do barwienia.
<ol>
	<li>Denaturacja 3 x 109 vg próbki wirusa AAV za pomocą buforu Laemmli. 
	UWAGA: Użyj referencyjnego wirusa AAV jako kontroli. Używany jest referencyjny pełny kapsyd AAV6-CMV-GFP.</li>
	<li>Załaduj denaturat AAV na żel SDS-PAGE o nachyleniu 4%-20% i pracuj pod napięciem 180 V przez 50 minut.</li>
	<li>Usuń żel z płytki do elektroforezy. Żel należy zabarwić srebrnym zestawem do barwienia zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Sprawdź białka kapsydu AAV VP1, VP2 i VP3. 
	UWAGA: Czysty wirus AAV zawiera tylko białko kapsydu VP1, VP2 i VP3. Jeśli nie jest czysty, na żelu będą widoczne inne prążki białkowe. 
	UWAGA: Przeprowadzono transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) rekombinowanych wirionów AAV barwionych ujemnie w celu oceny integralności morfologicznej i stosunku pełnego/pustego.</li>
	<li>Podnieś siatkę EM za pomocą pęsety i połóż się na ławce błyszczącą stroną siatki skierowaną do góry.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 5 μl próbki AAV na siatkę i pozostawić do wyschnięcia przez odparowanie. 
	UWAGA: W razie potrzeby rozcieńczyć AAV. 1012 vg/ml to średnie miano. Wyschnięcie siatki może zająć 30-60 minut.</li>
	<li>Przemyć siatkę przez pipetowanie, kropla po kropli, dosypując około 200 μlH2Ona siatkę.</li>
	<li>Usuń nadmiar wody, powoli kładąc bibułę chromatograficzną pionowo obok siatki.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 5 μl 2% roztworu octanu uranylu na siatkę. Inkubować przez 5 minut i odciąć, jak wspomniano powyżej. Pozostaw siatkę do wyschnięcia.</li>
	<li>Wizualizuj cząstki AAV pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (przy 50 000-krotnym powiększeniu). Kapsydy wirusowe z genomem wirusa pojawią się jako jednorodne białe sześciokąty, podczas gdy puste kapsydy pojawią się jako sześciokąty z białą obwódką, ale ciemnym środkiem.</li>
	<li>Policz losowo co najmniej 100 cząstek, aby określić przybliżony procent pełnych i pustych cząstek AAV.</li>
</ol>

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

<ol><li>Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+recombinant+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer.</a> BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).</li>
<li>Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+targeted+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy.</a> Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).</li>
<li>Bilal, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+large-scale+Adeno-Associated+Virus+%28AAV%29+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production.</a> Curr Protoc. 3 (5), e757(2023).</li>
<li>Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+adeno-associated+viral+vector+serotype-9+carrying+the+human+survival+motor+neuron+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene.</a> Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Publisher+Correction%3A+Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).</li>
<li>Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+discovery+of+novel+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14(2012).</li>
<li>Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+purification+of+AAV+and+delivery+to+the+pancreas+by+intraductal+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).</li>
<li>Berns, K. I., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy+for+human+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases.</a> Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).</li>
<li>Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+band+centrifugation+for+the+separation+and+quantification+of+empty+and+full+AAV+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+observation+of+the+recombinant+adeno-associated+virus+2+using+transmission+electron+microscopy+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy.</a> Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).</li>
<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ-formable%2C+dynamic+crosslinked+poly+%28ethylene+glycol%29+carrier+for+localized+adeno-associated+virus+infection+and+reduced+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects.</a> Commun Biol. 6 (1), 508(2023).</li>
<li>Sena-Esteves, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+fully+packaged+virions+in+column-purified+recombinant+adeno-associated+virus+%28rAAV%29+preparations+by+iodixanol+gradient+centrifugation+followed+by+anion-exchange+column+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638(2020).</li>
<li>Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+avian+encephalomyelitis+virus+by+ultracentrifugation+in+a+nonlinear+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient.</a> Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

W tym przypadku wprowadzono zaawansowany technicznie protokół do produkcji na dużą skalę wektorów AAV o wysokim mianie i wysokiej jakości przy użyciu platformy fabryki komórek (CF10), co stanowi znaczny postęp w porównaniu z konwencjonalnymi metodami hodowli komórkowych. Wykorzystanie fabryk komórkowych upraszcza proces hodowli dużych ilości komórek, ułatwiając bardziej efektywną produkcję wirusów AAV1. Ponadto, optymalizując warunki hodowli, szczególnie w przypadku DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionego 10 mM HEPES i 2% FBS, potwierdzono znacznie zwiększoną produkcję wirusa, co wskazuje na kluczową rolę środowiska komórkowego w wydajności wirusa.
Zmieniony protokół oczyszczania, który łączy AAV zarówno z osadów komórkowych, jak i pożywek hodowlanych, rozwiązuje powszechny problem niskiej wydajności wirusa i zanieczyszczeń obserwowanych w wielu istniejących protokołach. Etapy ekstrakcji chloroformem i wodnego dwufazowego podziału skutecznie usuwają większość zanieczyszczeń białkowych, przy czym AAV pozostaje rozpuszczalny w fazie siarczanu amonu. Poprawę zarówno wydajności, jak i czystości wektorów AAV przy użyciu dwufazowego podziału PEG/wodnego w połączeniu z ultrawirowaniem w gradinie jodiksanolu, w przeciwieństwie do tradycyjnych metod ultrawirowania gradientowego, można przypisać zwiększonej początkowej separacji za pomocą dwufazowego podziału PEG/wodnego, wyrafinowanej czystości za pomocą ultrawirowania w gradinie jodiksanolu oraz zmniejszeniu współoczyszczania zanieczyszczeń12. Po pierwsze, wprowadzenie dwufazowego podziału PEG/wodnego przed ultrawirowaniem znacznie poprawia początkową separację cząstek AAV od szczątków komórkowych i innych zanieczyszczeń. PEG, polimer o dużej masie cząsteczkowej, po zmieszaniu z roztworem wodnym tworzy dwie odrębne fazy13. Wektory AAV mają skłonność do preferencyjnego podziału na jedną z tych faz (zwykle fazę bogatą w PEG), podczas gdy wiele zanieczyszczeń i zanieczyszczeń jest podzielonych na pozostałe13. To selektywne dzielenie skutecznie koncentruje cząstki AAV i usuwa znaczną część zanieczyszczeń jeszcze przed ultrawirowaniem, zwiększając w ten sposób wydajność i zmniejszając ładunek zanieczyszczeń wchodzących do etapuultrawirowania 13. Po drugie, ultrawirowanie w gradionym jodiksanolu dodatkowo poprawia czystość wektorów AAV. Jodixanol, niejonowe, izoosmolarne medium gradientowe, pozwala na łagodniejszą i bardziej kontrolowaną separację w porównaniu z tradycyjnymi gradientami CsCl14. W tym gradiencie cząstki AAV migrują do pozycji w gradiencie, która odpowiada ich gęstości wyporu14. Co ważne, proces ten jest skuteczny w oddzielaniu pełnych kapsydów AAV (zawierających ładunek genetyczny) od pustych kapsydów (pozbawionych materiału genetycznego), co jest kluczowym wyznacznikiem jakości wektora. Izoosmolarny charakter jodiksanolu zachowuje również integralność kapsydów AAV lepiej niż środki hiperosmolarne, takie jak CsCl, potencjalnie prowadząc do wyższych plonów nienaruszonych, funkcjonalnych wektorów14. Wreszcie, tradycyjne metody ultrawirowania, zwłaszcza te wykorzystujące gradienty CsCl, mogą czasami współoczyszczać zanieczyszczenia, które mają podobną gęstość wyporu do wektorów AAV15. Dzięki zastosowaniu podziału PEG jako etapu wstępnego, ładunek takich zanieczyszczeń jest znacznie zmniejszony przed ultrawirowaniem13. To zmniejszenie ładunku zanieczyszczeń oznacza, że gradient jodiksanolu może działać skuteczniej i bardziej selektywnie w oczyszczaniu wektorów AAV, prowadząc do wyższej czystości15.
Czystość i jakość wektorów AAV są rygorystycznie oceniane za pomocą barwienia srebrem i TEM11. Obserwacja trzech głównych prążków odpowiadających białkom kapsydu AAV VP1, VP2 i VP3, o czystości przekraczającej 90%, wskazuje na przydatność tych wektorów AAV do stosowania in vivo . Analiza TEM w celu określenia stosunku pełnego do pustego kapsydu jest szczególnie istotna, ponieważ wysoki odsetek pustych kapsydów może prowadzić do zmniejszenia wydajności dostarczania genów i potencjalnej odpowiedzi immunologicznej11. Ta kontrola jakości, choć niezbędna, dodatkowo komplikuje procedurę i może wymagać dodatkowej wiedzy technicznej.
Podsumowując, protokół oferuje znaczący postęp techniczny w produkcji wektorów AAV, szczególnie pod względem skalowalności i czystości. Jednak złożoność związana z procesem oczyszczania oraz potrzeba specjalistycznego sprzętu i wiedzy specjalistycznej mogą nadal stanowić niewielkie ograniczenie dla jego zastosowania w niektórych warunkach badawczych. Dalsze udoskonalanie i upraszczanie tych technik może sprawić, że podejście to stanie się bardziej dostępne i będzie miało szersze zastosowanie w dziedzinie badań nad terapią genową.

Wektory wirusa związanego z adenowirusem (AAV) stały się niezastąpionym narzędziem w badaniach nad terapią genową, oferując unikalne połączenie skuteczności i bezpieczeństwa dostarczania genów1. Tradycyjne metody generowania AAV w warunkach laboratoryjnych odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszego zrozumienia i zastosowania terapii genowej2. Jednak metody te, choć fundamentalne, wykazują pewne ograniczenia i wyzwania, zwłaszcza pod względem wydajności, efektywności czasowej i jakości wytwarzanych wektorów, w szczególności stosunku pełnych do pustych cząstek3.
Konwencjonalna procedura produkcji AAV polega przede wszystkim na transfekcji komórek HEK2934. Proces ten, zwykle przeprowadzany w szalkach do hodowli komórkowych, wymaga transfekcji komórek plazmidem zawierającym interesujący nas gen wraz z plazmidem pomocniczym i plazmidem kapsydu AAV5,6. Po transfekcji komórki wytwarzają cząsteczki AAV, które są następnie zbierane i oczyszczane5,6. Proces oczyszczania często obejmuje ultrawirowanie, co jest krytycznym krokiem w uzyskiwaniu wektorów AAV o wysokiej czystości7. Ultrawirowanie, szczególnie przy użyciu chlorku cezu (CsCl) lub gradientu jodoksanolu, jest standardową metodą oddzielania cząstek AAV od resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń8. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanej czystości i stężenia wektorów AAV, co bezpośrednio wpływa na ich skuteczność w dostarczaniu genów8. Pomimo powszechnego stosowania, tradycyjne ultrawirowanie ma swoje wady. Na przykład wydajność wektorów AAV z tej metody może być zmienna i często niska, co stanowi poważne wyzwanie, gdy potrzebne są duże ilości wektorów o wysokim mianie, szczególnie w przypadku badań in vivo lub dużych modeli zwierzęcych9.
Innym krytycznym aspektem jakości wektora AAV jest stosunek pełnych do pustych cząstek10. Preparaty AAV często zawierają mieszaninę tych cząstek; Jednak tylko pełne cząstki zawierają terapeutyczny materiał genetyczny. Obecność dużej ilości pustych cząstek może znacznie zmniejszyć efektywność dostarczania genów10. Ocena i optymalizacja stosunku pełnych do pustych cząstek jest zatem kluczowym parametrem w ocenie skuteczności wektorów AAV. Tradycyjne metody, choć zdolne do wytwarzania wektorów AAV, często mają trudności z konsekwentnym kontrolowaniem tego stosunku, co prowadzi do różnic w potencji wektorów10.
Tutaj prezentowana jest unikalna metoda, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV przy użyciu platformy fabryki komórek bez użycia pracochłonnych HEK293T hodowli komórkowych w naczyniach komórkowych, integrując dwufazowe rozdzielanie glikolu polietylenowego/wodnego z ultrawirowaniem gradientu jodixanol. Czystość wektora AAV jest potwierdzana za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem, a stosunek pełnych do pustych cząstek jest określany za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), spełniającej standardy jakości dla badań in vivo11.

<table><tbody><tr><td>293T/17 ogniw</td><td>ATTC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>324506-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1 mL strzykawka Henke-Ject</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-211</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór pluroniczny F68</td><td>Fisher Scientific</td><td>24-040-032</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor Tris/Glicyna/SDS</td><td>Biorad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>2% roztwór octanu uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4%&ndash; 20% prefabrykowane żele białkowe</td><td>biorad</td><td>4561094</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór PEG</td><td>Sigma</td><td>P1458-50ML</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 referencyjne pełne kapsydy</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odrywania komórek Accutase</td><td>Fisher Scientific</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza</td><td>Sigma</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>BioLite Hodowla komórkowa Naczynia poddane obróbce 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-003</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Filtry strzykawkowe PES</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-29</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do dializy, 10 K MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI66810</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe jednostki filtrujące PES 1 L 0,2 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566506</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe jednostki filtrujące PES 1 L 0,45 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566507</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe jednostki filtrujące PES 500 ml 0,2 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566504</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokim poziomie glukozy</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-569-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o niskim poziomie glukozy</td><td>Fisher Scientific</td><td>10567022</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica Bovin (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>FCF300-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Sigma</td><td>L2897-250G</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9732-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCL2&middot; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M9272-100G</td><td></td></tr><tr><td>Stabilne kompetentne komórki NEB</td><td></td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Nest Biofactory 10-komorowy</td><td>MidSci</td><td>771302</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Gradient gęstości średni</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556-250ml</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CMV-GFP</td><td>Addgene</td><td>105530</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-DJ</td><td>Cell BioLab</td><td>VPK-420-DJ</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC6</td><td>Cell BioLab</td><td>VPK-426</td><td></td></tr><tr><td>pAdDeltaF6</td><td>Addgene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>PEI Max</td><td>Polysciences, Inc</td><td>49553-93-7</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-163</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.07242.0100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Pierce Silver Stain Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24612</td><td></td></tr><tr><td>Rurka QuickSeal</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9144589</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>1162245000</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti Tytanowy rotor o stałym kącie</td> nachylenia <td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting</td><td>Substrate ThermoFisher&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 32209</td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy cell factory

A Streamlined and Standardized Procedure for Generating High-Titer, High-Quality Adeno-Associated Virus Vectors Utilizing a Cell Factory Platform

Przedkliniczne badania nad terapią genową, szczególnie na gryzoniach i dużych modelach zwierzęcych, wymagają produkcji wektorów AAV o wysokiej wydajności i czystości. Tradycyjne podejścia w laboratoriach badawczych często obejmują intensywne wykorzystanie szalek do hodowli komórkowych do hodowli HEK293T komórek, co może być zarówno pracochłonne, jak i problematyczne. W tym miejscu zaprezentowana jest unikalna metoda wewnętrzna, która upraszcza ten proces dzięki specjalnej platformie fabryki ogniw (lub stosów ogniw, CF10). Integracja dwufazowego podziału glikolu polietylenowego i wody z ultrawirowaniem w gradionym jodiksanolu poprawia zarówno wydajność, jak i czystość generowanych wektorów AAV. Czystość wektorów AAV jest weryfikowana za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem, natomiast stosunek pełnych do pustych cząstek określa się za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Podejście to oferuje wydajną platformę fabryki komórek do produkcji wektorów AAV z wysoką wydajnością, w połączeniu z ulepszoną metodą oczyszczania, aby spełnić wymagania jakościowe dotyczące badań in vivo.

W niniejszym szczegółowym protokole krok po kroku zaprezentowano standaryzowaną platformę służącą do wytwarzania wirusa AAV o wysokim mianie i wysokiej jakości z wykorzystaniem CF10 w warunkach wielkoskalowego laboratorium badawczego. W porównaniu z konwencjonalnymi naczyniami do hodowli komórkowej, CF10 umożliwia wygodną hodowlę dużych ilości komórek i produkcję wirusa AAV (Rysunek 1). Przetestowano kilka warunków hodowli, aby ustalić, czy komórki w optymalnym środowisku mogą zwiększyć produkcję wirusową. Najwyższą produkcję AAV uzyskano przy zastosowaniu DMEM o niskiej zawartości glukozy, uzupełnionego o 10 mM HEPES i 2% FBS.
W celu oczyszczania AAV przetestowano kilka protokołów. Większość procedur charakteryzowała się niską wydajnością wirusów oraz obecnością zanieczyszczeń w kapsydach AAV. W niniejszej pracy opracowano zmodyfikowany protokół oczyszczania, łączący AAV z osadów komórkowych oraz z pośrodków hodowlanych (Ryc. 2). Stwierdzono, że 80% AAV znajdowało się w komórkach, a pozostałe 20% AAV znajdowało się w pośrodkach hodowlanych, skąd zostały wydzielone z komórek. Obie frakcje AAV poddano działaniu DNazy w celu usunięcia wolnego DNA. W celu dalszego uwalniania AAV z komórek zastosowano deoksycholan sodu. Następnie AAV wyekstrahowano przy użyciu chloroformu, a potem przeprowadzono podział na dwie fazy wodne. Kroki te pozwoliły na usunięcie większości zanieczyszczeń białkowych. AAV pozostaje rozpuszczalne w fazie siarczanu amonu.
Pozostałe zanieczyszczenia usunięto za pomocą nieciągłego gradientowego ultrawirowania w iodiksanolu (Rycina 3A). Gradient pomógł również w usunięciu pustych kapsydów AAV, szczególnie podczas drugiej serii ultrawirowania w gradiencie iodiksanolu.
Czystość wirusa AAV określono za pomocą barwienia srebrem. Gdy uzyskano trzy główne prążki odpowiadające białkom kapsydu AAV – VP1, VP2 i VP3 – o czystości przekraczającej 90%, uznano, że wirus AAV nadaje się do zastosowań in vivo (Rysunek 3B). Stosunek pełnych kapsydów do pustych kapsydów AAV oceniono za pomocą TEM (Rysunek 3C). Tylko pełny kapsyd z insertem transgenu umożliwia ekspresję transgenu w docelowej tkance. Wysoki odsetek pustych kapsydów może również indukować odpowiedź immunologiczną przeciwko kapsydowi AAV. Te kontrole jakości są niezbędne dla każdego wirusa AAV, który został wyprodukowany i oczyszczony przed zastosowaniem.
<img alt="Schemat procesu produkcji AAV; kotransfekcja w komórkach 293T na potrzeby badań nad transferem genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig01.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja produkcji AAV metodą potrójnej transfekcji komórek HEK293T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat procesu oczyszczania wirusa obejmujący lizę komórek, trawienie DNA, ultrawirowanie i dializę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig02.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczna ilustracja oczyszczania AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat oczyszczania AAV, elektroforeza białek w żelu i mikroskopia elektronowa w analizie strukturalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig03.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Oczyszczanie AAV za pomocą ultrawirowania w gradiencie jodiksanolu i weryfikacja czystości wirusa AAV. (A) Warstwy gradientu jodiksanolu i pozycja igły do pobierania próbek. (B) Reprezentatywny żel oceniający zawartość i czystość kapsydów. M: marker molekularny; R: referencyjny pełny kapsyd AAV6; S1: kapsyd AAVDJ wytworzony wewnętrznie po jednej rundzie ultrawirowania; S2: kapsyd AAVDJ wytworzony wewnętrznie po dwóch rundach ultrawirowania; S3: kapsyd AAV6 wytworzony wewnętrznie. (C) Obraz AAV wykonany za pomocą mikroskopii elektronowej. Wirus pobrany po oczyszczeniu. Kapsydy wirusowe zawierające genom wirusowy widoczne są jako jednorodne białe sześciokąty, natomiast kapsydy puste jako sześciokąty z białą obwódką i ciemnym centrum. Pasek skali: 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Kalkulator PEI do pakowania AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%201%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Wykres objętości surowego AAV-PEG-Sulfate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%202%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Przygotowanie gradientu jodiksanolu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%203%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Przygotowanie drugiej rundy gradientu jodiksanolu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%204%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>
Tabela 5: Primery do miareczkowania AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%205%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Składy buforów użytych w badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. ...

Celem niniejszego projektu jest przedstawienie nowatorskiego protokołu wielkoskalowej produkcji wektorów wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) o wysokim mianie i wysokiej czystości, z wykorzystaniem platformy cell factory oraz zoptymalizowanych warunków hodowli. Zmodyfikowany proces oczyszczania łączy frakcje AAV z obu części hodowli, wykorzystując rozdział dwufazowy PEG/woda, a następnie wirowanie w gradiencie jodiksanolu, co pozwala na uzyskanie wyższej wydajności i czystości. Mimo niedawnych postępów, w akademickich laboratoriach badawczych wciąż istnieją pewne wyzwania – obejmują one optymalizację skalowalnych warunków hodowli przy użyciu standardowych komórek, redukcję odsetka pustych kapsydów oraz balansowanie między wydajnością wirusa a czystością. W porównaniu z innymi technikami, nasz protokół zapewnia skalowalność dzięki zastosowaniu systemów cell factory, zwiększoną wydajność dzięki zoptymalizowanym warunkom hodowli oraz poprawioną czystość wektorów wirusa towarzyszącego adenowirusom dzięki nowatorskiemu dwuetapowemu procesowi oczyszczania. Ten skalowalny protokół, zapewniający wysoką czystość wirusów AAV, utorował drogę do prowadzenia większych badań przedklinicznych w laboratoriach akademickich, co potencjalnie prowadzi do opracowania bezpieczniejszych i skuteczniejszych terapii genowych dzięki poprawie jakości wektorów.Na początek wysiej komórki HEK293T do 10-warstwowej fabryki komórek zawierającej pożywkę DMEM z wysoką zawartością glukozy i 10% FBS. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze z 5% CO2. Następnie odmierz 350 ml Opti-MEM do sterylnej butelki o pojemności 500 ml.Do butelki dodać plazmidowy DNA do transfekcji i wstrząsnąć w celu dokładnego wymieszania. Następnie dodać do butelki 15 mililitrów roztworu PEI. Mieszaninę energicznie wstrząsać przez 30 sekund, aby zapewnić jednorodne zmieszanie. Po inkubowaniu mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 15 minut, przenieść ją do butelki o pojemności jednego litra, a następnie dodać 700 mililitrów DMEM z niską zawartością glukozy. Wyjąć 10-warstwową fabrykę komórkową z inkubatora i odessać medium do pojemnika na odpady. Ostrożnie nalać pipetą mieszaninę do transfekcji DNA do fabryki komórkowej, a następnie umieścić fabrykę komórkową z powrotem w inkubatorze na 72 do 96 godzin.Po trzech lub czterech dniach przefiltruj oczyszczony nadsącz przez jednostkę filtrującą o rozmiarze porów 0,45 µm. Wlej 500 ml DPBS do fabryki komórkowej w celu jej wypłukania. Odwiruj zawiesinę przy 4 000g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.Za pomocą systemu próżniowego i pipety aspiracyjnej usuń i odrzuć supernatant. Do osadu dodaj 20 mililitrów buforu do lizy AAV i wymieszaj, aby resuspenderć osad w buforze. Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu oczyszczania.Następnie do roztworu AAV dodać 40% roztwór PEG z chlorkiem sodu, tak aby stężenie końcowe PEG wynosiło 8%. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze orbitalnym przy niskiej prędkości. Odwirować roztwór z prędkością 4 000g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia wirusa.Odpipetuj supernatant, a następnie dodaj od 5 do 10 mililitrów buforu do resuspensji AAV HEPES do osadu. Przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, aby kontynuować dalszą puryfikację. Następnie zamocuj ściętą igłę o rozmiarze 16 G do strzykawki o pojemności 10 mililitrów i nałóż przygotowane gradienty jodiksanolu do polipropylenowej probówki do ultrawirówki z zaokrąglonym dnem.Za pomocą igły o rozmiarze 22 G ostrożnie nanieś do 17 mililitrów roztworu AAV na wierzch gradientu. Uzupełnij objętość w probówce buforem do dializy AAV. Zamknij probówki za pomocą zgrzewarki elektrycznej.Wirować probówki przy 350 000g przez dwie godziny w rotorze tytanowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przenieść je do statywu na probówki do ultrawirówki. Następnie za pomocą nowej igły o rozmiarze 18 G przenieść wirus AAV do kasety dializacyjnej. Po wstrzyknięciu wirusa usunąć powietrze z kasety.Włóż mieszadło magnetyczne do zlewki zawierającej bufor do dializy AAV i ustaw ją na mieszalniku magnetycznym, a następnie umieść kasetę do dializy w buforze, używając pływaka. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przenieś wirusy z kasety do jednostki filtra odśrodkowego. Wiruj przy 4 000g przez 15 do 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zebierz skoncentrowany AAV z jednostki filtrującej, a następnie przepłucz filtr 300 µL buforu do dializy AAV. Na koniec przenieś roztwór z płukania do skoncentrowanego AAV. Stwierdzono, że wyizolowany wirus AAV posiada czystość powyżej 90%, co czyni go odpowiednim do zastosowań in vivo.

a-streamlined-standardized-procedure-for-generating-high-titer-high

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zoptymalizowana i standaryzowana procedura generowania wektorów wirusa adeno-związanego z adenowirusem o wysokiej titrze i wysokiej jakości przy użyciu platformy Cell Factory

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

W tym protokole, wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturację komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wirusa bakulowirusa (BV)-AAV2-AAV2 lub genem terapeutycznym oraz komórkami Sf9 zakażonymi BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej. Cząsteczki AAV są uwalniane z komórek za pomocą detergentu, klarowane, oczyszczane za pomocą chromatografii kolumnowej powinowactwa i zagęszczane przez filtrację o przepływie stycznym.

Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Omówiono metodę, za pomocą której mechaniczne zachowanie in vivo materiałów reagujących na bodźce jest monitorowane w funkcji czasu. Próbki są badane ex vivo przy użyciu testera mikrorozciągania z kontrolą środowiska w celu symulacji środowiska fizjologicznego. Praca ta dodatkowo przyczynia się do zrozumienia zachowania naszego materiału in vivo.

Kontrolowane środowiskowo badania mikrorozciągalności mechanicznie adaptacyjnych nanokompozytów polimerowych do charakterystyki ex vivo

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

Poznaj skalowalny protokół produkcji wektorów AAV o wysokiej czystości przy użyciu platformy Cell Factory. Metoda zapewnia czystość powyżej 90% i umożliwia prowadzenie większych badań przedklinicznych w terapii genowej.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory (Wideo) | JoVE Journal

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Przeglądaj więcej filmów