Name: Ukosowanie na mokro igieł do mikroiniekcji z wykorzystaniem stałego ciśnienia powietrza w celu uzyskania informacji zwrotnej o otwarciu igły (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Naucz się techniki ukosowania igieł na mokro z wykorzystaniem stałego ciśnienia powietrza do mikroiniekcji w badaniach nad genetycznie modyfikowanymi owadami. Metoda zapewnia precyzyjną kontrolę wielkości otwarcia igły.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor pragnie podziękować następującym osobom. Personel University of Maryland Insect Transformation Facility: Channa Aluvihare, Robert Alford i Daniel Gay. Bez ich oddanej pracy Zakład Transformacji Owadów nie istniałby. Vanessie Meldener-Harrell za korektę tego rękopisu.

UWAGA: Protokół opisany poniżej wykorzystuje mikrokapilarny skos Sutter BV-10. Protokół ten można jednak zmodyfikować do użytku z dowolnym modelem mikrokapilarnym fazowanym.
1. Zespół regulatora, manometru i przewodu doprowadzającego powietrze
<ol>
	<li>Wyciąć odcinek rurki uretanowej do połączenia od dopływu powietrza do podstawy regulatora (R; Sekcja 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Długość tego odcinka będzie zależała od odległości od dopływu powietrza do regulatora, który będzie znajdował się obok ukosownika.</li>
	<li>Wsuń wąż clamp na rurkę uretanową, a następnie wepchnij złącze węża do końca rurki. Upewnij się, że złącze węża jest całkowicie włożone, umieszczając złącze węża na twardej powierzchni. Trzymając rurkę blisko złącza węża, mocno wciśnij rurkę w wąż, aż złącze węża zostanie całkowicie włożone. Zacisk węża i złącze węża tworzą razem połączenie HC (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).</li>
	<li>Przesuń wąż clamp do końca rurki, do którego włożone jest złącze węża. Obróć wąż clamp nad włożonym końcem zadzioru, aby utworzył hermetyczne połączenie.</li>
	<li>Ręcznie wkręć złącze węża w podstawę regulatora (R), a następnie dokończ dokręcanie połączenia małym kluczem. Upewnij się, że połączenie jest szczelne, ale nie zbyt szczelne.</li>
	<li>W bocznym porcie regulatora wkręć ręcznie złącze T (T), a następnie użyj małego klucza, aby zakończyć dokręcanie.</li>
	<li>Wytnij mały kawałek rurki uretanowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, sekcja 2), o długości około 3-5 cm. Umieść dwa węże clamps na kawałku rurki, a następnie włóż złącze węża do każdego końca rurki i zakończ połączenia (HC) zgodnie z opisem w krokach 1.2-1.4 dla każdego końca rurki.</li>
	<li>Wkręć jeden koniec krótkiej rurki w podstawę manometru, a następnie zakończ dokręcanie kluczem, jak w kroku 1.5.</li>
	<li>Wkręć drugi koniec krótkiej rurki do jednego z portów na złączu T (T) podłączonym do regulatora w kroku 1.5.</li>
	<li>Wytnij odcinek rurki uretanowej (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 1, sekcja 3) do połączenia między regulatorem a uchwytem igły (NH). Rozmiar tej sekcji będzie zależał od odległości od ukosowania do lokalizacji regulatora.</li>
	<li>Umieść wąż clamp na odcinku rurki, a następnie włóż złącze węża zgodnie z opisem w krokach 1.2-1.4.</li>
	<li>Po drugiej stronie tej sekcji rurki umieść żeńskie złącze luer (LC), które jest dostarczane z uchwytem igły (NH).</li>
	<li>Zdejmij zacisk mocujący i nylonową podkładkę (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2, f) z manipulatora. Zacisk mocujący i podkładka są przeznaczone wyłącznie do utrzymywania szklanej mikrokapilary, nie są przeznaczone do utrzymywania dodatkowego ciężaru uchwytu mikrokapilarnego, pręta gwintowanego i rurki doprowadzającej powietrze.</li>
	<li>Wytnij prostokątny kawałek gumowego arkusza uszczelniającego o wymiarach 1,5 cm x 2 cm, aby owinąć gwintowany pręt w zacisku błotnika roweru. Pomoże to pewniej utrzymać pręt gwintowany i uchwyt igły w zacisku błotnika roweru. Za pomocą dwóch szczypiec półokrągłych otwórz zacisk błotnika roweru, złóż prostokątny kawałek gumowego arkusza uszczelniającego na pręt gwintowany 3.5 cm od jednego końca pręta, tak aby utworzył literę U nad prętem. Włóż pręt gwintowany pokryty gumową blachą do otwartego błotnika roweru clamp i za pomocą szczypiec zamknij zacisk wokół pręta i arkusza gumy. Zamontuj zacisk rowerowy i zespół pręta gwintowanego na manipulatora, wymień zacisk mocujący bez podkładki nylonowej i dokręć zacisk mocujący, aż bezpiecznie przytrzyma zespół pręta gwintowanego.</li>
	<li>Nakręcić uchwyt igły na pręt gwintowany. Upewnij się, że złącze luer kończy się w pozycji, która nie zwiąże rurki uretanowej po jej podłączeniu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2, g).</li>
	<li>Podłącz żeńskie złącze luer do męskiego złącza luer (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, g) uchwytu igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, d).</li>
	<li>Podłącz wolny koniec rurki Rysunek 1, sekcja 1 do źródła powietrza (to połączenie będzie się różnić w zależności od użytego źródła powietrza). Dopływ powietrza powinien być czystym, suchym i wolnym od pozostałości oleju. Dopływ powietrza może pochodzić z domowego źródła powietrza lub butli gazowej, sprężonego powietrza lub azotu.</li>
</ol>
2. Igły borokrzemianowe do fazowania
<ol>
	<li>Wyciągnij igły do mikroiniekcji za pomocą mikrokapilar ze szkła borokrzemianowego z następującymi ustawieniami urządzenia: Heat: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, z czasem pętli 12,24.</li>
	<li>Montaż zespołu szlifierskiego zgodnie z instrukcjami producenta, składającego się z płyty ściernej i pierścienia ustalającego z magnesami12. 
	UWAGA: Płyta ścierna może wymagać owinięcia cienkim paskiem przezroczystej folii, aby zapobiec przedwczesnemu wyciekowi Photo-Flo (środka zwilżającego) z płyty ściernej. Jest to konieczne tylko wtedy, gdy roztwór środka zwilżającego przedwcześnie wycieknie do oleju na cokole, powodując zatrzymanie obracania się płyty szlifierskiej. Środek zwilżający zmniejsza ryzyko wysuszenia śladów na szklanych igłach po ukosowaniu. Użycie środka zwilżającego nie jest krytyczne dla procesu ukosowania, a woda może zostać zastąpiona.</li>
	<li>Umieść 10 kropli oleju w cokole na optycznie płaskiej powierzchni cokołu i umieść na nim zestaw szlifierski. Rozpocznij montaż szlifierski.</li>
	<li>Włącz źródło światła, aby oświetlić powierzchnię. Upewnij się, że źródło światła jest umieszczone za fazowanym i świeci pod kątem 45° do płytki ściernej i igły. Kąt oświetlenia jest niezbędny, aby cień igły był dobrze widoczny. Przy 90-krotnym powiększeniu obróć głowicę mikroskopu w miejscu. Na chwilę zatrzymaj obracanie się płyty ściernej i ustaw ostroskop na powierzchni płyty ściernej.</li>
	<li>Dodaj 1% środka zwilżającego do, aż będzie całkowicie mokry. Dodaj 1% środka zwilżającego na powierzchnię płyty ściernej. Upewnij się, że środek zwilżający pokrywa powierzchnię ścierną, ale nie przecieka na pierścień ustalający.</li>
	<li>Umieść wstępnie zwilżony na powierzchni płyty ściernej podczas jej wirowania. Upewnij się, że znajduje się po lewej stronie płyty ściernej (patrząc w dół od góry) i rozciąga się od godziny 11 do godziny 6 (z płytką jako tarczą zegara). Upewnij się, że nie porusza się po czarnej części pierścienia ustalającego.</li>
	<li>Włóż igłę do uchwytu igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, d) i dokręć pierścień ustalający, aby utrzymać igłę na miejscu. Otwórz regulator (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, R) i zwiększ ciśnienie do 24 psi.</li>
	<li>Podnieś uchwyt igły, obracając pokrętło regulacji kursu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, a) Upewnij się, że igła jest podniesiona na tyle wysoko, aby znajdowała się wyżej niż powierzchnia obracającej się płyty ściernej, a następnie obróć cały manipulator tak, aby igła wychyliła się na miejsce nad obracającą się płytą ścierną. Igłę, która ma być skośna, powinna być umieszczona na obracającej się płycie ściernej zorientowanej w taki sposób, aby obrót płytki odsunął się od końcówki igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)</li>
	<li>Obserwując z boku, użyj pokrętła regulacji zgrubnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, a), aby opuścić igłę w kierunku powierzchni płyty ściernej. Zatrzymaj się, gdy igła prawie dotyka powierzchni płynu.</li>
	<li>Użyj zoomu, aby zmniejszyć powiększenie mikroskopu, a następnie przesuń mikroskop tak, aby igła znalazła się w środku pola widzenia. Gdy znajdziesz się w centrum view, zwiększ powiększenie, dostosowując pozycję manipulatora tak, aby końcówka igły pozostała w środku view. Po osiągnięciu maksymalnego powiększenia zatrzymaj płytę szlifierską i ustaw mikroskop na powierzchni płyty ściernej, a następnie natychmiast wznowij obracanie płytki, gdy powierzchnia jest ostrą. W tym momencie igła może nie być widoczna.</li>
	<li>Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej manipulatora opuść igłę w kierunku płyty ściernej. W polu widzenia widoczny będzie obraz igły i cień (cienie) igły. Gdy igła i cień (cienie) igły są bliskie zetknięcia, przełącz się na pokrętło precyzyjnej regulacji manipulatora i kontynuuj opuszczanie igły, aż igła i jej cień (cienie) wydają się stykać. W tym momencie odczytaj suwmiarkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, c) i zanotuj odczyt. Powierzchnia tarczy ściernej znajduje się na poziomie lub poniżej tego odczytu suwmiarki. 
	UWAGA: Trudno jest zobaczyć, kiedy igła dotyka powierzchni obracającej się płyty ściernej, więc igła może w tym momencie nie dotykać płyty ściernej.</li>
	<li>Pozwól, aby igła pozostała na tym poziomie odczytu suwmiarki przez 5-10 sekund.</li>
	<li>Za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji manipulatora podnieś igłę, upewniając się, że pozostaje pod powierzchnią środka zwilżającego. Zatrzymaj obrót płyty ściernej na kilka sekund i obserwuj, czy z końcówki igły wydostają się pęcherzyki. Jeśli obecne są bąbelki, przejdź do kroku 2.15. Jeśli bąbelki nie są obecne, przejdź do kroku 2.14.</li>
	<li>Przesuń wskazówkę z powrotem do odczytu suwmiarki za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji manipulatora, a następnie przesuń ją nieco niżej i wykonaj nowy odczyt suwmiarki, a następnie powtórz kroki 2.12-2.13.</li>
	<li>Uruchom ponownie płytę ścierną, aby sprawdzić, czy można zaobserwować tworzenie się pęcherzyków podczas obracania się płyty. Jeśli podczas obracania płytki widoczne są oznaki tworzenia się pęcherzyków, otwór końcówki igły jest prawdopodobnie zbyt duży dla wrażliwych mikroiniekcji zarodków, takich jak zastrzyki z zarodków komarów. Jeśli tworzenie się pęcherzyków nie jest widoczne podczas obracania się płyty ściernej, wówczas otwór igły jest idealny do stosowania w zabiegach wymagających ostrej i małej igły otwierającej.</li>
	<li>Użyj pokrętła regulacji kursu manipulatora, aby podnieść igłę nad płytą ścierną do pozycji, która jest wystarczająco wysoko nad płytą, aby igła nie uderzyła w nic, ponieważ cały manipulator jest obracany, aby odsunąć igłę od płytki ściernej i mikroskopu.</li>
	<li>Gdy igła znajdzie się w pozycji, w której można ją wyjąć bez uderzania w cokolwiek, obniż ciśnienie powietrza do zera, wyjmij igłę i umieść ją w pudełku do przechowywania igieł (szalka Petriego z podwójną taśmą samoprzylepną lub plasteliną do przytrzymywania skośnych igieł) do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Określanie względnego rozmiaru otworu igły ze skosem
UWAGA: Określanie względnych rozmiarów otworów igły fazowanej odbywa się w kroku 2.13. Poniższe kroki opisują ten proces dokładniej.
<ol>
	<li>Po zaobserwowaniu pęcherzyków w kroku 2.13, gdy płyta ścierna się nie obraca, powoli zmniejszaj ciśnienie powietrza, obracając pokrętło regulacji regulatora (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, R), aż pęcherzyki przestaną wypływać z końcówki igły. Zwróć uwagę na ciśnienie, przy którym bąbelki przestają wypływać z końcówki.</li>
	<li>Zwiększać ciśnienie powietrza, aż pęcherzyki znów zaczną wypływać z końcówki igły. Im wyższe ciśnienie, tym mniejszy otwór igły.</li>
	<li>Kontynuuj przesuwanie igły do pozycji, w której można ją bezpiecznie wyjąć, kroki 2.16-2.17.</li>
</ol>

Protocol for Wet Beveling of Microinjection Needles Under Constant Air Pressure

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Modyfikacja genetyczna komarów polega na precyzyjnym mikrowstrzykiwaniu materiałów modyfikujących (plazmidów, przewodników RNA lub białek) do zarodków przed blastodermą 3,4,5,6,7,8. Kluczowe znaczenie w tym procesie mają ostre igły, które z łatwością przebijają zarodek podczas iniekcji 2,4. Ostra igła jest w stanie prześlizgnąć się przez błonę, dostarczyć materiał modyfikujący i zostać pobrana z zarodka bez wycieku plazmy zarodka w miejscu wstrzyknięcia po mikroiniekcji (obserwacja osobista).
Igły do mikroiniekcji są zamykane przy pierwszym wyciągnięciu i należy je otworzyć przed wstrzyknięciem2. Tradycyjnie, igły do mikroiniekcji były otwierane poprzez delikatne otarcie igły o coś, na przykład krawędź szkiełka nakrywkowego lub szkiełko podstawowe, które przytrzymuje zarodki, o sam zarodek lub inny materiał2. Jednak otwarcie igły poprzez otarcie jej o przedmiot daje niespójny wynik (osobista obserwacja). Czasami igła pęka w sposób, który sprawia, że jest ostra, podczas gdy innym razem igła staje się bardzo, co, jak wspomniano wcześniej, może uszkodzić wstrzykiwane zarodki, powodując, że nie zostaną one zmodyfikowane lub, w najgorszym przypadku, zabić zarodek. Alternatywnie, igły można również otworzyć, wprowadzając igłę do zarodka. Proces ten może spowodować pęknięcie igły, czyniąc ją gotową do wstrzyknięcia. Jednak daje również losowe wyniki, które czasami tworzą bardzo ostrą igłę, ale częściej zatykają igłę materiałem zarodkowym, zanim będzie można go użyć do wstrzyknięcia. Chociaż igły do fazowania wymagają dodatkowego czasu i wysiłku, proces ten wytwarza ostre igły bardziej konsekwentnie.
Modyfikacja genetyczna komarów jest również procesem zależnym od czasu, który wymaga mikroiniekcji zarodków, zanim rozwijający się zarodek ukomórkujesię 4,5,6,7,8. Podczas otwierania igieł poprzez ocieranie się o coś lub poprzez wkładanie igły do zarodka, czas potrzebny na otwarcie i znalezienie ostrej igły jest brany pod uwagę, gdy zarodki są już przygotowane do wstrzyknięcia i nadal się rozwijają. W najlepszym przypadku proces otwierania igły i wytworzenia ostrej igły trwa tylko minutę lub dwie, ale innym razem może trwać na tyle długo, że jaja przygotowane do tej rundy wstrzyknięcia są zbyt stare, zanim zostanie wykonana dobra igła. Zaletą ukosowania jest to, że wykonuje się je z wyprzedzeniem, a igły są gotowe do użycia, gdy tylko zarodki zostaną przygotowane do wstrzyknięcia, zapewniając, że zarodki są w idealnym stadium rozwoju do wstrzyknięcia.
Chociaż powyższy protokół został opracowany dla ukosowarki Sutter BV-10 i korzysta z niej, protokół można zmodyfikować do użytku z dowolną ukosowarką. Głównym czynnikiem jest to, że powierzchnia ukosowania musi być w stanie utrzymać niewielką objętość płynu, pod którym igła jest fazowana.
Igły do mikroiniekcji do fazowania, podczas gdy źródło powietrza dostarcza sprężone powietrze do tylnej części igły, ma dwie zalety. Po pierwsze, ciśnienie powietrza pomaga w wytwarzaniu spójnych igieł. Niezmiennie ostre igły są wytwarzane, gdy proces ukosowania rozpoczyna się przy tym samym ciśnieniu dostarczanego powietrza, a ukosowanie jest zatrzymywane, gdy po raz pierwszy pojawią się pęcherzyki. Bardzo ważne jest, aby zaobserwować początkowe tworzenie się pęcherzyków, należy na chwilę zatrzymać płytę ścierną, aby obracanie się płyty ściernej nie maskowało początkowego tworzenia się pęcherzyków. Jeśli ślady pęcherzyków są widoczne tylko wtedy, gdy płyta ścierna jest w ruchu, otwór igły może być zbyt duży. Bardzo ważne jest, aby ciśnienie dostarczanego powietrza było takie samo za każdym razem, gdy rozpoczyna się ukosowanie, aby ukosowanie zostało zatrzymane, gdy tylko pęcherzyki zaczną uciekać (wizualizowane, gdy płytka nie jest w ruchu) oraz aby pęcherzyki nie były widoczne, gdy płytka jest w ruchu Drugą zaletą jest to, że po otwarciu igły, Wielkość otworu można zmierzyć względnie, zmniejszając ciśnienie dostarczanego powietrza, aż pęcherzyki przestaną uciekać z końcówki igły. Zwracając uwagę na ciśnienie, przy którym pęcherzyki przestają wypływać z końcówki, można wywnioskować względny rozmiar otworu. Im niższe ciśnienie, przy którym pęcherzyki przestają płynąć, tym większy otwór w końcówce igły, a im wyższe ciśnienie, tym mniejszy rozmiar otworu końcówki. Znajomość względnego rozmiaru otworu może być przydatna w przypadku stosowania mieszanki iniekcyjnej, która jest bardziej lepka, a tym samym bardziej podatna na zatkanie igły iniekcyjnej. Użycie tego względnego pomiaru wielkości otworu pozwala na tworzenie igieł, które mogą dostarczać mieszanki iniekcyjne o wyższej lepkości. Oczywiście istnieją pewne kompromisy związane z używaniem igieł o większych rozmiarach otworów. W szczególności zarodki, którym wstrzyknięto zarodki, mogą być bardziej podatne na wyciek po wstrzyknięciu, a wskaźniki przeżycia zarodków, którym wstrzyknięto zarodki, mogą być niższe.

Modyfikacja genetyczna owadów to proces pierwotnie opracowany u Drosophila przez Rubina i Spradlinga, a z biegiem lat proces ten był modyfikowany w celu stworzenia modyfikacji genetycznych u innych gatunków1. Proces ten opiera się na precyzyjnym dostarczaniu składników modyfikujących mikrowstrzykiwanych do zarodków w określonym czasie i miejscu w rozwijającym się zarodku2,3,4. Ostre igły do mikroiniekcji są kluczowym narzędziem w procesie modyfikacji genetycznej niektórych owadów, takich jak komary4,5,6,7,8,9 i <muchy piaskowe class="xref">10 chociaż nie tak ważne dla innych owadów, takich jak jedwabniki11. Ostre igły są często kluczowym czynnikiem decydującym o sukcesie lub porażce podczas próby stworzenia genetycznie zmodyfikowanego owada2,4. Zazwyczaj igły ze szkła mikrokapilarnego są ciągnięte przez szkło grzewcze do punktu, w którym szkło staje się elastyczne, co pozwala na wciągnięcie kapilary do zwężającej się igły z zamkniętą końcówką. Przed użyciem igły należy ją otworzyć w taki sposób, aby powstała ostra końcówka do wstrzykiwań. Tradycyjnie, igły są otwierane poprzez delikatne otarcie końcówki igły o coś (krawędź szkiełka nakrywkowego/szkiełka nakrywkowego, zarodek itp.), co powoduje oderwanie się niewielkiej ilości szkła od końcówki, losowo tworząc ostrą końcówkę2,3. Nieco mniej przypadkowym procesem jest ukosowanie na sucho, gdzie igła jest szybko opuszczana na optycznie płaską, wirującą płytę ścierną na krótki okres czasu, powodując ścieranie niewielkiej ilości szkła z końcówki igły, tworząc ostrą końcówkę. Ukosowanie na sucho jest nieco mniej przypadkowe niż ocieranie się o coś końcówką igły. Opisany poniżej protokół idzie o krok dalej w procesie ukosowania, dostarczając sprężone powietrze do fazowanej igły i ukosując ją pod warstwą cieczy, tak aby pęcherzyki były widoczne zaraz po otwarciu igły. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę produkcji niezawodnie ostrych igieł do mikroiniekcji. Ukosowanie pod warstwą cieczy jest ulepszeniem w stosunku do losowego łamania igły, jak opisano powyżej, i ukosowania na sucho, ponieważ użytkownik otrzymuje informację zwrotną na temat procesu ukosowania, dzięki czemu osoba ukosująca wie, kiedy igła jest otwarta i względnie, jak duży jest otwór igły. Znajomość względnego rozmiaru otworu końcówki igły może pozwolić osobie fazującej na tworzenie igieł o różnych rozmiarach otworów. Różne rozmiary otworów igieł mają różne zalety; Na przykład większe rozmiary otworów igieł mogą pomieścić mieszanki iniekcyjne o wysokiej lepkości, podczas gdy mniejsze igły otwierające powodują mniejsze uszkodzenia wstrzykiwanego zarodka.
Powietrze jest dostarczane do igły za pomocą regulatora i systemu rurek uretanowych opartych na zmodyfikowanym systemie wtrysku o regulowanym ciśnieniu powietrza2. Podczas gdy powietrze jest dostarczane do igły pod stałym ciśnieniem, igła jest fazowana pod warstwą płynu. Proces ukosowania składa się z powtarzającego się pięcioetapowego procesu: 1) opuszczenie igły na powierzchnię ścierną, 2) pozostawienie igły na ukosowanie przez krótki czas, 3) podniesienie igły z dala od płyty ściernej, utrzymując ją pod powierzchnią warstwy cieczy, 4) zatrzymanie wirowania płyty ściernej w celu sprawdzenia, czy nie pojawiają się pęcherzyki. Jeśli nie ma żadnych bąbelków, kroki od 1 do 4 są powtarzane, aż pojawią się bąbelki; 5) Gdy pojawią się pęcherzyki, ciśnienie powietrza można regulować, aby określić względny rozmiar otworu igły. Im niższe ciśnienie potrzebne do zatrzymania tworzenia się pęcherzyków, tym większy otwór na końcu igły.

<table><tbody><tr><td>Mikrokapilary o średnicy zewnętrznej 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments Olej</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do cokołów Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>Klips na błotnik rowerowy</td><td>VeloOrange</td><td>R-clip 4-pak</td><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack</td></tr><tr><td>Mikroskop ze stojakiem na wysięgnik</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3,5X-90X Trójokularowy statyw LED Mikroskop stereoskopowy lub odpowiednik</td></tr><tr><td>BV-10 Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowa płyta ścierna&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>Diamentowa płyta ścierna - bardzo drobna (rozmiary końcówek 0,2 i mikro; do 1,0 & mikro)</td></tr><tr><td>Uszczelka, Buna-N</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>Służy do uszczelniania połączeń na złączach T lub L, jeśli nie są już dołączone do tych elementów</td></tr><tr><td>Zacisk węża</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>5000-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>Złącze węża</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>Need 5 złączy do węży</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę do mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3-10</td><td>Uchwyt igły do mikrokapilar o średnicy zewnętrznej 1 mm</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Dowolny ściągacz igieł</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 Solution</td><td>B& H Foto, wideo i audio</td><td>BH #KOPF200P&nbsp; MFR #1464510</td><td>środek zwilżający</td></tr><tr><td>Manometr</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>0-100 psi</td></tr><tr><td>miernik Referencyjny</td><td>Sutter Instruments</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt referencyjnego</td><td>Sutter Instruments</td><td>M100019</td><td></td></tr><tr><td>Regulator</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mar</td><td>Potrzebujesz portów # 10-32 do połączeń</td></tr><tr><td>Gumowy arkusz uszczelniający 6 inx 6 w</td><td>Danco</td><td>Model # 59849</td><td></td></tr><tr><td>T pasujący</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>15002-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>Pręt</td><td></td><td></td> gwintowany <td>Pręt gwintowany lub pręt z gwintowanym końcem. Gwinty muszą mieć rozmiary 10-32.</td></tr><tr><td>Rurki uretanowe</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

ukosowanie na mokro igieł do mikroiniekcji z wykorzystaniem stałego ciśnienia powietrza w celu uzyskania informacji zwrotnej o otwarciu igły

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

Igły do mikroiniekcji są kluczowym narzędziem w dostarczaniu odczynników modyfikujących genom, komponentów CRISPR (przewodnikowe RNA, białko Cas9 i matryca dawcy) oraz składników systemu transpozonów (plazmidy i transpozazy mRNA) do rozwijających się zarodków owadów. Ostre igły do mikroiniekcji są szczególnie ważne podczas dostarczania tych środków modyfikujących, ponieważ pomagają zminimalizować uszkodzenia wstrzykiwanego zarodka, zwiększając w ten sposób przeżywalność tych zarodków w porównaniu z wstrzykiwaniem igłami bez skosu. Co więcej, ukosowanie igieł wytwarza igły, które są bardziej spójne od igły do igły w porównaniu z igłami otwieranymi przez losowe złamanie końcówki igły poprzez ocieranie końcówki o przedmiot (bok szkiełka nakrywkowego, powierzchnia zarodka, który ma zostać wstrzyknięty itp.). Proces ukosowania na mokro igieł do mikroiniekcji powietrzem dostarczanym do igły pod stałym ciśnieniem pozwala osobie fazującej igłę wiedzieć, kiedy igła jest otwarta (obecność pęcherzyków), a także daje względne wskazanie, jak duży otwór igły został utworzony. Względny rozmiar otworu w igle można określić, regulując ciśnienie powietrza dostarczanego do igły, aż do osiągnięcia równowagi i przestania wypływać pęcherzyki z końcówki igły. Im niższe ciśnienie, przy którym osiągana jest równowaga, tym większy rozmiar igły; I odwrotnie, im wyższe ciśnienie, tym mniejszy rozmiar igły.

Opisana powyżej procedura pozwala na uzyskanie powtarzalnie ostrych igieł do mikroiniekcji. Ostre igły charakteryzują się zdolnością do wnikania w miękki chorion embrionów owadów, takich jak embriony komarów, przy minimalnym lub żadnym oporze ze strony błony embrionalnej. Podczas mikroiniekcji embrionów komarów w celu modyfikacji genetycznej, błona embrionalna jest stosunkowo elastyczna. Naciskanie tępą igłą na błonę embrionalną spowoduje jej wgłębienie (Rycina 4B). Po wycofaniu igły błona odzyskuje swój pierwotny kształt. Przy odpowiednim nacisku tępa igła ostatecznie przebije błonę, co prawdopodobnie doprowadzi do wycieku embrioplazmy. Im ostrzejsza igła, tym mniejsze wgłębienie powstaje podczas dociskania igły do błony embrionalnej (Rycina 4E). Zamiast rozrywać błonę, ostra igła prześlizgnie się przez nią, powodując niewielkie lub żadne uszkodzenia embrionu. W przypadku igły o optymalnej ostrości, w momencie wnikania do embrionu, wgłębienie błony embrionalnej będzie niemal niezauważalne.
Zakład Transformacji Owadów Uniwersytetu w Maryland (University of Maryland Insect Transformation Facility, UM-ITF) jest placówką usługową zajmującą się tworzeniem genetycznie zmodyfikowanych owadów dla klientów z sektora akademickiego i przemysłowego. Placówka wykorzystuje igły ścięte do mikroiniekcji embrionów komarów. W okresie od stycznia 2023 do grudnia 2023 roku UM-ITF przeprowadził iniekcje w 12 795 embrionów Aedes w ramach 56 projektów klientów (Tabela 1). Zastosowanie ściętych igieł pomogło UM-ITF utrzymać średni poziom wykluwalności po iniekcji na poziomie 31% we wszystkich projektach (Tabela 2). Co więcej, UM-ITF był w stanie utrzymać wskaźnik sukcesu iniekcji na poziomie 96%, co określono na podstawie monitoringu po zakończeniu projektów w kontakcie z klientami (Tabela 2). Sukces iniekcji jest miarą tego, czy materiały iniekcyjne (przewodniki CRISPR, białko Cas9, plazmidy wektorowe transpozony itp.) zostały wprowadzone do embrionów projektowych w sposób, który umożliwił stworzenie modyfikacji genetycznej – w zasadzie chodzi o to, czy stwierdzono obecność indeli CRISPR, wstawienie wektora opartego na transpozonie klienta lub wstawienie kontrolnego wektora jakości iniekcji (końce transpozonu z promotorem i markerem). Innymi słowy, czy iniekcje były wystarczająco precyzyjne, aby doprowadzić do modyfikacji genetycznej, pod warunkiem, że wstrzyknięte komponenty działały prawidłowo. Istnieje wiele czynników wpływających na sukces projektu modyfikacji genetycznej, a wysokiej jakości mikroiniekcje za pomocą ostrych igieł są kluczowym elementem sukcesu. Ścinanie igieł zgodnie z procedurą opisaną w powyższym protokole pozwala UM-ITF na konsekwentne wytwarzanie wysokiej jakości ostrych igieł do mikroiniekcji, co umożliwia placówce regularne przeprowadzanie udanych iniekcji.
<img alt="Schemat systemu chromatografii gazowej, manometr, igła kapilarna, przyłącze zasilania powietrzem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat komponentów systemu powietrznego i połączenia z mikrokapilarą. Powietrze jest dostarczane do igły kapilarnej poprzez system rurek uretanowych z zasilania powietrzem (powietrze zakładowe lub butla z powietrzem). Rurki uretanowe są połączone z regulatorem (R) i manometrem za pomocą złączy wężowych (HC), które składają się z konektora wężowego i opaski zaciskowej. Złącze wężowe jest wkręcane w żeńskie gniazdo z gwintem 10-32 w podstawie regulatora (R) oraz manometru. Konektor T (T) jest podłączony do regulatora (R), aby rozdzielić strumień powietrza między manometrem a uchwytem igły (NH). Rurka uretanowa jest połączona z uchwytem igły za pomocą złącza Luer-Lock (LC), które jest dostarczane wraz z uchwytem igły (NH). Sposób podłączenia do zasilania powietrzem będzie się różnić w zależności od zastosowanego źródła powietrza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat systemu mikroiniekcyjnego przedstawiający regulacje mikrometryczne dla iniekcji komórkowych w biotechnologii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Elementy manipulatora i konfiguracja pneumatyczna. Elementy manipulatora: a. pokrętło regulacji grubej, b. pokrętło regulacji precyzyjnej, c. suwmiarka, d. uchwyt do igieł WPI, e. kątomierz, f. zacisk mocujący i klips do błotnika rowerowego, g. adapter Luer i złącze węża Luer oraz h. rurka uretanowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy równowagi statycznej; ruch obrotowy; oznaczone igły; koncepcja zrównoważonych sił." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Ułożenie igły w stosunku do obrotu płyty ściernej. (A) Prawidłowe ułożenie igły podczas szlifowania. Igła poddawana szlifowaniu powinna zostać umieszczona na obracającej się płycie ściernej w orientacji pomiędzy prostopadłą a równoległą do kierunku obrotu, tak aby ruch obrotowy oddalał się od czubka igły. (B) Nieprawidłowe ułożenie igły. Przy tej orientacji obrót płyty ściernej powoduje nacisk powierzchni ściernej na czubek igły, zamiast ruchu pod i poza czubkiem. W takiej orientacji szlifowanie może nie przebiegać płynnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Sekwencyjne obrazy mikroskopowe rozpadu mikrostruktury, skala 0,1mm, strzałka wskazuje pęknięcie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Porównanie wprowadzania igły tępej i ostrej. (A-C) Igła tępa oraz (D-F) igła ostra. Obrazy (A) i (D) zarejestrowano przed kontaktem igły z zarodkiem; (B) i (E) przedstawiają moment tuż przed przebiciem błony zarodka, a (C) i (F) moment bezpośrednio po przebiciu. Biała strzałka na obrazie (B) wskazuje wgłębienie błony zarodka, wynikające z konieczności przyłożenia większego nacisku, aby tępa igła mogła ją przebić. Czarna strzałka na obrazie (E) wskazuje brak wgłębienia dzięki łatwemu przebiciu za pomocą ostrej igły. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Tabela 1: Projekty UM-ITF dotyczące Aedes od stycznia 2023 do grudnia 2023 r.Wykaz projektów mikroiniekcji Aedes w UM-ITF wraz z liczbą iniekcyjnych embrionów dla każdego projektu, liczbą larw, które wykluły się z tych iniekcyjnych embrionów, oraz procentem wyklutych larw w stosunku do całkowitej liczby iniekcyjnych embrionów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Wyniki projektów Aedes w UM-ITF. UM-ITF jest jednostką usługową świadczącą usługi mikroiniekcji w celu modyfikacji genetycznej owadów. Tabela przedstawia liczbę projektów Aedes poddanych iniekcji przez ITF od stycznia 2023 do grudnia 2023 roku. Liczba klientów, którzy odpowiedzieli na zapytania sprawdzające postępy projektów, w których odpowiedź wskazywała na sukces lub niepowodzenie projektu iniekcji. Liczba udanych projektów, gdzie projekt uznano za udany, jeśli materiały iniekcyjne zostały mikroiniektowane w odpowiednim czasie i miejscu do rozwijającego się embrionu w sposób umożliwiający wprowadzenie modyfikacji genetycznej, oraz liczba projektów uznanych za nieudane z powodu braku modyfikacji genetycznej. Średni wskaźnik wyklucia dla projektów mikroiniekcji Aedes w okresie od stycznia 2023 do grudnia 2023 roku. Wskaźnik sukcesu projektu oraz wskaźnik odpowiedzi klientów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół opisuje montaż systemu pneumatycznego do dostarczania sprężonego powietrza do igły podczas procesu ukosowania igły. Protokół dalej opisuje proces ukosowania w celu tworzenia ostrych igieł do mikroiniekcji oraz sposób oceny względnego rozmiaru otworu igły.

Ukosowanie na mokro igieł do mikroiniekcji z wykorzystaniem stałego ciśnienia powietrza w celu uzyskania informacji zwrotnej o otwarciu igły

Microinjection needles are a critical tool in the delivery of genome modification reagents, CRISPR components (guide RNAs, Cas9 protein, and donor ...

Zakład przekształcania owadów. Jesteśmy placówką świadczącą usługi uniwersyteckie, która pomaga klientom w wytwarzaniu owadów modyfikowanych genetycznie. Badania obejmują zarówno neurobiologię, w której prowadzą badania nad węchem komarów, jak i badania nad zdrowiem publicznym, w których tworzą szczepionki na malarię, a także ekspresję nowych białek w czarnej muszce żołnierskiej.Tradycyjnie, igły były otwierane poprzez pociągnięcie igieł, a następnie otarcie ich o coś, aby otworzyć tę igłę, co może spowodować powstanie igieł, które są albo idealne do mikroiniekcji, albo bezużyteczne. I tak ta metoda pozwala nam otworzyć igłę w zwięzły sposób, w którym za każdym razem otrzymujemy ostre igły. Protokół ten daje informację zwrotną na temat rozmiaru otworu igły.Gdy igła jest otwarta, można zmniejszyć ciśnienie dostarczane do końcówki igły, a im wyższe ciśnienie, przy którym pęcherzyki powietrza przestają płynąć, tym mniejszy rozmiar otworu tej igły. Przygotuj zespół szlifierski zgodnie z wytycznymi producenta, który obejmuje ustawienie płyty ściernej i zamocowanie pierścienia ustalającego wyposażonego w magnesy. Następnie nałóż 10 kropli oleju z postumentów na optycznie płaską powierzchnię postumentów.Umieść zespół szlifierski na cokole i rozpocznij operację szlifowania. Aktywuj źródło światła, aby oświetlić obszar roboczy, upewniając się, że światło znajduje się za ściętą krawędzią, świecąc pod kątem 45 stopni do płyty ściernej i igły. Obróć głowicę mikroskopu na miejscu przy 90-krotnym powiększeniu.Na chwilę zatrzymaj obracanie się płyty ściernej, aby ustawić ostrość mikroskopu na powierzchni płytki. Dodaj 1% środka zwilżającego do, aż będzie całkowicie mokry. Następnie dodaj 1% środka zwilżającego na powierzchnię płyty ściernej, upewniając się, że pokrywa powierzchnię bez przeciekania na pierścień ustalający.Umieść wstępnie zwilżony na powierzchni płyty ściernej podczas jej obracania się, upewniając się, że znajduje się po lewej stronie płyty, patrząc w dół od góry i rozciąga się od godziny 11 do godziny 6 z płytką jako tarczą zegara. Upewnij się, że nie porusza się po czarnej części pierścienia ustalającego. Aby rozpocząć ukosowanie igły krzemianowej bora po przygotowaniu zespołu szlifierskiego, włóż igłę do uchwytu igły i dokręć pierścień ustalający, aby zamocować igłę na miejscu.Otwórz regulator i zwiększ ciśnienie do 24 funtów na cal kwadratowy. Obróć pokrętło regulacji kursu na tyle, aby podnieść uchwyt igły, aż igła zostanie podniesiona wyżej niż powierzchnia obracającej się płyty ściernej. Obróć cały manipulator tak, aby igła wskoczyła na miejsce nad obracającą się płytą.Umieścić igłę na płytce w taki sposób, aby obrót płytki odsunął ją od końcówki igły. Obserwując z boku, użyj pokrętła regulacji zgrubnej, aby opuścić igłę w kierunku powierzchni płyty ściernej i zatrzymaj się, gdy igła prawie dotyka powierzchni cieczy. Wyregulować położenie igły tak, aby znajdowała się w środku pola widzenia.Po znalezieniu się w środku powoli zwiększaj powiększenie, dokonując niewielkich korekt, aby końcówka igły znajdowała się w centrum view. Przy maksymalnym powiększeniu zatrzymaj płytę szlifierską i ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni płyty ściernej. Gdy ostrość na powierzchni jest już ustawiona, natychmiast uruchom ponownie obrót płyty.Za pomocą pokrętła regulacji kursu manipulatora opuść igłę w kierunku płyty ściernej. W polu view obserwuj igłę i cień igły. Gdy oba elementy są bliskie styku, przełącz się na pokrętło precyzyjnej regulacji.Kontynuuj opuszczanie igły, aż dotknie swojego cienia. W tym momencie odczytaj suwmiarkę i zanotuj odczyt. Odczyt ten wskazuje, że powierzchnia płyty ściernej znajduje się na poziomie lub poniżej tego pomiaru suwmiarki.Pozwól, aby igła pozostała na tym wskazówku suwmiarki przez 5 do 10 sekund. Za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji manipulatora podnieś igłę, upewniając się, że pozostaje pod powierzchnią środka zwilżającego. Zatrzymaj na chwilę obrót płyty ściernej, aby obserwować, czy pęcherzyki powietrza wydostają się z końcówki igły.Jeśli bąbelki nie są obecne, przesuń igłę z powrotem do poprzedniego odczytu kalibru, obniż ją nieznacznie, wykonaj nowy odczyt kalibru i powtórz kroki, jak pokazano wcześniej. Jeśli widoczne są pęcherzyki, uruchom ponownie płytę ścierną, aby sprawdzić, czy podczas obracania się płyty dochodzi do tworzenia się pęcherzyków. Po zaobserwowaniu pęcherzyków, gdy płyta ścierna się nie obraca, powoli zmniejszaj ciśnienie powietrza, obracając pokrętło regulacyjne regulatora.Gdy pęcherzyki przestaną wypływać z końcówki igły, zwróć uwagę na ciśnienie, a następnie zwiększ ciśnienie powietrza, aż bąbelki zaczną ponownie wypływać z końcówki igły. Po zakończeniu ukosowania podnieś igłę nad płytę ścierną, upewniając się, że jest wystarczająco wysoko, aby w nic nie uderzyć, gdy cały manipulator jest obracany od płytki i mikroskopu. Gdy igła znajdzie się w pozycji, w której można ją bezpiecznie wyjąć, zmniejsz ciśnienie powietrza do zera.Wyjąć igłę i umieścić ją w pojemniku do przechowywania igieł, takim jak szalka Petriego, aż zostanie zużyta.

wet-beveling-microinjection-needles-utilizing-constant-air-pressure

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Poland, R. i wsp. Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania. J. Vis. Exp. (2015)W tym filmie zestaw do mikroiniekcji wypełniony wodą, składający się ze strzykawki i rurki do mikrowstrzykiwaczy, służy do precyzyjnego dostarczania leku. Szczur z wszczepioną kaniulą prowadzącą jest poddawany celowanej mikroiniekcji mózgu, umożliwiającej dokładne podawanie środków terapeutycznych obudzonym zwierzętom przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.

Oparte na mikroiniekcjach dostarczanie środka terapeutycznego do obudzonego mózgu gryzonia

Źródło: Vanegas, M. I., et al. System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia urządzenie mikroprzepływowe oparte na mikroelektrodach, które dostarcza roztwór leku przez rurkę kapilarną, wykorzystując roztwór markera na bazie oleju do precyzyjnego śledzenia objętości i umożliwiając jednoczesny zapis neuronowy i wlew leku.

System mikroiniekcji mikroprzepływowej do skojarzonego infuzji leków i elektrofizjologii

Źródło: Paolone, G., et al. Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).Ten film przedstawia wstrzyknięcie mikroigłowe do mózgu gryzonia za pomocą mikroigły kwarcowej z otworami. Mikroigła jest podłączona do strzykawki i mikropompy w celu kontrolowania szybkości podawania. Igła z roztworem do wstrzykiwań jest wprowadzana do mózgu z prędkością podawania ustawioną na niską. Po ustawieniu zwiększa się szybkość dostawy. Igła jest wycofywana po krótkiej przerwie.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni za pomocą mikroigły kwarcowej

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Opisujemy tutaj protokół mikroiniekcji do mózgu gryzonia, który wykorzystuje igły kwarcowe. Igły te nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanek i zapewniają niezawodne dostarczanie nawet w głębokich obszarach. Co więcej, mogą być dostosowywane do potrzeb badawczych poprzez spersonalizowane projekty i mogą być ponownie wykorzystywane.

Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Danio pręgowany to modelowy system, który posiada wiele cennych cech, w tym przejrzystość optyczną, szybki rozwój zewnętrzny oraz, co szczególnie ważne dla dziedziny słuchu i równowagi, zewnętrznie zlokalizowane czuciowe komórki rzęsate. W tym artykule opisano, w jaki sposób transgeniczny danio pręgowany może być używany do oznaczania zarówno mechanosensacji komórek rzęsatych, jak i funkcji presynaptycznych in toto.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych w linii bocznej u larw danio pręgowanego

Prezentujemy system mikroiniekcji przeznaczony do elektrofizjologii i wspomaganego dostarczania eksperymentalnych sond (tj. nanosensorów, mikroelektrod), z opcjonalnym wlewem leku. Powszechnie dostępne składniki mikroprzepływowe są sprzężone z kaniulą zawierającą sondę. Dołączony jest protokół krok po kroku dotyczący budowy mikroiniekcji, z wynikami podczas infuzji muscymolu w korze makaka.

System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Naucz się techniki ukosowania igieł na mokro z wykorzystaniem stałego ciśnienia powietrza do mikroiniekcji w badaniach nad genetycznie modyfikowanymi owadami. Metoda zapewnia precyzyjną kontrolę wielkości otwarcia igły.

Ukosowanie na mokro igieł do mikroiniekcji z wykorzystaniem stałego ciśnienia powietrza w celu uzyskania informacji zwrotnej o otwarciu igły (Wideo) | JoVE Journal

Ukosowanie na mokro igieł do mikroiniekcji z wykorzystaniem stałego ciśnienia powietrza w celu uzyskania informacji zwrotnej o otwarciu igły

Przeglądaj więcej filmów