Name: Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę indukcji ciężkiego ostrego zapalenia trzustki u myszy C57BL/6J za pomocą ceruleiny i LPS. Model ten umożliwia badanie ekspresji genu HMGB1 oraz poszukiwanie nowych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Projekty Badawcze w Dziedzinie Zdrowia i Nauk Medycznych w mieście Huainan (No. HNWJ2023005); Miejski program przewodnickiego planu naukowo-technologicznego w mieście Huainan (nr 2023151); Program szkoleniowy dla studentów Innowacyjności i Przedsiębiorczości Kolegium Prowincji Anhui (nr S202310361254); dziewiąta partia zespołów innowacyjnych "50·Stars of Science and Technology" w mieście Huainan i projekcie budowy kluczowej specjalizacji klinicznej prowincji Anhui. Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność Działowi Laboratoryjnemu Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Nauki i Technologii w Anhui za dostarczenie odpowiednich danych testowych.

Inducing Pancreatic Injury in Mice Through Intraperitoneal Drug Injection

<ol><li>Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+severe+acute+pancreatitis%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Management of severe acute pancreatitis: An update.</a> Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).</li>
<li>Duan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDF11+ameliorates+severe+acute+pancreatitis+through+modulating+macrophage+M1+and+M2+polarization+by+targeting+the+TGFbetaR1%2FSMAD-2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway.</a> Int Immunopharmacol. 108, 108777(2022).</li>
<li>Zhang, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+method+of+an+ideal+model+of+multiple+organ+injury+of+rat+with+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis.</a> World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).</li>
<li>Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+regenerating+protein+%28reg+I%29+and+reg+I+receptor+mRNA+are+upregulated+in+rat+pancreas+after+induction+of+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis.</a> World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).</li>
<li>Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+low+molecular+weight+heparin+on+pancreatic+micro-circulation+in+severe+acute+pancreatitis+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model.</a> Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).</li>
<li>Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hemorrhagic+pancreatitis+%28massive+necrosis%29+with+fat+necrosis+induced+in+mice+by+DL-ethionine+fed+with+a+choline-deficient+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet.</a> Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+XIAP+reduces+the+severity+of+acute+pancreatitis+via+regulation+of+cell+death+and+nuclear+factor-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity.</a> Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).</li>
<li>Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caerulein-induced+acute+necrotizing+pancreatitis+in+mice%3A+Protective+effects+of+proglumide%2C+benzotript%2C+and+secretin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin.</a> Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPP4+inhibitor+attenuates+severe+acute+pancreatitis-associated+intestinal+inflammation+via+Nrf2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling.</a> Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+protects+severe+acute+pancreatitis+by+inhibiting+HMGB-1+active+secretion+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages.</a> Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sitagliptin+activates+the+p62-Keap1-Nrf2+signalling+pathway+to+alleviate+oxidative+stress+and+excessive+autophagy+in+severe+acute+pancreatitis-related+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Schmidt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+better+model+of+acute+pancreatitis+for+evaluating+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.</a> Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+paracentesis+drainage+attenuates+severe+acute+pancreatitis+by+enhancing+cell+apoptosis+via+PI3K%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway.</a> Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).</li>
<li>Fontaine, D. A., Davis, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attention+to+background+strain+is+essential+for+metabolic+research%3A+C57BL%2F6+and+the+international+knockout+mouse+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium.</a> Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+CHRM3+activation+causes+pancreatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice.</a> JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).</li>
<li>Sah, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerulein-induced+chronic+pancreatitis+does+not+require+intra-acinar+activation+of+trypsinogen+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice.</a> Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+AMPK+ameliorates+acute+severe+pancreatitis+by+suppressing+pancreatic+acinar+cell+necroptosis+in+obese+mice+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models.</a> Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).</li>
<li>Jin, C., Li, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+severe+acute+pancreatitis+model+in+mice+induced+by+combined+Rain+Frog+Peptide+and+lipopolysaccharide+and+exploration+of+its+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Exp+Bio+Sinica%22%5BJournal%5D)">Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism.</a> Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Roy, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Ubap2+deletion+regulates+glucose+tolerance%2C+inflammation%2C+and+protection+from+Caerulein-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis.</a> Cancer Lett. 578, 216455(2023).</li>
<li>Chen, R., Kang, R., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+HMGB1+secretion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The mechanism of HMGB1 secretion and release.</a> Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).</li>
<li>Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+mechanisms+of+major+DAMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Release mechanisms of major DAMPs.</a> Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+circulating+histones+in+predicting+persistent+organ+failure+and+mortality+in+patients+with+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis.</a> Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).</li>
<li>Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+high+mobility+Group+Box+1+and+Interleukin-6+levels+in+acute+pancreatitis%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis.</a> J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Obecnie brakuje skutecznych środków poprawiających wysoką śmiertelność u pacjentów z ciężkim ostrym zapaleniem trzustki. Kluczowe znaczenie ma zbadanie skuteczności leków we wzmacnianiu mechanizmów stabilności immunologicznej. Istnieje pilna potrzeba stworzenia idealnego modelu zwierzęcego dla ciężkiego ostrego zapalenia trzustki. Myszy z pochodzeniem genetycznym C57BL/6J są szeroko stosowane w badaniach biomedycznych, w tym w badaniach nad patofizjologią SAP. Ponad 70 lat różnicowania genetycznego u myszy B6J spowodowało spontaniczną delecję kilku eksonów15, co prowadzi do zmniejszenia wrażliwości na uszkodzenie trzustki wywołane przez ceruleinę16. Ponadto istniejące modele zwierzęce ostrego zapalenia trzustki mają ograniczenia, takie jak uraz chirurgiczny lub możliwość zastosowania tylko do większych zwierząt, co utrudnia badania naukowe z wykorzystaniem tych modeli. Dlatego bardzo cenne jest stworzenie stabilnego, wydajnego i wygodnego modelu zwierzęcego przy użyciu tego specyficznego szczepu genu.
Ceruleina jest analogiem cholecystokininy, który indukuje uszkodzenie tkanki trzustki, powodując względną niedrożność płynu trawiennego w trzustce i wydzielanie enzymów poprzez wstrzyknięcia o wysokiej częstotliwości w krótkim czasie, gdy myszy poszczą i zmagazynują wystarczającą ilość płynu trawiennego. LPS jest głównym składnikiem znajdującym się w ścianach komórkowych bakterii i może powodować MODS i SIRS u myszy18. Poprzednie badanie wykazało, że połączenie iniekcji Caeruleiny z różną częstotliwością z różnymi dawkami LPS podawanymi w iniekcji dootrzewnowej wywołało podobne zmiany patologiczne obserwowane u człowieka SAP19,20. W badaniu tym zastosowano nieinwazyjne podejście w celu wywołania różnego stopnia uszkodzenia trzustki poprzez połączenie różnych częstotliwości wstrzyknięć ceruleiny z różnymi dawkami LPS podawanymi dootrzewnowo myszom. Zapewnienie równomiernego wchłaniania przez otrzewną miało kluczowe znaczenie podczas opracowywania protokołu. Aby spełnić ten wymóg, konieczne jest ścisłe przestrzeganie etapów iniekcji dootrzewnowej, aby zapewnić precyzyjną kontrolę nad każdym podawaniem leku. Dodatkowo, delikatne pocieranie i wywieranie odpowiedniego nacisku na miejsce wstrzyknięcia sterylnym wacikiem po każdym wstrzyknięciu leku jest niezbędne do równomiernego rozprowadzenia leku w całej jamie otrzewnej. Ponadto niezwykle ważne jest dokładne i precyzyjne umieszczenie główki szpilki w jamie otrzewnej, z igłą skierowaną w stronę środkowej części górnej części brzucha. Należy przeprowadzić wcześniejsze szkolenie, aby umożliwić operatorom dokładne dostrzeżenie braku oporu podczas wprowadzania igły do jamy brzusznej. Zastosowanie mikroilościowej pompy infuzyjnej zamiast obsługi ręcznej może potencjalnie poprawić jakość wstrzykiwanych leków; Niestety, nie zostało to zrealizowane w tym badaniu. Niemniej jednak, stosując różne schematy wstrzykiwań, wywołaliśmy różne stopnie uszkodzenia trzustki i skutecznie zaobserwowaliśmy różnice w uszkodzeniu trzustki spowodowane różnymi częstotliwościami i dawkami w identycznych warunkach technicznych wywołanych przez ceruleinę w połączeniu z iniekcjami LPS. Dostarcza to cennych informacji na temat przyszłego stosowania ceruleiny w nieinwazyjnych modelach zwierzęcych w leczeniu indukcji ciężkiego ostrego zapalenia trzustki.
Skojarzenie ceruleiny i LPS powodowało znacznie podwyższone poziomy amylazy i lipazy w surowicy, zwiększenie masy trzustki i zmiany histologiczne, w tym rozległy naciek komórek zapalnych, obrzęk komórek groniastych trzustki, martwicę i krwotok, jak wykazano za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (HE). Co więcej, wraz ze wzrostem dawki LPS zmiany patologiczne w trzustce stały się bardziej wyraźne. Warto jednak zauważyć, że nie było zauważalnych różnic w wynikach patologii trzustki między grupami PI IV i PI V, podczas gdy zakres martwicy komórek tkanki trzustki był bardziej wyraźny w grupie PI III w porównaniu z grupą PI IV. Obserwacja ta sugeruje, że częstotliwość dawkowania ceruleiny może służyć jako główny czynnik przyczyniający się do uszkodzenia trzustki, podczas gdy LPS nasila jego progresję, prowadząc do ogólnoustrojowego uszkodzenia stanu zapalnego18,21. HMGB-1 jest białkiem, które funkcjonuje w zależności od swojego położenia22. Zewnątrzkomórkowy HMGB-1 działa jako białko biorące udział w sygnałach ostrzegawczych stanu zapalnego i jest ściśle związane z nasileniem ostrego zapalenia trzustki 23,24,25. W tym badaniu poziomy HMGB-1 w surowicy u myszy ze wszystkich grup eksperymentalnych były znacznie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną, przy czym grupa PI V wykazała najbardziej znaczący wzrost. Eksperymenty immunohistochemiczne i elektroforeza białek również potwierdziły wysoką ekspresję HMGB-1 w tkance trzustki. To ważne białko może służyć jako cel terapeutyczny do hamowania burzy zapalnej w ciężkim ostrym zapaleniu trzustki.
Podsumowując, kluczowe jest opracowanie nieinwazyjnego, prostego i łatwego do wykonania modelu SAP u myszy. W tym protokole eksperymentalnym indukcja uszkodzenia trzustki za pomocą ceruleiny w połączeniu z LPS jest niezawodna i skuteczna. Podając Caeruleinę dootrzewnowo przez dziesięć kolejnych dni w dawce 50 μg/kg, a następnie pojedyncze wstrzyknięcie dootrzewnowe 15 mg/kg LPS, można ustalić stabilny, niezawodny, opłacalny i wydajny model zwierzęcy SAP.

Ciężkie ostre zapalenie trzustki charakteryzuje się szybkim początkiem, szybkim postępem i wysoką śmiertelnością w obrębie choroby układu pokarmowego1. Jego wysoka śmiertelność zawsze była głównym przedmiotem badań klinicznych. Ze względu na nieprzewidywalne zmiany w warunkach klinicznych, niejednorodność objawów choroby i ograniczoną dostępność próbek ludzkich, tworzenie modeli zwierzęcych staje się coraz ważniejsze dla badań nad chorobami.
Wsteczne wstrzyknięcie taurocholanu sodu do wspólnego przewodu żółciowego jest powszechnie używane do stworzenia szczurzego modelu klasy SAP<sup="xref">2. Symulując niedrożność trzustki i dróg żółciowych oraz wywołując refluks żółci i płynu trzustkowego, ta technika modelowania wykazuje wysoki wskaźnik sukcesu w replikacji modeli zwierzęcych SAP. Należy jednak zauważyć, że chirurgia inwazyjna ma wpływ na sam model zwierzęcy. Co więcej, metoda ta jest ograniczona do większych zwierząt, takich jak szczury i psy, które są wykorzystywane głównie jako obiekty eksperymentalne. Alternatywne techniki, w tym intubacja dwunastnicy3, bezpośrednie nakłucie dwunastnicy4 oraz bezpośrednie nakłucie przewodu żółciowego-trzustkowego5, są często wykorzystywane do celów modelowania.
Metody iniekcji dootrzewnowej i modelowania diety oferują nieinwazyjne korzyści, które można zastosować do zwierząt dowolnej wielkości. Mysi model SAP indukowany przez podawanie etyoniny z niedoborem choliny (CDE)6 przedstawia pewne komplikacje, takie jak słabo kontrolowana hiperglikemia i hipokalcemia, co czyni go nieodpowiednim do oceny nowych podejść diagnostycznych i terapeutycznych. Z drugiej strony, dootrzewnowe wstrzyknięcie ceruleiny w połączeniu z L-arginininą7 stanowi najczęściej stosowaną metodę wywoływania ostrego zapalenia trzustki u myszy. W szczególności, wielokrotne dootrzewnowe podawanie ceruleiny - analogu cholecystokininy - stanowi bardzo odpowiednie podejście do badania różnych aspektów związanych z tą destrukcyjną chorobą, w tym patogenezy, stanu zapalnego i procesów regeneracji. Ze względu na swoje strukturalne podobieństwo do cholecystokininy (CCK), ceruleina skutecznie stymuluje skurcz pęcherzyka żółciowego i wydzielanie enzymów trzustkowych, co prowadzi do zaburzenia równowagi w wydzielaniu enzymów, a następnie do samozniszczenia8. Lipopolisacharyd (LPS), wszechobecny i szeroko badany jako cząsteczka molekularna związana z patogenem, może być łączony z ceruleiną poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe w celu stworzenia skutecznego mysiego modelu SAP. Ta kombinacja szybko wyzwala i uwalnia znaczną liczbę cytokin zapalnych, co skutkuje nadmiernym stanem zapalnym miejscowym i ogólnoustrojowym. W kilku badaniach wykazano indukcję modeli SAP u myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ceruleiny w połączeniu z LPS. Można to przypisać faktowi, że dootrzewnowe wstrzyknięcie Caeruleiny może spowodować obrzęk trzustki i krwotok u myszy, podczas gdy dodanie LPS może natychmiast wywołać martwicę trzustki i zaostrzyć ogólnoustrojową odpowiedź zapalną, posocznicę, a nawet niewydolność narządów. Obecnie występują różnice w dawkowaniu i częstości dootrzewnowych wstrzyknięć ceruleiny, a także niespójność w dodatkowych dawkach LPS. Osiągnięcie spójności w mysich modelach SAP jest wyzwaniem9,10,11,12; Dlatego konieczne jest ustalenie ustandaryzowanego protokołu w celu uzyskania idealnego modelu. W tym artykule opisujemy protokół wstrzykiwania dootrzewnowego u myszy i badamy optymalną częstotliwość wstrzykiwań i dodatkową dawkę LPS.

<table><tbody><tr><td>20 i razy; Roztwór naprawczy antygenu kwasu cytrynowego (pH 6,0)</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1202-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Amylase</td><td>Mindray, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aneksin V-FITC/PI</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>&nbsp; G1511</td><td>&nbsp; rozcieńczony w stosunku 1:20</td></tr><tr><td>Anty-HMGB1 Rabbit pAB</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>GB11103</td><td>&nbsp; rozcieńczony w stosunku 1:1800</td></tr><tr><td>zestaw do ilościowego wykrywania białka BCA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G2026-200T</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Cytometr przepływowy</td><td>BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA</td><td>BD FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>GC305010-100g</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, Chiny</td><td></td><td>numer licencji SCXY (Su) 2011&ndash; 0003</td></tr><tr><td>Ceruletide</td><td>&nbsp; MCE, New Jersey, Stany Zjednoczone</td><td>17650-98-5&nbsp;</td><td>50 &mikro; g/kg</td></tr><tr><td>Chemiluminescencyjny aparat</td><td>do obrazowania Cytiva CO., LTD.; USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór naprawczy antygenu kwasu cytrynowego (suchy proszek pH 6,0)</td> <td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1201-5 L</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>&nbsp; GC305014</td><td>0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>DAB (SA-HRP) Zestaw do wykrywania apoptozy komórek tunelowych</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1507-100 T</td><td></td></tr><tr><td>Dimension EXL ze zintegrowanym systemem chemicznym LM</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Brookfield, USA</td><td>YZB/USA 8311-2014</td><td></td></tr><tr><td>Deweloper ECL</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik eozyny (rozpuszczalny w alkoholu)</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1001-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>&nbsp; Noldus, Holandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw królikom z oznaczeniem FITC</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>GB22303</td><td>&nbsp; rozcieńczony w stosunku 1:50</td></tr><tr><td>W pełni automatyczny analizator komórek krwi</td><td>Zybio Inc. Chiny</td><td>&nbsp; Zybio-Z3 CRP</td><td></td></tr><tr><td>GapDH</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>GB11103</td><td>&nbsp; rozcieńczony w stosunku 1:1500</td></tr><tr><td>Niebieski roztwór powrotny Hematoksyliny</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1040-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>roztwór różnicujący hematoksylinę</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1039-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik hematoksyliny</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1004-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy HMGB-1 ELISA</td><td>njjcbio Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HOMOGENIZATOR</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>KZ-III-F; </td><td></td>IC111150 100222</tr><tr><td>IgG kozy przeciw królikom znakowanym przez HRP</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>GB23303</td><td>&nbsp; rozcieńczone w stosunku 1:1500</td></tr><tr><td>Zestawy IL-6 ELISA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>GEM0001</td><td></td></tr><tr><td>Lipase&nbsp;</td><td>Mindray,Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd&nbsp;</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>GC205009</td><td>15 mg / kg</td></tr><tr><td>Wirówka wysokoobrotowa o niskiej temperaturze</td><td>Changsha Pingfan Apparatus & Instrument Co., Ltd., Chiny</td><td>TGL-20M</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do łamania membrany</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1204</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom</td><td>Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; Chiny</td><td>CR-601ST</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td>200-mesh</td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw do wykrywania apoptozy komórek TUNEL (metoda barwienia DAB)</td> <td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G1507-100T</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do zatapiania tkanek parafinowych</td><td>PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, Chiny</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>Patologiczny aparat do suszenia tkanek</td><td>PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, Chiny</td><td>PHY-III</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G4202-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G2008-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencji dodatniej</td><td>Olympus Corporation, Tokio, Japonia</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Pro Kalcytonina</td><td>Mindray, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore, USA</td><td></td><td>0,22 &mikro; m</td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>G2002-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Beyotime Biotechnology, Chiny</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha; Zestawy ELISA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>GEM0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa kąpiel wodna</td><td>DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; Chiny</td><td>KQ-200KDE</td><td></td></tr><tr><td>Western Blot</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western blot imaging System</td><td>Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPONIA</td><td>Amersham ImageQuant 800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikser Whirlpool</td><td>SCILOGEX; USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

Leczenie ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP), z wysoką śmiertelnością, stanowi poważne wyzwanie kliniczne. Badanie zmian patologicznych związanych z SAP przy użyciu modeli zwierzęcych może pomóc w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i odkrywaniu nowych podejść terapeutycznych. Wcześniejsze badania indukowały przede wszystkim uszkodzenie trzustki poprzez wsteczne wstrzyknięcie taviaurocholanu sodu do dróg żółciowych, ale wpływ uszkodzeń chirurgicznych na jakość modelu zwierzęcego pozostaje niejasny. W tym badaniu zastosowaliśmy różne częstotliwości dootrzewnowych wstrzyknięć ceruleiny w połączeniu z różnymi dawkami LPS w celu wywołania uszkodzenia trzustki u myszy C57BL / 6J i porównaliśmy zakres urazu w pięciu protokołach wstrzyknięć dootrzewnowych. Jeśli chodzi o wywoływanie ostrego zapalenia trzustki u myszy, proponuje się protokół wstrzyknięcia dootrzewnowego, który powoduje śmiertelność nawet 80% w ciągu 5 dni. W szczególności myszy otrzymywały dziesięć codziennych wstrzyknięć dootrzewnowych Caeruleiny (50 μg/kg), a następnie wstrzyknięcie LPS (15 mg/kg) godzinę po ostatnim podaniu Caeruleiny. Dostosowując częstotliwość i dawkę wstrzykiwanych leków, można skutecznie manipulować ciężkością uszkodzenia trzustki. Model ten wykazuje dużą sterowalność i ma krótki cykl replikacji, dzięki czemu jest możliwy do wykonania przez jednego badacza bez konieczności posiadania drogiego sprzętu. Wygodnie i dokładnie symuluje kluczowe cechy choroby obserwowane w ludzkim SAP, wykazując jednocześnie wysoki stopień odtwarzalności.

Proces eksperymentalnego modelowania na myszach przedstawiono na Rysunku 1. Po 12 h od zakończenia wstrzykiwania użyto rejestratora wideo w polu otwartym (open-field), aby monitorować dystans ruchu i czas unieruchomienia różnych grup eksperymentalnych myszy przez 5 cykli (Rysunek 2A). W ciągu 5 cykli myszy w grupie PI V utrzymywały niski poziom dystansu ruchu w ciągu 3 min, podczas gdy stosunek unieruchomienia w ciągu 3 min zwiększał się z każdym kolejnym cyklem (Rysunek 2B,C). Dodatkowo przeprowadzono analizę statystyczną całkowitego dystansu ruchu myszy z różnych grup eksperymentalnych podczas 5 cykli. Grupa PI V wykazała najmniejszy całkowity dystans ruchu w porównaniu z pozostałymi grupami eksperymentalnymi, a różnica ta była istotna statystycznie (p &lt; 0.001) (Rysunek 2D,E). Z wyjątkiem grupy kontrolnej i grupy PI I, myszy w pozostałych grupach eksperymentalnych wykazały ujemny przyrost masy ciała (D-Value weight). Wśród nich grupa PI V wykazała największą zmianę masy ciała, a różnica w zmianie masy w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi była istotna statystycznie (Rysunek 2F). Po ocenie przeżywalności dodatkowych 10 myszy w każdej grupie eksperymentalnej wyniki wykazały, że śmiertelność myszy w grupie PI V osiągnęła 80% w 5tym dniu. Jednak nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w śmiertelności między czterema pozostałymi grupami eksperymentalnymi a myszami z grupy kontrolnej (Rysunek 2G).
Przy użyciu mikroskopu o dużym powiększeniu w grupach myszy PI IV i PI V zaobserwowano znaczny obrzęk komórek, nekrozę oraz nacieki komórek zapalnych (Rycina 3A,B). Wykorzystując kryteria oceny podane w Tabeli uzupełniającej 2, oceniono patologię trzustki w różnych eksperymentalnych grupach myszy, stwierdzając istotne różnice w wyniku patologii trzustki w porównaniu z myszami z grupy kontrolnej (p &lt; 0,001) (Rycina 3C; Rycina uzupełniająca 1). Ponadto, w porównaniu z grupą kontrolną, poziomy amylazy i lipazy w surowicy zmierzonych myszy były znacząco wyższe w grupach eksperymentalnych od PI II do PI V, a różnice te były istotne statystycznie. Co ciekawe, w grupie myszy PI I nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic (Rycina 3D,E). Do oceny poziomów markerów zapalnych14, w tym TNF-α i IL-6, w surowicy myszy zastosowano metodę ELISA. Wyniki wykazały, że poziomy TNF-α i IL-6 w grupie myszy PI V były znacznie wyższe niż w pozostałych grupach eksperymentalnych, a różnice te były istotne statystycznie (Rycina 3F,G). W porównaniu z grupą kontrolną poziomy PCT wzrosły we wszystkich czterech grupach eksperymentalnych, jednak tylko różnica w grupie PI V była istotna statystycznie (p &lt; 0,05) (Rycina 3H).
Stan apoptozy tkanek trzustki w różnych grupach eksperymentalnych myszy 
Poprzez przeprowadzenie barwienia TUNEL tkanek trzustki w każdej grupie myszy zaobserwowano stan nekrozy komórkowej w tkankach trzustki różnych grup eksperymentalnych (Rycina 4A). Wartości skali szarości (OD) na jednostkę powierzchni przekrojów tkanek trzustki oraz odsetek pozytywny nekrozy komórkowej przeanalizowano półilościowo przy użyciu oprogramowania Image J. Wyniki wykazały, że w porównaniu z pozostałymi grupami eksperymentalnymi poziom nekrozy komórek w tkankach trzustki myszy z grupy PI V był znacznie zwiększony, a różnica ta była istotna statystycznie (p &lt; 0,001) (Rycina 4B,C). Przeprowadzono eksperymenty z użyciem immunoblotingu białek w celu oceny poziomów ekspresji cysteinyl aspartatowej proteazy specyficznej-3 (Caspase-3), markeru nekrozy komórkowej, w tkankach trzustki myszy z różnych grup eksperymentalnych (Rycina 4D). Ilościowe oznaczenie ekspresji caspase-3 wykazało, że poziom ekspresji białka caspase-3 w tkankach trzustki grupy PI V był znacznie zwiększony, a różnica była istotna statystycznie (p &lt; 0,001). Poziomy ekspresji białek zostały zmierzone i znormalizowane względem wewnętrznej kontroli GapDH (Rycina 4E). Dodatkowo świeże zawiesiny komórek acynarnych trzustki znakowano Annexin V-FITC/PI i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Stwierdzono, że w porównaniu z pozostałymi grupami eksperymentalnymi myszy, grupa PI V wykazywała znacznie wyższy odsetek pozytywny śmierci komórkowej, co było istotne statystycznie (p &lt; 0,001) (Rycina 4F,G).
Zawartość HMGB-1 w surowicy obwodowej oraz poziom ekspresji HMGB-1 w tkance trzustki 
W celu zbadania zależności między białkiem HMGB-1 a uszkodzeniem trzustki, przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne i ilościowe w tkankach trzustek myszy w każdej z grup eksperymentalnych. Stwierdzono statystycznie istotną różnicę między grupami eksperymentalnymi a grupą kontrolną (p &lt; 0,001) (Rysunek 5A,B). Do pomiaru poziomu HMGB-1 w surowicy myszy z różnych grup eksperymentalnych wykorzystano test ELISA. Wyniki wykazały, że w porównaniu z grupą kontrolną poziomy HMGB-1 w surowicy były znacząco wyższe we wszystkich grupach eksperymentalnych, przy czym najwyższy poziom zaobserwowano w grupie PI V, a różnica ta była statystycznie istotna (p &lt; 0,001) (Rysunek 5C). Ponadto analiza Western blot wykazała podwyższoną ekspresję białka HMGB-1 w tkankach trzustek myszy we wszystkich grupach eksperymentalnych, przy statystycznie istotnych różnicach w porównaniu z grupą kontrolną (p &lt; 0,001) (Rysunek 5D,E).
<img alt="Schemat harmonogramu badania trzustki; wstrzykiwanie, monitorowanie, eutanazja; obserwacja wskaźnika przeżywalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat doświadczenia. Dzień 2 i Dzień 3: Iniekcja doszpikowa (dojamy). Dzień 4: Rozpoczęcie testu otwartego pola po 12 h od ostatniej iniekcji doszpikowej. Dzień 5: Eutanazja 36 h po iniekcji doszpikowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Efekty podania caeruleiny, wykresy statystyczne A-G, analiza ruchu, wskaźnik przeżywalności, wyniki eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zmiany makroskopowe w modelu mysim PI. (A) Przedstawiono wykres trajektorii ruchu myszy w czasie rzeczywistym. (B) Całkowity dystans ruchu w każdym okresie monitorowania dla różnych grup eksperymentalnych myszy. (C) Procent czasu unieruchomienia w każdym okresie monitorowania dla różnych grup eksperymentalnych myszy. (D,E) Przeanalizowano całkowity dystans ruchu oraz procent czasu unieruchomienia w ciągu 15 min dla myszy w różnych grupach eksperymentalnych. (F) Przedstawiono wartość D reprezentującą masę ciała myszy przed i po procesie modelowania. (G) Obserwowano przeżywalność 10 myszy w każdej grupie przez 7 dni po wstrzyknięciu doszpikowym. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM, n = 4. „ns” oznacza brak istotności statystycznej, *P &lt; 0.05, ****P &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histologia tkanki trzustki z zastosowaniem caeruleiny i LPS; wykresy danych przedstawiające oceny patologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zmiany patologiczne w zapaleniu trzustki u myszy w różnych grupach eksperymentalnych. (A) Przekroje histologiczne tkanki trzustki myszy w różnych grupach eksperymentalnych barwione H&amp;E (przekroje tkanki trzustki zatopione w parafinie, barwione hematoksyliną i eozyną, powiększenia 100-krotne z paskiem skali 200 µm oraz 400-krotne z paskiem skali 50 µm. Żółte długie strzałki wskazują wysepki; czerwone długie strzałki wskazują komórki acynarne; brązowe długie strzałki wskazują naczynia krwionośne; niebieskie długie strzałki wskazują przewody). (B) Obliczenie stosunku masy trzustki do masy ciała myszy. (C) Ocena patologiczna trzustki myszy. (D,E) Oznaczanie poziomów amylazy i lipazy w surowicy myszy. (F-G) Pomiar poziomu TNF-α i IL-6 w surowicy myszy metodą ELISA. (H) Ocena poziomu PCT. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM, n = 4. „ns” oznacza brak istotności statystycznej, *P &lt; 0.05, ****P &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki testu TUNEL, Western blot, dane z cytometrii przepływowej w analizie eksperymentalnej apoptozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Apoptoza tkanki trzustki u myszy. (A) Reprezentatywne obrazy barwienia TUNEL uzyskane z parafiniowych przekrojów trzustki myszy oraz powiększenia wybranych obszarów. (400x, pasek skali 50 µm, kolor żółto-brązowy oznacza komórki pozytywne). (B,C) Analiza ilościowa wartości skali szarości na jednostkę powierzchni w przekrojach tkanki trzustki myszy barwionych metodą TUNEL oraz odsetek pozytywnie zabarwionych martwych komórek. (D) Poziom ekspresji kaspazy-3 w tkance trzustki wykryty za pomocą metody Western blot. (E) Ilościowe oznaczenie ekspresji kaspazy-3 w tkance trzustki. (F) Wykorzystanie cytometrii przepływowej do oceny stopnia śmierci komórek w komórkach acynarnych trzustki myszy. (G) Wyliczenie liczby martwych komórek w późnej fazie w komórkach acynarnych trzustki myszy. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM, n = 4. „ns” oznacza brak istotności, *P &lt; 0.05, ****P &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunohistochemia i Western blot ekspresji HMGB1; efekty traktowania caureliną i LPS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Ekspresja HMGB-1 w tkance trzustkowej myszy. (A) Reprezentatywne obrazy i powiększenia (x400, pasek skali 50 µm) barwienia immunohistochemicznego HMGB-1 w przekrojach trzustki. Kolor brązowo-żółty wskazuje komórki dodatnie (n = 4). (B) Odsetek komórek dodatnich pod kątem HMGB-1 w przekrojach tkanki trzustkowej (n = 24). (C) Poziom HMGB-1 w surowicy myszy (n = 4). (D,E) Wykonano Western blot w celu oznaczenia poziomu ekspresji HMGB-1 w tkance trzustkowej oraz uzyskania wyników ilościowych (n = 4). Dane przedstawiono jako średnie ± SEM, „ns” oznacza brak istotności statystycznej, *P &lt; 0.05, ****P &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Wielonarządowe uszkodzenia w modelu mysim grupy PI V. (A) Reprezentatywne obrazy zmian histologicznych w tkankach trzustki, płuc, wątroby i nerek pobranych od myszy z grupy CON i grupy PI V, przeanalizowane przy użyciu barwienia H&amp;E (powiększenie 200x, pasek skali 50 µm). Zmiany patologiczne związane z nekrozą komórek acynarnych wskazano czarnymi strzałkami. Żółte strzałki wskazują zmiany patologiczne charakteryzujące się krwotokiem śródmiąższowym i obrzękiem pęcherzyków pławnych. Obrzęk i nekrozę hepatocytów oznaczono zielonymi strzałkami. Zmiany patologiczne związane z krwotokiem kłębuszkowym zaznaczono czerwonymi strzałkami. (B) Obliczono oceny histologiczne tkanek trzustki, płuc, wątroby i nerek uzyskanych od myszy z grupy CON oraz grupy PI V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/supplementary%20FIG%203.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Protokół iniekcji domięśniowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/Supplementary%20Table%201_Updated.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Kryteria oceny patologicznej ciężkości zapalenia trzustki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Dootrzewnowe podawanie leków jest bezpiecznym i skutecznym nieinwazyjnym sposobem na wywołanie uszkodzenia trzustki. W badaniu tym porównano pięć różnych protokołów wstrzyknięć dootrzewnowych na myszach w celu wywołania różnego stopnia uszkodzenia trzustki i ustanowiono model ciężkiego uszkodzenia trzustki w celu zbadania zmian patologicznych i strategii leczenia ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP).

Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

Leczenie ciężkiego ostrego zapalenia trzustki jest trudne ze względu na wysoką śmiertelność przy użyciu modeli zwierzęcych, w szczególności myszy z wybranym tłem C57BL/6J. Badamy SAP jako patologiczny w celu identyfikacji celów terapeutycznych i opracowania nowych metod leczenia, dostarczając metodę polimyszy w jednym badaniu SAP.Badania te wykazały wysoką ekspresję genów HMGB1 uszkadzających zapalenie trzustki, co sugeruje jego związek z kamieniem zapalnym ciężkiego ostrego zapalenia trzustki. Nasz protokół obejmuje ceruleinę w celu wywołania skurczu pęcherzyka żółciowego i zakłócenia postu u myszy, co prowadzi do uszkodzenia tkanki trzustki poprzez blokowanie wydzielania płynu trawiennego. W połączeniu z wstrzyknięciem LPS wywołaliśmy ciężkie zapalenie trzustki z niewydolnością narządów u myszy. Takie podejście jest nieinwazyjne i łatwe do wdrożenia z krótkimi cyklami i wysoką powtarzalnością.[Demonstrator] Na początek zmierz i zapisz wagę myszy eksperymentalnej. W przypadku dootrzewnowego wstrzyknięcia Caeruleiny należy chwycić i przytrzymać mysz brzuchem do góry i głową umieszczoną niżej niż ogon. Trzymać strzykawkę w prawej ręce i wprowadzić igłę w skórę podskórną po lewej stronie białej linii brzusznej. Przesuń igłę do przodu o około trzy do pięciu milimetrów i włóż ją do jamy brzusznej pod kątem 45 stopni. Trzymać igłę nieruchomo i powoli wstrzykiwać Caeruleinę. Wyciągnąć igłę, a następnie delikatnie wmasować i docisnąć miejsce wstrzyknięcia sterylnym wacikiem, aby całkowicie rozprowadzić lek do jamy brzusznej. 12 godzin po wstrzyknięciu należy umieścić mysz na środku siatki w pudełku doświadczalnym, przodem do osoby przeprowadzającej eksperyment. Włącz oprogramowanie do śledzenia wideo i skonfiguruj monitorowanie dla czterech jednoczesnych pól widzenia. Zaznacz długość i szerokość obiektu eksperymentalnego, który może poruszać się w obrębie pudełka na ekranie monitorowania w czasie rzeczywistym. Rejestruj aktywność myszy przez 15 minut. Zmiany makroskopowe mierzone w modelu myszy z uszkodzeniem trzustki podczas pięciu cykli wykazały, że myszy z grupy urazów trzustki 5 utrzymywały niski poziom odległości ruchu w ciągu trzech minut, podczas gdy współczynnik bezruchu w ciągu trzech minut zwiększał się z każdym kolejnym cyklem. Grupa 5 z urazem trzustki wykazała najmniejszą całkowitą odległość ruchu w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi, a różnica była istotna statystycznie. Z wyjątkiem grupy kontrolnej i urazu trzustki 1, wszystkie grupy wykazały ujemny wzrost masy ciała o wartości D, przy czym grupa 5 urazów trzustki wykazała największą zmianę. Analiza wskaźnika przeżycia wykazała 80% śmiertelność w grupie urazów trzustki 5 do piątego dnia, w przeciwieństwie do innych grup, które nie wykazały znaczącej różnicy w stosunku do grupy kontrolnej. Po 36 godzinach od dootrzewnowego wstrzyknięcia Caeruleiny należy poddać mysz eutanazji i zabezpieczyć ją w pozycji leżącej na piankowej płytce. Wykonaj środkowe nacięcie brzucha i odwróć rurkę jelita cienkiego w prawo, aby odsłonić trzustkę. Odłączyć dwunastnicę i przewód odźwiernika. Zlokalizuj jelito cienkie pod trzustką, a następnie całkowicie uwolnij tkankę trzustki wzdłuż przewodu jelitowego. Za pomocą bezzębnych kleszczy zaciśnij śledzionę i delikatnie pociągnij do góry. Ostro wypreparuj tkankę więzadła trzustki tylnej aż do głowy trzustki. Następnie odłącz przewód żółciowy i naczynia krwionośne. Usuń tkankę trzustkową z jamy brzusznej i osusz powierzchnię wilgoci papierem chłonnym. Zmierz i zapisz masę tkanki trzustki. Po przygotowaniu skrawków parafiny należy dwukrotnie odwoskować tkanki trzustki w ksylenie przez pięć minut każda. Potraktuj każdą sekcję 100 mikrolitrami proteinazy K i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj wymaganą ilość 3% nadtlenku wodoru do tkanki i inkubuj przez 20 minut, aby w pełni ją zinfiltrować. Przykryj całą powierzchnię próbki 50 mikrolitrami buforu równoważącego i inkubuj przez 10 minut. Następnie dodać 56 mikrolitrów buforu inkubacyjnego TDT do każdej próbki tkanki i inkubować przez jedną godzinę. Przemyć skrawki tkanki czterokrotnie PBS przez pięć minut każda, a następnie inkubować przez 30 minut w 100 mikrolitrach roztworu reakcyjnego Streptawidyna-HRP. W przypadku barwienia DAB dodaj 50 mikrolitrów DAB do każdej sekcji tkanki. Zanurz skrawki w roztworze barwiącym hematoksylinę na trzy do pięciu minut, a następnie spłucz czystą wodą. Odwodnić próbki czterema rundami świeżego bezwodnego etanolu przez pięć minut każdy. Wykonaj badanie histologiczne pod mikroskopem światła białego. Barwienie TUNEL na tkankach trzustki myszy wykazało wzrost martwicy komórkowej w grupie 5 urazów trzustki, ze znacznie wyższymi wartościami skali szarości i dodatnimi wskaźnikami martwicy w porównaniu z innymi grupami. Immunoblotting białkowy ocenił ekspresję kaspazy-3, markera martwicy komórkowej, i wykazał znaczny wzrost w tkankach grupy 5 uszkodzenia trzustki. Cytometria przepływowa zawiesin komórek groniastych trzustki, oznaczona wskaźnikiem CPI Nexin 5, wykazała znacznie wyższy wskaźnik śmiertelności komórek w grupie urazów trzustki 5 w porównaniu z innymi, przy istotności statystycznej.

preparing-mice-model-severe-acute-pancreatitis-via-combination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje procedurę generowania modelu myszy z ostrym żółciowym zapaleniem trzustki poprzez trzustkowy wlew taurocholanu sodu. Model ten pomaga badać zmiany patofizjologiczne wywołane przez taurocholan sodu w trzustce.

Model ostrego żółciowego zapalenia trzustki: metoda generowania mysiego modelu ostrego żółciowego zapalenia trzustki za pomocą infuzji z przewodu trzustkowego

Modele zwierzęce dla ciężkiego ostrego zapalenia trzustki umożliwiają badanie zmian patofizjologicznych na początkowym etapie, ułatwiając obserwację ewolucji zdarzeń zapalnych. Tutaj przedstawiamy protokół indukcji ciężkiego ostrego żółciowego zapalenia trzustki poprzez wsteczny wlew taurocholanu sodu do przewodu trzustkowego znieczulonych myszy C57BL / 6.

Taurocholan sodu wywołał ciężkie ostre zapalenie trzustki u myszy C57BL/6

Przewlekłe zapalenie trzustki (CP) to choroba charakteryzująca się stanem zapalnym i zwłóknieniem trzustki, często związana z nieuleczalnym bólem brzucha. Ten artykuł koncentruje się na udoskonaleniu techniki generowania mysiego modelu CP poprzez infuzję dróg żółciowych z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS).

Mysi model przewlekłego zapalenia trzustki poprzez infuzję TNBS z dróg żółciowych

Mysi model ciężkiego ostrego zapalenia trzustki jest opisany tutaj. Przedstawiona tutaj procedura jest bardzo szybka, prosta i dostępna, co potencjalnie pozwala na badanie mechanizmów molekularnych i różnych interwencji terapeutycznych w ostrym zapaleniu trzustki w wygodny sposób.

Ustanowienie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki przy użyciu wstecznego wstrzyknięcia taurocholanu sodu do przewodu żółciowo-trzustkowego

Niniejszy protokół opisuje nowatorskie podejście do modelowania przewlekłego obturacyjnego zapalenia trzustki, które polega na wizualizacji przewodu trzustkowego oraz elektrokrzepnięciu przewodu trzustkowego w celu spowoduje jego niedrożności.

Model obturacyjnego przewlekłego zapalenia trzustki ustanowiony poprzez elektrokoagulację

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

W niniejszej pracy opisujemy nową metodę monitorowania pobierania i transportu prionów przez komórki odpornościowe bezpośrednio po inokulacji doprzewnowej, polegającą na oczyszczaniu i znakowaniu fluorescencyjnym zagregowanych prętów prionowych z zakażonego materiału mózgowego, a następnie śledzeniu ich pobierania i przemieszczania się z miejsca wstrzyknięcia oraz charakteryzacji komórek pośredniczących w tych zdarzeniach.

Monitorowanie przemieszczania się komórek odpornościowych do fluorescencyjnych pręcików prionowych w godzinach po zakażeniu drogą dosytrychialną

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Obrazowanie multimodalne jest cennym podejściem do badania kolonizacji bakteryjnej w małych modelach zwierzęcych. Protokół ten przedstawia zakażenie myszy bioluminescencyjnym Citrobacter rodentium i podłużne monitorowanie kolonizacji bakteryjnej za pomocą kompozytowej tomografii obrazowania 3D w świetle rozproszonym z obrazowaniem μCT w celu stworzenia filmu 4D infekcji C. rodentium.

Multimodalne obrazowanie 4D zakażeń Citrobacter rodentium u myszy

Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Poznaj nieinwazyjną metodę indukcji ciężkiego ostrego zapalenia trzustki u myszy C57BL/6J za pomocą ceruleiny i LPS. Model ten umożliwia badanie ekspresji genu HMGB1 oraz poszukiwanie nowych celów terapeutycznych.

Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym

Przeglądaj więcej filmów