Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym

Leczenie ciężkiego ostrego zapalenia trzustki jest trudne ze względu na wysoką śmiertelność przy użyciu modeli zwierzęcych, w szczególności myszy z wybranym tłem C57BL/6J. Badamy SAP jako patologiczny w celu identyfikacji celów terapeutycznych i opracowania nowych metod leczenia, dostarczając metodę polimyszy w jednym badaniu SAP.

Badania te wykazały wysoką ekspresję genów HMGB1 uszkadzających zapalenie trzustki, co sugeruje jego związek z kamieniem zapalnym ciężkiego ostrego zapalenia trzustki. Nasz protokół obejmuje ceruleinę w celu wywołania skurczu pęcherzyka żółciowego i zakłócenia postu u myszy, co prowadzi do uszkodzenia tkanki trzustki poprzez blokowanie wydzielania płynu trawiennego. W połączeniu z wstrzyknięciem LPS wywołaliśmy ciężkie zapalenie trzustki z niewydolnością narządów u myszy. Takie podejście jest nieinwazyjne i łatwe do wdrożenia z krótkimi cyklami i wysoką powtarzalnością.

[Demonstrator] Na początek zmierz i zapisz wagę myszy eksperymentalnej. W przypadku dootrzewnowego wstrzyknięcia Caeruleiny należy chwycić i przytrzymać mysz brzuchem do góry i głową umieszczoną niżej niż ogon. Trzymać strzykawkę w prawej ręce i wprowadzić igłę w skórę podskórną po lewej stronie białej linii brzusznej. Przesuń igłę do przodu o około trzy do pięciu milimetrów i włóż ją do jamy brzusznej pod kątem 45 stopni. Trzymać igłę nieruchomo i powoli wstrzykiwać Caeruleinę. Wyciągnąć igłę, a następnie delikatnie wmasować i docisnąć miejsce wstrzyknięcia sterylnym wacikiem, aby całkowicie rozprowadzić lek do jamy brzusznej. 12 godzin po wstrzyknięciu należy umieścić mysz na środku siatki w pudełku doświadczalnym, przodem do osoby przeprowadzającej eksperyment. Włącz oprogramowanie do śledzenia wideo i skonfiguruj monitorowanie dla czterech jednoczesnych pól widzenia. Zaznacz długość i szerokość obiektu eksperymentalnego, który może poruszać się w obrębie pudełka na ekranie monitorowania w czasie rzeczywistym. Rejestruj aktywność myszy przez 15 minut. Zmiany makroskopowe mierzone w modelu myszy z uszkodzeniem trzustki podczas pięciu cykli wykazały, że myszy z grupy urazów trzustki 5 utrzymywały niski poziom odległości ruchu w ciągu trzech minut, podczas gdy współczynnik bezruchu w ciągu trzech minut zwiększał się z każdym kolejnym cyklem. Grupa 5 z urazem trzustki wykazała najmniejszą całkowitą odległość ruchu w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi, a różnica była istotna statystycznie. Z wyjątkiem grupy kontrolnej i urazu trzustki 1, wszystkie grupy wykazały ujemny wzrost masy ciała o wartości D, przy czym grupa 5 urazów trzustki wykazała największą zmianę. Analiza wskaźnika przeżycia wykazała 80% śmiertelność w grupie urazów trzustki 5 do piątego dnia, w przeciwieństwie do innych grup, które nie wykazały znaczącej różnicy w stosunku do grupy kontrolnej. Po 36 godzinach od dootrzewnowego wstrzyknięcia Caeruleiny należy poddać mysz eutanazji i zabezpieczyć ją w pozycji leżącej na piankowej płytce. Wykonaj środkowe nacięcie brzucha i odwróć rurkę jelita cienkiego w prawo, aby odsłonić trzustkę. Odłączyć dwunastnicę i przewód odźwiernika. Zlokalizuj jelito cienkie pod trzustką, a następnie całkowicie uwolnij tkankę trzustki wzdłuż przewodu jelitowego. Za pomocą bezzębnych kleszczy zaciśnij śledzionę i delikatnie pociągnij do góry. Ostro wypreparuj tkankę więzadła trzustki tylnej aż do głowy trzustki. Następnie odłącz przewód żółciowy i naczynia krwionośne. Usuń tkankę trzustkową z jamy brzusznej i osusz powierzchnię wilgoci papierem chłonnym. Zmierz i zapisz masę tkanki trzustki. Po przygotowaniu skrawków parafiny należy dwukrotnie odwoskować tkanki trzustki w ksylenie przez pięć minut każda. Potraktuj każdą sekcję 100 mikrolitrami proteinazy K i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodaj wymaganą ilość 3% nadtlenku wodoru do tkanki i inkubuj przez 20 minut, aby w pełni ją zinfiltrować. Przykryj całą powierzchnię próbki 50 mikrolitrami buforu równoważącego i inkubuj przez 10 minut. Następnie dodać 56 mikrolitrów buforu inkubacyjnego TDT do każdej próbki tkanki i inkubować przez jedną godzinę. Przemyć skrawki tkanki czterokrotnie PBS przez pięć minut każda, a następnie inkubować przez 30 minut w 100 mikrolitrach roztworu reakcyjnego Streptawidyna-HRP. W przypadku barwienia DAB dodaj 50 mikrolitrów DAB do każdej sekcji tkanki. Zanurz skrawki w roztworze barwiącym hematoksylinę na trzy do pięciu minut, a następnie spłucz czystą wodą. Odwodnić próbki czterema rundami świeżego bezwodnego etanolu przez pięć minut każdy. Wykonaj badanie histologiczne pod mikroskopem światła białego. Barwienie TUNEL na tkankach trzustki myszy wykazało wzrost martwicy komórkowej w grupie 5 urazów trzustki, ze znacznie wyższymi wartościami skali szarości i dodatnimi wskaźnikami martwicy w porównaniu z innymi grupami. Immunoblotting białkowy ocenił ekspresję kaspazy-3, markera martwicy komórkowej, i wykazał znaczny wzrost w tkankach grupy 5 uszkodzenia trzustki. Cytometria przepływowa zawiesin komórek groniastych trzustki, oznaczona wskaźnikiem CPI Nexin 5, wykazała znacznie wyższy wskaźnik śmiertelności komórek w grupie urazów trzustki 5 w porównaniu z innymi, przy istotności statystycznej.