Name: Pomiar zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych narażonych na cząstki stałe zawierające węgiel (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych jako biomarker narażenia na cząstki stałe zawierające węgiel. Protokół zapewnia dokładną i niezawodną ocenę indywidualnej ekspozycji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82273669, 82241086, 42207488), Program Stypendialny Taishan w prowincji Shandong (nr tsqn202211121) oraz Program Innowacji i Technologii dla Doskonałych Młodych Stypendystów Szkolnictwa Wyższego Prowincji Shandong (2022KJ295).

Badanie otrzymało zgodę Komisji Etyki Medycznej Instytutu Zdrowia Zawodowego i Kontroli Zatruć, Chińskiego Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (NIOHP201604), z pisemną świadomą zgodą uzyskaną od wszystkich uczestników przed badaniem i pobraniem próbek biologicznych. Do tego badania wybrano osoby pakujące sadzę, które pracowały w fabryce sadzy przez ponad 1 rok i były narażone na działanie aerozoli sadzy. Pracownicy wodociągów w fabryce wodociągów, którzy nie byli narażeni znacząco zawodowo na czynniki szkodliwe, zostali zrekrutowani z okolicy jako populacja kontrolna w celu przeprowadzenia badania. Dla badanej populacji wybrano następujące kryteria włączenia i wyłączenia: Kryteria włączenia dla pakowaczy sadzy obejmowały bezpośredni kontakt z sadzą podczas większości zmian oraz minimum roczną pracę w obszarze ekspozycji na sadzę. Uwzględniono pracowników wodociągów, którzy nie byli narażeni zawodowo na sadzę lub inne zanieczyszczenia w swoim środowisku pracy. Kryteria wykluczenia obejmowały pracowników cierpiących na choroby przewlekłe, takie jak rak, osoby, które zostały poddane ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie w ciągu ostatnich trzech miesięcy, osoby z historią gruźlicy płuc, chirurgii płuc, wirusowego zapalenia mięśnia sercowego, wrodzonej wady serca, niedawnej gorączki lub stanu zapalnego oraz pracownicy, którzy niedawno przyjmowali antybiotyki. Odczynniki i sprzęt używany w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Konserwacja plwociny
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór utrwalający, wykonując poniższe czynności:
	<ol>
		<li>Rozpuść 2% glikolu polietylenowego (PEG1500) w łaźni wodnej. Weź 20 ml stopionego PEG1500 do probówki wirówkowej. Dodaj 20 ml 50% etanolu do probówki wirówkowej i dokładnie wstrząśnij mieszaniną, aby uzyskać ług macierzysty.</li>
		<li>Stopniowo wlewać 40 ml roztworu macierzystego do 960 ml 50% etanolu. Dobrze wstrząsnąć roztworem, aby powstał roztwór utrwalający Saccomanno. Roztwór należy przechowywać w chłodnym, ciemnym miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 20-30 ml przygotowanego roztworu utrwalającego do probówki wirówkowej zawierającej około 2 ml plwociny. Dokładnie wymieszaj zawartość. 
	UWAGA: Upewnij się, że całkowita objętość nie przekracza 40 ml.</li>
	<li>Uszczelnij probówkę wirówkową folią uszczelniającą. Przechowuj go w chłodnym, ciemnym miejscu. Przetransportuj probówkę do laboratorium w celu dalszego przetwarzania, gdy będzie gotowa. 
	UWAGA: Zawsze rozpuść PEG1500 w łaźni wodnej i stosuj zgodnie z przepisaną dawką.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny komórkowej w plwocinie
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór trawienny, rozpuszczając 0,1 g ditiotreitolu w 100 ml soli fizjologicznej zgodnie z rzeczywistą dawką. Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C do 48 godzin.</li>
	<li>Odwirować probówkę zawierającą plwocinę o stężeniu 1,998 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Dodać równą objętość trawionej plwociny do osadu. Zmieszaj i dokładnie wstrząśnij mieszaniną.
	<ol>
		<li>Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego upłynnienia (10-15 min). 
		UWAGA: Ciągle potrząsaj rurką podczas procesu skraplania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltrować płynną mieszaninę za pomocą membrany filtracyjnej o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowany roztwór o sile 500 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, zatrzymując osad komórkowy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze fosforanowym Duchenne'a. Odwirować ponownie zawieszony roztwór o sile 500 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania czystego osadu komórkowego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie rozmazu komórkowego
<ol>
	<li>Dodać 200-600 μl buforu fosforanowego do osadu komórkowego. Dokładnie wymieszaj zawartość; Dostosuj objętość bufora na podstawie wyników zliczania komórek (celuj w >1.0 × 105 komórek).</li>
	<li>Weź 20 μl zawiesiny komórkowej i utwórz rozmaz komórkowy za pomocą metody hematokrytu17.</li>
	<li>Pozostaw rozmazany do naturalnego wyschnięcia na powietrzu (w ciągu 48 godzin). Utrwal rozmaz dostępnym w handlu roztworem barwiącym na 10 s.</li>
	<li>Zanurz rozmaz w roztworze barwiącym na 8 sekund. Podczas barwienia delikatnie podnieś szkiełko w górę i w dół, a nadmiar plamy spłucz pod bieżącą wodą.</li>
	<li>Plamić rozmaz w roztworze barwiącym B przez 8 s. Podczas barwienia podnieść szkiełko i spłukać nadmiar plamy pod bieżącą wodą. 
	UWAGA: Roztwory barwiące A i B są dostępne w dostępnym na rynku zestawie do barwienia.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w bezwodnym etanolu dwukrotnie, za każdym razem na 2-3 s.</li>
	<li>Po wyschnięciu nałóż odpowiednią ilość neutralnej gumy. Uszczelnij szkiełko za pomocą szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
4. Analiza ilościowa CCAM
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu świetlnego z obiektywem z soczewką olejową 100x. Uchwyć obrazy losowo wybranych, dobrze wybarwionych i morfologicznie nienaruszonych makrofagów. Wykonaj losowo 50 zdjęć makrofagów dla każdej próbki.</li>
	<li>Przeprowadź analizę obrazu w oprogramowaniu Image J, wykonując poniższe czynności:
	<ol>
		<li>Zmierz skalę i określ rzeczywistą długość oraz konwersję piksel na piksel (282 piksele = 10 μm). Ustaw skalę w Obraz J (Analizuj > Ustaw skalę), wprowadź Odległość w pikselach, Długość rzeczywista, Jednostka długości (μm) i zaznacz Globalny.</li>
		<li>Użyj nieregularnego kształtu, aby obrysować komórki. Usuń tło (zaznaczenia odręczne, Edycja > Wyczyść na zewnątrz). Zmierz całkowitą powierzchnię komórek (Analizuj > pomiar).</li>
		<li>Wytnij jądro (Edytuj > Wytnij). Konwertuj obraz w skali szarości na czarno-biały (Typ obrazu > > 8 bitów).</li>
		<li>Dostosuj wartość skali szarości specyficzną dla każdego barwienia komórek, aby uzyskać dokładne zliczanie cząstek węgla (Obraz > Dostosuj próg >> Zastosuj, Analizuj >> pomiarze).</li>
		<li>Oblicz zawartość węgla w 50 makrofagach na próbkę na podstawie zmierzonego obszaru i analizy obrazu w oprogramowaniu Image J.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Quantifying Carbon in Pulmonary Macrophages via Induced Sputum Analysis

<ol><li>Münzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+stressors+and+cardio-metabolic+disease%3A+part+I-epidemiologic+evidence+supporting+a+role+for+noise+and+air+pollution+and+effects+of+mitigation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies.</a> Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).</li>
<li>Guarnieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+function+in+rural+Guatemalan+women+before+and+after+a+chimney+stove+intervention+to+reduce+wood+smoke+exposure%3A+results+from+the+randomized+exposure+study+of+pollution+indoors+and+respiratory+effects+and+chronic+respiratory+effects+of+early+childhood+exposure+to+respirable+particulate+matter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Lung function in rural Guatemalan women before and after a chimney stove intervention to reduce wood smoke exposure: results from the randomized exposure study of pollution indoors and respiratory effects and chronic respiratory effects of early childhood exposure to respirable particulate matter study.</a> Chest. 148 (5), 1184-1192 (2015).</li>
<li>Khomenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+mortality+due+to+air+pollution+in+European+cities%3A+a+health+impact+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Planet+Health%22%5BJournal%5D)">Premature mortality due to air pollution in European cities: a health impact assessment.</a> Lancet Planet Health. 5 (3), e121-e134 (2021).</li>
<li>Kulkarni, N., Pierse, N., Rushton, L., Grigg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+in+airway+macrophages+and+lung+function+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Carbon in airway macrophages and lung function in children.</a> N Engl J Med. 355 (1), 21-30 (2006).</li>
<li>Krzyzanowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+air+quality+guidelines+for+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Toxicol+Environ+Health+A%22%5BJournal%5D)">WHO air quality guidelines for Europe.</a> J Toxicol Environ Health A. 71 (1), 47-50 (2008).</li>
<li>Cohen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+and+25-year+trends+of+the+global+burden+of+disease+attributable+to+ambient+air+pollution%3A+An+analysis+of+data+from+the+Global+Burden+of+Diseases+Study+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Estimates and 25-year trends of the global burden of disease attributable to ambient air pollution: An analysis of data from the Global Burden of Diseases Study 2015.</a> Lancet. 389 (10082), 1907-1918 (2017).</li>
<li>Hajat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+long-term+air+pollution+and+urinary+catecholamines%3A+Evidence+from+the+multi-ethnic+study+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">The association between long-term air pollution and urinary catecholamines: Evidence from the multi-ethnic study of atherosclerosis.</a> Environ Health Perspect. 127 (5), 57007(2019).</li>
<li>Traffic-related air pollution: A critical review of the literature on emissions, exposure, and health effects. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health">https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health</a> (2010).</li>
<li>Uccelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+lung+cancer+mortality+and+long-term+exposure+to+particulate+matter+in+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Public+Healt.h%22%5BJournal%5D)">Female lung cancer mortality and long-term exposure to particulate matter in Italy.</a> Eur J Public Healt.h. 27 (1), 178-183 (2017).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoor+particulate+matter+in+urban+households%3A+sources%2C+pathways%2C+characteristics%2C+health+effects%2C+and+exposure+mitigation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Indoor particulate matter in urban households: sources, pathways, characteristics, health effects, and exposure mitigation.</a> Int J Environ Res Public Health. 18 (21), 11055(2021).</li>
<li>Wang, K., Zeng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cough+and+expectoration%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Cough and expectoration.</a> Handbook of Clinical Diagnostics. , 27-29 (2020).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+exogeneous+fine+particles+from+the+lung+into+the+brain+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Passage of exogeneous fine particles from the lung into the brain in humans and animals.</a> PNAS. 119 (26), e2117083119(2022).</li>
<li>Comunian, S., Dongo, D., Milani, C., Palestini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+and+COVID-19%3A+The+role+of+particulate+matter+in+the+spread+and+increase+of+COVID-19%27s+morbidity+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Air pollution and COVID-19: The role of particulate matter in the spread and increase of COVID-19's morbidity and mortality.</a> Int J Environ Res Public Health. 17 (12), 4487(2020).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+mitochondria+in+airborne+particulate+matter-induced+immunotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Emerging role of mitochondria in airborne particulate matter-induced immunotoxicity.</a> Environ Pollut. 270, 116242(2021).</li>
<li>Uribe-Querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+Our+current+understanding+of+a+universal+biological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process.</a> Front Immunol. 11, 1066(2020).</li>
<li>Kupiainen, K., Klimont, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+emissions+of+fine+carbonaceous+particles+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Primary emissions of fine carbonaceous particles in Europe.</a> Atmos Environ. 41 (10), 2156-2170 (2007).</li>
<li>Tueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+smear+and+PCR+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+culture+positive+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Value of smear and PCR in bronchoalveolar lavage fluid in culture positive pulmonary tuberculosis.</a> Eur Respir J. 26 (5), 767-772 (2005).</li>
<li>Takiguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+with+reduced+expressions+of+classical+M1+and+M2+surface+markers+in+human+bronchoalveolar+lavage+fluid+exhibit+pro-inflammatory+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Macrophages with reduced expressions of classical M1 and M2 surface markers in human bronchoalveolar lavage fluid exhibit pro-inflammatory gene signatures.</a> Sci Rep. 11 (1), 8282(2021).</li>
<li>Andelid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+macrophages+drive+mucus+production+and+steroid-resistant+inflammation+in+chronic+bronchitis%5BTitle%5D)+AND+%22Resp+Res%22%5BJournal%5D)">Lung macrophages drive mucus production and steroid-resistant inflammation in chronic bronchitis.</a> Resp Res. 22 (1), 172(2021).</li>
<li>Weiszhar, Z., Horvath, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+analysis%3A+Step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respiratory+Soc%22%5BJournal%5D)">Induced sputum analysis: Step by step.</a> Eur Respiratory Soc. 9, 300-306 (2013).</li>
<li>Popov, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+technical+factors+influencing+the+induction+of+sputum+for+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis.</a> Eur Respir J. 8 (4), 559-565 (1995).</li>
<li>Sumner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+objective+cough+frequency+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Predictors of objective cough frequency in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 943-949 (2013).</li>
<li>Brugha, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+in+airway+macrophages+from+children+with+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Carbon in airway macrophages from children with asthma.</a> Thorax. 69 (7), 654-659 (2014).</li>
<li>Simpson, J. L., Timmins, N. L., Fakes, K., Talbot, P. I., Gibson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+saliva+contamination+on+induced+sputum+cell+counts%2C+IL-8+and+eosinophil+cationic+protein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Effect of saliva contamination on induced sputum cell counts, IL-8 and eosinophil cationic protein levels.</a> Eur Respir J. 23 (5), 759-762 (2004).</li>
<li>Risse, E. K., Van't Hof, M. A., Laurini, R. N., Vooijs, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+cytology+by+the+Saccomanno+method+in+diagnosing+lung+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Sputum cytology by the Saccomanno method in diagnosing lung malignancy.</a> Diagn Cytopathol. 1 (4), 286-291 (1985).</li>
<li>Eells, T. P., Pratt, D. S., Coppolo, D. P., Alpern, H. D., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+cell+recovery+following+bronchial+brushing%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">An improved method of cell recovery following bronchial brushing.</a> Chest. 93 (4), 727-729 (1988).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+content+in+blood+and+carbon+load+in+airway+macrophages.+A+panel+study+in+elderly+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA content in blood and carbon load in airway macrophages. A panel study in elderly subjects.</a> Environ Int. 119, 47-53 (2018).</li>
<li>Jary, H., Rylance, J., Patel, L., Gordon, S. B., Mortimer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+analysis+of+airway+macrophage+particulate+load+from+induced+sputum%2C+a+potential+biomarker+of+air+pollution+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulm+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the analysis of airway macrophage particulate load from induced sputum, a potential biomarker of air pollution exposure.</a> BMC Pulm Med. 15, 1-9 (2015).</li>
<li>Gilbert, D. F., Meinhof, T., Pepperkok, R., Runz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DetecTiff%3A+A+novel+image+analysis+routine+for+high-content+screening+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">DetecTiff: A novel image analysis routine for high-content screening microscopy.</a> J Biomol Screen. 14 (8), 944-955 (2009).</li>
<li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+occupational+exposure+to+carbon+black+on+peripheral+white+blood+cell+counts+and+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Effects of occupational exposure to carbon black on peripheral white blood cell counts and lymphocyte subsets.</a> Environ Mol Mutagen. 57 (8), 615-622 (2016).</li>
<li>Cheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+content+in+airway+macrophages+and+genomic+instability+in+Chinese+carbon+black+packers%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Carbon content in airway macrophages and genomic instability in Chinese carbon black packers.</a> Arch Toxicol. 94 (3), 761-771 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W pracy przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dotyczący wykorzystania indukowanego CCAM pochodzącego z plwociny jako markera biologicznego wewnętrznego narażenia na pył zawieszony w atmosferze. CCAM można wykryć i określić ilościowo za pomocą mikroskopii optycznej, służąc jako precyzyjny biomarker ekspozycji wewnętrznej odzwierciedlający związek ze skutkami zdrowotnymi. W związku z tym istnieje potrzeba ustanowienia i optymalizacji wygodnej, niezawodnej i wydajnej metody indukowanego przechowywania plwociny oraz metody kwantyfikacji CCAM w celu standaryzacji procedur metodologicznych.
Oznaczanie zawartości węgla w makrofagach płucnych obejmuje kilka etapów, w tym pobieranie makrofagów płucnych, rozmazywanie, barwienie, fotografowanie i analizę obrazu. Obecnie istnieją dwie metody pobierania makrofagów płucnych: plwocina indukowana i płukanie płuc, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia18,19. Płukanie płuc może dać wiele jednorodnych makrofagów płucnych, ale jest to traumatyczna metoda pobierania próbek, która wymaga znieczulenia i innych schorzeń. Dlatego nie nadaje się do pobierania próbek populacji ogólnej na dużą skalę. Natomiast plwocina indukowana jest łatwa do wykonania, nieinwazyjna i nadaje się do pobierania próbek na dużą skalę w populacji ogólnej. Pozwala również na uzyskanie powtórnych próbek. Płukanie płuc pozyskuje makrofagi z pęcherzyków płucnych lub dystalnych oskrzelików, podczas gdy indukowana plwocina uzyskuje makrofagi, które mogą pochodzić z dróg oddechowych. W tym badaniu przeprowadziliśmy indukowaną plwocinę zgodnie ze standardowym protokołem opublikowanym przez Europejskie Towarzystwo Chorób Układu Oddechowego20.
Na powodzenie indukowanej plwociny wpływają różne czynniki, w tym stężenie wdychanej soli fizjologicznej w nebulizacji oraz obecność chorób układu oddechowego u pacjenta 21,22,23. Próbki plwociny mogą również zawierać ślinę, która może zakłócać pomiar zawartości węgla w makrofagach, potencjalnie zmniejszając liczbę makrofagów dróg oddechowych w próbce24. Procedury operacyjne w tym badaniu były ustandaryzowane, metody były proste, a odtwarzalność wysoka. Zaobserwowano, że czynniki takie jak wielkość natężenia przepływu inhalacji w nebulizacji, adekwatność czasu indukcji oraz obecność przerw podczas indukcji wpływały na wskaźnik powodzenia indukowanej plwociny. Rozważania te są ważne dla zapewnienia dokładnego i wiarygodnego pomiaru CCAM jako biomarkera narażenia na cząstki stałe.
Roztwór utrwalający Saccomanno, składający się z 50% etanolu i 2% glikolu polietylenowego, jest zwykle stosowany jako utrwalacz do konserwacji próbek biologicznych, takich jak płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. W tym badaniu, po raz pierwszy, ten roztwór utrwalający został wykorzystany do konserwacji plwociny uzyskanej z epidemiologicznych badań terenowych. Wyniki były zgodne z późniejszą kwantyfikacją węgla w makrofagach, podobną do przechowywania komórek plwociny rano w celu uzyskania wyraźnych rozmazów komórek rakowych25. Procedury operacyjne były ustandaryzowane, metody proste, a odtwarzalność wysoka. Zalety indukowanego przechowywania plwociny w tym badaniu obejmują (1) łatwą konfigurację utrwalacza, (2) do konserwacji nie jest potrzebne chłodzenie, co jest wygodne w przypadku badań epidemiologicznych na dużą skalę, oraz (3) próbki można przechowywać w chłodnym miejscu z dala od światła. Wyraźny widok pod mikroskopem po barwieniu, z możliwymi do zidentyfikowania jądrami, minimalnymi zanieczyszczeniami i pełną morfologią komórki. Jest to lepsze niż bezpośrednie przetwarzanie plwociny i nakładanie rozmazu pod względem morfologii26.
Jeśli chodzi o metody eksperymentalne, zwrócono uwagę na następujące szczegóły: Plwocina była okresowo wstrząsana podczas trawienia w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż do całkowitego upłynnienia. Po skropleniu przeprowadzono filtrację na membranie 70 μm przed odwirowaniem w celu usunięcia zanieczyszczeń w celu uzyskania bardziej przejrzystego tła barwiącego. Osady komórkowe ponownie przemyto DPBS przed rozsmarowaniem na szkiełkach. Nadmiar płynu został usunięty podczas barwienia poprzez umycie szkiełek pod bieżącą wodą. Uchwyty szkiełek zostały zmienione między plamą I a plamą II, aby zapobiec pozostawianiu śladów. Do fotografii losowo wybrano makrofagi o pełnej morfologii i dobrym barwieniu, co wpłynęło na kwantyfikację CCAM27.
Opcje oprogramowania do analizy ilościowej dla tego badania obejmują Image SXM i Image J28. Obraz SXM wymaga ręcznej edycji obrazu przed analizą w celu zwiększenia dokładności, co znacznie wydłuża wymagany czas. Jest również ograniczony do przetwarzania pojedynczego typu komórki. W przeciwieństwie do tego, oprogramowanie Image J użyte w tym badaniu oferuje lepszą specyficzność w przetwarzaniu obrazu i szerszą kompatybilność. W innych dyscyplinach metody mikroskopii przesiewowej o wysokiej zawartości zostały wykorzystane do selekcji, a następnie analizy komórek znakowanych fluorescencyjnie, co pozwoliło na zautomatyzowanie operacji o wysokiej przepustowości. Przyszły kierunek badań metodologicznych może obejmować opracowanie zautomatyzowanego znakowania makrofagów w plwocinie i procedurach przesiewowych29. Podczas przetwarzania obrazu J czynniki wpływające na pomiar CCAM obejmują wiedzę mierzącego na temat informacji o próbce oraz określenie progów wartości w skali szarości. Przyjęcie ślepego podejścia może zmniejszyć stronniczość obserwatora, a niektóre próbki mogą wymagać wielokrotnych pomiarów w celu oceny odtwarzalności. Niezależne przechwytywanie i analiza obrazu przez dwie osoby posiadające specjalistyczną wiedzę na wysokim poziomie może zwiększyć dokładność identyfikacji makrofagów.
W badaniu wykorzystano standardowe metody Narodowego Instytutu Bezpieczeństwa i Zdrowia w Pracy (NIOSH) w celu oceny narażenia badanych na pył zawieszony w miejscu pracy. Przeprowadzono wiele ocen poziomów drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) i zawartości węgla pierwiastkowego (EC) związanego z PM2,5 w obszarze pakowania sadzy oraz w obszarach roboczych pracowników zakładu wodnego grupy kontrolnej. Aż 99,6% cząstek sadzy (CB) miało średnicę aerodynamiczną mniejszą niż 2,5 μm, a 96,7% było mniejszych niż 1,0 μm. Jesienią 2012 r. średni poziom PM2,5 w pakowni CB wynosił 800 mikrogramów na metr sześcienny, przy czym poziom EC związany z PM2,5 wynosił 657,0 mikrogramów na metr sześcienny30,31. Jesienią 2018 r. średnia geometryczna CB wynosiła 637,4 μg/m3, a poziom EC związany z PM2,5 wynosił 364,6 μg/m3. W obu obserwacjach stosunek EC/TC przekroczył 92,5%, co jest zgodne z faktem, że CB to prawie czyste EC. Tak więc z tego badania można wywnioskować, że cząsteczki węgla w makrofagach pochodzą głównie z ekspozycji na sadzę 30,31. W rezultacie stężenie PM2,5 w środowisku pracy populacji narażonej na działanie sadzy w tym badaniu wynosiło 637,4 μg/m3, czyli było znacznie wyższe niż stężenie PM2,5 w środowisku pracy populacji kontrolnej (130,0 μg/m3) i około pięciokrotnie wyższe niż w populacji kontrolnej. Poziom węgla pierwiastkowego w populacji narażonej na działanie sadzy wynosił 364,6 μg/m3, znacznie wyższy niż 2,0 μg/m3 w populacji kontrolnej.
Podsumowując, w badaniu tym wykorzystano plwocinę wywołaną hipertonicznym roztworem soli fizjologicznej do pobrania próbek, uzyskania makrofagów płucnych, wykonania rozmazów komórkowych i ilościowego określenia zawartości węgla w 50 makrofagach, używając mediany liczby do przedstawienia poziomu zawartości węgla w makrofagach dla każdej osoby. Ta metodologia badawcza może być dostosowana do dużych próbek populacyjnych i wykorzystana do dokładnej oceny poziomu wewnętrznego narażenia danej osoby na cząstki stałe.

Zanieczyszczenie powietrza atmosferycznego wiąże się ze zgonami z powodu chorób układu oddechowego i sercowo-naczyniowego, stanowiąc poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego1,2. Dane epidemiologiczne wskazują, że przewlekłe narażenie na pył zawieszony o średnicy mniejszej lub równej 2,5 μm (PM2,5) jest odpowiedzialne za przedwczesne zgony od 4 do 9 milionów ludzi na całym świecie. PM2,5 został uznany za piąty najważniejszy czynnik ryzyka globalnej śmiertelności w badaniu Global Burden of Disease, Injuries, and Risk Factors Study (GBD) z 2015 r.3,4,5,6. Badania wykazały, że przestrzeganie wytycznych WHO dotyczących zanieczyszczenia powietrza może zapobiec 51 213 zgonom rocznie z powodu narażenia na PM2,53. Obecnie w większości badań brakuje oceny narażenia wewnątrzosobniczego i opierają się one jedynie na surowych ocenach w większych regionalnych punktach monitorowania, które są dalekie od indywidualnych poziomów narażenia. Dostępne biomarkery narażenia wewnętrznego, takie jak WWA z moczem i benzo(a)piren, nie odzwierciedlają związku między narażeniem na cząstki stałe a skutkami zdrowotnymi7,8,9. Prowadzi to do niemożności ustalenia dokładnej zależności od skutków zdrowotnych. W związku z tym poszukiwanie markerów, które odzwierciedlają poziom narażenia na pył zawieszony u danej osoby, jest jednym z kluczy do dokładnej oceny narażenia u danej osoby.
Cząsteczki wdychane do oskrzeli mogą być wydalane wraz z plwociną poprzez oscylacje rzęskowe w oskrzelach. Brak systemu transportu przepływu śluzu rzęskowego w pęcherzykach płucnych oznacza, że główną drogą klirensu dla cząstek dostających się do pęcherzyków płucnych jest fagocytoza i translokacja przez makrofagi10,11. Opierając się na budowie anatomicznej płuc, usuwanie nierozpuszczalnych cząstek obcych jest powolne. Dzięki temu cząstki stałe mogą wchodzić w interakcje z komórkami płuc przez dłuższy czas i inicjować różne efekty biologiczne, powodując uszkodzenia tkanki płucnej i innych narządów12,13. Stymulacja przez cząstki stałe prowadzi do aktywacji makrofagów, wywołując kaskadę czynników zapalnych w płucach, które mogą powodować ogólnoustrojową reakcję zapalną14. Biorąc pod uwagę kluczową rolę cytofagii makrofagów w wywoływaniu burz cytokin w płucach, teoretyzuje się, że cząsteczki węgla z makrofagów płucnych mogą odzwierciedlać biologicznie skuteczną dawkę ekspozycji na cząstki stałe w powietrzu jądrzaste węglem15. Ponadto, ponieważ w komórkach ssaków nie dochodzi do agregacji węgla elementarnego, a cząstki zawierające węgiel można obserwować jako czarne cząstki stałe pod mikroskopem świetlnym, zbiór makrofagów pęcherzykowych i oskrzelowych oraz pomiar zawartości węgla w nich może służyć jako marker do oceny narażenia na cząstki stałe16.
To badanie zidentyfikowało metodę dokładnej oceny indywidualnych poziomów narażenia na pył zawieszony, znaną jako Zawartość Węgla w Makrofagach Dróg Oddechowych (CCAM). W szczególności próbki plwociny populacyjnej pobrano po tym, jak uczestnicy wdychali hipertoniczną sól fizjologiczną generowaną przez nebulizator ultradźwiękowy. Próbki te zostały następnie zakonserwowane za pomocą roztworu utrwalającego. Makrofagi dróg oddechowych wyizolowano, zabarwiono i sfotografowano pod mikroskopem świetlnym w celu zidentyfikowania makrofagów zawierających cząstki zawierające węgiel, które następnie określono ilościowo. Metoda ta zapewnia biologiczny marker do dokładnej oceny indywidualnych poziomów narażenia na pył zawieszony. Ustanawia on podstawy metodologiczne do badania związku między narażeniem na pył zawieszony a skutkami zdrowotnymi, służąc jako podstawa badawcza do badania powiązań między narażeniem na pył zawieszony a skutkami zdrowotnymi, takimi jak choroby płuc.

<table><tbody><tr><td>3 ml sterylne słomki</td><td>Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD</td><td>84202ES03</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Bezwzględny alkohol etylowy</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Olejek cedrowy</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD</td><td>C805296</td><td></td></tr><tr><td>Szybkie barwienie rozwiązanie</td><td>Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD</td><td>40748ES76</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Solebo Bio Co., LTD</td><td>D8220</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Duchenne'a (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Olympus Corporation of Japan</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna guma drzewna</td><td>Solebo Bio Co., LTD</td><td>G8590</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa membrana filtracyjna 70um</td><td>BD Falcon Bioscience, USA</td><td>211755</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Olympus Corporation of Japan</td><td>BX60</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>SL40R</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko wiskotyczne</td><td>Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co., LTD</td><td></td><td></td>188105</tr></tbody></table>

pomiar zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych narażonych na cząstki stałe zawierające węgiel

Measuring Carbon Content in Airway Macrophages Exposed to Carbon-Containing Particulate Matters

Makrofagi płucne wykazują zależny od dawki wzór w cząsteczkach fagocytyzujących. Po pochłonięciu makrofagi te są następnie wydalane z plwociną, dzięki czemu makrofagi i cząstki stają się widoczne i możliwe do zmierzenia pod mikroskopem świetlnym. Warto zauważyć, że węgiel elementarny w ciele ssaków pochodzi wyłącznie z zanieczyszczeń zewnętrznych. W związku z tym zawartość węgla w makrofagach dróg oddechowych (CCAM) służy jako ważny biomarker narażenia, dokładnie szacujący indywidualne narażenie na cząstki stałe (PM) zawierające węgiel. W tym artykule przedstawiono protokół obejmujący pobieranie, konserwację, przetwarzanie, przygotowywanie i barwienie szkiełka, a także pozyskiwanie i analizę zdjęć makrofagów. Po usunięciu jąder makrofagów obliczono proporcję obszaru cytoplazmy zajmowanego przez cząstki węgla (PCOC) w celu ilościowego określenia zawartości węgla w każdym makrofagu. Wyniki wskazują na podwyższony poziom CCAM po ekspozycji na PM zawierający węgiel. Podsumowując, ta nieinwazyjna, precyzyjna, niezawodna i ustandaryzowana metoda umożliwia bezpośredni pomiar cząstek węgla w komórkach docelowych i jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania na dużą skalę poszczególnych CCAM za pomocą indukowanej plwociny.

Plwocina, utrwalona i przetworzona za pomocą roztworu utrwalającego, wykazała nienaruszoną morfologię makrofagów podczas badania morfologicznego pod mikroskopem optycznym. Makrofagi posiadały wyraźne, okrągłe lub nerkowate, łatwo barwiące się jądra komórkowe. Po barwieniu jądra komórkowe miały kolor niebiesko-fioletowy, natomiast cytoplazma była jasnoróżowa lub jasnoniebieska. W polu widzenia mikroskopu występowały minimalne zanieczyszczenia, co ułatwiło identyfikację komórek. Wewnątrz komórek wyraźnie widoczne były czarne cząsteczki węgla w postaci małych agregatów, co umożliwiło ilościową analizę cząsteczek węgla.
Reprezentatywne obrazy makrofagów z plwociny przedstawiono na Rysunku 1, ukazując różną liczbę cząsteczek węgla w poszczególnych komórkach. Na przykład Rysunek 1A nie wykazuje obecności cząsteczek węgla, podczas gdy na Rysunku 1D widoczne jest ich najwyższe stężenie. Wartości CCAM dla makrofagów (A-D) wyniosły odpowiednio 0.00%, 2.24%, 6.64% oraz 34.61%. Podczas procesu wyznaczania parametru CCAM przeprowadzono ilościową ocenę zawartości węgla w każdym makrofagu, aby zminimalizować błędy wynikające z różnic w wielkości makrofagów oraz nakładania się cząsteczek węgla na jądra komórkowe. Obliczenia i analiza CCAM zostały wykonane dla 50 makrofagów na każdego badanego obiektu, co przedstawiono na Rysunku 2.
W badaniu wybrano pracowników pakujących sadzę techniczną (CBP) z konkretnej fabryki sadzy acetylenowej jako grupę eksponowaną oraz pracowników pomp wodnych z lokalnych wodociągów, którzy nie byli narażeni zawodowo na szkodliwe czynniki, jako grupę kontrolną (Non-CBP). Wyniki przedstawione na Rysunku 2 wskazują na wyższy poziom CCAM u pracowników pakujących sadzę techniczną w porównaniu z grupą kontrolną.
<img alt="Obraz mikroskopowy barwionych komórek, przedstawiający morfologię komórkową w skali 10 μm do badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66781/66781fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obraz mikroskopii optycznej przedstawiający cząsteczki węgla w makrofagach dróg oddechowych. Czarny kolor w cytoplazmie reprezentuje cząsteczki węgla. Panele (A-D) przedstawiają reprezentatywne obrazy makrofagów dróg oddechowych, z których każdy wykazuje inny poziom CCAM. Wartości CCAM dla makrofagów w (A-D) wynosiły odpowiednio 0.00%, 2.24%, 6.64% i 34.61%. Najwyższy poziom CCAM zaobserwowano w (D). Paski skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66781/66781fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy porównujący poziomy CCAM między grupami Non-CBP i CBP, wykazujący istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66781/66781fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ilościowe poziomy CCAM w populacji. Do analizy i kwantyfikacji na każdego badanego podmiotu losowo wybrano pięćdziesiąt makrofagów o nienaruszonym cytoplazmie i prawidłowym barwieniu. Dane przeanalizowano za pomocą testu t Studenta: *P &lt; 0,05. CBP: pakowacze sadzy węglowej; Non-CBP: grupa kontrolna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66781/66781fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół eksperymentalny do pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych w celu oceny dawki ekspozycji wewnętrznej na poziomie indywidualnej ekspozycji na cząstki stałe.

Pomiar zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych narażonych na cząstki stałe zawierające węgiel

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with ...

Zakres naszych badań obejmuje opracowanie i walidację nieinwazyjnej metody pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych jako biomarkera narażenia na pył zawieszony zawierający węgiel. Naszym celem jest określenie dokładności i wiarygodności tej metody indywidualnych ocen narażenia na dużą skalę. Nasz protokół zapewnia nieinwazyjną, precyzyjną, ustandaryzowaną metodę pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych.Jako biomarker narażenia wewnętrznego jest to skutecznie i dokładnie indywidualne narażenie na cząstki stałe zawierające węgiel. Nasz protokół oferuje bezpośredni, niezawodny biomarker dla indywidualnego narażenia na cząstki stałe zawierające węgiel. Metoda ta pozwala na ilościowe oznaczanie na dużą skalę przy użyciu plwociny indukowanej, zwiększając zarówno dokładność, jak i niezawodność w porównaniu z innymi technikami.Zacznij od pobrania dwumililitrowej próbki plwociny do probówki wirówkowej. Następnie dodaj do probówki od 20 do 30 mililitrów przygotowanego roztworu utrwalającego i dokładnie wymieszaj zawartość. Aby przygotować roztwór trawienny do zawiesiny komórek, rozpuść 0,1 grama ditiotreitolu w 100 mililitrach soli fizjologicznej, zgodnie z wymaganą dawką.Teraz odwiruj probówkę zawierającą plwocinę o stężeniu 1 998 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odrzucić supernatant. Dodać równą objętość trawionej plwociny do osadu.Zmieszaj i dokładnie wstrząśnij mieszaniną. Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza aż do całkowitego upłynnienia. Następnie przefiltrować płynną mieszaninę za pomocą membrany filtracyjnej o średnicy 70 mikrometrów.Odwirować przefiltrowany roztwór o sile 500 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć supernatant, utrzymując osad komórkowy. Teraz ponownie zawieś osad komórkowy w buforze fosforanowym Duchenne'a.Odwirować roztwór o sile 500 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać czysty osad komórkowy. W celu przygotowania rozmazu komórkowego dodaj od 200 do 600 mikrolitrów buforu fosforanowego do osadu komórkowego i dokładnie wymieszaj. Następnie weź 20 mikrolitrów zawiesiny komórek i utwórz rozmaz komórek.Utrwal wysuszony rozmaz dostępnym w handlu roztworem barwiącym na 10 sekund. Następnie zanurz rozmaz w roztworze barwiącym A na osiem sekund. Podczas barwienia delikatnie podnieś szkiełko w górę i w dół, a następnie spłucz nadmiar plamy pod bieżącą wodą.W komórkach zaobserwowano małe agregaty wyraźnie widocznych cząstek sadzy, różniące się ilością cząstek węgla. Na początek zobrazuj zabarwione szkiełka plwociny pod mikroskopem. Losowo wybierz dobrze wybarwione i morfologicznie nienaruszone makrofagi i uchwyć ich obrazy.Korzystając z oprogramowania ImageJ, zmierz skalę, aby uzyskać dokładną konwersję pikseli. Wybierz opcję Measure (Miara) i kliknij przycisk Set Scale (Ustaw skalę). Wprowadź Odległość w pikselach, długość rzeczywistą i Jednostkę długości (mikrometry).Następnie zaznacz opcję Globalne. Teraz obrysuj komórki o nieregularnym kształcie i usuń tło za pomocą odręcznych zaznaczeń. W obszarze Edycja wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz.Zmierz całkowitą powierzchnię komórek za pomocą funkcji Analizuj i mierz. Wytnij jądro za pomocą Edytuj i wytnij. Aby przekonwertować obraz w skali szarości na czarno-biały.Kliknij opcję Obraz, Typ i 8-bitowy. Aby dostosować wartość skali szarości na podstawie barwienia komórek w celu dokładnego zliczania cząstek węgla, przejdź do pozycji Obraz, wybierz opcję Dostosuj, Próg i Zastosuj. Na koniec kliknij Analizuj i wybierz Pomiar.Pracownicy zajmujący się pakowaniem sadzy mieli wyższą zawartość węgla w makrofagach dróg oddechowych niż grupa kontrolna.

measuring-carbon-content-airway-macrophages-exposed-to-carbon

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów, MET, w makrofagach oskrzelowo-pęcherzykowych z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, oraz ich wizualizację za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych w makrofagach z ludzkich płynów płucnych oskrzelowo-pęcherzykowych

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Ten protokół opisuje techniki kwantyfikacji i charakterystyki aberracji chromosomowych in vitro w makrofagach myszy RAW264.7 po leczeniu cząstkami powietrza atmosferycznego.

Analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro

Pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów to nowo opisana jednostka. W tym artykule skoncentrujemy się na metodach mikroskopii konfokalnej i sposobie ich wizualizacji in vitro i in vivo na próbkach płuc.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Ten manuskrypt opisuje protokół określający, czy narażenie na ozon, podstawowe zanieczyszczenie powietrza, upośledza efferocytozę makrofagów pęcherzykowych in vivo. Protokół ten wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki i techniki i może być dostosowany do wielu modeli uszkodzenia płuc w celu określenia wpływu na efferocytozę makrofagów pęcherzykowych.

Ocena in vivo efferocytozy makrofagów pęcherzykowych po ekspozycji na ozon

Opisana jest metoda hodowli komórkowej i ekspozycji modelu oskrzelowego in vitro dla realistycznej, powtarzającej się ekspozycji inhalacyjnej na cząstki do testów toksyczności.

Model nabłonka oskrzeli na granicy faz powietrze-ciecz do realistycznego, powtarzającego się narażenia inhalacyjnego na cząstki unoszące się w powietrzu do testów toksyczności

Poznaj nieinwazyjną metodę pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych jako biomarker narażenia na cząstki stałe zawierające węgiel. Protokół zapewnia dokładną i niezawodną ocenę indywidualnej ekspozycji.

Pomiar zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych narażonych na cząstki stałe zawierające węgiel

Przeglądaj więcej filmów