Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Nasza grupa badawcza stara się zrozumieć skład komórkowy i specyficzne dla komórek profile transkrypcyjne międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) u ludzi. IMAT jest w rzeczywistości ektopowym magazynem tkanki tłuszczowej znajdującym się pomiędzy włóknami mięśniowymi i wokół nich. Tomografia komputerowa i M-R-I były w stanie określić ilościowo objętość IMAT i ostatnio wykazały, że wzrasta ona zarówno wraz z wiekiem, jak i B-M-I, a także jest związana z chorobami zwyrodnieniowymi mięśni.

Badania nad sekretomem in vitro wykazały niedawno, że białka wydzielane przez IMAT mają zdolność wpływania na wrażliwość na insulinę, profile zapalne, a także na kurczliwą ekspresję białek w ludzkich mięśniach szkieletowych. Ograniczona ilość tkanki IMAT pobranej podczas biopsji oraz obciążony lipidami charakter adipocytów sprawiają, że tkanka ta jest niekompatybilna z trawieniem tkankowym i sekwencją RNA pojedynczej komórki. W związku z tym chcieliśmy opracować protokół, który przeprowadzałby izolację jąder na niewielkich ilościach tkanki, które można by następnie wykorzystać w sekwencjonowaniu pojedynczych jąder jądrowych.

Protokół ten umożliwi naukowcom określenie zmian w składzie i transkrypcji specyficznych dla komórki, które zachodzą w IMAT, w różnych stanach choroby metabolicznej oraz w odpowiedzi na interwencje. Mamy nadzieję, że te informacje będą miały kluczowe znaczenie w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych, które pomogą złagodzić choroby metaboliczne poprzez bezpośrednie ukierunkowanie na IMAT lub jego wydzielane czynniki. W tej dziedzinie bardzo brakuje danych na temat biologii IMAT, jego pochodzenia komórkowego i komunikacji z innymi komórkami, przebywającymi zarówno w IMAT, jak i poza nim, a także jego reakcji molekularnych na interwencje związane ze stylem życia, takie jak dieta i ćwiczenia lub farmakoterapia.

To wszystko są kluczowe pytania badawcze dla naszej grupy. Aby rozpocząć, napełnij kanister ciekłym azotem. Na platformie roboczej umieść moździerze, tłuczki, mikromiarki, szpatułkę, szklany Dounce, tłuczek ze stali nierdzewnej i automatyczny Doouncer.

Wstępnie ostudzić szklankę Odbić w zlewce wypełnionej lodem. Napełnij dwa moździerze zawierające tłuczek i szpatułkę ciekłym azotem, aby schłodzić instrumenty. W międzyczasie dodaj jeden mililitr buforu homogenizacyjnego do szklanki Dounce.

Napełnij obie moździerze ciekłym azotem i wlej 50 miligramów próbki ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej do jednego z moździerzy. W celu sproszkowania delikatnie dociśnij tłuczek do kawałka tkanki, aby rozbić go na małe kawałki. Gdy tkanka zostanie sproszkowana i nadal pozostaje 1/4 do 1/2 zaprawy ciekłego azotu.

Przechylić zaprawę, zbierając sproszkowaną tkankę w krawędź moździerza. Gdy ciekły azot odparuje, zgarnij sproszkowaną tkankę do szklanki Dounce zawierającej bufor homogenizacyjny. W automatycznym Douncer przesuń szklankę Odbijaj tłuczek ze stali nierdzewnej w górę iw dół przez 10 uderzeń do przodu, a następnie 10 uderzeń w odwrotnym kierunku.

Gdy roztwór jest mętny i wolny od widocznych fragmentów tkanki, przenieś go do wstępnie schłodzonej 1,7 mililitrowej probówki LoBind na lodzie. Przepłucz Dounce 400 mikrolitrami buforu homogenizacyjnego i przenieś go do probówki LoBind. Po zebraniu zhomogenizowanej ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej do 1,7 mililitrowej probówki LoBind na lodzie, dodaj 14 mikrolitrów 10%Triton X-100 do homogenatu.

Inkubuj probówkę w ciemności na lodzie przez 10 do 15 minut, wirując co trzy minuty. W osobnej stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów, wstępnie zwilżone sitko komórkowe 1/100 i 1/40 mikronów ze 100 mikrolitrami D-P-B-S. Przefiltrować homogenat do sitka o wielkości 100 mikronów.

Przepłucz 1,7-mililitrową probówkę LoBind 400 mikrolitrami buforu homogenizacyjnego i przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikronów. Następnie otrzymaną zawiesinę przefiltrować przez filtrat o wielkości 100 mikronów na sitku o wielkości 40 mikronów. Równomiernie rozprowadź roztwór w dwóch wstępnie schłodzonych 1,7 mililitrowych probówkach LoBind

Odwirować probówki o stężeniu 2 700 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzuć górną warstwę lipidową i supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów w pierwszej probówce. Delikatnie pipetuj w górę i w dół 20 razy bez tworzenia pęcherzyków, aby ponownie zawiesić granulkę w pierwszej probówce i przenieść do zawiesiny do nowej probówki LoBind o pojemności 1,7 mililitra.

Następnie dodać 500 mikrolitrów pożywki do izolacji jąder do 1,7 mililitrowej probówki LoBind i wymieszać z pipetowaniem. Odwirować probówkę o sile 1000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów w probówce i delikatnie odpipetować, aby ponownie zawiesić osad.

Następnie dodać 200 mikrolitrów pożywki do izolacji jąder i wymieszać zawiesinę. Dodaj jedną kroplę roztworu do barwienia żywych komórek i inkubuj w ciemności na lodzie. Po 15 minutach przefiltruj roztwór przez sitko o wielkości 30 mikronów.

Wymieszać roztwór jąder i dodać 10 mikrolitrów do szkiełka w komorze do liczenia komórek. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek.