Name: Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Poznaj izolację jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder. Ta metoda umożliwia analizę transkryptomiczną komórek IMAT w chorobach metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Bryanowi Bergmanowi, doktorowi z University of Colorado za dostarczenie obrazu biopsji IMAT na rysunku 1C z badania MoTrIMAT (R01AG077956). Jesteśmy wdzięczni za to, że Badanie Mięśni, Mobilność i Starzenie się dostarczyło próbkę IMAT, z której dane są pokazane w sekcji reprezentatywnych wyników. National Institute on Aging (NIA) sfinansował badanie mięśni, mobilności i starzenia się (SOMMA; R01AG059416) oraz jego badania pomocnicze SOMMA AT (R01AG066474) i SOMMA Knee OA (R01AG070647). Wsparcie infrastruktury badawczej zostało częściowo sfinansowane przez NIA Claude D. Pepper Older American Independence Centers na Uniwersytecie w Pittsburghu (P30AG024827) i Wake Forest University (P30AG021332) oraz Instytuty Nauk Klinicznych i Translacyjnych, finansowane przez National Center for Advancing Translational Science, na Uniwersytecie Wake Forest (UL1 0TR001420).

Próbka wykorzystana w tym protokole stanowiła część badania Study of Muscle, Mobility, and Aging (SOMMA)15, które zostało zatwierdzone przez komisję Institutional Review Board Western IRB-Copernicus Group (WCG) i przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu.
UWAGA: Niniejszy protokół został zaadaptowany z wcześniejszego protokołu wykorzystującego 100 mg ludzkiej tkanki tłuszczowej podskórnej z okolic brzucha na platformie opartej na nanodołkach16. Obecny protokół został zoptymalizowany dla 50 mg ludzkiej IMAT i przygotowania biblioteki przy użyciu platformy opartej na kropelkach. Może być wymagana dalsza optymalizacja tego protokołu w celu izolacji jąder z nie-ludzkiej IMAT lub innych depotów tłuszczowych.
1. Przygotowanie buforów i odczynników (Tabela 1 i Tabela 2)
UWAGA: Bufor należy przygotować na świeżo w dniu eksperymentu i nie używać ponownie.
<ol>
	<li>Wstępnie schłodzić wirówkę do 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor do homogenizacji oraz medium do izolacji jąder.
	<ol>
		<li>Przygotować dwa pojemniki z lodem i wstępnie schłodzić 2 x 15 mL probówki stożkowe.</li>
		<li>Wymieszać wszystkie odczynniki do buforu do homogenizacji (HB) w probówce stożkowej 15 mL w kolejności wymienionej w Tabeli 1. Przechowywać w lodzie. Wymieszać za pomocą wierzchołka (vortex).</li>
		<li>Wymieszać wszystkie odczynniki do medium do izolacji jąder (NIM) w probówce stożkowej 15 mL zgodnie z listą w Tabeli 2. Przechowywać w lodzie. Wymieszać za pomocą wierzchołka (vortex).</li>
		<li>Przygotować 10% Triton-X, dodając 100 µL Triton X-100 do 900 µL wody wolnej od nukleaz. Wymieszać za pomocą wierzchołka (vortex), aby zapewnić odpowiednie połączenie składników. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Odczynnik</td>
			<td colspan="2">Objętość (μL)</td>
			<td rowspan="2">Stężenie końcowe (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x</td>
			<td>2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl22</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor Tris 1 M, pH 8,0</td>
			<td>20</td>
			<td>40</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 M sacharoza (-4oC)</td>
			<td>334</td>
			<td>668</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM DTT</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
			<td>0.001 (~1 µM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor proteaz 100x</td>
			<td>20</td>
			<td>40</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superasin 20 U/µL</td>
			<td>40</td>
			<td>80</td>
			<td>0,4 U/µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>1549</td>
			<td>3098</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>2000</td>
			<td>4000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Bufor do homogenizacji (HB). Przechowywać w lodzie. Mieszać za pomocą wortexa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td rowspan="2">Odczynnik</td>
			<td colspan="2">Objętość (μL)</td>
			<td rowspan="2">Stężenie końcowe (mM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1x</td>
			<td >2x</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA </td>
			<td >0.4</td>
			<td >0.8</td>
			<td >0.1 </td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inhibitor RNazy Ribolock (40U/µL)</td>
			<td >40</td>
			<td >80</td>
			<td >0.8 U/µL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% BSA-PBS (-/-)</td>
			<td >1959.6 </td>
			<td >3919.2</td>
			<td >-</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Objętość całkowita</td>
			<td >2000</td>
			<td >4000</td>
			<td >-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Medium do izolacji jąder (NIM). Przechowywać w lodzie. Mieszać za pomocą wortexa.
2. Pulweryzacja zamrożonej tkanki ( Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Przygotuj stanowisko do homogenizacji.
	<ol>
		<li>Napełnij pojemnik ciekłym azotem (LN2). 
		OSTROŻNIE: podczas pracy z LN2 zawsze należy nosić gogle i rękawice kriogeniczne.</li>
		<li>Przygotuj 2 moździerze, 1 tłuczek, 1 szpatułkę mikro-czerpak, 1 szklany homogenizator Dounce oraz 1 stalowy tłuczek do automatycznego homogenizatora.</li>
		<li>Uruchom automatyczny homogenizator.</li>
		<li>Wypełnij zlew lodu i schłodź w nim szklany homogenizator.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypełnij 2 moździerze (zawierające tłuczek i szpatułkę) LN2, aby schłodzić narzędzia. Odczekaj do odparowania LN2 i powtórz czynność.</li>
	<li>Podczas chłodzenia narzędzi, dodaj 1 mL buforu HB do szklanego homogenizatora.</li>
	<li>Wypełnij oba moździerze LN2 po raz ostatni i wsyp 50 mg próbki IMAT do jednego z moździerzy.</li>
	<li>Rozdrobnij IMAT za pomocą tłuczka, delikatnie naciskając na fragment tkanki, aby rozbić go na małe kawałki. Upewnij się, że wszystkie fragmenty zostały sproszkowane.</li>
	<li>LN2 będzie powoli odparowywać podczas rozdrabniania tkanki. Gdy tkanka zostanie odpowiednio sproszkowana, a w moździerzu pozostanie jeszcze ¼ - ½ objętości LN2, przechyl moździerz w stronę krawędzi, aby zebrać sproszkowaną tkankę przy brzegu. Pozostaw LN2 do całkowitego odparowania.</li>
	<li>Natychmiast po odparowaniu resztek LN2, przełóż sproszkowaną tkankę do szklanego homogenizatora zawierającego 1 mL HB.</li>
</ol>
3. Homogenizacja sproszkowanej tkanki
<ol>
	<li>Zhomogenizować sproszkowaną tkankę za pomocą automatycznego homogenizatora typu dounce. Przesuwać szklany tłuczek w górę i w dół stalowego pestle, wykonując 10 ruchów w kierunku przednim, a następnie 10 ruchów w kierunku odwrotnym.</li>
	<li>Upewnić się, że po homogenizacji roztwór jest mętny i nie zawiera widocznych fragmentów tkanki. Ze względu na zanieczyszczenie tkanką mięśniową często oczekiwany jest jasnoróżowy kolor.</li>
	<li>Przenieść homogenizat do schłodzonej wcześniej probówki low-bind o pojemności 1,7 mL, umieszczonej w lodzie.</li>
	<li>Użyć 400 µL buforu HB do wypłukania homogenizatora, aby upewnić się, że cały materiał został przeniesiony, a następnie dodać go do probówki. 
	UWAGA: Jednocześnie można przetworzyć dwie próbki. W tym celu należy podwoić ilość HB oraz NIM. Sproszkować i zhomogenizować jedną próbkę tkanki, a bezpośrednio po niej sproszkować i zhomogenizować drugą próbkę tkanki, aby móc przeprowadzić etapy izolacji i oczyszczania równolegle.</li>
</ol>
4. Izolacja i oczyszczanie jąder komórkowych (Rysunek 2B)
<ol>
	<li>Dodaj 14 µL Triton-X (10%) do homogenatu, aby uzyskać stężenie 0,1%.</li>
	<li>Przechowuj probówkę na lodzie i w ciemności przez 10-15 min, mieszając na wirówce vortex co 3 min.</li>
	<li>Namocz jedno sitko komórkowe 100 µm i jedno sitko komórkowe 40 µm (na próbkę), używając 100 µL RT DPBS dla każdego z nich w stożkowej probówce 50 mL.</li>
	<li>Przefiltruj homogenat przez sitko komórkowe 100 µm.</li>
	<li>Wypłucz probówkę 1,7 mL za pomocą 400 µL HB i przefiltruj przez sitko komórkowe 100 µm.</li>
	<li>Następnie przefiltruj roztwór przez sitko komórkowe 40 µm.</li>
	<li>Przenieś równą ilość roztworu do dwóch schłodzonych wcześniej probówek 1,7 mL typu low-bind, co odpowiada ok. 900 µL w każdej probówce.</li>
	<li>Wiruj probówki przez 10 min przy 2700 x g w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu powinien być widoczny mały pellet.</li>
	<li>Usuń i odrzuć górną warstwę lipidową oraz pozostały supernatant, pozostawiając ok. 50 µL roztworu w pierwszej probówce.</li>
	<li>Powtórz czynność dla drugiej probówki.</li>
	<li>Dokładnie resuspenduj pellet w pierwszej probówce, delikatnie pipetując w górę i w dół 20 razy, a następnie przenieś do nowej probówki 1,7 mL typu low-bind. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę dla drugiej probówki i przenieś zresuspendowany roztwór do tej samej probówki.</li>
	<li>Dodaj 500 µL NIM i wymieszaj poprzez pipetowanie.</li>
	<li>Wirowuj probówkę z przeciwwagą przy 1000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń supernatant, pozostawiając ok. 50 µL, i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aż pellet zostanie zresuspendowany. Opcjonalnie przenieś zresuspendowany pellet do nowej, czystej probówki, jeśli na ściankach probówki pozostały resztki lipidów.</li>
	<li>Dodaj 200 µL NIM i wymieszaj poprzez pipetowanie.</li>
</ol>
5. Barwienie i liczenie jąder komórkowych (Rycina 2C oraz Rycina 3)
UWAGA: Aby ułatwić zliczanie, należy skonfigurować protokół „zliczania jąder” w automatycznym liczniku komórek, ponieważ regulacja kanałów jasnego pola oraz DAPI może znacząco wpłynąć na wynik zliczania. Dostrój kanały w taki sposób, aby rejestrowane były tylko jądra, a nie zanieczyszczenia. Upewnij się, że kanał jasnego pola oznacza jedynie „obiekty”, które posiadają również barwienie DAPI.
<ol>
	<li>Dodać 1 kroplę roztworu do barwienia żywych komórek i pozostawić w ciemności, w lodzie, na 15 min.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez sitko komórkowe 30 µm.</li>
	<li>Wymieszać roztwór jąder metodą pipetowania i nanieść 10 µL roztworu na szkiełko z komorą do liczenia komórek.</li>
	<li>Policzyć jądra za pomocą automatycznego licznika komórek. 
	UWAGA: Optymalne stężenie wynosi 1000 jąder/µL, co odpowiada 1,0 x 106/mL.
	<ol>
		<li>Upewnić się, że nie występują skupiska jąder, ponieważ mogłyby one zapchać chip do generowania kropel z pojedynczymi jądrami (Rysunek 3).</li>
		<li>Jeśli stężenie jąder jest zbyt niskie, odwirować roztwór przy 1000 x g przez 10 min w 4 °C w celu uzyskania osadu, usunąć nadsącz i resuspender w mniejszej objętości.</li>
		<li>Jeśli w roztworze znajduje się dużo zanieczyszczeń (debris), resuspender roztwór jąder w większej objętości NIM (np. 1 mL) i ponownie przefiltrować przez sitko komórkowe 30 µm. Następnie odwirować przy 1000 x g przez 10 min w 4 °C i resuspender w odpowiedniej objętości w zależności od stężenia jąder.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po uzyskaniu odpowiedniego stężenia jąder przejść bezpośrednio do pierwszego etapu przygotowania biblioteki.</li>
</ol>
<img alt="Porównanie barwienia DAPI i mikroskopii w polu jasnym, obrazowanie komórek, analiza fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Barwienie wyizolowanych jąder. Obraz z licznika komórek przedstawiający jądra zabarwione NucBlue/DAPI (obraz po lewej) oraz odpowiadający mu obraz w polu jasnym (obraz po prawej). Na obrazie w polu jasnym widoczna jest obecność niewielkiej ilości zanieczyszczeń. Użyty tutaj automatyczny licznik komórek nie posiada opcji dodawania pasków skali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
6. Przygotowanie biblioteki i parametry sekwencjonowania
<ol>
	<li>Należy zapoznać się z dokładnym protokołem przygotowania bibliotek z wykorzystaniem metody kropelkowej dla pojedynczych jąder komórkowych, dostępnym na stronie internetowej dostawcy17.
	<ol>
		<li>Należy dążyć do odzyskania docelowo 10 000 jąder. Jednak w przypadku próbek o wysokim poziomie zanieczyszczeń lub zawierających kruche jądra, należy spodziewać się uzyskania mniejszej liczby odzyskanych jąder.</li>
		<li>Aby umożliwić równoległe przetwarzanie większej liczby próbek, próbki można przechowywać w temperaturze 4°C do 72 h po wykonaniu kroku 2.3. protokołu przygotowania bibliotek. W tym celu należy przetwarzać dwie próbki do kroku 2.3. przez dwa kolejne dni, a w trzecim dniu przetworzyć wszystkie 4 próbki wspólnie, zaczynając od kroku 3. protokołu przygotowania bibliotek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parametry sekwencjonowania: Sekwencjonowanie należy przeprowadzić na platformie sekwencyjnej, dążąc do uzyskania 50 000 odczytów par końcowych (paired-end reads) na jądro. 
	UWAGA: Dane przedstawione w niniejszym protokole zostały zsekwencjonowane na platformie NovaSeq 6000, przy założeniu 50 000 odczytów par końcowych na jądro.</li>
</ol>
<img alt="Proces pulveryzacji tkanki i izolacji jąder z użyciem ciekłego azotu, douncera, wirówki i licznika komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat procedury. Schematyczne przedstawienie przebiegu pracy w (A) krokach 2 i 3, (B) kroku 4 oraz (C) kroku 5 protokołu. Rysunek został przygotowany przy użyciu BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
7. Przetwarzanie i analiza danych
UWAGA: W niniejszym protokole krótko przedstawiono niektóre z zalecanych programów i pakietów R wykorzystywanych do przetwarzania uzyskanych danych z sekwencjonowania, koncentrując się na etapach następujących po wstępnym przetwarzaniu (Tabela 3). Niniejsze badanie dostarcza ogólnych wskaźników kontroli jakości (QC) oraz przykładu przybliżonej i rzutowanej projekcji jednostajnej rozmaitości (UMAP) w Rycina 4Jednak szczegółowy opis analizy bioinformatycznej wykracza poza zakres niniejszego protokołu. W związku z tym czytelnicy mogą zapoznać się z niedawnym przeglądem najlepszych praktyk w analizie pojedynczych komórek autorstwa Heumos i wsp.18.
<ol>
	<li>Wstępne przetwarzanie danych z sekwencjonowania
	<ol>
		<li>Zmapuj odczyty z pojedynczych jąder do ludzkiego genomu referencyjnego GRCh38.</li>
		<li>Uwzględnij odczyty intronowe w zliczaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź kontrolę jakości (QC) i filtrowanie danych przy użyciu pakietu Seurat R19.
	<ol>
		<li>Oblicz wskaźnik złożoności komórek, dzieląc log(10) liczby wykrytych genów przez log(10) liczby wykrytych odczytów.</li>
		<li>Przedstaw najważniejsze metryki QC na histogramach lub wykresach skrzypcowych, w tym liczbę genów wykrytych na jądro, procent odczytów mitochondrialnych oraz wskaźnik złożoności komórek.</li>
		<li>Odrzuć jądra z liczbą genów mniejszą niż 200 lub większą niż 10 000 na jądro, odsetkiem odczytów mitochondrialnych przekraczającym 10% oraz wskaźnikiem złożoności poniżej 0.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizuj dane i przeprowadź redukcję wymiarowości.
	<ol>
		<li>Użyj funkcji SCTransform z pakietu Seurat , aby znormalizować dane przy użyciu 2000 cech zmiennych.</li>
		<li>Pogrupuj dane (klasteryzacja), korzystając z następujących funkcji pakietu Seurat R: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters oraz RunUMAP.</li>
		<li>Wygeneruj wykres UMAP, aby zwizualizować klastry danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odrzuć przewidywane dublety przy użyciu pakietu DoubletFinder R 20 i przeprowadź ponowną klasteryzację danych.</li>
	<li>Adnotuj klastry, korzystając ze znanych markerów genowych typów komórek spodziewanych w tkance (podejście nadzorowane) lub na podstawie 5 genów o największej różnicy w ekspresji pomiędzy klastrami (podejście nienadzorowane).</li>
	<li>Użyj narzędzia decontX21 , aby określić stopień kontaminacji tłem RNA (ambient RNA) i skorygować macierz ekspresji genów pod kątem tego zjawiska.
	<ol>
		<li>Uwzględnij surową macierz genów jako tło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz obiekt Seurat do przyszłej analizy danych. 
	UWAGA: Kod do analizy QC i klasteryzacji znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oprogramowanie/pakiety R wykorzystane w przepływie danych</td>
			<td>Alternatywne oprogramowanie/pakiety</td>
			<td>Etap przetwarzania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellRanger</td>
			<td>STARsolo, kallisto</td>
			<td>Przycinanie, wyrównywanie, mapowanie </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat</td>
			<td>SingleCellExperiment, Cellranger</td>
			<td>Kontrola jakości, analiza i eksploracja danych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DoubletFinder</td>
			<td>scds, scdblFinder, Scrublet</td>
			<td>Wykrywanie dubletów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DecontX</td>
			<td>SoupX, CellBender</td>
			<td>Korekta RNA tła</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Oprogramowanie/narzędzia do przepływu danych.

Single Cell Nuclei Isolation from IMAT for Studying Gene Expression Profiles 

<ol><li>Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+adipose+tissue+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intermuscular adipose tissue in metabolic disease.</a> Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).</li>
<li>Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+significance+of+intermuscular+adipose+tissue%3A+Is+IMAT+a+friend+or+a+foe+to+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health.</a> Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).</li>
<li>Gallagher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+muscle%3A+A+novel+depot+similar+in+size+to+visceral+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue.</a> Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).</li>
<li>Manini, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+physical+activity+increases+intermuscular+adipose+tissue+in+healthy+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults.</a> Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).</li>
<li>Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+fat%3A+A+review+of+the+consequences+and+causes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intermuscular fat: A review of the consequences and causes.</a> Int J Endocrinol. 2014, 309570(2014).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Sachs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+adipose+tissue+directly+modulates+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).</li>
<li>Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipose+tissue+heterogeneity+in+the+single-cell+era%3A+From+mice+and+humans+to+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle.</a> Biology (Basel). 12 (10), 1289(2023).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+bulk+RNA+sequencing+reveal+cellular+and+transcriptional+mechanisms+underlying+lipid+dynamics+in+high+marbled+pork%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Sci+Food%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork.</a> NPJ Sci Food. 7 (1), 23(2023).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+diverse+cell+populations+in+skeletal+muscles+and+biomarkers+for+intramuscular+fat+of+chicken+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 21 (1), 752(2020).</li>
<li>Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+heterogeneity+of+cultured+bovine+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells.</a> Front Genet. 12, 742077(2021).</li>
<li>Fitzgerald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MME%2B+fibro-adipogenic+progenitors+are+the+dominant+adipogenic+population+during+fatty+infiltration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle.</a> Commun Biol. 6 (1), 111(2023).</li>
<li>Cummings, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+muscle%2C+mobility+and+aging+%28SOMMA%29%3A+A+unique+cohort+study+about+the+cellular+biology+of+aging+and+age-related+loss+of+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).</li>
<li>Whytock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+frozen+human+subcutaneous+adipose+tissue+for+full-length+single-nuclei+transcriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102054(2023).</li>
<li>10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf">https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf</a> (2022).</li>
<li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictionary+learning+for+integrative%2C+multimodal+and+scalable+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis.</a> Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).</li>
<li>McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DoubletFinder%3A+Doublet+detection+in+single-cell+RNA+sequencing+data+using+artificial+nearest+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors.</a> Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+ambient+RNA+in+single-cell+RNA-seq+with+DecontX%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX.</a> Genome Biol. 21 (2), 57(2020).</li>
<li>Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data">https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data</a> (2022).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Whytock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+full-length+transcriptome+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+reveals+unique+and+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations.</a> iScience. 25 (8), 104772(2022).</li>
<li>Probst, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+full-length+transcript+single+cell+mRNA+sequencing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols.</a> BMC Genomics. 23 (1), 860(2022).</li>
<li>CG000148 Rev A Technical Note - Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf">https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf</a> (2018).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transcript+enrichment+and+detection+bias+in+single-nucleus+RNA-seq+for+mapping+of+distinct+human+adipocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages.</a> Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+of+cell+type+deconvolution+pipelines+for+transcriptomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data.</a> Nat Commun. 11 (1), 5650(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Praca z IMAT wiąże się z kilkoma nieodłącznymi wyzwaniami. Oprócz ograniczonej dostępności, wydajność materiału próbki jest często bardzo rzadka, a "zanieczyszczenie" mięśni szkieletowych jest prawie niemożliwe do uniknięcia. Aby uzyskać próbkę najlepszej jakości, należy przeniknąć do powięzi mięśniowej podczas wprowadzania igły do biopsji (aby upewnić się, że nie pobiera się podskórnej tkanki tłuszczowej) i usunąć jak najwięcej tkanki mięśniowej poprzez wypreparowanie próbki pod mikroskopem natychmiast po pobraniu, a następnie przetworzenie w celu histologii, szybkiego zamrożenia itp. Jest to pierwsza metoda wykorzystania próbek IMAT prospektywnie pobranych i wypreparowanych z mięśni szkieletowych. Dla porównania, poprzednie dane dotyczące sekwencji snRNA w IMAT pochodziły z izolacji jąder mieszaniny biopsji mięśni szkieletowych ze znanym naciekiem tłuszczowym, a nie samego IMAT.
IMAT ma charakter gęstszy w porównaniu do podskórnych tkanek tłuszczowych, co sprawia, że prawidłowe sproszkowanie tkanki podczas izolacji jąder jest niezbędne do uwolnienia jąder ze struktury tkanki. Niewłaściwa proszkowanie może prowadzić do mniejszej wydajności jąder, co jest niekorzystne przy ograniczonej ilości tkanki. Co więcej, obliczenie prawidłowej liczby jąder w przygotowanym roztworze jąder jest krytycznym krokiem w celu zapewnienia wystarczającej liczby (ale nie za wielu) jąder do załadowania do chipa w celu wygenerowania GEM. Zbyt wiele jąder lub obecność dużych klastrów jąder lub szczątków może spowodować zatkanie, wpływając na końcowe stężenie cDNA i ostatecznie na wynik sekwencjonowania. Ominięcie zlepiania się jąder i zanieczyszczeń w preparacji pojedynczych jąder jest trudne i zależy od jakości próbki. Zbrylanie się jąder i/lub obecność zanieczyszczeń można zmniejszyć, włączając dodatkowy etap filtracji z sitkiem do komórek o średnicy 30 μm.
Ważne jest, aby szybko przetwarzać próbki, aby zmniejszyć ryzyko degradacji RNA. Utrzymywanie roztworów na lodzie lub schładzanych podczas wszystkich możliwych etapów izolacji jąder, a także dodanie wystarczającej ilości inhibitorów RNAzy, może zminimalizować degradację. Ze względu na znaczenie czasu przetwarzania dla każdej próbki, zalecamy przeprowadzanie maksymalnie dwóch próbek jednocześnie. Ponadto z roztworem jąder należy obchodzić się ostrożnie, aby jądra nie były zbyt delikatne. Delikatne jądra są podatne na pękanie podczas generowania GEM, co może skutkować powstawaniem dużych ilości RNA w próbce. W tym protokole etap filtrowania za pomocą strzykawki (opisany w protokole STAR16) został wykluczony w celu zachowania integralności jąder.
Wybór metody przygotowania biblioteki zależy od pytania badawczego. Pracowaliśmy zarówno nad podejściem opartym na pojedynczych jądrach kropelkowych, jak i nanostunkowych. Podejście oparte na nanostudzienkach profiluje 1200-1600 jąder i około 3000-6000 wykrytych genów na jądro16. Co więcej, podejście to obsługuje transkryptomikę o pełnej długości, co pozwala na badanie zmienności strukturalnej, pseudogenów i wariantów splicingu27. Dla porównania, ponad 10 000 jąder można profilować przy użyciu podejścia kropelkowego, ale kosztem mniejszej liczby wykrywanych genów na jądro (2-3-krotnie niższej). W przypadku tego protokołu zdecydowaliśmy się użyć jednej z platform opartych na kropelkach, ponieważ większa liczba profilowanych jąder daje nam większą zdolność do wykrywania rzadkich typów komórek o niskiej liczebności28.
Głównym ograniczeniem sekwencji snRNA jest utrata zawartości cytozolu, co ogranicza analizę ekspresji do transkryptów jądrowych. Jądro zawiera 10-100 razy mniej mRNA niż cała komórka29, co może być problemem dla odkrycia wszystkich typów komórek w tkance. Jednak niedawne badanie przeprowadzone przez Guptę i wsp. wykazało, że transkryptomika jądrowa - w porównaniu z transkryptomiką całych komórek29 - wykryła podobne populacje komórek i profile ekspresji biologicznie istotnych genów w hodowanych preadipocytach i dojrzałych adipocytach. Podobne wyniki uzyskano w innych typach komórek30,31.
Izolacja pojedynczych jąder ma swoje zalety w zapewnianiu wzorców ekspresji genów o rozdzielczości pojedynczej komórki (sc) w delikatnych komórkach niezgodnych z sekwencją scRNA. Ponadto można wykorzystać zamrożone próbki z biobanków, a izolacja jąder nie wymaga enzymatycznego trawienia tkanki, co może wywołać reakcję stresową w komórkach, wpływając na transkryptom32. Stosując sekwencję snRNA, byliśmy w stanie transkrypcyjnie profilować adipocyty i inne typy komórek obecne w IMAT, co nie byłoby możliwe w przypadku sekwencji scRNA, ponieważ adipocyty są obciążone lipidami i niezgodne z podejściem opartym na kropelkach.
Ważnym zastosowaniem snRNA-Seq IMAT jest rozszyfrowanie składu komórkowego i różnic transkrypcyjnych IMAT w różnych stanach metabolicznych. Co więcej, zestawy danych snRNA-seq mogą być wykorzystane do dekonwolucji masowego sekwencjonowania RNA na IMAT w celu oceny różnic w składzie komórek na większą skalę33. Dodatkowo, pseudo-czasowa analiza danych sekwencyjnych snRNA-seq może służyć do identyfikacji trajektorii dojrzewania komórek, co jest szczególnie interesujące w tkankach takich jak IMAT, w których pochodzenie komórkowe dojrzałych adipocytów jest nadal przedmiotem dyskusji.

Tkanka tłuszczowa wewnątrzmięśniowa (IMAT) jest ektopowym depotem tłuszczowym znajdującym się pomiędzy włóknami mięśniowymi i wokół nich1. Jak szczegółowo opisano w niedawnym przeglądzie Goodpaster i wsp., IMAT można wykryć za pomocą wysokorozdzielczej tomografii komputerowej (CT) oraz obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) (Rycina 1A,B) i występuje ona wokół oraz wewnątrz włókien mięśniowych w całym organizmie1. Ilość IMAT znacznie różni się między osobnikami i jest zależna od BMI, wieku, płci, rasy oraz siedzącego trybu życia2,3,4. Co więcej, odkładanie się IMAT jest powszechnie obserwowane w stanach patologicznych związanych z degeneracją mięśni5, a liczne badania udokumentowały zwiększoną masę IMAT u osób z otyłością, cukrzycą typu 2, zespołem metabolicznym i insulinoopornością6,7,8,9. Niemniej jednak, właściwości komórkowe i biologiczne IMAT są dopiero na początku procesu odkrywania. Ograniczona dostępność oraz zmienność lokalizacji i zawartości IMAT w całym organizmie utrudniały pobieranie próbek z tego unikalnego depotu tłuszczowego2. Ponadto próbki są łatwo „zanieczyszczane” mięśniami szkieletowymi (SM) podczas pobierania, co sprawia, że rozróżnienie wkładu biologicznego różnych tkanek jest trudne do ustalenia (Rycina 1C). W związku z tym sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder (snRNA-seq), które zyskało znaczną uwagę w ciągu ostatniej dekady, stanowi idealną metodologię pozwalającą na oddzielenie wzorców ekspresji genów pochodzących z IMAT i SM z rozdzielczością pojedynczej komórki. Co więcej, izolacja jąder jest szczególnie użyteczna w przypadku tkanki tłuszczowej ze względu na duże, wypełnione lipidami adipocyty, których nie da się rozdzielić do zawiesiny pojedynczych komórek bez naruszenia integralności komórek. Wreszcie, technologia ta daje potencjał do odkrycia nowych markerów adipocytów specyficznych dla IMAT i ujawnienia składu oraz obecności różnych populacji komórek progenitorowych, a także do badania zmienności składu komórkowego w warunkach patologicznych i normalnych.
<img alt="Obrazowanie przekrojowe MRI; segmentacja tkanki tłuszczowej i mięśniowej; schemat anatomiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Obrazy IMAT. Reprezentatywny obraz rezonansu magnetycznego (MRI) IMAT u (A) szczupłej kobiety w średnim wieku oraz (B) mężczyzny w średnim wieku z otyłością. Kolor czerwony: tkanka tłuszczowa podskórna, żółty: tkanka tłuszczowa śródmięśniowa, zielony: mięsień szkieletowy, niebieski: kość. Obraz courtesy of Heather Cornnell, AdventHealth Translational Research Institute. (C) Świeża próbka tkanki z IMAT (otoczona przerywaną czarną linią). Obraz courtesy of Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute oraz Bryan Bergman, University of Colorado. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Goodpaster i wsp.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
W przemyśle hodowlanym opublikowano szereg badań dotyczących marmurkowatości mięsa (w szczególności IMAT) u świń, kurczaków i bydła z wykorzystaniem sekwencjonowania pojedynczych komórek (sc) oraz jąder komórkowych (snRNA-seq)10. Badania te zidentyfikowały kilka subpopulacji adipocytów oraz markery potencjalnych komórek progenitorowych IMAT11,12,13; jednak nie wiadomo, czy skład komórkowy ten przekłada się na ludzką tkankę IMAT. Z naszej wiedzy tylko jedna praca analizowała heterogeniczność komórkową ludzkiego mięśnia z naciekiem tłuszczowym, pobranego od pacjentów płci męskiej z chorobą zwyrodnieniową stawu biodrowego, przy użyciu snRNA-seq14. Badacze zgłosili obecność niewielkiej populacji adipocytów oraz kilku subpopulacji fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) w obrębie licznej populacji jąder mięśniowych14. Nasze badanie jest pierwszym, w którym opracowano metodę bezpośredniej analizy składu komórkowego IMAT, wypreparowanego manualnie z ludzkiego mięśnia, z wykorzystaniem snRNA-seq.
Co ważne, protokoły snRNA-seq wymagają dostosowania do badanej tkanki, ponieważ ilość dostępnego materiału oraz właściwości fizyczne konkretnej tkanki determinują optymalne etapy przetwarzania. Wydajność tkankowa w przypadku IMAT jest zazwyczaj niewielka i często nie przekracza 50 mg, nawet przy wykonywaniu biopsji pod kontrolą USG. W związku z tym prawidłowe przetwarzanie tej rzadkiej tkanki jest niezbędne. Wierzymy, że niniejszy protokół będzie stanowił cenny zasób dla badaczy zajmujących się ludzkim IMAT.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; Filtry strzykawkowe M Corning&nbsp;</td><td>Rurki Millipore Sigma</td><td>CLS431229</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml DNA LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>probówki o niskim poziomie wiązania</td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>100x inhibitor proteazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>10X Separator magnetyczny</td><td>10X Genomics</td><td>230003</td><td></td></tr><tr><td>10X Adapter Vortex</td><td>10X Genomics</td><td></td><td></td>330002</tr><tr><td>Probówki kanoniczne 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,54,502</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizator&nbsp;</td>Probówki stożkowe <td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,47,254</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw akcesoriów CellRanger</td><td>Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chromium iX</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000323</td><td></td></tr><tr><td>Chromium iX Controller</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000326</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Zestaw jednoogniwowy&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Jednokomórkowy 3-calowy zestaw kulek żelowych v3.1&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000129</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Zestaw jednokomórkowy GEM v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000130</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka komory zliczania komórek Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DoubletFinder</td><td>R&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (bez wapnia, bez magnezu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw podwójnego indeksu TT Zestaw A, 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000215</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN2000048</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 &micro; m Sitko do komórek</td><td>Corning Life Science</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Sitko komórkowe</td><td>Corning Life Science</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Gliceryna (glicerol), 50% (v/v) Roztwór wodny</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>Library Zestaw konstrukcyjny v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000196</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30&micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Nexus Gradient Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>6331000017</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i pestel</td><td>Logistyka opieki zdrowotnej&nbsp;</td><td>14075</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do sond NucBlue Live Ready</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Probumin Albumina surowicy bydlęcej bez kwasów tłuszczowych, proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>820024</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Bufor EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNAzy ryboloku</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>R&nbsp;</td><td>Nie dotyczy Sacharozy</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SUPERasin 20 U/&micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2695</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>5382000015</tr><tr><td>Homogenizator tkankowy</td><td>Glass-Col</td><td>099C K54</td><td></td></tr><tr><td>Tris bufor pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC327372500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA pH 8,0</td><td>Gibco</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie rna pojedynczych jąder w dół

Isolation of Nuclei from Human Intermuscular Adipose Tissue and Downstream Single-Nuclei RNA Sequencing

Międzymięśniowa tkanka tłuszczowa (IMAT) to stosunkowo słabo zbadany magazyn tkanki tłuszczowej znajdujący się pomiędzy włóknami mięśniowymi. Zawartość IMAT wzrasta wraz z wiekiem i BMI i jest związana z chorobami metabolicznymi i zwyrodnieniowymi mięśni; jednak poważnie brakuje zrozumienia właściwości biologicznych IMAT i jego interakcji z otaczającymi włóknami mięśniowymi. W ostatnich latach sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i jąder dostarczyło nam atlasów specyficznych dla typu komórki kilku tkanek ludzkich. Jednak skład komórkowy ludzkiego IMAT pozostaje w dużej mierze niezbadany ze względu na nieodłączne wyzwania związane z jego dostępnością z biopsji pobranej u ludzi. Oprócz ograniczonej ilości pobranej tkanki, przetwarzanie ludzkiego IMAT jest skomplikowane ze względu na jego bliskość do tkanki mięśni szkieletowych i powięzi. Obciążony lipidami charakter adipocytów sprawia, że jest on niezgodny z izolacją pojedynczych komórek. W związku z tym sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder jest optymalne do uzyskania wielowymiarowej transkryptomiki w rozdzielczości pojedynczej komórki i zapewnia potencjał do odkrycia biologii tego magazynu, w tym dokładnego składu komórkowego IMAT. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder. Protokół ten pozwala na profilowanie tysięcy jąder przy użyciu podejścia kropelkowego, zapewniając w ten sposób możliwość wykrywania rzadkich i mało obfitych typów komórek.

Niniejszy schemat pracy został opracowany w celu przeprowadzenia obróbki zamrożonych próbek ludzkiej tkanki IMAT w celu uzyskania profili ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczych jąder, co umożliwia identyfikację typów komórek. W niniejszej procedurze zaprezentowano jedną reprezentatywną próbkę IMAT pochodzącą od uczestnika badania SOMMA.
Pierwszym krokiem każdej analizy danych snRNA-seq jest ocena jakości danych w celu zidentyfikowania jąder o niskiej jakości, które potencjalnie powinny zostać usunięte ze zbioru danych. Co istotne, kroki filtrowania oraz progi powinny zostać określone dla konkretnego rodzaju próbki i posiadanego zbioru danych, ponieważ powszechnie oceniane mierniki mogą różnić się w zależności od tkanek i typów komórek22,23. Rycina 4A przedstawia wizualizację niektórych kluczowych mierników stosowanych do oceny jakości wygenerowanych danych snRNA-seq. Liczba genów wykrytych na jądro zależy od głębokości sekwencjonowania i typu komórki, jednak w przypadku jąder dobrej jakości spodziewana wartość powinna przekraczać 20018,23. Stwierdzono, że dane wygenerowane przy użyciu niniejszego protokołu mieszczą się w oczekiwanym zakresie, z medianą 1134 genów na jądro, przy całkowitej liczbie 4662 jąder.
Ocenia się odsetek odczytów mitochondrialnych, ponieważ wysoki stopień kontaminacji mitochondrialnej może wynikać z uszkodzeń jąder komórkowych lub przyłączenia się zewnętrznego RNA do jąder, co wskazuje na niską jakość tych struktur. W prezentowanym tutaj zestawie danych stwierdzono medianę odsetka odczytów mitochondrialnych na poziomie 2,65, co znajduje się znacznie poniżej progu 5%-20% powszechnie stosowanego w literaturze24,25,26. Odsetek odczytów rybosomalnych różni się w zależności od typu komórek i tkanki. Jednakże, ponieważ duże proporcje genów rybosomalnych mogą wpływać na klasteryzację danych, zaleca się sprawdzenie odsetka odczytów rybosomalnych i ewentualne usunięcie genów rybosomalnych lub jąder z wysokim poziomem genów rybosomalnych z zestawu danych przed przeprowadzeniem klasteryzacji. Dane wygenerowane zgodnie z niniejszym protokołem wykazały niski poziom odczytów rybosomalnych z medianą 2,46% i maksymalną wartością 16,5%, w związku z czym nie zastosowano filtrowania w oparciu o tę metrykę. Na koniec obliczono wskaźnik złożoności komórki na podstawie log(10) liczby wykrytych genów podzielonej przez log(10) liczby wykrytych odczytów. Oczekuje się, że wysokiej jakości jądra będą miały wartość powyżej 0,8; w próbce użytej w niniejszym badaniu uzyskano medianę 0,92. Na podstawie tych metryk kontroli jakości można zdecydować, które jądra należy odfiltrować z zestawu danych. Do analizy zdecydowaliśmy się odfiltrować jądra z mniej niż 200 lub więcej niż 10 000 genów na jądro, odsetkiem odczytów mitochondrialnych przekraczającym 10% oraz wskaźnikiem złożoności poniżej 0,8.
Po wstępnej ocenie jakości i etapie filtrowania można wygenerować wykres UMAP, aby zwizualizować grupowanie jąder. Klasteryzację przeprowadzono w oparciu o 2000 najbardziej zmiennych genów z zastosowaniem transformacji SCT. Wstępne etapy grupowania mogą służyć do sprawdzenia, czy cechy QC grupują się razem, np. jądra z wysoką liczbą odczytów mitochondrialnych. Ponadto informacje o klastrach są wymagane dla niektórych metod detekcji dubletów, w tym DoubletFinder20, który został wykorzystany w niniejszym protokole. DoubletFinder zastosowano z oczekiwaną stopą multipletów ustawioną na 4,8%, zgodnie z sugestią dostawców platformy opartej na kropelkach. Po usunięciu dubletów oszacowano poziom zanieczyszczenia wolnym RNA (ambient RNA), co jest szczególnie powszechne w preparatach pojedynczych jąder, ponieważ RNA uwalnia się z cytoplazmy podczas lizy komórek, przedostaje się do kropelek Gel Beads-in-emulsion (GEMs) i ulega amplifikacji w kolejnych etapach przygotowania biblioteki. W związku z tym opracowano kilka narzędzi do korekty problemu zanieczyszczenia wolnym RNA (patrz Tabela 3). Wykorzystano pakiet R decontX21, w którym surowa macierz tła (zawierająca tylko puste kropelki) służy do skorygowania macierzy ekspresji genów, co wzmacnia rzeczywisty sygnaturę ekspresji genów.
Klastrowanie i zdolność do wykrywania rzadkich typów komórek zależą od liczby jąder. W niniejszym badaniu, po filtracji QC, usunięciu dubletów i korekcie RNA tła, zidentyfikowano wszystkie oczekiwane główne typy komórek w IMAT (Rycina 4B) z łącznej liczby 3817 jąder. Obejmowały one komórki macierzyste, fibro-adipogenne komórki progenitorowe (FAPs) i dojrzałe adipocyty, a także perycyty, komórki mięśni gładkich, komórki układu odpornościowego, komórki progenitorowe mięśni oraz mionukleidy pochodzące z zanieczyszczenia komórkami mięśni szkieletowych.
Podsumowując, wykazaliśmy, że niniejszy protokół pozwala na uzyskanie danych o pojedynczych jądrach o wysokiej rozdzielczości, co umożliwia adnotację typów komórek istotną dla wyjaśnienia biologii i pochodzenia komórkowego IMAT.
<img alt="Wykresy skrzypcowe i klastry UMAP w analizie ekspresji genów; procent odczytów i wskaźniki złożoności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ocena jakości, klastrowanie i adnotacja typów komórek w danych sekwencyjnych. (A) Wykresy skrzypcowe kluczowych parametrów do oceny próbek i wydajności sekwencjonowania, w tym liczby genów wykrytych na jądro, procenta odczytów mitochondrialnych, procenta odczytów rybosomalnych oraz złożoności komórkowej mierzonej jako log(10) liczby wykrytych genów podzielone przez log(10) liczby wykrytych odczytów. Wartości mediany dla każdego parametru przedstawiono w zamkniętych polach. Całkowita liczba jąder: 4662. (B) Wykres UMAP przedstawiający klastrowanie poszczególnych jąder oraz odpowiadający mu wykres DotPlot ukazujący względną ekspresję genów markerowych dla typów komórek w każdym klastrze po filtrowaniu. Liczba jąder: 3817. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Kod do analizy QC i klastrowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/Supplementary_File_1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Intermuscular adipose tissue (IMAT) is a relatively understudied adipose depot located between muscle fibers. IMAT content increases with age and BMI and ...

Nasza grupa badawcza stara się zrozumieć skład komórkowy i specyficzne dla komórek profile transkrypcyjne międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) u ludzi. IMAT jest w rzeczywistości ektopowym magazynem tkanki tłuszczowej znajdującym się pomiędzy włóknami mięśniowymi i wokół nich. Tomografia komputerowa i M-R-I były w stanie określić ilościowo objętość IMAT i ostatnio wykazały, że wzrasta ona zarówno wraz z wiekiem, jak i B-M-I, a także jest związana z chorobami zwyrodnieniowymi mięśni.Badania nad sekretomem in vitro wykazały niedawno, że białka wydzielane przez IMAT mają zdolność wpływania na wrażliwość na insulinę, profile zapalne, a także na kurczliwą ekspresję białek w ludzkich mięśniach szkieletowych. Ograniczona ilość tkanki IMAT pobranej podczas biopsji oraz obciążony lipidami charakter adipocytów sprawiają, że tkanka ta jest niekompatybilna z trawieniem tkankowym i sekwencją RNA pojedynczej komórki. W związku z tym chcieliśmy opracować protokół, który przeprowadzałby izolację jąder na niewielkich ilościach tkanki, które można by następnie wykorzystać w sekwencjonowaniu pojedynczych jąder jądrowych.Protokół ten umożliwi naukowcom określenie zmian w składzie i transkrypcji specyficznych dla komórki, które zachodzą w IMAT, w różnych stanach choroby metabolicznej oraz w odpowiedzi na interwencje. Mamy nadzieję, że te informacje będą miały kluczowe znaczenie w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych, które pomogą złagodzić choroby metaboliczne poprzez bezpośrednie ukierunkowanie na IMAT lub jego wydzielane czynniki. W tej dziedzinie bardzo brakuje danych na temat biologii IMAT, jego pochodzenia komórkowego i komunikacji z innymi komórkami, przebywającymi zarówno w IMAT, jak i poza nim, a także jego reakcji molekularnych na interwencje związane ze stylem życia, takie jak dieta i ćwiczenia lub farmakoterapia.To wszystko są kluczowe pytania badawcze dla naszej grupy. Aby rozpocząć, napełnij kanister ciekłym azotem. Na platformie roboczej umieść moździerze, tłuczki, mikromiarki, szpatułkę, szklany Dounce, tłuczek ze stali nierdzewnej i automatyczny Doouncer.Wstępnie ostudzić szklankę Odbić w zlewce wypełnionej lodem. Napełnij dwa moździerze zawierające tłuczek i szpatułkę ciekłym azotem, aby schłodzić instrumenty. W międzyczasie dodaj jeden mililitr buforu homogenizacyjnego do szklanki Dounce.Napełnij obie moździerze ciekłym azotem i wlej 50 miligramów próbki ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej do jednego z moździerzy. W celu sproszkowania delikatnie dociśnij tłuczek do kawałka tkanki, aby rozbić go na małe kawałki. Gdy tkanka zostanie sproszkowana i nadal pozostaje 1/4 do 1/2 zaprawy ciekłego azotu.Przechylić zaprawę, zbierając sproszkowaną tkankę w krawędź moździerza. Gdy ciekły azot odparuje, zgarnij sproszkowaną tkankę do szklanki Dounce zawierającej bufor homogenizacyjny. W automatycznym Douncer przesuń szklankę Odbijaj tłuczek ze stali nierdzewnej w górę iw dół przez 10 uderzeń do przodu, a następnie 10 uderzeń w odwrotnym kierunku.Gdy roztwór jest mętny i wolny od widocznych fragmentów tkanki, przenieś go do wstępnie schłodzonej 1,7 mililitrowej probówki LoBind na lodzie. Przepłucz Dounce 400 mikrolitrami buforu homogenizacyjnego i przenieś go do probówki LoBind. Po zebraniu zhomogenizowanej ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej do 1,7 mililitrowej probówki LoBind na lodzie, dodaj 14 mikrolitrów 10%Triton X-100 do homogenatu.Inkubuj probówkę w ciemności na lodzie przez 10 do 15 minut, wirując co trzy minuty. W osobnej stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów, wstępnie zwilżone sitko komórkowe 1/100 i 1/40 mikronów ze 100 mikrolitrami D-P-B-S. Przefiltrować homogenat do sitka o wielkości 100 mikronów.Przepłucz 1,7-mililitrową probówkę LoBind 400 mikrolitrami buforu homogenizacyjnego i przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikronów. Następnie otrzymaną zawiesinę przefiltrować przez filtrat o wielkości 100 mikronów na sitku o wielkości 40 mikronów. Równomiernie rozprowadź roztwór w dwóch wstępnie schłodzonych 1,7 mililitrowych probówkach LoBind.Odwirować probówki o stężeniu 2 700 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzuć górną warstwę lipidową i supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów w pierwszej probówce. Delikatnie pipetuj w górę i w dół 20 razy bez tworzenia pęcherzyków, aby ponownie zawiesić granulkę w pierwszej probówce i przenieść do zawiesiny do nowej probówki LoBind o pojemności 1,7 mililitra.Następnie dodać 500 mikrolitrów pożywki do izolacji jąder do 1,7 mililitrowej probówki LoBind i wymieszać z pipetowaniem. Odwirować probówkę o sile 1000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów w probówce i delikatnie odpipetować, aby ponownie zawiesić osad.Następnie dodać 200 mikrolitrów pożywki do izolacji jąder i wymieszać zawiesinę. Dodaj jedną kroplę roztworu do barwienia żywych komórek i inkubuj w ciemności na lodzie. Po 15 minutach przefiltruj roztwór przez sitko o wielkości 30 mikronów.Wymieszać roztwór jąder i dodać 10 mikrolitrów do szkiełka w komorze do liczenia komórek. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek.

isolation-nuclei-from-human-intermuscular-adipose-tissue-downstream

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Opisujemy procedurę izolowania RNA o wysokiej integralności z bogatej w rybonukleazy trzustki myszy.

Izolacja RNA z trzustki myszy: tkanka bogata w rybonukleazę

Poznaj izolację jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder. Ta metoda umożliwia analizę transkryptomiczną komórek IMAT w chorobach metabolicznych.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Przeglądaj więcej filmów