Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności
April 19th, 2024
Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.
Staramy się zrozumieć, jak zachowują się mikroorganizmy, gdy są hodowane w warunkach naśladujących warunki rzeczywistego życia, w celu określenia mechanizmów napędzających zmiany fenotypowe w społecznościach wielogatunkowych w porównaniu ze wzrostem monokulturowym. Dzięki wykorzystaniu tego systemu in vitro scharakteryzowaliśmy szlak molekularny napędzający oporność Pseudomonas aeruginosa, znanego patogenu w kontekście zakażeń dróg oddechowych mukowiscydozy. Ze względu na format płytki 96-dołkowej i warunki wzrostu odzwierciedlające te obserwowane w płucach mukowiscydozy, możemy z łatwością badać szeroki zakres interakcji mikrobiomu.
Uzyskaliśmy wgląd w mechanizmy stojące za podatnością drobnoustrojów na środki przeciwdrobnoustrojowe w kontekście w pełni mikrobiomowym. Nasz model służy jako pomost między obserwacjami klinicznymi a indywidualnymi pracami laboratoryjnymi w badaniach nad mukowiscydozą, oferując cenne narzędzie do badania różnych interakcji mikrobiomu. Na początek przygotuj wszystkie wymagane odczynniki i pożywki.
W eksperymencie z jednoczesną hodowlą należy odwirować nocne kultury bakterii i umyć komórki sterylnym PBS. Po odwirowaniu ostrożnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę w jednym mililitrze 1X rozcieńczonej wodą pożywki ze sztucznej plwociny lub bazy ASM. Zmierzyć gęstość optyczną od 1 do 10 rozcieńczonych próbek o długości fali 600 nanometrów w spektrofotometrze lub czytniku płytek.
Rozcieńczyć każdą próbkę bakteryjną do końcowej gęstości optycznej 0,01 nanometra w odległości 600 nanometrów i dokładnie wirować przez pięć sekund. Dodać 100 mikrolitrów zawiesin monokultury i kokultury do trzech oddzielnych studzienek sterylnej plastikowej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem i inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach beztlenowych. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej usuń nieprzyłączone komórki planktonowe i uzupełnij wstępnie uformowane biofilmy 100 mikrolitrami świeżego ASM lub pożądanego odczynnika do zabiegu.
Po odessaniu komórek planktonu delikatnie przemyj biofilmy dwa razy 125 mikrolitrami sterylnego PBS i wylej roztwór do mycia. Dodaj 50 mikrolitrów sterylnego PBS. I za pomocą 96-pinowego replikatora delikatnie zeskrobał ogniwa z płytki.
Przenieść zawieszone komórki biofilmu do rzędu A nowej sterylnej płytki 96-dołkowej i wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie. Umieścić od trzech do pięciu mikrolitrów każdej próbki rozcieńczonej na płytkach agarowych. Po wyschnięciu plam inokulacji należy odpowiednio inkubować płytki.
Zaobserwowano kilka fenotypów, w tym zmniejszenie liczby żywotnych komórek Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus podczas hodowli w mieszanym zbiorowisku planktonicznym w porównaniu z monokulturą. Zaobserwowano wzrost wielodrobnoustrojowego wzrostu Streptococcus sanguinis i mieszany wzrost zbiorowiska Prevotella melaninogenica.
Przegląd
To badanie przedstawia nowy model wielogatunkowego biofilmu z czterema gatunkami, istotny dla środowisk płuc w mukowiscydozie (CF), mający na celu zrozumienie interakcji mikroorganizmów w wielogatunkowych środowiskach. Badania podkreślają mechanizmy zmian fenotypowych w Pseudomonas aeruginosa, istotnym patogenie w infekcjach dróg oddechowych CF, kiedy jest uprawiany razem z innymi gatunkami w kontrolowanym systemie.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Interakcje mikrobiomu mukowiscydozy
- Zachowanie patogenu w biofilmach
- Zmiany wrażliwości na antibiotyki
Tło
- Złożoność społeczności mikroorganizmów w płucach z mukowiscydozą
- Znaczenie badania interakcji międzygatunkowych
- Wpływ na strategie leczenia infekcji dróg oddechowych
Zastosowanie metod
- In vitro uprawa wielogatunkowego biofilmu
- Pseudomonas aeruginosa i inne gatunki
- Zastosowanie płytek 96-dołkowych i pomiarów gęstości optycznej
Główne wyniki
- Zmniejszenie liczby żywych komórek Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w kulturach mieszanych w porównaniu z kulturami pojedynczymi
- Wzrost Streptococcus sanguinis i Prevotella melaninogenica w warunkach wielogatunkowych
- Wgląd w wrażliwość na antybiotyki w różnych interakcjach mikrobiomu
Wnioski
- Badanie dostarcza cenne narzędzie do badania dynamiki mikroorganizmów w badaniach nad mukowiscydozą.
- Łączy wyniki laboratoryjne z obserwacjami klinicznymi, poprawiając rozumienie infekcji płuc.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Chronic polymicrobial biofilms in cystic fibrosis (CF) lungs present a major challenge for therapeutic development due to complex interspecies interactions and antimicrobial recalcitrance. This standardized four-species in vitro model enables mechanistic de-risking and predictive confidence in understanding microbial community phenotypes relevant to CF airway infections. The system bridges clinical microbiome observations with actionable R&D workflows, supporting portfolio decisions in anti-infective discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial phenotypes emerging from clinically relevant community interactions.
- Supports biological de-risking by modeling pathogen recalcitrance in a CF-like environment.
- Facilitates functional target validation for anti-biofilm and antimicrobial strategies.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective candidates.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible 96-well plate workflow for high-throughput screening of microbial communities.
- Standardizes assay conditions using artificial sputum medium and anoxic incubation.
- Generates quantitative outputs such as optical density and viable cell counts for robust comparison.
- Enables reliable evaluation of compound efficacy against polymicrobial biofilms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with clinical microbiome data from CF patients.
- Supports translational biomarker identification by modeling pathogen behavior in disease-relevant systems.
- Facilitates risk-adjusted advancement of anti-infective leads with improved disease relevance.
- Provides mechanistic insights into antimicrobial susceptibility shifts in mixed-species contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation for CF-related infections.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on interspecies interactions and antimicrobial recalcitrance mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible, and quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, optical density, and phenotypic shifts across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro microbial dynamics to clinical infection phenotypes in CF.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for ongoing anti-infective R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CF infection models.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability for multi-species biofilm assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in anti-infective pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates targeting chronic polymicrobial infections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology and biofilm cultivation under anoxic conditions.
- Needs access to 96-well plate readers, spectrophotometers, and sterile handling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- Adaptation may be needed for other disease-relevant microbial communities or model systems.
- Limitations include in vitro constraints and the need for careful interpretation relative to in vivo complexity.
