Name: Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Poznaj metodę budowy ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca z wykorzystaniem sferoidów wielokomórkowych A549-iRFP. Technika ta umożliwia dynamiczne monitorowanie progresji nowotworu i odpowiedzi na leczenie cisplatyną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty SAAG i SEED z Uniwersytetu Pacyfiku. Dziękujemy dr. Williamowi Chanowi za udzielenie dostępu do systemu Odyssey Infrared Imaging 205 oraz dr. Johnowi Liveseyowi za udzielenie dostępu do czytnika płytek SpectraMax iD3. Dziękujemy dr Melanie Felmlee za porady techniczne dotyczące protokołów leczenia zwierząt.

Badanie na zwierzętach zostało przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na University of the Pacific (protokoły dotyczące zwierząt 19R10 i 22R10). W niniejszym badaniu wykorzystano osiem samców atypowych myszy nudes w wieku 5–6 tygodni, o masie ciała 20–25 g, karmionych wskazaną dietą dla gryzoni i utrzymywanych w warunkach wolnych od patogenów (SPF). Klatki, ściółkę i wodę pitną autoklawowano i regularnie wymieniano. Schemat inokulacji guza u myszy przedstawiono na Rysunku 1. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i instrumentów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Utworzenie trójwymiarowych MCS komórek A549-iRFP
<ol>
	<li>Inkubować komórki A549-iRFP (ludzki gruczolakorak płuca) w atmosferze nawilżonej z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, hodując je w pełnej pożywce wzrostowej DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1 µg/mL puromycyny.</li>
	<li>Wysiać komórki A549-iRFP do 96-dołkowej mikropłytki do sferoidów o okrągłym dnie i bardzo niskim przywieraniu (ultra-low attachment) z gęstością 4 000 komórek/dołek, używając 100 µL pełnej pożywki wzrostowej uzupełnionej o 0,3% kolagenu.</li>
	<li>Wirować mikropłytki przy 300 × g przez 7 min w temperaturze 4 °C, aby ułatwić tworzenie się MCS. Zbadać morfologię MCS pod mikroskopem, aby upewnić się, że po wirowaniu nastąpiła agregacja komórek.</li>
	<li>Po 48 h dodać 100 µL pełnej pożywki wzrostowej do każdego dołka, aby uzyskać całkowitą objętość 200 µL pożywki wzrostowej na dołek.</li>
	<li>Wymieniać 100 µL pożywki wzrostowej w każdym dołku na świeżą pełną pożywkę wzrostową co drugi dzień.</li>
</ol>
2. Charakterystyka linii A549-iRFP MCS
<ol>
	<li>Obserwować i obrazować morfologię MCS za pomocą mikroskopu oraz oszacować objętość MCS poprzez symulację z wykorzystaniem odniesionego oprogramowania z MATLAB na podstawie obrazów z mikroskopu fazowo-kontrastowego.
	<ol>
		<li>Otworzyć jeden obraz MCS w oprogramowaniu ImageJ.</li>
		<li>Użyć funkcji Freehand selections, aby zaznaczyć krawędź MCS i dodać ją do ROI Manager.</li>
		<li>Kliknąć Edit | Selection | Create Mask.</li>
		<li>Kliknąć Edit | Invert.</li>
		<li>Kliknąć File | Save As | Tiff.</li>
		<li>Otworzyć oprogramowanie ReViSP.</li>
		<li>Otworzyć zapisany obraz TIFF, klikając Browse.</li>
		<li>Kliknąć Start, aby zakończyć symulację MCS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierzyć sygnał fluorescencyjny iRFP za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni na kanale 700 nm i skwantyfikować sygnał fluorescencyjny za pomocą oprogramowania (np. Image Studio).
	<ol>
		<li>Otworzyć oprogramowanie Image Studio.</li>
		<li>W karcie Channels wybrać 700 oraz Intensity = 5.</li>
		<li>W karcie Scan Controls wybrać 84 µm, Medium, 0.0 mm oraz Flip Image. Pozostałe ustawienia pozostawić domyślne.</li>
		<li>Kliknąć Start, aby rozpocząć skanowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocenić i skwantyfikować żywotność komórek za pomocą testu żywotności komórek 3D zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Ocenić i skwantyfikować białko komórkowe za pomocą testu BCA zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
3. Wybór MCS do inokulacji guza
UWAGA: Po wysianiu MCS do mikropłytek do sferoidów i ich hodowli przez 2-3 tygodnie z regularną wymianą pożywki wzrostowej, należy wybrać MCS o następujących odpowiednich charakterystykach do inokulacji nowotworu.
<ol>
	<li>Zaobserwować morfologię MCS pod mikroskopem i wybrać MCS o okrągłym kształcie z ogólnie gładkimi krawędziami, ale z 5-10 chropowatymi wypustkami (strzałki na Rysunku 2F) i średnicą w zakresie 700-800 µm.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję iRFP (patrz krok 2.2) i wybrać MCS, których sygnały fluorescencyjne mieszczą się w granicach jednego odchylenia standardowego od średniej.</li>
</ol>
4. Inokulacja wewnątrzopłucnowa MCS
UWAGA: Przed pracą ze zwierzętami należy oczyścić stanowisko chirurgiczne oraz narzędzia, używając 70% alkoholu izopropylowego w sprayu. Chirurg powinien przez cały czas trwania zabiegów chirurgicznych nosić sterylne rękawiczki.
<ol>
	<li>Zanurz każdą mysz w narkozie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo (IP) 80 mg/kg ketaminy i 12 mg/kg ksylazyny; uciśnij łapy myszy pęsetą, aby upewnić się, że znieczulenie jest pełne.</li>
	<li>Wstrzyknij podskórnie 0,05 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Nałóż maść oftalmiczną na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji grzbietowej na podgrzewaczu na podczerwień i przymocuj kończyny w pozycji rozciągniętej za pomocą taśm. 
	UWAGA: Zapewnij wsparcie termiczne znieczulonej myszy przez cały czas trwania procedury chirurgicznej.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę na grzbiecie, przecierając ją naprzemiennie jodyną i alkoholem, co najmniej po trzy razy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie o długości 0,5-1 cm za pomocą nożyczek chirurgicznych na lewej stronie grzbietu (Rysunek 1B). Ostrożnie rozdziel pęsetą tkankę mięśniową i tłuszczową, aż do momentu, gdy widoczna będzie ściana klatki piersiowej i ruchy płuc.</li>
	<li>Przenieś jedną wybraną MCS z mikropłytki do szklanej szalki Petriego zawierającej lodowaty PBS, używając pipety.</li>
	<li>Załóż igłę 20 G na szklaną strzykawkę 100 µL, schłodź je wcześniej na lodzie i pobierz 20 µL schłodzonej mieszaniny PBS i Matrigel (1:1 v/v).</li>
	<li>Użyj strzykawki, aby szybko zasysać jedną MCS z szalki Petriego w minimalnej objętości mieszaniny PBS-Matrigel, utrzymując MCS w metalowej części igły. 
	UWAGA: Mocno trzymaj strzykawkę i tłok, aby zapobiec wysunięciu się MCS z igły.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź igłę pionowo między dwa żebra na głębokość ok. 3 mm i powoli wstrzyknij całe 20 µL mieszaniny PBS i Matrigel zawierającej MCS. 
	UWAGA: Unikaj nadmiernej siły podczas wprowadzania igły, aby nie uszkodzić płuc, naczyń krwionośnych lub serca.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij igłę i nałóż na ranę maść z potrójnym antybiotykiem.</li>
	<li>Zamknij nacięcie za pomocą klipsów chirurgicznych, które należy usunąć po 2 tygodniach. 
	UWAGA: Nie zszywaj nacięcia, ponieważ szwy mogą zakłócać obrazowanie fluorescencyjne. Myszy nude są w stanie zagoić się naturalnie po operacji.</li>
	<li>Umieść zwierzę na podgrzewaczu na podczerwień i przykryj chusteczkami laboratoryjnymi, aby utrzymać temperaturę ciała. Monitoruj zwierzę przez co najmniej 30-60 min, aż się obudzi i zacznie prawidłowo poruszać.</li>
	<li>Wstrzykuj podskórnie 0,05 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny co 8 h przez pierwsze 48 h w celu złagodzenia bólu.</li>
</ol>
5. Monitorowanie pooperacyjne
<ol>
	<li>Mierz masę ciała co 3-4 dni.</li>
	<li>Mierz sygnał fluorescencyjny iRFP z ksenoprzeszczepu guza co 3-4 dni w systemie obrazowania małych zwierząt na kanale 700 nm w czterech pozycjach: lewej, prawej, grzbietowej i brzusznej, podczas gdy myszy są utrzymywane w narkozie poprzez inhalację izofluranu (przepływ: 1,5-2 L/min tlenu zawierającego 1,5% izofluranu) przez 2-3 min. 
	UWAGA: Przed umieszczeniem zwierzęcia na stacji obrazowania należy oczyścić system obrazowania małych zwierząt za pomocą sprayu z 70% alkoholu izopropylowego. Chirurg powinien nosić sterylne rękawiczki przez cały czas trwania procedur chirurgicznych.</li>
	<li>Ilościowo określ netto intensywność fluorescencji nowotworu ksenoprzeszczepionego in vivo przy użyciu oprogramowania (np. Image Studio).
	<ol>
		<li>Użyj stałego prostokąta (A1, 200 x 125 pikseli) jako okna próbkowania dla obszaru klatki piersiowej myszy.</li>
		<li>Użyj funkcji free-hand, aby obrysować kształt myszy w obrębie prostokąta (A1) i zmierz intensywność fluorescencji (F1) w obszarze A1.</li>
		<li>Użyj drugiego, mniejszego prostokąta (A2, 25 x 40 pikseli), aby zmierzylić fluorescencję tła (F2) myszy w obszarze uda.</li>
		<li>Użyj równania (1), aby obliczyć netto intensywność fluorescencji nowotworu ksenoprzeszczepionego u każdej myszy: 
		<img alt="Równanie netto intensywności fluorescencji F1-F2×A1/A2; wzór do analizy fluorescencji." src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">     (1)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Intrapulmonary Inoculation of Multicellular Spheroids to Model Orthotopic NSCLC

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathologic+classification+of+lung+cancer%3A+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li>
<li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).</li>
<li>Lim, Z. F., Ma, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+of+tumor+heterogeneity+and+drug+resistance+mechanisms+in+lung+cancer+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).</li>
<li>Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+heterogeneity+and+new+strategies+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).</li>
<li>Peterson, J. K., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+pharmacology+and+in+vivo+cancer+models+in+preclinical+and+clinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).</li>
<li>Mclemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+intrapulmonary+model+for+orthotopic+propagation+of+human+lung+cancers+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice.</a> Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Huang, B. W., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+3d+cultured+multicellular+spheroid+tumor+models+in+tumor-targeted+drug+delivery+system+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research.</a> J Control Release. 270, 246-259 (2018).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Sethi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+tissue+analogs+and+their+orthotopic+implants+for+understanding+tumor-targeting+of+microenvironment-responsive+nanosized+chemotherapy+and+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation.</a> Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).</li>
<li>Valta, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+of+lucap+136+patient-derived+xenograft+enables+versatile+preclinical+models+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapulmonary+inoculation+of+multicellular+spheroids+to+construct+an+orthotopic+lung+cancer+xenograft+model+that+mimics+four+clinical+stages+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).</li>
<li>Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer%3A+Biology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lung cancer: Biology and treatment options.</a> Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).</li>
<li>Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eighth+edition+lung+cancer+stage+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The eighth edition lung cancer stage classification.</a> Chest. 151 (1), 193-203 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Konstrukcja MCS A549-iRFP jest prostą i wysoce powtarzalną procedurą laboratoryjną i może być przełożona na tworzenie MCS dla wielu linii komórkowych. MCS wygenerowany za pomocą wirowania i kolagenu wykazuje bardziej integralną i solidną strukturę podobną do guza w ciągu 3-4 dni. Ta metoda zapewnia tworzenie wytrzymałych sferoid, które zachowują swoją integralną strukturę przez dłuższy czas, zwykle 2-3 tygodnie lub nawet dłużej, aż zaczną pojawiać się małe pączki. Stosując wirowanie i kolagen, ustandaryzowaliśmy tworzenie MCS, zapewniając ich spójność i niezawodność w naszym modelu eksperymentalnym. Takie podejście zwiększa powtarzalność naszych wyników i minimalizuje zmienność kinetyki wzrostu guza, zapewniając w ten sposób bardziej solidną platformę do badania biologii guza i interwencji terapeutycznych.
W przeciwieństwie do tradycyjnych jednowarstwowych hodowli komórkowych 2D, MCS 3D może rosnąć przez znacznie dłuższy czas, co najmniej 6 tygodni w tym badaniu. Aby monitorować wzrost i progresję raka, bardzo korzystny jest dynamiczny, długoterminowy pomiar ilościowy. Wiele istniejących testów MCS 3D jest destrukcyjnych podczas pomiarów, co ogranicza ich przydatność do długoterminowych ocen. Nieniszczący charakter pomiaru sygnałów fluorescencyjnych iRFP pozwala na ciągłe i długoterminowe monitorowanie wzrostu komórek nowotworowych w MCS 3D. Cecha ta jest szczególnie cenna przy ocenie skutków przewlekłego narażenia na leki przeciwnowotworowe oraz przy uchwyceniu dynamicznej ewolucji komórek nowotworowych w czasie. Sygnały fluorescencyjne iRFP emitowane przez A549-iRFP 3D MCS wykazywały silną korelację z tradycyjnymi pomiarami ilościowymi wzrostu sferoidów, w tym objętością sferoidy, żywotnością komórek i poziomami białek komórkowych. Podkreśla to wiarygodność sygnałów fluorescencyjnych jako wskaźnika zastępczego do oceny wzrostu komórek rakowych w MCS. Długa długość fali sygnałów fluorescencyjnych iRFP pozwala na ilościowe określenie wzrostu i progresji raka u małych zwierząt, co ma kluczowe znaczenie dla przedklinicznego rozwoju leków przeciwnowotworowych.
Aby zapewnić spójność tego ortotopowego modelu NSCLC, MCS musi być starannie wybrany do inokulacji dopłucnej. Podobny rozmiar i intensywność fluorescencji MCS są konieczne, aby zminimalizować zmienność; inokulacja większego MCS ma tendencję do powodowania większych różnic w progresji guza. Ponadto kontrolowanie chropowatości powierzchni MCS odgrywa kluczową rolę w zmniejszaniu zmienności. Podczas gdy niektóre MCS zachowywały gładkie krawędzie w miarę wzrostu, inne wykazywały bardziej szorstkie krawędzie w miarę wzrostu. W naszych rękach integralny, przypominający guza MCS po 2-3 tygodniach wzrostu w hodowli komórkowej z 5-10 pączkami na krawędziach dawał bardziej równomierny wzrost guza u myszy, podczas gdy te bez ostrych krawędzi lub te z rozluźnionymi strukturami i zbyt wieloma pączkami dawały bardziej zróżnicowane wzorce wzrostu guza po inokulacji. 
Podczas procesu transferu MCS ważne jest, aby obchodzić się z igłą 20 G z dużą ostrożnością. MCS powinien być przechowywany w skosie lub metalowej części igły, aby ograniczyć potencjalne uszkodzenia. Wybór rozmiaru igły został dokonany celowo, aby zachować równowagę między zapewnieniem żywotności MCS podczas inokulacji a zminimalizowaniem potencjalnego uszkodzenia płuc myszy. Większe rozmiary igieł mogą potencjalnie spowodować uszkodzenie tkanek myszy. Jeśli MCS utknie w igle lub jeśli w pierwszych dniach po inokulacji zaobserwuje się wiele fluorescencyjnych kropek, może to oznaczać, że zaszczepiony MCS został uszkodzony podczas inokulacji. Myszy wykazujące te cechy zostały wykluczone z dalszych badań i sklasyfikowane jako nieudane inokulacje.
Sferoidy wielokomórkowe (MCS) zostały zaszczepione w lewym płucu, a nie w prawym płucu w oparciu o względy anatomiczne. Lewe płuco ma dwa płaty ułożone jeden na drugim, zapewniając bardziej spójny i dostępny obszar docelowy w porównaniu z prawym płucem, które ma trzy płaty umieszczone obok siebie. W ten sposób lewe płuco umożliwia wysoce niezawodną inokulację w określonym obszarze, a mianowicie w lewym górnym płacie, co pomaga zmniejszyć różnice w powstawaniu i progresji guza. 
Oprócz fluorescencji iRFP w klatce piersiowej, masa ciała myszy z guzem służy jako ważny wskaźnik potwierdzający obciążenie guza. W miarę postępu raka ksenoprzeszczepu po inokulacji MCS, myszy po raz pierwszy wykazywały normalne zachowanie, w tym jedzenie, picie i czynności po przebudzeniu, aż do około 40 dnia, kiedy duże obciążenie guza, jak wykazano silną fluorescencją iRFP w klatce piersiowej, spowodowało zauważalny spadek masy ciała i utratę normalnego zachowania. Zgodnie z humanitarnymi wytycznymi, zwierzęta zostały poddane eutanazji przy 15-20% utracie masy ciała. Chociaż czas utraty wagi różnił się w zależności od partii, pasuje on do utraty normalnego zachowania zwierząt, a zatem może być również stosowany jako wiarygodny wskaźnik zdrowia zwierząt.
Progresja raka w ortotopowym modelu niedrobnokomórkowego raka płuca była monitorowana przede wszystkim za pomocą obrazowania fluorescencyjnego po lewej i brzusznej stronie, które wykazało stały i stały wzrost guza po inokulacji MCS. Fluorescencja od strony brzusznej wykazywała wolniejszy wzrost niż po stronie lewej, prawdopodobnie z powodu (1) głębokości iniekcji i (2) obecności zarówno guzów ortotopowych, jak i podskórnych w zaawansowanych stadiach raka. W szczególności MCS został zaszczepiony przez kości żebrowe do klatki piersiowej, która zdeponowała go na grzbietowej powierzchni lewego płuca, co wymagało czasu opóźnienia, aby MCS zrósł do brzusznej powierzchni lewego płuca w celu zobrazowania. W miarę wzrostu guz od czasu do czasu rozciągał się na wewnętrzną powierzchnię ściany klatki piersiowej, zbliżając go w ten sposób do skanera fluorescencyjnego, aby dać wyższe sygnały do obrazowania po lewej stronie. Dlatego obrazowanie fluorescencyjne po stronie brzusznej dokładniej przedstawiało guz w płucu, ale zwykle zajmowało więcej czasu, aby wykryć guz. Pod koniec obrazowania fluorescencyjnego in vivo , zwierzęta zostały uśmiercone i poddane sekcji klatki piersiowej i obrazowaniu ex vivo , które nie tylko potwierdziło powstanie guza ortotopowego po inokulacji MCS, ale także wykazało wiele cech anatomicznych, które podsumowały cztery etapy kliniczne NSCLC u ludzi. 
W pilotażowym badaniu skuteczności silna korelacja między obrazowaniem ex vivo płuc a obrazowaniem in vivo myszy z guzem potwierdza wiarygodność metodologii dynamicznego obrazowania fluorescencyjnego in vivo . Ortotopowy model niedrobnokomórkowego raka płuca niezawodnie reagował na leczenie przeciwnowotworowe zarówno poprzez wolniejszy wzrost guza jako kluczowy wskaźnik skuteczności terapeutycznej, jak i przez utratę masy ciała jako kluczowy wskaźnik toksyczności leku. Takie odpowiedzi pokazały, że model jest cennym narzędziem do oceny przedklinicznej i opracowywania potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Przerzuty, cecha charakterystyczna raka płuc, zostały wiernie odwzorowane w modelu, a co ważniejsze, były niezawodnie hamowane przez lek przeciwnowotworowy cisplatynę. W tym badaniu pilotażowym zaobserwowano wolniejszy wzrost guza po zaledwie dwóch wstrzyknięciach cisplatyny, co sugeruje, że bardziej znaczące działanie przeciwnowotworowe cisplatyny wynikałoby z bardziej istotnego klinicznie schematu czterech dawek tygodniowych. 
Ortotopowy model niedrobnokomórkowego raka płuca przedstawiony w tym raporcie ma kilka ważnych zalet w porównaniu z wieloma powszechnymi modelami zwierzęcymi raka płuc. W porównaniu z podskórnymi modelami ksenoprzeszczepu raka płuc, model ten oferuje bardziej odpowiednie mikrośrodowisko tkankowe wokół guzów; W porównaniu z genetycznie modyfikowanym modelem myszy, model ten oferuje wygodniejsze procedury eksperymentalne oraz bardziej powtarzalną progresję guza i przeżywalność zwierząt. Kompleksowe porównanie tego modelu z innymi modelami raka płuc jest dostępne w naszej poprzedniej publikacji18. Podobnie jak w przypadku innych zwierzęcych modeli ksenoprzeszczepów, jednym z ograniczeń tego modelu jest brak kompletnego układu odpornościowego, który jest ważnym składnikiem nowotworów u ludzi. Dodatkowo, zaszczepiony MCS w tym modelu czasami rozwija pierwotny guz ksenoprzeszczepu na wewnętrznej powierzchni ściany klatki piersiowej. W związku z tym procedury eksperymentalne mające na celu łatwe wykrycie i zminimalizowanie takiego rozwoju powinny zostać włączone do przyszłych badań w celu ulepszenia tego modelu. Ponadto przeprowadzone zostaną badania z udziałem obu płci w celu uzyskania bardziej wszechstronnego zrozumienia biologii guza i odpowiedzi na leczenie niedrobnokomórkowego raka płuca. Podsumowując, mysi ortotopowy model ksenoprzeszczepu raka płuc przedstawiony w tym raporcie stanowi pionierskie i solidne narzędzie do rekapitulacji progresji raka płuc i oceny leczenia przeciwnowotworowego. Model ten ma ogromny potencjał w zakresie pogłębiania naszej wiedzy na temat patologii niedrobnokomórkowego raka płuca i opracowywania odpowiednich interwencji terapeutycznych.

Wśród wszystkich zaburzeń onkologicznych, rak płuc nie tylko powoduje największą liczbę ofiar śmiertelnych, ale także generuje drugą co do wielkości liczbę nowych pacjentów każdego roku w USA1. Ten niszczycielski nowotwór złośliwy stanowi główną przeszkodę we współczesnej opiece zdrowotnej, domagając się głębszego zrozumienia jego skomplikowanej biologii i bardziej skutecznych metod terapeutycznych2. Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) stanowi 85% przypadków raka płuc i ma tendencję do przekształcania się w guzy lite3. Jednym z największych wyzwań w raku płuc jest dynamiczne i niejednorodne mikrośrodowisko guza, które ma głęboki wpływ na postęp nowotworu i reakcje na interwencje terapeutyczne4,5,6. Głębsze zrozumienie wzajemnych oddziaływań między komórkami nowotworowymi i ich mikrośrodowiskiem na różnych etapach niedrobnokomórkowego raka płuca wymaga udoskonalonych modeli patologicznych, które podsumowują histologiczne cechy progresji niedrobnokomórkowego raka płuca.
W związku z tym, ortotopowe modele zwierzęce jawią się jako obiecująca droga do badań nad NSCLC. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych podskórnych modeli ksenoprzeszczepów7, modele ortotopowe zawierają komórki rakowe, które są bezpośrednio inokulowane w narządzie pochodzenia. W przypadku raka płuc oznacza to wszczepienie komórek rakowych bezpośrednio do tkanki płucnej8,9. W związku z tym ortotopowe modele raka płuc lepiej naśladują natywne mikrośrodowisko guza, w tym sąsiednie tkanki, naczynia i składniki odpornościowe, poprawiając w ten sposób ich znaczenie fizjologiczne i kliniczne.
Trójwymiarowe sferoidy wielokomórkowe (MCS) reprezentują kolejne obiecujące podejście do rekapitulacji cech środowiska nowotworowego. Większość nowotworów charakteryzuje się złożonym mikrośrodowiskiem guza, w tym różnymi interakcjami komórka-komórka, macierz zewnątrzkomórkowa oraz gradienty tlenu i składników odżywczych10,11. Tradycyjne hodowle komórkowe 2D nie są wystarczająco złożone przestrzennie i strukturalnie, aby podsumować te specyficzne dla nowotworu cechy12. Natomiast MCS o odpowiedniej wielkości charakteryzują się niejednorodną strukturą z niedotlenionym i martwiczym rdzeniem, który podsumowuje nie tylko mikrośrodowisko wewnątrznowotworowe, ale także fizjologiczną barierę przed przenikaniem leków, co jest głównym mechanizmem oporności na leki w terapii przeciwnowotworowej13,14,15.
Korzystając zarówno z ortotopowych modeli zwierzęcych, jak i technik hodowli MCS, MCS został zaszczepiony myszom z obniżoną odpornością, aby z powodzeniem zbudować ortotopowe modele raka piersi i raka prostaty16,17. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółową metodologię konstruowania i charakteryzowania mysiego ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu raka płuc. Metoda ta wykorzystuje inokulację dopłucną 3D MCS pochodzącego z fluorescencyjnych ludzkich komórek raka płuc (A549-iRFP)18. Model ten daje wyjątkową możliwość obserwowania progresji raka płuca in vivo w etapach, które są ściśle równoległe do czterech stadiów klinicznych NDRP. Co więcej, rak ksenoprzeszczepu tego modelu zareagował na klinicznie ustalony lek przeciw rakowi płuc, cisplatynę.

<table><tbody><tr><td>100 &mikro; L Szklana strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>Część / REF #80601</td><td></td></tr><tr><td>Igła 20 G</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>14 826D</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka sferoidalna o bardzo niskim stopniu mocowania&nbsp;</td><td>Corning</td><td>15-100-173</td><td></td></tr><tr><td>A549-iRFP</td><td>Imanis Nauki Przyrodnicze&nbsp;</td><td>CL082-STAN</td><td></td></tr><tr><td>AIN-93M Dieta dla dojrzałych gryzoni&nbsp;</td><td>Badania dietetyczne, Inc.</td><td></td><td></td>D10012M</tr><tr><td>Atymyczna naga mysz</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td>Kod szczepu: 490; homozygotyczny</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek buprenorfiny</td><td>Patterson Weterynaryjny</td><td>numer NDC: 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>Gibco</td><td>A1064401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narzędzie open source (https://imagej.net/ij/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Wersja 5.2</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Weterynaryjny</td><td>numer NDC: 17033-0091-25</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson Weterynaryjny</td><td>numer NDC: 50989-0161-06</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Numer modelu Keyence</td><td>: BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Infrared Imaging 205 System&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Numer modelu: 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td> System obrazowania małych zwierząt Corning MT21040CV <td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Numer modelu: 9430</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>AAJ67236XF</tr><tr><td>Oprogramowanie ReViSP firmy MATLAB&nbsp;</td><td>Narzędzie open source na Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td> <td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>klipsów chirurgicznych - AutoClip System</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC Numer: 61133-6017-01</td><td></td></tr></tbody></table>

budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) jest wysoce śmiertelną chorobą o złożonym i niejednorodnym mikrośrodowisku nowotworowym. Obecnie powszechne modele zwierzęce oparte na podskórnej inokulacji zawiesin komórek nowotworowych nie oddają mikrośrodowiska guza w NSCLC. W niniejszym artykule opisujemy mysi ortotopowy model ksenoprzeszczepu raka płuc, który wykorzystuje inokulację wewnątrzpłucną trójwymiarowych wielokomórkowych sferoid (MCS). W szczególności fluorescencyjne ludzkie komórki NSCLC (A549-iRFP) hodowano w 96-dołkowych mikropłytkach o niskim przyczepie z kolagenem przez 3 tygodnie w celu utworzenia MCS, które następnie zaszczepiono międzyżebrowo w lewym płucu nagich myszy atymicznych w celu ustalenia ortotopowego modelu raka płuc.
W porównaniu z oryginalną linią komórkową A549, MCS linii komórkowej A549-iRFP reagował podobnie na leki przeciwnowotworowe. Sygnał fluorescencyjny o dużej długości fali komórek A549-iRFP silnie korelował z powszechnymi markerami wzrostu komórek rakowych, w tym objętością sferoidalną, żywotnością komórek i poziomem białek komórkowych, umożliwiając w ten sposób dynamiczne monitorowanie wzrostu raka in vivo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Po inokulacji myszom ksenoprzeszczep MCS A549-iRFP niezawodnie przechodził przez fazy bardzo przypominające stadia kliniczne NSCLC, w tym ekspansję guza pierwotnego, pojawienie się sąsiednich guzów wtórnych i przerzuty komórek rakowych do przeciwległego prawego płuca i odległych narządów. Co więcej, model zareagował na wzorcowy lek przeciw rakowi płuc, cisplatynę, z przewidywaną toksycznością i wolniejszym postępem nowotworu. W związku z tym ten mysi ortotopowy model ksenoprzeszczepu NSCLC posłużyłby jako platforma do podsumowania postępu choroby i ułatwienia opracowania potencjalnych leków przeciwnowotworowych.

Charakterystyka linii A549-iRFP MCS 
Sferoidy A549-iRFP (MCS) zostały pomyślnie wyhodowane w mikropłytkach do sferoidów przy zastosowaniu kolagenu i wirowania. Gdy MCS osiągnęły średnicę około 500 µm Po 1 tygodniu zarówno MCS A549, jak i MCS A549-iRFP poddano działaniu różnych leków przeciwnowotworowych i ich formulacji przez 3 dni, a następnie utrzymywano w pożywce wzrostowej wolnej od leków przez kolejne 4 dni. MCS A549-iRFP wykazały wzorzec odpowiedzi ściśle odzwierciedlający odpowiedź komórek macierzystych A549. MCS A549 oraz MCS A549-iRFP wykazały podobne krzywe dawka-odpowiedź oraz IC50 wartości w stosunku do cisplatyny, jednego z leków pierwszego rzutu stosowanych w leczeniu raka płuc (Rycina 2A)Żywotność komórek A549 oraz A549-iRFP MCS była hamowana w podobnym stopniu przez inne leki przeciwnowotworowe lub ich formulacje. (Rycina 2B).
Sferoidy (MCS) A549-iRFP monitorowano przez okres do 6 tygodni, analizując fluorescencję iRFP, żywotność komórek oraz poziom białek komórkowych. Objętość MCS oszacowano za pomocą symulacji programowej na podstawie obrazów z mikroskopu fazowego; symulowana morfologia wykazywała kształty zbliżone do tych zarejestrowanych za pomocą mikroskopii i sygnału fluorescencyjnego (Rycina 2C). Żywotność komórek w MCS A549-iRFP określono za pomocą testu żywotności komórek 3D, a metodę tę zwalidowano na MCS o różnych rozmiarach, o średnicach od 350 do 950 µm. Nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy różnymi stosunkami objętości medium hodowlanego zawierającego MCS a odczynnikiem testowym, ani pomiędzy różnymi czasami wytrząsania (5 minut i 10 minut) (Supplementary Figure S1). Poziom wszystkich czterech biomarkerów wzrastał wraz z czasem, przy czym większe wariacje odnotowano w późniejszych punktach czasowych (Rycina 2D). Fluorescencja iRFP wykazała silne korelacje z pozostałymi trzema tradycyjnymi pomiarami ilościowymi MCS: objętością (Pearson r = 0.9307, p &lt; 0.0001), żywotnością komórek (Pearson r = 0.7666, p &lt; 0.0001) oraz białkiem komórkowym (Pearson r = 0.7317, p &lt; 0.0001) (Rycina 2E).
Progresja guza u myszy 
Po 2-3 tygodniach hodowli wybrano sferoidy (MCS) A549-iRFP o odpowiednich charakterystykach, obejmujących morfologię, średnicę MCS, odpowiednio chropowate krawędzie oraz sygnał fluorescencyjny (szczegółowe parametry opisano w sekcji 3 protokołu), do inokulacji guza. Po zabiegu inokulacji guza masę ciała myszy z guzem mierzono co 3 dni i przedstawiano jako stosunek zmiany w porównaniu z masą w dniu 0 bezpośrednio przed operacją. Masa ciała myszy nieznacznie spadła po operacji i szybko powróciła do normy w ciągu 1 tygodnia. Bez leczenia masa ciała stopniowo rosła do ok. 40 dnia, lecz w kolejnym tygodniu gwałtownie spadła (~15%), co doprowadziło do eutanazji myszy (trzykrotna dawka anestezyku: 80 mg/kg ketaminy i 12 mg/kg ksylazyny w zastrzyku IP) zgodnie z wytycznymi IACUC (Rycina 3A). Myszy z guzem obrazowano co 3 dni w czterech pozycjach: lewej, grzbietowej, prawej i brzusznej. Spośród nich pozycję lewą (miejsce inokulacji guza) oraz brzuszną (gdzie można zaobserwować obie strony płuc) wybrano jako kluczowe pozycje do kwantyfikacji netto natężenia fluorescencji zgodnie z równaniem (1) (Rycina 3B,C). Natężenie fluorescencji netto w obu pozycjach wykazało podobny trend progresji guza, przy czym fluorescencja po stronie brzusznej rosła nieco wolniej niż po stronie lewej.
Ksenoprzeszczep MCS w tym modelu ortotopowym postępował przez wyraźne fazy odzwierciedlające cztery stadia kliniczne NSCLC (Rycina 3D)18,19,20. Około 8. dnia po inokulacji MCS w lewym płucu pojawiła się skoncentrowana fluorescencja, co oznaczało powstanie zlokalizowanego guza odpowiadającego stadium 1 NSCLC w warunkach klinicznych. Około 11. dnia fluorescencja wyraźnie się zintensyfikowała i/lub rozprzestrzeniła na wiele miejsc w lewym płucu, co wskazywało na obecność guza lub guzów przypominających stadium 2 NSCLC. Następnie, około 18. dnia, od strony brzusznej zaobserwowano zwiększone sygnały fluorescencyjne, co sugerowało progresję ksenoprzeszczepu charakterystyczną dla stadium 3. Co więcej, badanie anatomiczne i obrazowanie ex vivo ujawniły wzrost guza na powierzchni serca, co jest istotną cechą charakterystyczną dla stadium 3 NSCLC. Około 27. dnia po inokulacji MCS po obu stronach płuc pojawiła się fluorescencja perfuzyjna, a badanie anatomiczne po otwarciu klatki piersiowej wykazało perfuzyjny wzrost guza w sercu, tchawicy i głównych naczyniach krwionośnych, co świadczyło o przerzutach nowotworowych podobnych do stadium 4 NSCLC.
Odpowiedź myszy z nowotworem na cisplatynę 
Przeprowadzono pilotażowe badanie skuteczności na tym ortotopowym mysim modelu raka płuca. Dziesięć dni po inokulacji guza, myszom z nowotworem wstrzykiwano dożylnie przez ogon cisplatynę w dawce 5 mg/kg lub sól fizjologiczną, raz w tygodniu, łącznie w dwóch iniekcjach. Zdjęcia strony brzusznej myszy z nowotworem przedstawiono w Rycina 4AMasę ciała oraz fluorescencję guza monitorowano co 3–4 dni. W porównaniu z grupą otrzymującą sól fizjologiczną myszy w grupie cisplatyny odnotowały znaczną utratę masy ciała po każdym wtryśnięciu cisplatyny, jednak masa ta uległa regeneracji w tygodniach następujących po leczeniu cisplatyną. (Rycina 4B)W grupie otrzymującej cisplatynę odnotowano wolniejszą tendencję wzrostu netto intensywności fluorescencji niż w grupie otrzymującej sól fizjologiczną. (Rysunek 4C)Na koniec in vivo podczas monitorowania fluorescencji zwierzęta zostały uśmiercone, a ich płuca wypreparowane i poddane obrazowaniu fluorescencyjnemu. Po normalizacji względem całkowitej ilości białka tkankowego potwierdzono, że intensywność fluorescencji płuc wypreparowanych od myszy z grupy cisplatyny była niższa niż w grupie soli fizjologicznej. (Rysunek 4E)W obrazowaniu fluorescencyjnym strony brzusznej (Rysunek 4A)obrazy w czerwonych prostokątach wskazują pierwszy moment, w którym fluorescencja guza została uwidoczniona w obu płucach (lewym i prawym), co jest kluczowym wskaźnikiem przerzutowania nowotworu w IV stadium niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Cisplatyna, jeden z leków pierwszego rzutu w leczeniu raka płuca, spowolniła przerzutowanie nowotworu z lewego płuca do prawego płuca (Rysunek 4D).
<img alt="Schemat badania agregacji komórek i MCS; mikropłytki do sferoidów, wirowanie, etapy leczenia lekami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat blokowy badania. (A) Wysiewanie komórek A549-iRFP do mikropłytek do sferoidów w celu utworzenia MCS z pomocą kolagenu i wirowania. (B) Inokulacja wewnątrzopłucnowa MCS A549-iRFP o odpowiednich charakterystykach do lewego płuca myszy w celu stworzenia ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu raka płuc, naśladującego cztery stadia raka płuc w warunkach klinicznych. Biała strzykawka zawierająca jeden MCS oznacza inokulację guza, natomiast dwie czerwone strzykawki oznaczają podawanie leku drogą dożylną przez żyłę ogonową. Skrót: MCS = wielokomórkowy sferoid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki testu żywotności 3D MCS; krzywe stężeń, wykresy słupkowe, wykresy czasowe, korelacja fluorescencji iRFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka MCS A549-iRFP. (A) Krzywe zależności dawka-odpowiedź MCS A549-iRPF i MCS A549 na cisplatynę po 3-dniowej ekspozycji i 4-dniowym wzroście bez leku (średnia ± SD, N = 3-4). (B) Żywotność komórek MCS A549-iRFP po 3-dniowej ekspozycji na leczenie przeciwnowotworowe (cisplatynę, paklitaksel lub dwie formulacje leków opracowane wewnętrznie) i 4-dniowym wzroście bez leku (średnia ± SD, N = 3-4). (C) Badania morfologiczne reprezentatywnych MCS A549-iRFP po 1-6 tygodniach hodowli za pomocą mikroskopii fazowej (C1, pasek skali = 500 µm), konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (C2) i symulacji programowej (C3). (D) Dynamiczna zmiana fluorescencji iRFP, objętości, żywotności komórek i białka komórkowego MCS A549-iRFP w ciągu 1-6 tygodni (N = 10 dla fluorescencji iRFP i objętości; N = 5 dla żywotności komórek i białka komórkowego). (E) Korelacja fluorescencji iRFP MCS A549-iRFP z trzema innymi tradycyjnymi pomiarami wzrostu (objętością, żywotnością komórek i białkiem komórkowym) w ciągu 1-6 tygodni (N = 60). (F) Przykład MCS A549-iRFP o odpowiednich charakterystykach do inokulacji guza (pasek skali = 500 µm). Skrót: MCS = sferoid wielokomórkowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie progresji raka; wykres masy ciała, obrazowanie fluorescencyjne, wyniki obserwacji anatomicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Progresja guza w ortotopowym mysim modelu NSCLC. (A) Zmiana masy ciała myszy po inokulacji guza (średnia ± SEM, N = 5). (B) Dynamiczna zmiana netto intensywności fluorescencji u myszy z guzami na podstawie obrazowania bocznego lewego (N = 5). (C) Dynamiczna zmiana netto intensywności fluorescencji u myszy z guzami na podstawie obrazowania brzusznego (N = 5). (D) Progresja raka odzwierciedlająca cztery stadia kliniczne NSCLC. Obrazowanie bocznego lewego, obrazowanie brzuszne, obserwacja anatomiczna (żółte strzałki wskazują guzy w płucach i na powierzchni serca) oraz obrazowanie ex-vivo reprezentatywnych myszy z guzami w czterech stadiach. Rycina pochodzi z pracy Huang et al.18. Skrót: NSCLC = niedrobnokomórkowy rak płuca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie wzrostu guza; fluorescencja, masa ciała, dane o guzach; wykresy, porównanie wyników dla soli fizjologicznej i cisplatyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reakcja myszy z guzami na cisplatynę. (A) Obrazowanie strony brzusznej myszy z guzami po leczeniu solą fizjologiczną lub cisplatyną (obrazy w czerwonych prostokątach wskazują moment, w którym fluorescencja guza staje się po raz pierwszy widoczna zarówno w lewym, jak i prawym płucu). (B) Zmiana masy ciała myszy z guzami po leczeniu solą fizjologiczną lub cisplatyną (Średnia ± SEM, N = 3-4). (C) Dynamiczna zmiana wypadkowej intensywności fluorescencji u myszy z guzami po leczeniu solą fizjologiczną lub cisplatyną na podstawie obrazowania strony brzusznej (Średnia ± SEM, N = 3-4). (D) Procent myszy wykazujących fluorescencję guza w obu płucach (lewym i prawym). (E) Znormalizowana intensywność fluorescencji płuc wyciętych od myszy uśmierconych po zakończeniu obrazowania fluorescencyjnego in vivo (Średnia ± SEM, N = 3-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek uzupełniający S1: 3D test żywotności komórek w MCS A549-iRFP o różnych średnicach. (A) ~350 µm; (B) ~550 µm; (C) ~750 µm; (D) ~950 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787_Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

To badanie przedstawia ortotopowy model niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) oparty na wewnątrzpłucnej inokulacji wielokomórkowych sferoid fluorescencyjnych komórek A549-iRFP. Model podsumowuje kliniczne stadia niedrobnokomórkowego raka płuca i reaguje na cisplatynę, zgodnie z dynamicznym monitorowaniem in vivo fluorescencji na długich falach.

Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

Nasze badania koncentrowały się na opracowaniu nanoformulacji leków przeciwnowotworowych. Aby ocenić działanie przeciwnowotworowe, ustaliliśmy lustrzany model niedrobnokomórkowego raka płuca poprzez inokulację wielokomórkowych sferoidów. Naszym celem jest zweryfikowanie zdolności tego modelu do replikacji etapów klinicznych, progresji nowotworu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i reagowania na leczenie terapeutyczne.Naszym celem jest stworzenie bardziej istotnego klinicznie modelu niedrobnokomórkowego raka płuca. Tradycyjny model wykorzystujący podskórną inokulację zawiesiny komórek 2D nie był wierny mikrośrodowisku guza i postępowi choroby. Wykorzystując sferoidy wielokomórkowe i inokulację autotroficzną, wypełniamy lukę, lepiej naśladując złożoność niedrobnokomórkowego raka płuc i odpowiedź na terapię.Dzięki temu autotroficznemu modelowi zwierzęcemu otworzyliśmy możliwości badania mikrośrodowiska guza niedrobnokomórkowego raka płuc i badania przesiewowego normalnej cząsteczki pod kątem aktywności przeciwnowotworowej. Nasze odkrycie utorowało drogę do głębszego wyjaśnienia biologii nowotworów i rozwoju terapii przeciwnowotworowych. Aby rozpocząć, ustal trójwymiarowe wielokomórkowe sferoidy lub MCS z ludzkiego gruczolakoraka płuc lub komórek A549-iRFP.Zasiej komórki w 96-dołkowej, bardzo nisko przylegającej, sferoidalnej mikropłytce z okrągłym dnem, używając 100 l kompletnej pożywki wzrostowej uzupełnionej 0,3% kolagenu. Odwirować mikropłytki o stężeniu 300 G przez 7 minut w temperaturze 4 °C, aby ułatwić tworzenie MCS. Po odwirowaniu zbadaj morfologię sferoidów pod mikroskopem, aby zapewnić agregację komórek.Zastępować 100 l podłoża wzrostowego w każdym dołku świeżą, kompletną pożywką co drugi dzień. Obserwując pod mikroskopem, wybieraj sferoidy o okrągłym kształcie i ogólnie gładkich krawędziach, ale z 5 do 10 szorstkimi cieniami i odpowiednią średnicą. Zmierz fluorescencję IRFP, aby wybrać MCS z sygnałami fluorescencyjnymi w zakresie 1 odchylenia standardowego od średniej.Rozpocznij zabieg chirurgiczny na odpowiednio znieczulonej myszy, wstrzykując podskórnie chlorowodorek buprenorfiny w celu zmniejszenia bólu. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Ułóż mysz w pozycji grzbietowej i zabezpiecz kończyny w pozycji rozciągającej za pomocą taśm.Zdezynfekuj skórę pleców za pomocą naprzemiennych wacików z jodem i alkoholem co najmniej trzy razy każdy. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wytnij nacięcie o długości od 0,5 do 1 cm po lewej tylnej stronie zwierzęcia. Ostrożnie użyj kleszczy, aby oddzielić tkankę mięśniową i tłuszczową, aż ściana klatki piersiowej i ruch płuc będą widoczne.Za pomocą pipety przenieś jedną wybraną wielokomórkową sferoidę lub MCS z mikropłytki na szklaną szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS. Przymocuj igłę o rozmiarze 20 do szklanej strzykawki o pojemności 100 l i wstępnie schłodź je na lodzie. Następnie narysuj 20 l wstępnie schłodzonej mieszanki PBS i Matrigel.Za pomocą strzykawki szybko odessać 1 MCS z płytki Petriego w minimalnej objętości mieszaniny PBS/Matrigel, utrzymując sferoidę w metalowej części igły. Delikatnie wprowadzić igłę pionowo między dwie kości żeber na głębokość około 3 mm i powoli wstrzyknąć całe 20 l mieszaniny zawierającej odessany MCS. Następnie ostrożnie wyjmij igłę.Nałóż potrójną maść z antybiotykiem na ranę. Uszczelnij nacięcie klipsami chirurgicznymi, które zostaną usunięte po dwóch tygodniach. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej na podczerwień i przykryj je chusteczkami laboratoryjnymi, aby utrzymać temperaturę ciała.Monitoruj zwierzę przez co najmniej 30 do 60 minut, aż się obudzi i będzie się prawidłowo poruszać. Używając systemu obrazowania małych zwierząt w kanale 700 nm, mierz sygnał fluorescencyjny IRFP z ksenoprzeszczepu guza znieczulonej myszy co trzy do czterech dni. Zmierz fluorescencję w czterech pozycjach: lewej, prawej, grzbietowej i brzusznej.Intensywność fluorescencji netto zarówno po stronie lewej, jak i brzusznej wykazywała podobny trend progresji guza przy fluorescencji od strony brzusznej, rosnącej nieco wolniej niż fluorescencja po stronie lewej.

construction-an-orthotopic-xenograft-model-non-small-cell-lung-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.

Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Tutaj opisujemy minimalnie inwazyjny model syngenicznego przeszczepu ortotopowego komórek gruczolakoraka płuc myszy jako model redukujący czas i koszty do badania niedrobnokomórkowego raka płuc.

Ortotopowe przeszczepienie komórek syngenicznego gruczolakoraka płuc w celu zbadania ekspresji PD-L1

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Obecny protokół ustanawia i charakteryzuje model ksenoprzeszczepu (PDX) anaplastycznego raka tarczycy (ATC) oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) pochodzącego od pacjenta, ponieważ modele PDX szybko stają się standardem w dziedzinie onkologii translacyjnej.

Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Poznaj metodę budowy ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca z wykorzystaniem sferoidów wielokomórkowych A549-iRFP. Technika ta umożliwia dynamiczne monitorowanie progresji nowotworu i odpowiedzi na leczenie cisplatyną.

Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków (Wideo) | JoVE Journal

Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków

Przeglądaj więcej filmów