Name: Obrazowanie i kwantyfikacja unaczynienia wątroby myszy za pomocą ultraszybkich ultradźwięków dopplerowskich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania naczyń wątrobowych u myszy za pomocą ultraszybkiego ultrasonografii dopplerowskiej. Protokół UFUS umożliwia precyzyjną kwantyfikację objętości krwi bez stosowania środków kontrastowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy M.S. Zuurmondowi (Centrum Medyczne Uniwersytetu w Lejdzie) za przygotowanie ilustracji graficznych. Ten protokół został zaczerpnięty i zaadaptowany z naszej wcześniej opublikowanej oryginalnej pracy de Haan et al. 202216. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o grant nr 813839 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie"; Niderlandzka Organizacja Badań i Rozwoju Zdrowia (ZonMw) PTO 446002501 we współpracy z CVON-PHAEDRA Impact; Health Holland (PPS-Match call LUMC Top sector LSH 2020), projekt NV-STAB; Centrum Medycyny Komórek Macierzystych Fundacji Novo Nordisk, które jest wspierane przez grant Fundacji Novo Nordisk (NNF21CC0073729); przez Europejską Radę ds. Innowacji, program EIC Pathfinder Project MICROVASC nr 101070917; Francuska Narodowa Agencja Badawcza ANR-17-T171105J-RHUS-0009 projekt RHU Quid-Nash; Francuska Narodowa Agencja Badawcza ANR-22-CE19-0034-03, projekt Peri-fUS; oraz INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Akcelerator Badań Technologicznych w Ultrasonografii Biomedycznej.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z prawodawstwem europejskim (Dyrektywa 2010/63/UE) oraz wytycznymi rządu holenderskiego i zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie.
1. Przygotowanie myszy do obrazowania UFUS (Czas ~ 10 min)
<ol>
	<li>Przygotowanie stanowiska do obrazowania
	<ol>
		<li>Odwirować żel transmisyjny ultradźwięków w probówkach o pojemności 50 ml o pojemności 100 x g przez 3-5 minut, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Włącz poduszkę grzewczą i rozgrzej do 35 °C. Napełnij wydrukowany w 3D zbiornik na wodę wodą dejonizowaną. 
		UWAGA: Pęcherzyki wody lub małe cząstki obecne w wodzie mogą zakłócać pomiar dopplerowski.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie zwierzęcia
	<ol>
		<li>Zważ zwierzę. Wykorzystano samce i samice z miotu w wieku 8-16 tygodni o masie ciała 19-32 g. Przygotować mieszankę znieczulającą składającą się z ketaminy w dawce 100 mg/kg i ksylazyny 10 mg/kg w 0,9% NaCl. Codziennie przygotowuj mieszaninę sterylną i świeżą, ponieważ mieszanina nie jest stabilna i może stracić moc. 
		UWAGA: Preferowana masa ciała zwierzęcia wynosi od 23 do 30 g.</li>
		<li>Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia, tj. dolną prawą lub lewą ćwiartkę brzucha, za pomocą gazy i 70% etanolu. Wstrzyknąć dootrzewnowo (ip) 10 μl/g masy ciała za pomocą igły 27G i jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml lub strzykawki insulinowej 30G.</li>
		<li>Umieść zwierzę z powrotem w klatce na poduszce grzewczej bez zamykania pokrywy klatki. Minutnik startowy. 
		UWAGA: Głębokie znieczulenie powinno trwać około 40 minut. Jeśli pożądana jest dłuższa sesja obrazowania, należy rozważyć zastosowanie znieczulenia odwracalnego, takiego jak mieszaniny ketaminy 60 mg/kg i medetomidyny 0,4 mg/kg w 0,9% NaCl, a następnie odwrócenie poprzez podskórne wstrzyknięcie Atipamezolu 1 mg/kg. Znieczulenie iniekcyjne jest preferowane w stosunku do znieczulenia wziewnego ze względu na konfigurację obrazowania.</li>
		<li>Sprawdź skuteczność znieczulenia. Potwierdź, czy znieczulenie działa, delikatnie szczypiąc tylne łapy po około 5 minutach. Jeśli zwierzę nadal reaguje, odczekaj kolejne 2-3 minuty, aby uzyskać pełne znieczulenie.</li>
		<li>Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i urazom oczu, gdy zwierzę głęboko śpi. Ponownie sprawdź odruchy i rozpocznij procedurę dopiero wtedy, gdy zwierzę nie wykaże żadnej reakcji na szczypanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie obszaru obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Delikatnie przytnij brzuch zwierzęcia trymerem weterynarza, gdy jest umieszczony na poduszce grzewczej. Wykonuj przycinanie bardzo delikatnie, bez uciskania klatki piersiowej lub brzucha.</li>
		<li>Krem do depilacji należy stosować nie dłużej niż 2 minuty 
		UWAGA: Nie należy wydłużać czasu inkubacji kremu do depilacji, ponieważ może to spowodować stan zapalny skóry. Wpływa to nie tylko na jakość obrazowania, ale także może powodować dyskomfort u zwierzęcia.</li>
		<li>Usuń krem do depilacji papierowymi chusteczkami i delikatnie wyczyść ciepłą wodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw zwierzę i konfigurację obrazowania do pomiarów dopplerowskich (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).
	<ol>
		<li>Ułóż zwierzę grzbietowo na poduszce grzewczej i delikatnie zabezpiecz łapy taśmą. Nawilż skórę niewielką ilością ciepłej wody.</li>
		<li>Odwirowany żel transmisyjny do transmisji ultradźwięków nanieść bezpośrednio na ogoloną skórę za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml. 
		UWAGA: Pęcherzyki powietrza mogą wpływać na obrazowanie dopplerowskie i powodować artefakty.</li>
		<li>Umieść wydrukowany w 3D zbiornik na wodę wypełniony wodą nad zwierzęciem. Upewnij się, że wysokość zbiornika na wodę jest odpowiednia dla zwierzęcia, około 1 mm nad nim i nie ściska zwierzęcia.</li>
		<li>Sprawdź, czy między żelem transmisyjnym do ultradźwięków a termoplastycznym tworzywem z polimetylopentenu (PMP) w zbiorniku na wodę nie ma powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Działanie sondy i wybór płaszczyzny (Czas ~ 10 min)
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie i utwórz sesję eksperymentalną w systemie. Uruchom oprogramowanie do skanowania. 
	UWAGA: Oprogramowanie do skanowania jest zintegrowane z systemem.</li>
	<li>Wyśrodkuj silniki, klikając Tak w wyskakującym okienku. System zmotoryzowany służy do zdalnego sterowania sondą za pomocą oprogramowania skanującego. Centrując silniki, sonda będzie się automatycznie poruszać w trzech kierunkach, czyli pionowo, na boki i obracać. Upewnij się, że żadne przedmioty nie utrudniają trajektorii sondy, aby uniknąć uszkodzenia sprzętu. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wyśrodkować silniki; Niezastosowanie się do tego może prowadzić do dysfunkcji oprogramowania.</li>
	<li>Utwórz nową sesję eksperymentalną, wybierając pozycję Sesja z menu. Wypełnij wymagane informacje w panelu sesji, w tym projekt, temat, sesję, nazwę użytkownika, komentarz i tag. Kliknij przycisk Validate. 
	UWAGA: Sesja musi zostać utworzona przed pobraniem lub zapisaniem danych obrazowania. Informacje o sesji można zmienić podczas eksperymentu, ale należy pamiętać, że spowoduje to również zmianę miejsca docelowego zapisywania danych.</li>
	<li>Ustaw sondę. Liniowa sonda ultradźwiękowa 15 MHz ze 128 elementami jest podłączona do systemu poprzez zmotoryzowany układ złożony z czteroosiowego modułu silnika, czyli trzech kierunków ruchu translacyjnego i jednego obrotowego.
	<ol>
		<li>Przejdź do menu Przesuń sondę i użyj sterowanego komputerowo systemu pozycjonowania, aby wprowadzić sondę do wody w wydrukowanym w 3D zbiorniku na wodę. Użyj przycisków sterujących wskazanych w pozycji sondy, aby przesunąć silniki, definiując kroki w mm dla ruchu translacyjnego (X, Y i Z) lub w ° dla ruchu obrotowego (R). Aby zapobiec wypadkom w kierunku Z, zdefiniuj granicę Z w Safety. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest, aby elementy sondy miały kontakt z wodą. Należy jednak unikać całkowitego wkładania sondy do wody, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sprzętu. Jeśli silniki nie mogą osiągnąć pozycji, wyświetlane jest ostrzeżenie Poza obszarem roboczym.</li>
		<li>Zapisz współrzędne jako pozycję odniesienia, klikając Ustaw punkt początkowy. Nie modyfikuj translacji i obrotów jednocześnie, ponieważ R jest względne w stosunku do X, Y i Z. Zawsze klikaj Ustaw punkt początkowy przed modyfikacją R.</li>
		<li>Definiowanie parametrów obrazowania i wizualizacji. Przejdź do menu Podgląd na żywo i kliknij przycisk Odtwórz, aby wybrać płaszczyznę zainteresowania. 
		UWAGA: Uruchamiaj podgląd na żywo lub akwizycję tylko wtedy, gdy elementy sondy ultradźwiękowej są otoczone medium dopasowanym do impedancji akustycznej, aby zapewnić żywotność sprzętu i zapobiec przegrzaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz parametry obrazowania w Preset.
	<ol>
		<li>Załaduj ultraczułą sekwencję ultradźwiękową Dopplera 10 ms za pomocą przycisku Load Sequence, na przykład 11 złożonych fal płaskich (kąty od -10° do 10°) o napięciu obrazowania 25 V i szybkości odświeżania Dopplera 10 ms. 
		UWAGA: Nie ma potrzeby stosowania szybkiej sekwencji dopplerowskiej (np. 10 ms) w celu zobrazowania i przefiltrowania ruchów oddechowych narządu podczas analizy.</li>
		<li>Umożliwia zdefiniowanie głębokości obrazowania w zakresie od 1 mm do 50 mm, przy maksymalnej głębokości obrazowania wynoszącej 50 mm. Ustawienie domyślne to głębokość 9 mm od 1 mm do 10 mm, przy zalecanej głębokości od 2 mm do 12 mm. 
		UWAGA: W zależności od wielkości zwierzęcia i zbiornika na wodę, głębokość obrazowania może być dostosowana do konkretnych potrzeb.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz parametry wizualizacji.
	<ol>
		<li>Wybierz Dopplera, aby zobrazować układ naczyniowy. 
		UWAGA: Intensywność pikseli w A.U. reprezentuje objętość krwi i powinna być porównywana tylko w przypadku korzystania z tej samej sondy i sekwencji.</li>
		<li>Wybierz opcję Uśrednianie, aby zastosować uśrednianie czasowe w celu zoptymalizowania stosunku sygnału do szumu. 
		UWAGA: Czasowe uśrednianie obrazów zwiększa jakość obrazu, ale zmniejsza liczbę klatek na sekundę. W zależności od celu należy dokonać odpowiedniego kompromisu.</li>
		<li>Wybierz opcję Kompresja obrazu: logarytmiczna (wysoka), pierwiastek kwadratowy (pośrednia) lub liniowa (niska). Alternatywnie, dostosuj zakres kontrastu automatycznie lub ręcznie za pomocą suwaków dla opcji wysokiego i niskiego kontrastu. 
		UWAGA: Wybór kompresji obrazu nie ma wpływu na dane; Ma to wpływ tylko na wyświetlanie obrazowania w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Wybierz skalę mapy kolorów od czarnej do białej, zaznaczając opcję Szary, lub od czerwonawo-czarnej do żółtej, zaznaczając opcję Gorący.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór płaszczyzny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B)
	<ol>
		<li>Wybierz płaszczyznę obrazowania na anatomicznych punktach orientacyjnych. Przełączaj się między wizualizacją Dopplera a trybem B, aby zapoznać się z anatomią płatów wątroby i naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Zatrzymaj podgląd na żywo, klikając ikonę Zatrzymaj.</li>
		<li>Przejdź do menu Przesuń sondę, aby poruszać się po sondzie i wybierz płaszczyznę, klikając Ustaw punkt początkowy, aby zapisać współrzędne jako pozycję odniesienia. Upewnij się, że drzewo naczyniowe jest dobrze zdefiniowane i widoczne z jak najmniejszym sygnałem poza płaszczyzną.</li>
		<li>Wróć do menu Podgląd na żywo i kliknij ikonę Zatrzymaj.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Akwizycja skanu dopplerowskiego (Czas ~ 20 min)
<ol>
	<li>Uruchom akwizycję dopplerowską z szybkością 10 ms.
	<ol>
		<li>Przejdź do menu fUS 2D, aby zobrazować zmiany hemodynamiczne w czasie w określonej pozycji (Rysunek 3). W celu zwiększenia kontrastu należy podać bolus 50 μl dożylnie (iv) wstrzyknięte mikropęcherzyki o stężeniu 2 x 108 mikropęcherzyków na ml do żyły ogonowej.</li>
		<li>W kranie Preset (Zaprogramowane polecenie) określ całkowity czas nagrywania w sekundach (30 s). Wybierz tryb ciągły bez przerw między obrazami, ustawiając Czas między obrazami na 0 s.</li>
		<li>Naciśnij przycisk nagrywania, aby rozpocząć akwizycję 2D. Nagrywanie można anulować, naciskając przycisk Stop. Dane mogą zostać utracone, jeśli pobieranie zostanie przerwane przed zakończeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja i adaptacja pozyskanego nagrania.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby zmodyfikuj kontrast i mapę kolorów w obszarze Wizualizacja. W razie potrzeby odtwórz ponownie nagranie, przewijając klatki za pomocą suwaka, który jest zawarty w funkcji Czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz dane.
	<ol>
		<li>Podaj nazwę uzyskanego nagrania, aby zapisać plik w formacie .scan w folderze sesji. Wyskakujące okienko do zapisania danych jest automatycznie proponowane na końcu każdego nagrania. Dane są zapisywane automatycznie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom kolejną akwizycję, klikając kartę Preset (Ustawienia wstępne) i powtórz czynność od kroku 3.1.1</li>.
	<li>Usuń konfigurację obrazowania i zajmij się zwierzęciem.
	<ol>
		<li>Przejdź do menu Przesuń sondę, aby przesunąć sondę w pionie na zewnątrz wydrukowanego w 3D zbiornika na wodę. Usuń zestaw i żel ultradźwiękowy i odczep zwierzę.</li>
		<li>Poddaj zwierzę eutanazji, gdy projekt eksperymentalny osiągnie punkt końcowy; w przeciwnym razie przejdź do następujących kroków.</li>
		<li>Nałóż trochę kremu nawilżającego na ogolony obszar skóry zwierzęcia, jeśli planowane są pomiary podłużne.</li>
		<li>Umieść zwierzę z powrotem w klatce i pozwól mu obudzić się z narkozy pod lampą grzewczą, aby zapobiec hipotermii. Monitoruj zwierzę podczas rekonwalescencji.</li>
		<li>Umieść zwierzę z powrotem w indywidualnie wentylowanym stojaku na klatkę, gdy znów będzie normalnie chodzić. Zakończ eksperymenty laboratoryjne na zwierzętach przed analizą zestawu danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza ilościowa (Czas ~ 1 h)
<ol>
	<li>Otwórz skrypt analizy gui_analysis.m dostępny w pliku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Wybierz skan i ustaw parametry ilościowe w ustawieniach: 10 obszarów zainteresowania (ROI) o rozmiarze woksela 2 x 2. Wybierz 40 ms dla każdej klatki, aby wykonać integrację Dopplera.</li>
	<li>Narysuj obwód naczyń krwionośnych narządu; 10 ROI jest automatycznie ustawianych między wyraźnie widocznymi tętnicami i w razie potrzeby można je regulować ręcznie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A). Zamknij ruchome okno dialogowe, gdy położenie jest zadowalające. Zapewnij stabilną akwizycję (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B) w celu solidnego obliczenia objętości krwi, unikając akwizycji dotkniętych silnymi artefaktami ruchu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Określ ilościowo średnią objętość krwi wątrobowej w A.U. dla całkowitych 10 ROI, automatycznie szacując średnią i odchylenie standardowe wartości cichej ramki w ciągu 30 sekund nagrania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D). 
	UWAGA: Tabelę danych intensywności ROI można skopiować/wkleić bezpośrednio do pliku arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Powtórz analizę dla co najmniej dwóch dodatkowych płaszczyzn, -0,3 mm i -0,6 mm, w kierunku ogonowym. Określ ilościowo wszystkie dane akwizycji przed wykonaniem analizy statystycznej.</li>
	<li>Sprawdź odchylenie standardowe intensywności na całym obrazie i wyznacz punkt odcięcia jako średnią ogólną (μ) z 2 odchyleniami standardowymi (2σ), aby obiektywnie wykluczyć pomiary podatne na artefakty ruchu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E). 
	UWAGA: Średnia i odchylenie standardowe wartości cichej ramki oszacowane dla całego obrazu są podane w pierwszym wierszu tabeli danych. 
	UWAGA: Artefakty ruchu uniemożliwiają solidną kwantyfikację i powinny być obiektywnie zidentyfikowane na podstawie analizy całego obrazu czasowego.</li>
	<li>Weźmy średnią wszystkich średnich objętości krwi wątrobowej oznaczoną ilościowo na 3 różnych płaszczyznach w 30 ROI na zwierzę w kroku 4.3 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4F). Zastosuj test ROUT 1% w oprogramowaniu do analizy statystycznej, aby zidentyfikować odstające zwroty z inwestycji przed uśrednieniem 30 ROI na zwierzę. Aby poprawić oszacowanie objętości krwi, zapisz dodatkowe samoloty na zwierzę.</li>
	<li>W celu podania produktu leczniczego należy zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia, tj. dolną prawą lub lewą ćwiartkę brzucha, przy użyciu gazy i 70% etanolu. Wstrzyknąć 20 μl soli fizjologicznej lub DMSO ip za pomocą igły 27G i jednorazowej strzykawki 1 ml lub strzykawki insulinowej 30G lub podać 100 μl (hydroksypropylometylocelulozy) przez zgłębnik za pomocą igły wielokrotnego użytku 30G z okrągłą końcówką. Wykreśl dane 3 kohort otrzymujących sól fizjologiczną lub DMSO przez ip lub doustne podawanie (po) celulozy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4G). Wykonuj analizę w sposób ślepy, bez ujawniania stanu i/lub otrzymanego leczenia. 
	UWAGA: Podawanie pojazdu nie ma wpływu na pomiary objętości krwi.</li>
</ol>

Ultrafast Doppler Ultrasound for Hepatic Microvasculature Analysis in Mice

<ol><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+Physiology+and+role+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> J Hepatol. 66 (1), 212-227 (2017).</li>
<li>Gracia-Sancho, J., Caparrós, E., Fernández-Iglesias, A., Francés, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Role of liver sinusoidal endothelial cells in liver diseases.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 18 (6), 411-431 (2021).</li>
<li>Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+neuroimaging%3A+a+review+of+the+preclinical+and+clinical+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art.</a> Curr Opin Neurobiol. 50, 128-135 (2018).</li>
<li>Macé, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+imaging+of+the+brain%3A+Theory+and+basic+principles%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrason+Ferroelectr+Freq+Control%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound imaging of the brain: Theory and basic principles.</a> IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 60 (3), 492-506 (2013).</li>
<li>Tanter, M., Fink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+imaging+in+biomedical+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrason+Ferroelectr+Freq+Control%22%5BJournal%5D)">Ultrafast imaging in biomedical ultrasound.</a> IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 61 (1), 102-119 (2014).</li>
<li>Demené, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+clutter+filtering+of+ultrafast+ultrasound+data+highly+increases+Doppler+and+fUltrasound+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Med+Imaging%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal clutter filtering of ultrafast ultrasound data highly increases Doppler and fUltrasound sensitivity.</a> IEEE Trans Med Imaging. 34 (11), 2271-2285 (2015).</li>
<li>Deffieux, T., Demené, C., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+imaging%3A+A+new+imaging+modality+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound imaging: A new imaging modality for neuroscience.</a> Neuroscience. 474, 110-121 (2021).</li>
<li>Fiebig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vivo+imaging+of+the+murine+liver%3A+A+micro-computed+tomography-based+anatomical+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: A micro-computed tomography-based anatomical study.</a> PLoS One. 7 (2), e31179(2012).</li>
<li>Sänger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+vascular+anatomy+in+rats+and+mice+-+Variations+and+surgical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications.</a> PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).</li>
<li>Higashiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+murine+hepatobiliary+system%3A+A+whole-organ-level+analysis+using+a+transparency+method%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the murine hepatobiliary system: A whole-organ-level analysis using a transparency method.</a> Anat Rec. 299 (2), 161-172 (2016).</li>
<li>World Association of Veterinary Anatomists. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wava-amav.org/">http://www.wava-amav.org/</a> (2023).</li>
<li>Szklaruk, J., Bhosale, P., Luersen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+cross-sectional+liver+imaging%3A+beyond+lesion+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatocell+Carcinoma%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art cross-sectional liver imaging: beyond lesion detection and characterization.</a> J Hepatocell Carcinoma. 2, 101-117 (2015).</li>
<li>Lv, J., Xu, Y., Xu, L., Nie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+functional+evaluation+of+liver+fibrosis+in+mice+with+dynamic+contrast-enhanced+photoacoustic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative functional evaluation of liver fibrosis in mice with dynamic contrast-enhanced photoacoustic imaging.</a> Radiology. 300 (1), 89-97 (2021).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liver+function+reserve+assessments+in+alcoholic+liver+disease+by+scalable+photoacoustic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Photoacoustics%22%5BJournal%5D)">In vivo liver function reserve assessments in alcoholic liver disease by scalable photoacoustic imaging.</a> Photoacoustics. 34, 100569(2023).</li>
<li>Macé, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+imaging+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound imaging of the brain.</a> Nat Methods. 8 (8), 662-664 (2011).</li>
<li>de Haan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Zeb2+preserves+the+hepatic+angioarchitecture+and+protects+against+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial Zeb2 preserves the hepatic angioarchitecture and protects against liver fibrosis.</a> Cardiovasc Res. 118 (5), 1262-1275 (2022).</li>
<li>Couture, O., Hingot, V., Heiles, B., Muleki-Seya, P., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+localization+microscopy+and+super-resolution%3A+A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrason+Ferroelectr+Freq+Control%22%5BJournal%5D)">Ultrasound localization microscopy and super-resolution: A state of the art.</a> IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 65 (8), 1304-1320 (2018).</li>
</ol>

M. Tanter i T. Deffieux są współzałożycielami i udziałowcami Iconeus. Wszyscy pozostali autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

W tym protokole pokazujemy, jak wykonać nieinwazyjne obrazowanie UFUS naczyń krwionośnych wątroby myszy. Przedstawiamy szczegółowy opis procedury obrazowania, obejmujący postępowanie ze zwierzętami, obsługę skanera ultrasonograficznego oraz analizę danych do obliczania zmian objętości krwi in vivo. Aby ułatwić interpretację danych ultrasonograficznych, zapewniamy kompleksowy przegląd struktur anatomicznych, które mogą być przejrzyście zobrazowane przez UFUS. Ponadto opisujemy ustandaryzowaną procedurę kwantyfikacji w celu uzyskania solidnych pomiarów parametrów naczyniowych. Osiągnięcie odpowiedniej rozdzielczości jest możliwe bez użycia środka kontrastowego, co umożliwia bezpieczną i prostą ilościową ocenę objętości krwi w wątrobie w mikrokrążeniu. Kładziemy nacisk na stosowanie znormalizowanej nomenklatury anatomicznej, aby zapobiec nieporozumieniom i błędnej interpretacji, szczególnie podczas oceny ilościowych pomiarów mikrokrążenia.
Obrazowanie mysiego układu krwionośnego metodą UFUS było już wcześniej opisywane, głównie w dziedzinie neurobiologii7. Artefakty ruchowe nie mają negatywnego wpływu na obrazowanie mózgu, w przeciwieństwie do wątroby, która jest bardzo podatna na ruchy oddechowe. Ze względu na anatomiczne położenie pod przeponą, depilacja w okolicy brzucha musi być wykonywana bardzo delikatnie, aby uniknąć wprowadzenia nieregularnego oddechu poprzez zminimalizowanie sił fizycznych działających na klatkę piersiową i okolicę brzucha. Co więcej, osiągnięcie odpowiedniego stopnia znieczulenia jest niezbędne, aby zapewnić regularne oddychanie oscylacyjne, czynnik, który można stosunkowo łatwo skorygować na etapach obróbki końcowej. Czułość UFUS została tutaj zwiększona poprzez zastosowanie filtra dekompozycji wartości osobliwych (SVD) w celu usunięcia artefaktów ruchu6 i dalszej cenzury klatek o dużym ruchu. Filmy Power Doppler o wysokiej liczbie klatek na sekundę są tutaj rejestrowane w czasie 10 ms, aby dodatkowo umożliwić nam wizualizację i pomiar wpływu ruchu oddechowego na klatki, które generowały szczyty o wysokiej wartości z powodu artefaktów ruchu. Częstość oddechów można następnie zidentyfikować na podstawie piku w szybkiej transformacji Fouriera średniego sygnału obrazu, a odpowiadające im klatki pików odpowiadające wysokiemu ruchowi narządu można odrzucić.
Powtarzalne ultrasonograficzne obrazowanie dopplerowskie u jednego zwierzęcia w czasie, a także między zwierzętami o różnej masie ciała, może nadal napotykać kilka ograniczeń. Po pierwsze, na ułożenie wątroby mogą mieć wpływ takie czynniki, jak mocno wypełniony żołądek i perystaltyczne ruchy jelit. Wpływ ten jest szczególnie wyraźny przy wyborze lewego bocznego płata wątroby jako punktu odniesienia. Dlatego zalecamy wybór lewego płata bocznego tylko u większych zwierząt i preferowanie prawego lub lewego płata przyśrodkowego u mniejszych zwierząt. Po drugie, u zwierząt w trudnej sytuacji mogą wystąpić ciężkie, nieoscylacyjne ruchy oddechowe, co skutkuje artefaktami ruchowymi, które są trudne do skorygowania, a w konsekwencji nie mogą być wykorzystane do obliczenia objętości krwi. Dlatego tak ważny jest odpowiedni dobór znieczulenia, wraz z dawką dostosowaną do masy ciała. Wreszcie, limit rozdzielczości ogranicza wizualizację mikrokrążenia wątrobowego, tj. można uwidocznić naczynia krwionośne o średnicach do 100 mm3.
Niedawno zaproponowano zastosowanie środków kontrastowych w celu uzyskania szczegółowego obrazu układu naczyniowego myszy poprzez śledzenie mikropęcherzyków. Takie podejście pozwala osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną i zapewnić ilościowe pomiary prędkości krwi17. Jednak śledzenie mikropęcherzyków pozostaje dużym wyzwaniem dla poruszających się narządów wewnętrznych, zwłaszcza gdy są one pozyskiwane w 2D.
Tutaj wykazaliśmy, że stabilne pomiary objętości krwi wątrobowej uzyskane za pomocą ultraszybkiego Dopplera można uzyskać u myszy kontrolnych z trzech kohort otrzymujących różne nośniki podawane w zastrzykach ip lub zgłębniku doustnym. Ostatnio takie pomiary objętości krwi zostały z powodzeniem wykorzystane w mysim modelu16 z chorobą wątroby. Rozszerzając tę kwestię, ekspansję naczyniową wykryto na poziomie mikroskopii elektronowej i potwierdzono pomiarami ilościowymi za pomocą UFUS. W badaniu tym podkreślono wrażliwość oceny in vivo na badanie wad naczyniowych na poziomie funkcjonalnym i ilościowym, nawet przy zachowanej angioarchitekturze wątroby, co jest obiecujące dla diagnostyki klinicznej i monitorowania.
Podsumowując, protokół ten służy jako przewodnik dla nieinwazyjnych badań jakościowych i ilościowych naczyń wątrobowych u myszy. Może być również stosowany do obserwacji podłużnej ze względu na nieinwazyjną i prostą procedurę. Dodatkowo posiada potencjał do zapewnienia oceny funkcjonalnej naczyń krwionośnych.

Przedkliniczne modele myszy są powszechnie używane do badania początku i progresji choroby mikronaczyniowej wątroby1,2. Obserwacja podłużna jest korzystna, ponieważ zmiany w naczyniach włosowatych krwi występują we wczesnym stadium choroby, zanim pojawi się stan zapalny i zwłóknienie, co z czasem może prowadzić do marskości wątroby1. Aby zbadać postęp choroby, niezbędne są potężne narzędzia do obrazowania do wizualizacji i pomiaru funkcji naczyń krwionośnych in vivo. Ultraszybkie ultrasonografie dopplerowskie (UFUS) stanowią odpowiednią metodę ze względu na niski koszt, przenośność, prostotę i możliwość pracy w czasie rzeczywistym, ale także dlatego, że jest to procedura nieinwazyjna i oszczędzająca czas3. W porównaniu z konwencjonalnym USG Dopplerowskim, które może osiągnąć podobną rozdzielczość przestrzenną, ale jest ograniczone do dużego przepływu krwi, UFUS pozwala na wykrycie powolnego przepływu krwi do 2 mm/s z 1 cm/s, co pozwala na zbadanie udziału znacznie mniejszych naczyń krwionośnych4. UFUS poprawia czułość, co jest osiągane poprzez transmisje fal płaskich z dużym polem widzenia w pojedynczej insonifikacji, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę, a tym samym liczbę dostępnych obrazów ultrasonograficznych5. Duża liczba próbek czasowych poprawia anulowanie sygnału pochodzącego z tkanki i poprawia wykrywanie echa odbitego od rozpraszaczy krwi, zwiększając czułość bez konieczności stosowania środków kontrastowych6. Szacując energię echa rozpraszacza krwi za pomocą oszacowania dopplerowskiego mocy, uzyskuje się ilość, która jest proporcjonalna do objętości krwi w każdym pikselu, nawet jeśli naczynia krwionośne są zbyt małe, aby można je było rozdzielić na obrazie7.
UFUS oferuje korzystną kombinację rozdzielczości przestrzennej i czasowej, co czyni go odpowiednim narzędziem do jakościowej oceny architektury naczyń wątroby. Chociaż obsługa skanera ultrasonograficznego jest stosunkowo prosta, kompleksowe zrozumienie anatomii wątroby jest wymagane, aby poruszać się po unaczynieniu wątroby różnych płatów wątroby u myszy. Ostatnie badania koncentrowały się na opisie anatomii mysiej wątroby i drzewa naczyniowego wątroby za pomocą mikrotomografii komputerowej 3D (μ-CT)8,9. Mimo że niektóre różnice morfologiczne między wątrobą człowieka i myszy są dobrze udokumentowane10, badania przeprowadzone na gryzoniach często przyjmują terminologię anatomiczną odnoszącą się do ludzi, co prowadzi do pewnego zamieszania w kontekście czworonogów. Nawet uznana znormalizowana nomenklatura, taka jak Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), nie zawiera wystarczających informacji na temat spójnej terminologii dla struktur naczyniowych wątroby u gryzoni11. Oprócz wyzwania, jakim są słabo udokumentowane struktury anatomiczne u gryzoni, pojawiają się jeszcze większe trudności w interpretacji odczytów ultrasonograficznych, zwłaszcza gdy przewiduje się powtarzalne podejście.
Uzyskanie nieinwazyjnych informacji funkcjonalnych o żywych organach w różnych skalach przestrzennych stanowi wyzwanie dla obrazowania in vivo3. Zaawansowane metody obrazowania wątroby, takie jak tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny i angiografia (MRI/MRA) lub konwencjonalne obrazowanie dopplerowskie wykorzystujące skupione fale, są niezbędne do oceny postępu choroby, ale nie są w stanie uchwycić większości dynamiki przepływu krwi, z wyjątkiem obrazowania fotoakustycznego12,13,14. UFUS ma wysoką czułość i może wykrywać powolny przepływ krwi w małych naczyniach, który nie jest ograniczony do przepływu większego niż centymetr na sekundę4,15. Niedawno opracowaliśmy niestandardową metodę obrazowania opartą na rozważaniach anatomicznych przy użyciu UFUS, umożliwiającą wiarygodny pomiar objętości krwi w wątrobie w modelu mysim z rozszerzeniem naczyń krwionośnych16.
W tym protokole opisujemy procedurę nieinwazyjnego obrazowania wątroby metodą UFUS za pomocą dostępnej na rynku platformy ultradźwiękowej, pierwotnie opracowanej do funkcjonalnego obrazowania mózgu. Aby usprawnić proces i usprawnić wyszukiwanie informacji, oferujemy kompleksową ilustrację wątroby myszy z anatomiczną nomenklaturą i kompletną metodą analizy. Dodatkowo zapewniamy szczegółową reprezentację uzyskanych odczytów obrazowych jako odniesienie, wskazując wspólne struktury anatomiczne i punkty orientacyjne, aby pomóc w wyborze płaszczyzny zależnej od operatora. Ponadto zamieszczamy odpowiednią ilustrację zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz naczyń krwionośnych wątroby.

<table><tbody><tr><td>(Hydroksypropylo)metyloceluloza HPMC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7509</td><td>0,5% HPMC</td></tr><tr><td>Wirówka ZentriMix 380 R</td><td>Hettich</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml stożkowe sterylne probówki polipropylenowe</td><td>CELLSTAR</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Bawełniane końcówki</td><td>Meditip Clean</td><td>G80215</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>w pobliżu drogerii</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650-5X5ML</td><td>sterylny</td></tr><tr><td>absolut etanolu</td><td>FRESENIUS KABI</td><td>010-0622-1</td><td></td></tr><tr><td>Igła do karmienia, wielokrotnego użytku</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>18064-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze z cienką końcówką Kleszcze Dumont #5</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Gaziki 5 x 5 cm</td><td>Klinipress</td><td>175 004</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Wersja 9</td><td></td></tr><tr><td>Skrypt analizy GUI</td><td>Inserm</td><td>gui_analysis.m</td><td>potrzebuje skanu dopplerowskiego 10 ms</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza 17 x 17 cm, 6 W</td><td>ThermoLux Acculux</td><td>461265</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 30G 0,30 x 8 mm, 0,3 ml i 0,5 ml</td><td>BD Microfine + Demi</td><td>25636</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina Anesketin</td><td>Dechra</td><td>REG NL 111764</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Kimwipes Wycieraczka niskokłaczkowa KIMTECH</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna 19 mm x 50 m x 0,125 mm</td><td>Oprogramowanie Stokvis</td><td>M451</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td></td><td>MathWorks Wersja R2022b</td><td></td></tr><tr><td>Krem nawilżający</td><td>w pobliżu drogerii</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła żółta 30G 0,3 x 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Oculentum Simplex</td><td>Dodano Pharma</td><td>220201</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki papierowe</td><td>we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trwały marker laboratoryjny</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Fizjologiczny roztwór soli (NaCl 0,9%)</td><td>FRESENIUS KABI</td><td>B102986</td><td>sterylny</td></tr><tr><td>jednorazowy pojemnik na ostre przedmioty Medical Dispo 2,5 L</td><td>APmedical</td><td>UN3291</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki z blokadą 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 20 ml Luer-Lok</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>West Bend</td><td>40053</td><td></td></tr><tr><td>Trymer</td><td>Exacta Aesculap</td><td>GT416</td><td></td></tr><tr><td>Ultraszybki platforma ultrasonograficzna</td><td>Iconeus & &nbsp; INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART</td><td>Iconeus Jeden prototyp</td><td>z sekwencją 10ms</td></tr><tr><td>Żel transmisyjny do ultradźwięków Aquasonic 100</td><td>Parker Laboratories INC.</td><td>BT-025-0037N</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na wodę wydrukowany w 3D 10 x 10 x 1,5 cm polimetylopentenu (PMP) 0,125 mm</td><td>Plik CAD GoodFellow Cambridge limited</td><td>ME311100/2</td><td>na żądanie</td></tr><tr><td>Ksylazyna Sedamun</td><td>Dechra</td><td>REG NL 10084</td><td>20 mg / ml</td></tr></tbody></table>

obrazowanie i kwantyfikacja unaczynienia wątroby myszy za pomocą ultraszybkich ultradźwięków dopplerowskich

Imaging and Quantification of the Hepatic Vasculature of Mice Using Ultrafast Doppler Ultrasound

Nieinwazyjne obrazowanie in vivo naczyń krwionośnych jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów chorobowych u gryzoni. Aby uzyskać wysoką czułość obrazowania mikrokrążenia za pomocą metod ultrasonograficznych Dopplera, preferowane są metody obrazowania wykorzystujące koncepcję ultraszybkiego obrazowania. Zwiększając liczbę klatek na sekundę skanera ultrasonograficznego do tysięcy klatek na sekundę, możliwe staje się zmniejszenie czułości przepływu krwi do 2 mm/s i uzyskanie funkcjonalnych informacji o mikrokrążeniu w porównaniu z czułością około 1 cm/s w konwencjonalnych trybach Dopplera. Podczas gdy ultraszybkie obrazowanie ultrasonograficzne Dopplera (UFUS) zostało przyjęte w neurobiologii, gdzie może rejestrować aktywność mózgu poprzez sprzężenie nerwowo-naczyniowe, stanowi większe wyzwanie podczas obrazowania unaczynienia narządów jamy brzusznej ze względu na większe ruchy związane z oddychaniem. Wątroba, umieszczona anatomicznie pod przeponą, jest szczególnie podatna na ruchy poza płaszczyzną i oscylacyjne ruchy oddechowe. Artefakty te nie tylko niekorzystnie wpływają na obrazowanie dopplerowskie, ale także komplikują analizę anatomiczną struktur naczyniowych i obliczanie parametrów naczyniowych. W tym miejscu przedstawiamy jakościową i ilościową analizę obrazową naczyń krwionośnych wątroby u myszy za pomocą UFUS. Identyfikujemy główne anatomiczne struktury naczyniowe i dostarczamy graficzne ilustracje makroskopowej anatomii wątroby, porównując ją z dogłębną oceną anatomiczną unaczynienia wątroby na podstawie odczytów dopplerowskich. Dodatkowo opracowaliśmy protokół kwantyfikacji do solidnych pomiarów objętości krwi w wątrobie w mikrokrążeniu w czasie. Aby zastanowić się nad dalszymi badaniami, jakościowa analiza naczyniowa zapewnia kompleksowy przegląd i sugeruje ustandaryzowaną terminologię dla badaczy pracujących z mysimi modelami chorób wątroby. Ponadto daje możliwość zastosowania ultradźwięków jako nieinwazyjnej metody uzupełniającej do kontroli ubytków naczyniowych wątroby in vivo i pomiaru funkcjonalnych zmian mikronaczyniowych głęboko w obrębie narządu przed rozwikłaniem anomalii naczyń krwionośnych na poziomie mikronów za pomocą barwienia ex vivo na skrawkach tkanek.

Zgodnie z protokołem, obrazowanie naczyń krwionośnych wątroby ułatwia standaryzacja struktur anatomicznych i odpowiadającej im terminologii (Rysunek 1). Aby zaproponować zestandaryzowaną nomenklaturę dla badaczy korzystających z przedklinicznych modeli wątroby, schematycznie przedstawiono typowe rozmieszczenie wątroby w jamie brzusznej myszy (Rysunek 1A), zaprezentowano układ strukturalny poszczególnych płatów wątroby (Rysunek 1B) oraz określono sieć naczyń tętniczych (Rysunek 1C). Wykorzystując wiedzę anatomiczną, przeprowadzono obrazowanie UFUS in vivo, stosując wydrukowany w technologii 3D zbiornik z wodą w celu zredukowania artefaktów ruchowych (Rysunek 2A). Impedancję akustyczną skorygowano poprzez zanurzenie głowicy w wodzie i nałożenie żelu do badań ultrasonograficznych bezpośrednio na ogoloną skórę zwierzęcia. Dzięki takiemu ustawieniu zredukowano artefakty związane z oddychaniem i innymi ruchami, ponieważ głowica nie styka się bezpośrednio z poruszającą się klatką piersiową i brzuchem zwierzęcia. W ten sposób zwizualizowano strukturę naczyniową płata prawego i lewego, które ze względu na powierzchowne położenie są łatwo dostępne dla UFUS (Rysunek 2B). Pozostałe płaty wątroby, takie jak płat ogonowy i czworoboczny, znajdują się głębiej w organizmie, co utrudnia prawidłową identyfikację anatomiczną naczyń wątrobowych za pomocą UFUS.
Po wykazaniu znaczenia ustandaryzowanych i powszechnie akceptowanych oznaczeń anatomicznych oraz interpretacji struktur naczyniowych, przeprowadziliśmy wielokrotne skanowanie Dopplera w różnych płaszczyznach, aby zapewnić kompleksowy przegląd naczyń krwionośnych wątroby obrazowanych za pomocą kontrastowego UFUS u myszy (Rycina 3). Wyznaczyliśmy sieć tętnic wątrobowych poszczególnych płatów wątroby, tj. płata lewego bocznego (LL), lewego przyśrodkowego (LM), prawego bocznego (RL) oraz prawego przyśrodkowego (RM). Ponadto oznakowano główne tętnice, takie jak aorta brzuszna (AA), tętnica wątrobowa (HA), lewa boczna tętnica wątrobowa (LLHA) oraz prawa przyśrodkowa tętnica wątrobowa (RMHA). Należy zauważyć, że płaty wątroby mogą być rozmieszczone nieco inaczej w zależności od ułożenia i ruchów perystaltycznych jelita cienkiego (SM), a także stopnia wypełnienia żołądka (S). Ten kontrastowy przegląd całego układu naczyniowego wątroby myszy stanowi kompleksowy atlas naczyniowy dla obrazowania wątroby in vivo za pomocą UFUS.
Precyzyjny wybór płaszczyzn anatomicznych jest kluczowy dla uzyskania ilościowego odczytu pochodzącego z jednego płata wątroby. Wiarygodne pomiary objętości krwi można uzyskać poprzez ręczny wybór 10 obszarów zainteresowania (ROI) na każdą płaszczyznę (Rycina 4A). Do niezawodnej kwantyfikacji objętości krwi w mikrokrążeniu wymagana jest stabilna akwizycja o niskiej zmienności średnich intensywności obrazu. Określa się to na podstawie średniej wartości obrazu (MIV) całego obrazu w czasie (Rycina 4B), w przeciwieństwie do rejestracji podatnej na znaczne artefakty ruchowe (Rycina 4C). Aby wyeliminować artefakty ruchowe, do wiarygodnej kwantyfikacji pomiarów objętości krwi w wątrobie zastosowano automatyczny wybór niskich wartości MIV (Rycina 4D), wykreślając odchylenie standardowe wszystkich czasowych niskich wartości MIV całego obrazu (Rycina 4E). Skanowania dopplerowskie wielu płaszczyzn na zwierzę wykazują akceptowalną zmienność wewnątrz- i międzyosobniczą w obrębie i pomiędzy myszami z 3 różnych kohort po usunięciu wartości odstających w 30 ROI na zwierzę za pomocą testu ROUT 1% (Rycina 4F). Aby poprawić szacunkową objętość krwi na zwierzę, zaleca się rejestrację dodatkowych płaszczyzn lub zwiększenie liczby wybranych ROI na płaszczyznę. Ponadto odczyty objętości krwi mogą być wykorzystane do monitorowania leczenia farmakologicznego, ukierunkowanego konkretnie na mikrokrążenie. Podając nośnik dwiema drogami podania, wykazaliśmy, że nie ma on wpływu na pomiary objętości krwi w wątrobie (Rycyna 4G). Wyniki te wskazują, że delecja genu lub podanie leku nie są zawyżone przez administrację nośnika, co zapewnia solidną konstrukcję eksperymentalną. Podsumowując, opracowano obiektywny i powtarzalny protokół ilościowy do przyszłych badań nad wadami naczyniowymi wątroby w różnych modelach mysich.
<img alt="Schemat anatomii wątroby gryzonia; opisane płaty, tętnice i żyły; do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Anatomia wątroby myszy. (A) Schematyczne przedstawienie położenia wątroby w jamie brzusznej pod przeponą myszy. (B) Schematyczny opis wątroby myszy z czterema płatami, tj. lewym, czworobocznym, ogoniastym i prawym, oraz triadą wrotną składającą się z żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej i przewodu żółciowego. (C) Schematyczna ilustracja sieci tętniczej naczyń wątrobowych. Identyfikacja tętnic wątrobowych (HA) i ich gałęzi (ramus) z podaną nomenklaturą łacińską. Skrót: HA = tętnica wątrobowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat ustawienia obrazowania ultradźwiękowego z przenośnym skanerem do analizy wątroby gryzoni i wyniki UFUS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ultraszybkie obrazowanie Dopplera ultradźwiękowego (UFUS) naczyń krwionośnych wątroby u myszy. (A) Schematyczny przegląd ustawienia eksperymentalnego dla nieinwazyjnego obrazowania in vivo. (B) Schematyczne ilustracje kierunku obrazowania oraz powiązanych reprezentacji prawego i lewego płata przyśrodkowego, a także lewego płata bocznego, obrazowanych za pomocą UFUS. Skróty: AA = aorta brzuszna, LLL = lewy płat boczny, LML = lewy płat przyśrodkowy, RML = prawy płat przyśrodkowy. Pasek skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Segmentacja organów w MRI, przekroje poprzeczne, schemat; orientacja przestrzenna czaszkowa-ogonowa, boczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne obrazowanie ultrafast Doppler ultrasound (UFUS) z zastosowaniem kontrastu w naczyniach wątroby myszy. Przegląd całego układu naczyniowego wątroby dorosłej myszy obrazowany w 3 pozycjach, tj. bocznej prawej, środkowej i bocznej lewej, w 4 płaszczyznach od strony czaszkowej w kierunku ogonowym. Punkt odniesienia znajduje się bezpośrednio pod przeponą obrazowaną w przekroju środkowym oraz 1 cm bocznie po prawej i lewej stronie, w tych samych płaszczyznach w kierunku ogonowym. Skróty: AA = aorta brzuszna, HA = tętnica wątrobowa, LLL = lewy płat boczny, LLHA = lewa boczna tętnica wątrobowa, LML = lewy płat przyśrodkowy, RLL = prawy płat boczny, RMHA = prawa przyśrodkowa tętnica wątrobowa, RML = prawy płat przyśrodkowy, SI = jelito cienkie, S = żołądek. Pasek skali 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Równowaga statyczna w tkance biologicznej; obejmuje schematy, wykresy i analizę statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ilościowy pomiar objętości krwi w wątrobie za pomocą ultraszybkiego Dopplera ultradźwiękowego (UFUS). (A) Reprezentatywne obrazy środkowego płata (ML) u dorosłych myszy kontrolnych szczepu C57BL/6 typu dzikiego w płaszczyźnie 1 wybrane pod przeponą, odpowiadającej 0 mm, płaszczyźnie 2 przy -0,3 mm i płaszczyźnie 3 przy -0,6 mm z wyborem 10 obszarów zainteresowania (ROI). Pasek skali 1 mm. Ilustracja Power Doppler z 30 s z (B) stabilną akwizycją (szary) i (C) ruchem tkanki (czerwony) na podstawie średnich wartości obrazu w jednostkach arbitralnych (A.U.) całego obrazu do oceny ilościowej. (D) Automatyczne rozpoznawanie niskich intensywności (A.U.) do ilościowego pomiaru objętości krwi w czasie. (E) Odchylenie standardowe (St. Deviation) niskich intensywności wykreślone w celu zidentyfikowania niestabilnych akwizycji (czerwony) spowodowanych artefaktami ruchu, wskazanych przez punkt odcięcia średniej ogólnej (µ) z liczby (N) zwierząt z 3 kohort z oceną 2 SD (2σ) odchylenia standardowego (SD) niskich intensywności (A.U.) w warunkach fizjologicznych (szary) u dorosłych myszy kontrolnych szczepu C57BL/6 typu dzikiego. (F) Ilościowe oznaczenie zmian objętości krwi mierzonych in vivo w czasie, uśrednione z 3 płaszczyzn, tj. łącznie 30 ROI na zwierzę, przedstawione jako intensywność pikseli (A.U.). Wykrywanie wartości odstających testem ROUT 1%. (G) Brak różnic między rodzajem nośnika a drogą podania. Kohorta 1 (n=6) otrzymała dostawę soli fizjologicznej drogą doszpikową (ip), kohorta 2 (n=3) dostawę DMSO drogą ip, a kohorta 3 (n=6) celulozę drogą doustną (po). Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Dunnetta, ns P &gt; 0,05. Skróty: A.U. = jednostki arbitralne, DMSO = dimetylosulfoksyd, ip = droga doszpikowa, po = podanie doustne, ROI = obszar zainteresowania, St. Deviation = odchylenie standardowe, UFUS = ultraszybki Doppler ultradźwiękowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Skrypt ilościowy pomiarów objętości krwi w wątrobie przy użyciu ultraszybkiego ultradźwiękowego Dopplera (UFUS). Skrypt gui_analysis.m zapewnia interfejs graficzny do automatycznego pozycjonowania obszaru zainteresowania (ROI) dla pomiarów objętości krwi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/gui_analysis.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ultraszybkie ultrasonografie dopplerowskie (UFUS) o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (100 μm) i czułości stanowi odpowiednią nieinwazyjną metodę obrazowania w celu uzyskania kompleksowego jakościowego przeglądu naczyń wątrobowych. UFUS ułatwia również ilościowe pomiary mikrokrążenia, mając na celu pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów chorób naczyniowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja unaczynienia wątroby myszy za pomocą ultraszybkich ultradźwięków dopplerowskich

Non-invasive in vivo imaging of the vasculature is a powerful tool for studying disease mechanisms in rodents. To achieve high sensitivity imaging of the ...

Nasze badania koncentrują się na nieinwazyjnym ultraszybkim obrazowaniu ultrasonograficznym wątroby z wykorzystaniem dostępnej na rynku platformy ultrasonograficznej. Ma on na celu usprawnienie procesów obrazowania i analizy, zapewnienie odniesień anatomicznych oraz poprawę ilościowej i jakościowej oceny unaczynienia wątroby. Najnowsze osiągnięcia w naszej dziedzinie obejmują ultraszybkie ultradźwięki, które wykrywają mały przepływ krwi w małych naczyniach, zwiększają czułość na środek kontrastowy i poprawiają rozdzielczość przestrzenną.Osiąga się to poprzez transmisje fal płaskich, zwiększanie liczby klatek na sekundę i dostarczanie szczegółowych szacunków objętości krwi w każdym pikselu. Obecne technologie spotykane w badaniach w naszej dziedzinie to ultraszybkie obrazowanie ultrasonograficzne oraz mikrotomografia komputerowa 3D. Narzędzia te, w połączeniu z zaawansowanym zrozumieniem anatomii wątroby, poprawiły dokładność i odtwarzalność obrazowania ultrasonograficznego w modelach mysich.Opracowaliśmy nieinwazyjny, ultraszybki protokół obrazowania ultrasonograficznego unaczynienia wątroby myszy, umożliwiający precyzyjne pomiary objętości krwi bez użycia środków kontrastowych. Nasze odkrycia obejmują ustandaryzowaną procedurę analizy danych, solidną parametryzację naczyń krwionośnych i przejrzystą wizualizację struktur anatomicznych, zapewniając dokładną i powtarzalną ocenę mikrokrążenia. Nasz protokół oferuje nieinwazyjne, bardzo czułe obrazowanie wątroby bez konieczności stosowania środków kontrastowych, wychwytując powolny przepływ krwi i małe naczynia krwionośne.Poprawia dokładność poprzez usuwanie artefaktów ruchu, standaryzowaną kwantyfikację i przejrzysty przegląd anatomiczny oraz pokazuje precyzyjne, powtarzalne pomiary. Aby rozpocząć, umieść przygotowaną znieczuloną mysz na poduszce grzewczej. Delikatnie przytnij brzuch zwierzęcia trymerem weterynarza bez uciskania klatki piersiowej lub brzucha. Wtedy.Nakładaj krem do depilacji nie dłużej niż dwie minuty. Usuń krem do depilacji i delikatnie wyczyść ciepłą wodą. Następnie ułóż zwierzę grzbietowo na poduszce grzewczej i delikatnie zabezpiecz łapy za pomocą taśmy.Nawilż skórę niewielką ilością ciepłej wody. Za pomocą strzykawki o pojemności 20 mililitrów nałóż odwirowany żel transmisyjny do transmisji ultradźwięków bezpośrednio na ogoloną skórę. Następnie umieść wydrukowany w 3D zbiornik na wodę nad zwierzęciem.Sprawdź, czy między żelem transmisyjnym do ultradźwięków a tworzywem termoplastycznym z polimetylopentenu w zbiorniku na wodę nie ma powietrza, a następnie dodaj wodę do zbiornika. Po przygotowaniu myszy do ultraszybkiego USG Dopplera uruchom oprogramowanie, utwórz sesję eksperymentalną w systemie i uruchom oprogramowanie do skanowania. Kliknij tak w wyskakującym okienku, aby wyśrodkować silniki.Aby utworzyć nową sesję eksperymentalną, wybierz pozycję Sesja z menu. W panelu sesji uzupełnij niezbędne informacje, w tym projekt, temat, sesję, nazwę użytkownika, komentarz i tag. Kliknij przycisk Zatwierdź.Następnie załaduj 10-milisekundową ultraczułą sekwencję ultradźwiękową Dopplera za pomocą przycisku sekwencji ładowania. Umożliwia zdefiniowanie głębokości obrazowania w zakresie od jednego do 50 milimetrów, przy czym maksymalna głębokość obrazowania wynosi 50 milimetrów. Aby wybrać parametry wizualizacji, wybierz opcję Doppler, aby zobrazować naczynia krwionośne.Wybierz metodę kompresji obrazu: logarytmiczną, pierwiastkową kwadratową lub liniową. Alternatywnie dostosuj zakres kontrastu automatycznie lub ręcznie za pomocą suwaków dla opcji wysokiego i niskiego kontrastu. Aby wybrać skalę mapy kolorów od czarnej do białej, zaznacz opcję szary lub od czerwonawo-czarnej do żółtej, zaznacz gorącą.Wybierz płaszczyznę obrazowania na podstawie anatomicznych punktów orientacyjnych. Przełączaj się między wizualizacją Dopplera a trybem B, aby zapoznać się z anatomią płatów wątroby i naczyń krwionośnych. Kliknij ikonę zatrzymania, aby zatrzymać podgląd na żywo.Teraz przejdź do menu przesuwania sondy, aby wyregulować sondę i wybrać płaszczyznę. Aby rozpocząć, przygotuj zwierzę do obrazowania i umieść sondę w zbiorniku na wodę. Wykonaj operację sondy i wybierz płaszczyznę, a następnie uruchom akwizycję dopplerowską z 10-milisekundową liczbą klatek na sekundę.Przejdź do menu fUS 2D, aby zobrazować zmiany hemodynamiczne w czasie w określonej pozycji. Na karcie ustawień wstępnych ustaw czas między obrazami na zero sekund, aby wybrać tryb ciągły bez przerw między obrazami, a następnie określ całkowity czas nagrywania w sekundach. Następnie naciśnij przycisk nagrywania, aby rozpocząć akwizycję 2D.Po zakończeniu nagrywania naciśnij przycisk stop. Podaj nazwę pobranego nagrania, aby zapisać plik w formacie skanowania w folderze sesji. Na końcu każdego nagrania pojawi się wyskakujące okienko, w którym można automatycznie zapisać dane.Otwórz skrypt analizy gui_analysis.m. Wybierz skanowanie i ustaw 10 interesujących regionów z rozmiarem woksela dwa na dwa. Wybierz 40 milisekund dla każdej klatki, aby wykonać całkowanie Dopplera.Następnie narysuj obwód naczyń krwionośnych narządu w taki sposób, aby 10 ROI zostało automatycznie ustawionych między wyraźnie widocznymi tętnicami i w razie potrzeby można je było regulować ręcznie. Aby określić ilościowo średnią objętość krwi wątroby w dowolnych jednostkach łącznych 10 ROI, automatycznie oszacuj średnią i odchylenie standardowe wartości cichych ramek w ciągu 30-sekundowego nagrania.

imaging-quantification-hepatic-vasculature-mice-using-ultrafast

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym filmie zaprezentowano zastosowanie zamontowanej na szynie głowicy ultradźwiękowej o wysokiej częstotliwości do wykonywania echokardiografii u znieczulonej myszy. Metody obejmują zarówno konwencjonalne pomiary funkcji serca w trybie dwuwymiarowym i M-mode, jak i nowsze, bardziej zaawansowane narzędzia, takie jak kolorowy Doppler, analiza odkształceń (strain) oraz ogólne i ukierunkowane obrazowanie kontrastowe.

Echokardiografia i obrazowanie ultrasonograficzne u myszy

Ten film opisuje procedurę obrazowania do obserwacji i badania wewnątrznaczyniowej dynamiki tkanki wątroby myszy za pomocą mikroskopii wielofotonowej po ustabilizowaniu narządu. Mikroskopia wielofotonowa umożliwia obrazowanie tkanek biologicznych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej in vivo.

Wspomagana oprawą obrazowania ocena wątroby myszy do wizualizacji naczyniowej opartej na mikroskopii wielofotonowej: technika obrazowania wspomagana urządzeniem stabilizacyjnym w celu uzyskania wielowymiarowych obrazów naczyń krwionośnych w wątrobie myszy

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Sztywność tętnic stanowi kluczowy czynnik w chorobach sercowo-naczyniowych, a prędkość fali tętna (PWV) może być uważana za wskaźnik zastępczy sztywności tętnic. Protokół ten opisuje algorytm przetwarzania obrazu do obliczania PWV u myszy na podstawie przetwarzania obrazu ultrasonograficznego, który ma zastosowanie w różnych miejscach tętnic.

Ocena prędkości fali tętna na podstawie ultradźwięków u myszy

Obrazowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości u płodu myszy poprawiło rozdzielczość obrazowania i może zapewnić precyzyjną, nieinwazyjną charakterystykę rozwoju serca i wad strukturalnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest przeznaczony do wykonywania echokardiografii płodu u myszy w czasie rzeczywistym in vivo.

Obrazowanie układu sercowo-naczyniowego u płodu myszy za pomocą systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości (30/45 MHZ)

W tym eksperymencie, myszowi wstrzykuje się do żyły ogonowej izotiocyjanian rodaminy B, który może zabarwiać naczynia krwionośne. Po odsłonięciu i utrwaleniu wątroby można wybrać określoną część wątroby do obserwacji głębokiej tkanki w żywym ciele za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Wielofotonowa obserwacja mikroskopowa naczyń w tkance wątroby myszy

Ten protokół pokazuje, jak zastosować ultraszybkie obrazowanie dopplerowskie ultrasonograficzne do ilościowego określenia przepływów krwi. Po akwizycji trwającej 1 s eksperymentator ma dostęp do filmu z pełnym polem widzenia z wartościami prędkości osiowej dla każdego piksela co ≈0,3 ms (w zależności od czasu lotu ultradźwięków).

Obrazowanie przepływu krwi za pomocą ultraszybkiego Dopplera

Tutaj prezentujemy protokół, który demonstruje technikę i niezbędne kontrole dla laserowego obrazowania perfuzjowego Dopplera do pomiaru przepływu krwi w tylnej kończynie myszy.

Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej w tylnej kończynie myszy

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Zmiany w przepływie krwi w jajnikach w okresie przedowulacyjnym są niezbędne do owulacji. Ultrasonografia Dopplera była stosowana u ludzi i dużych zwierząt do oceny hemodynamiki jajnika i perfuzji. Przedstawiono protokół stosowania ultrasonografii Dopplera w celu oceny hemodynamiki jajników w fazie przedowulacyjnej i okołoowulacyjnej u myszy.

Ultrasonografia Dopplera do obrazowania na żywo i ilościowej funkcji naczyń jajników u myszy

Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania naczyń wątrobowych u myszy za pomocą ultraszybkiego ultrasonografii dopplerowskiej. Protokół UFUS umożliwia precyzyjną kwantyfikację objętości krwi bez stosowania środków kontrastowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja unaczynienia wątroby myszy za pomocą ultraszybkich ultradźwięków dopplerowskich

Przeglądaj więcej filmów