Izolacja i kriokonserwacja wysoce żywotnych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej: przewodnik dla początkujących

W tym protokole staramy się zapewnić łatwy do naśladowania samouczek krok po kroku, jak pobierać i przechowywać krew obwodową o wysokiej żywotności i komórki jednojądrzaste (PBMC) z krwi pełnej. PBMC obejmują limfocyty, komórki dendrytyczne i monocyty. Masowe PBMC mogą być przetwarzane w celu wyizolowania poszczególnych typów komórek i są powszechnie stosowane w szerokiej gamie eksperymentów i testów, w tym w sekwencjonowaniu RNA i cytometrii przepływowej.

Oprócz PBMC pokazujemy również, jak zbierać osocze EDTA i całą sierść kożuchową. Przed przystąpieniem do sporządzania niniejszego protokołu należy przygotować materiały i odczynniki wymienione w Tabeli 2. Należy pamiętać, że ten protokół jest przeznaczony do zbierania PBMC z sześciu probówek wirujących z gradientem gęstości, z których każda daje około 12 milionów komórek.

Skaluj odpowiednio. Stosując standardową technikę upuszczania krwi, zbierz pełną krew w sześciu probówkach wirowych z gradientem gęstości i jednej probówce EDTA, aż do napełnienia. Odwirować wszystkie probówki o masie 1800 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

W razie potrzeby zebrane probówki mogą być przechowywane do czterech godzin, a następnie przetwarzane jednocześnie. Zapoznaj się z dodatkowym filmem 1, aby zapoznać się z demonstracją obsługi wirówki. Po odwirowaniu probówki zawierającej ośrodek o gradiencie gęstości, osocze i PBMC znajdą się powyżej ośrodka o gradiencie gęstości.

Erytrocyty i granulocyty osiądą na dnie. Patrz rysunek 1A, aby zapoznać się z wizualizacją. Po odwirowaniu ostrożnie otwórz probówkę wirówkową z gradientem gęstości.

Za pomocą pipety transferowej usunąć i wyrzucić półprzezroczystą żółtą warstwę zawierającą osocze. Nie należy naruszać zamglonej warstwy komórek bezpośrednio nad podłożem o gradiencie gęstości. Błądź po stronie pozostawiania nadmiaru osocza, a nie odrzucania PBMC.

Powtórz dla wszystkich probówek. Za pomocą nowej pipety transferowej delikatnie odpipetować pozostałą objętość zawierającą komórki i resztki osocza w każdej probówce w górę i w dół, kilkakrotnie powyżej pożywki o gradinie gęstości. Po ponownym wymieszaniu odpipetować zawieszoną zawartość probówki do oznaczonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

Powtórz dla wszystkich probówek. Napełnić probówkę o pojemności 50 ml do linii 50 ml roztworem 1, wlewając. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

W tym czasie można wypełnić protokół pobierania osocza i buffy wyszczególniony w punkcie 2. Po odwirowaniu osad zawiera PBMC, a supernatant zawiera płytki krwi i resztki osocza. Odrzucić jak najwięcej supernatantu.

Stuknij w razie potrzeby, aby usunąć resztki kropli. Wlać 15 ml probówkę z roztworem 2 do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej osad PBMC. Delikatnie odwróć rurkę, aby ponownie zawiesić granulkę.

Odessać 15 ml roztworu 3 za pomocą pipety transferowej. Dodawać kroplami do probówki o pojemności 50 ml. Roztwór 3 zawiera DMSO, który jest toksyczny dla komórek w temperaturze pokojowej.

Nie dodawaj roztworu 3, dopóki nie będzie on gotowy do natychmiastowego przetworzenia. Delikatnie odwróć probówkę trzy razy, aby wymieszać. Napełnij każdą wstępnie oznakowaną i schłodzoną fiolkę kriogeniczną 1 ml PBMC za pomocą pipety wielodozownikowej.

Zapoznaj się z dodatkowym filmem 2, aby zapoznać się z instrukcją obsługi pipety wielodozownikowej. Umieść fiolki kriogeniczne w wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Następnie przenieś pojemnik do zamrażarki o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.

Przechowywać fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania przez co najmniej 12 godzin. Następnie przenieś do oznaczonego pudełka do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Alternatywnie, przenieś zamrożone fiolki kriogeniczne do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

Po odwirowaniu górna warstwa składa się z osocza, dolna zawiera erytrocyty, a interfejsem będą kożuchy. Zobacz rysunek 1B, aby zapoznać się z wizualizacją. Za pomocą nowej pipety transferowej pobrać jak najwięcej osocza, nie naruszając warstwy kożuchowca.

Następnie dozować 0,5 ml porcji do wstępnie oznakowanych fiolek kriogenicznych. Odessać warstwę kożucha i przenieść ją do odpowiednio oznakowanej kriofiolki. Należy pamiętać, że niektóre osocze i erytrocyty mogą zanieczyścić kolekcję kożucha kożuchowego.

Po pobraniu przechowuj fiolki kriogeniczne w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Alternatywnie przechowuj w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania. Przed rozpoczęciem protokołu rozmrażania PBMC należy przygotować materiały i odczynniki wymienione w Tabeli 3.

Protokół ten jest przeznaczony do rozmrażania jednej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej około 2 milionów komórek. Skaluj odpowiednio. Należy pamiętać, że bezwzględna liczba komórek może się znacznie różnić u różnych pacjentów i w różnych warunkach leczenia.

Przenieś zamrożone PBMC z magazynu za pomocą suchego lodu i rozmrażaj w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 4 minuty. W razie potrzeby można pobrać podwielokrotność do pomiarów zliczania komórek i żywotności, jak wyszczególniono w sekcji 4 pisemnego protokołu. Po rozmrożeniu dodać 1 ml roztworu 4 do każdej fiolki kriogenicznej.

Następnie wlej zawartość do wstępnie oznakowanej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml roztworu 4 na każdą rozmrożoną probówkę PBMC. Stuknij, aby usunąć resztki kropli. Umieścić sitko na pustej probówce o pojemności 50 ml, a następnie przelać zawiesinę komórek przez sitko do komórek.

W razie potrzeby lekko postukaj, aby złamać napięcie powierzchniowe. Odwirować każdą probówkę zawierającą odcedzone komórki w ilości 400 g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu wylać supernatant zawierający DMSO.

Stuknij w razie potrzeby, aby usunąć resztki kropli. Zawiesić osad komórkowy w żądanym podłożu odpowiednim dla dalszych potrzeb doświadczalnych, takich jak pożywki do hodowli komórkowych lub koktajle przeciwciał cytometrii przepływowej. Kontynuuj eksperyment.

Po pobraniu PBMC i krioprezerwacji, żywotność rozmrożonych PBMC, monocytów i limfocytów z 56 unikalnych próbek oceniono za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu odczynników wymienionych w tabeli 4 zgodnie z instrukcjami producenta pokazanymi na rysunkach od 2A do F.A średnia i odchylenie standardowe żywotności PBMC, monocytów i limfocytów wynoszące 94 plus minus 4%98 plus minus 1,1% i 93 plus minus 5,6%odpowiednio, osiągnięto, jak pokazano na rysunku 2G. Pomiary żywotności przez wykluczenie błękitu trypanowego dały średnią żywotność 88 plus minus 7,5% i liczbę komórek 2,3 razy 10 do 6 plus minus 1,9 razy 10 do 6. Analiza cytometrii przepływowej wykazała również, że żywe monocyty stanowiły 17 plus minus 5,9%, a limfocyty składały się z 53 plus minus 13% wszystkich PBMC.

Następnie monocyty posortowano z rozmrożonych PBMC z 59 unikalnych próbek za pomocą cytometrii przepływowej i przekazano do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania RNA, jak opisano w innym miejscu. Średnia i całkowita liczba sekwencji odchyleń standardowych wynosząca 18 plus minus 16,3 miliona została osiągnięta przy 93 plus minus 6,3% wyrównaniu odczytu i 49,6 plus minus 1,4 zawartości GC, jak pokazano na rysunkach 3A i B.A średnia i odchylenie standardowe unikalnie odwzorowany procent odczytów wynoszący 88 plus minus 3,6% stwierdzono w podzbiorze 56 unikalnych próbek. Parametry te pokazują, że wysoce żywotne PBMC odpowiednie do dalszych zastosowań, w tym do sekwencjonowania wysokiej jakości RNA, mogą być uzyskiwane przez operatorów na dowolnym poziomie przeszkolenia laboratoryjnego przy użyciu tego protokołu.

Podczas wykonywania tego protokołu bardzo ważne jest, aby pracować szybko, aby uniknąć śmierci komórki, zwłaszcza po dodaniu roztworu 3, który jest toksyczny dla komórek w temperaturze pokojowej. Ponadto z ogniwami należy obchodzić się delikatnie, aby zminimalizować uszkodzenia. Protokół ten zapewnia wydajną, łatwą do naśladowania metodę izolacji PBMC, osocza EDTA i kożucha.

Te komórki odpornościowe mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie eksperymentów i testów skoncentrowanych na roli układu odpornościowego w różnych kontekstach biologicznych.