Name: Organoidy nabłonka powierzchni jajników człowieka jako platforma do badania regeneracji tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych organoidów nabłonka powierzchni jajników człowieka. Ta technika umożliwia badanie regeneracji tkanek jajnikowych i procesów związanych z płodnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wszystkim pacjentom, którzy oddali tkanki do tego badania, członkom grupy Chuva de Sousa Lopes za użyteczne dyskusje, oraz I. De Poorter za zaprojektowanie karykatur użytych na rysunku 1. Badania zostały sfinansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, grant nr ERC-CoG-2016- 725722 (OVOGROWTH) dla J.S.D.V. i S.M.C.D.S.L.; oraz Fundacja Novo Nordisk (reNEW), grant numer NNF21CC0073729 dla J.S.D.V. i S.M.C.d.S.L.

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej. Projekt badania został przedłożony Komisji Etyki Medycznej Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie (LUMC), a przed badaniem uzyskano pismo o braku zastrzeżeń (B18.029). Pierwotna ludzka tkanka jajnika została pobrana od osób transmęskich poddanych operacji afirmującej płeć w szpitalu VUmc (Amsterdam, Holandia). Uzyskano podpisaną świadomą zgodę od wszystkich dawców. Wszystkie materiały użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja ludzkich pierwotnych komórek OSE
<ol>
	<li>Po wycięciu jajników umieść jajniki w 0,9% NaCl lub podobnym sterylnym roztworze soli fizjologicznej i przetransportuj go do laboratorium na lodzie.</li>
	<li>Przenieś poszczególne jajniki do stożkowej rurki o pojemności 50 ml zawierającej 2-3 ml pożywki trawiącej (Tabela 1) lub wystarczającej do pokrycia jajnika. 
	UWAGA: Jeśli jajnik nie jest nienaruszony (część narządu została wycięta do analizy histologicznej), ważne jest, aby nie pokrywać tej części pożywką trawiącą.</li>
	<li>Umieścić probówkę w podgrzanej kąpieli perełkowej (lub wodnej) w temperaturze 37 °C na 30 minut.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść jajnik na szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 10 ml pożywki zbiorczej (Tabela 1).</li>
	<li>Delikatnie zeskrobać powierzchnię jajnika zawierającą komórki hOSE za pomocą skrobaka do komórek. Umyj skrobak w podłożu i powtórz ten krok co najmniej trzy razy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Jeśli jajnik nie jest nienaruszony, unikaj zarówno skrobania, jak i zanurzania uszkodzonego obszaru, aby zminimalizować zanieczyszczenie niepożądanymi typami komórek.</li>
	<li>Przenieść komórki hOSE z pożywki zbiorczej do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wiruj komórki hOSE przy 240 x g przez 5 minut.
	<ol>
		<li>Jeśli osad ma czerwony kolor, wskazujący na zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami (RBC), należy ponownie zawiesić osad z 1 ml buforu do lizy RBC. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT) z okazjonalnym pipetowaniem, dodać 4 ml PBS z wapniem i magnezem (PBS+/+) i odwirować przy 240 x g przez 5 minut. Jeśli RBC będzie się powtarzać, powtórz ten krok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwuj osad komórkowy hOSE (sekcja 2), użyj go do hodowli 2D (sekcja 3) lub organoidów 3D (sekcja 4) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
2. Kriokonserwacja-rozmrażanie komórek hOSE
<ol>
	<li>Kriokonserwacja
	<ol>
		<li>Zawiesić osad komórek hOSE w 1 ml pożywki do zamrażania komórek.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek do kriowiali (2x kriowiale na jajnik).</li>
		<li>Umieść kriowiale w pojemniku do zamrażania i umieść je w temperaturze -80 °C na noc.</li>
		<li>Przenieś zamrożone kriowia do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>rozmrażanie:
	<ol>
		<li>Usuń kriowial z ciekłego azotu.</li>
		<li>Umieścić kriowial we wstępnie podgrzanej kąpieli perełkowej (lub łaźni wodnej) w temperaturze 37 °C na 5 minut lub do momentu, gdy wewnątrz kriowialu widoczny będzie tylko mały zamrożony rdzeń.</li>
		<li>Odpipetować zawiesinę komórek hOSE do probówki o pojemności 15 ml z 10 ml pożywki zbiorczej (Tabela 1).</li>
		<li>Wirować przy 240 x g przez 5 min.</li>
		<li>Osad komórkowy hOSE należy wykorzystać do hodowli 2D (sekcja 3) lub organoidów 3D (sekcja 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kultura 2D hOSE w monowarstwie
<ol>
	<li>Zawiesić osad hOSE w 1 ml pożywki OSE_2D (Tabela 1) i przenieść go do jednego dołka z płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml dodatkowej pożywki OSE_2D do studzienki i hodować w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze (5% CO2) przez 72 godziny, aby upewnić się, że komórki hOSE przyczepią się przed pierwszą zmianą podłoża.</li>
	<li>Odświeżaj pożywkę co 2-3 dni, aż komórki hOSE osiągną 70%-90% konfluencji (P0) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Jeśli erytrocyty są nadal obecne w hodowli, zostaną usunięte podczas pierwszej zmiany pożywki i tylko komórki hOSE pozostaną przyłączone do studzienki.</li>
	<li>W przypadku pasażowania komórek hOSE wykonaj czynności opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Usuń pożywki hodowlane ze studzienki.</li>
		<li>Przemyć 1 ml sterylnego PBS.</li>
		<li>Usuń PBS i dodaj tyle 0,05% trypsyny/EDTA, aby pokryć komórki.</li>
		<li>Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze (5% CO2 ) na 4-7 minut, aż zauważymy, że komórki zaokrąglają się i odłączają od studzienki.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 1 ml pożywki zbiorczej.</li>
		<li>Zebrać komórki hOSE i odwirować przy 240 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Komórki nasienne w nowej studzience o pożądanej gęstości, odświeżaj pożywkę co 2-3 dni, aż komórki hOSE osiągną 70%-90% konfluencji, i powtórz krok 3.4. 
		UWAGA: Pierwotne komórki hOSE mogą być hodowane do trzech pasaży. Następnie większość komórek staje się stara (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj rozszerzonych komórek hOSE do dalszej charakterystyki za pomocą immunofluorescencji (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B) w celu przetestowania wpływu pożywek hodowlanych (<silna klasa = "xfig" >Figura 2C) lub dla organoidów 3D (Sekcja 4).</li>
</ol>
4. 3D kultura organoidów hOSE
<ol>
	<li>Wstępnie ogrzane szkiełko wielostudzienkowe w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Policz (świeżo wyizolowane lub kriokonserwująco-rozmrożone) komórki hOSE za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Zawiesić żądaną liczbę komórek hOSE w 1 ml lodowatego podłoża zasadowego organoidu OSE (Tabela 1) w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 240 x g przez 5 min.</li>
	<li>Zawiesić osad hOSE w żądanej ilości lodowatego roztworu nierozcieńczonego ekstraktu z błony podstawnej (BME), aby uzyskać stężenie komórek 1 x 104 komórki/10 μL BME.</li>
	<li>Pipetować roztwór hOSE-BME w górę i w dół, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie.</li>
	<li>Przygotować 10 μl kropelek roztworu hOSE-BME na studzienkę we wstępnie podgrzanym szkiełku wielodołkowym. 
	UWAGA: Upewnij się, że każda kropla znajduje się w środku studzienki, aby uzyskać kształt kropli.</li>
	<li>Umieścić płytkę z kropelkami do góry nogami w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze (5% CO2 ) na 15 minut, aby umożliwić zestalenie się żelu.</li>
	<li>Dodać 100 μl pożywki OSE_3D (tabela 1) i wyhodować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze (5%CO2).</li>
	<li>Odświeżaj podłoże co 3-4 dni. 
	UWAGA: organoidy hOSE kontynuują wzrost co najmniej do 28 dni w hodowli (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 3A, B), ale zaleca się pasaż co 14-28 dni (tempo wzrostu zależy od dawcy, świeże kontra kriogeniczne hOSE) w celu stymulowania proliferacji komórek i przeżycia organoidów. Trzy niezależne linie organoidów hOSE zostały przepasane co najmniej 4 razy bez oznak starzenia. Organoidy hOSE wykazują różne morfologie (<silna klasa="xfig">Ryc. 3C).</li>
	<li>Dla pasażujących organoidów hOSE:
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę i dodaj 100 μl lodowatego zaawansowanego DMEM/F12 do każdego dołka.</li>
		<li>Zeskrob dno studzienek końcówką pipety P1000, aby oderwać kropelki żelu.</li>
		<li>Przenieść każdą pływającą kroplę żelu do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować probówki z kropelkami żelu o stężeniu 240 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 300 μl buforu dysocjacji komórek i umieścić probówki w wstępnie podgrzanej kąpieli perełkowej (lub łaźni wodnej) w temperaturze 37 °C na 5-10 minut. 
		UWAGA: Jeśli niektóre organoidy pozostaną nienaruszone, kilkakrotnie przesuń pipetą w górę i w dół za pomocą pokrytej lodowatą surowicą płodową wołową końcówki pipety, aby mechanicznie je rozbić. Powlekanie końcówek pipet płodową surowicą bydlęcą zapobiega przywieraniu organoidów do końcówki.</li>
		<li>Dodać 300 μl pożywki zasadowej dla organoidów hOSE i wirować w sile 240 x g przez 5 min.</li>
		<li>Zawiesić osad w żądanej ilości nierozcieńczonego roztworu BME, ponownie wysiać je w odpowiednim stosunku (rozprowadzić zawartość 1 kropli na 1-4 krople) i wyhodować jak wyżej. 
		UWAGA: Organoidy nie są dysocjowane na pojedyncze komórki, a zatem komórek nie można dokładnie policzyć do dalszego przejścia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Immunofluorescencja 3D organoidów hOSE
UWAGA: Immunofluorescencja z całą górą może być przeprowadzona w tej samej studzience hodowlanej (in de droplet), jeśli używa się szkiełek wielokomorowych odpowiednich dla technik mikroskopowych.
<ol>
	<li>Utrwalić organoidy hOSE w kropelkach w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć dwukrotnie PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej na platformie obrotowej/wstrząsającej.</li>
	<li>Przepuszczalność organoidów hOSE w kropelkach przy użyciu 100 μl buforu permeabilizacji (Tabela 1) przez 15 minut w suchej temperaturze słonecznej.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie 100 μl buforu blokującego (tabela 1) przez 15 minut w temperaturze pokojowej i zablokować przez noc (o/n) w temperaturze 4 °C na platformie obracającej się/wytrząsającej.</li>
	<li>Inkubować ze 100 μl pierwszorzędowej mieszaniny przeciwciał rozcieńczonej w buforze blokującym w temperaturze 4 °C o/n na platformie obracającej/wstrząsającej. 
	UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów, aby uzyskać listę użytych przeciwciał pierwszorzędowych, oznaczony typ komórki i model zwierzęcy używany do walidacji wyrażenia12,19,20,21,22,23,24,25.</li>
	<li>Przynieś płytkę do RT i umyj ją trzykrotnie 100 μl buforu blokującego przez 15 minut w temperaturze pokojowej na platformie obracającej/wstrząsającej.</li>
	<li>Inkubować ze 100 μl drugorzędowej mieszaniny przeciwciał rozcieńczonej w buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na platformie obracającej się/wytrząsającej, ale chronionej przed światłem. 
	UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z listą stosowanych przeciwciał drugorzędowych. Aby chronić przed światłem, umieść talerz w ciemnym pudełku lub przykryj go folią aluminiową.</li>
	<li>Umyć trzy razy w 100 μl PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej na platformie obrotowej/wstrząsającej.</li>
	<li>Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przykrytą folią aluminiową do czasu obrazowania (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4).</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja wielkości organoidów hOSE
<ol>
	<li>Rób zdjęcia w jasnym polu 10x (obraz TIFF) pod mikroskopem.</li>
	<li>Pobierz i zainstaluj Fiji (https://imagej.net/software/fiji/)26.</li>
	<li>Zmierz obszar obrazu organoidów hOSE za pomocą oprogramowania ImageJ Fidżi:
	<ol>
		<li>Załaduj pliki TIFF obrazu na Fidżi.</li>
		<li>Utwórz próg, aby oprogramowanie mogło rozpoznać organoidy hOSE (ciemniejszy obszar) na przesłanym obrazie w jasnym polu, klikając Obraz > Dostosuj próg >. Dostosuj wartości poniżej i powyżej, aż większość tła zostanie usunięta, a poszczególne organoidy zostaną zachowane.</li>
		<li>Otwórz narzędzie ROI, klikając Analizuj narzędzie > > ROI.</li>
		<li>Wybierz narzędzie Różdżka i klikaj region z organoidem hOSE, aż zobaczysz żółtą linię otaczającą cały obwód organoidu. W panelu ROI kliknij przycisk Dodaj i zmierz, aby uzyskać wartość powierzchni tego organoidu OSE.</li>
		<li>Powtórzyć krok 6.3.4 dla każdego organoidu hOSE, który ma zostać poddany pomiarowi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Human Ovarian Epithelium Organoids: A Model for Tissue Repair and Drug Testing

<ol><li>Ng, A., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovary+and+fimbrial+stem+cells%3A+biology%2C+niche+and+cancer+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (10), 625-638 (2015).</li>
<li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium%3A+biology%2C+endocrinology%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocr Rev. 22 (2), 255-288 (2001).</li>
<li>Tan, O. L., Fleming, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+cell+nuclear+antigen+immunoreactivity+in+the+ovarian+surface+epithelium+of+mice+of+varying+ages+and+total+lifetime+ovulation+number+following+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Proliferating cell nuclear antigen immunoreactivity in the ovarian surface epithelium of mice of varying ages and total lifetime ovulation number following ovulation.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1501-1507 (2004).</li>
<li>Carter, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+heterogeneity+of+stemness+phenotypes+in+the+ovarian+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional heterogeneity of stemness phenotypes in the ovarian epithelium.</a> Commun Biol. 4 (1), 527(2021).</li>
<li>Chumduri, C., Turco, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Organoids of the female reproductive tract.</a> J Mol Med (Berl). 99 (4), 531-553 (2021).</li>
<li>Edmondson, R. J., Monaghan, J. M., Davies, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+ovarian+surface+epithelium+is+an+androgen+responsive+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The human ovarian surface epithelium is an androgen responsive tissue.</a> Br J Cancer. 86 (6), 879-885 (2002).</li>
<li>Karlan, B. Y., Jones, J., Greenwald, M., Lagasse, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+hormone+effects+on+the+proliferation+of+human+ovarian+surface+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Steroid hormone effects on the proliferation of human ovarian surface epithelium in vitro.</a> Am J Obstet Gynecol. 173 (1), 97-104 (1995).</li>
<li>Nakamura, M., Katabuchi, H., Ohba, T., Fukumatsu, Y., Okamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+characteristics+of+human+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and characteristics of human ovarian surface epithelium.</a> Virchows Arch. 424 (1), 59-67 (1994).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Del Valle, J. S., Chuva de Sousa Lopes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+ovarian+models+as+paramount+technology+for+female+health+management+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D ovarian models as paramount technology for female health management and reproduction.</a> Bioengineering (Basel). 10 (7), 832(2023).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Maenhoudt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+organoids+from+ovarian+cancer+as+experimental+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models.</a> Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).</li>
<li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+efficient+establishment+and+drug-response+profiling+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids.</a> Dev Cell. 58 (12), 1106-1121.e7 (2023).</li>
<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nat Commun. 11 (1), 2660(2020).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+fallopian+tube+and+ovarian+surface+epithelium+are+cells-of-origin+for+high-grade+serous+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Both fallopian tube and ovarian surface epithelium are cells-of-origin for high-grade serous ovarian carcinoma.</a> Nat Commun. 10 (1), 5367(2019).</li>
<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6, 8989(2015).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Abedini, A., Sayed, C., Carter, L. E., Boerboom, D., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+WNT5a+regulates+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+the+mouse+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Non-canonical WNT5a regulates Epithelial-to-Mesenchymal Transition in the mouse ovarian surface epithelium.</a> Sci Rep. 10 (1), 9695(2020).</li>
<li>Bowen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+supports+the+hypothesis+that+human+ovarian+surface+epithelia+are+multipotent+and+capable+of+serving+as+ovarian+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling supports the hypothesis that human ovarian surface epithelia are multipotent and capable of serving as ovarian cancer-initiating cells.</a> BMC Med Genomics. 2, 71(2009).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+switch+for+the+orientation+of+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A molecular switch for the orientation of epithelial cell polarization.</a> Dev Cell. 31 (2), 171-187 (2014).</li>
<li>Flesken-Nikitin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium+at+the+junction+area+contains+a+cancer-prone+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche.</a> Nature. 495 (7440), 241-245 (2013).</li>
<li>Hosper, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+in+fibrosis%3A+collagen+type+I+expression+is+highly+upregulated+after+EMT%2C+but+does+not+contribute+to+collagen+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition in fibrosis: collagen type I expression is highly upregulated after EMT, but does not contribute to collagen deposition.</a> Exp Cell Res. 319 (19), 3000-3009 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+YAP+activation+in+Procr+cells+is+essential+for+ovarian+stem%2Fprogenitor+expansion+and+epithelium+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Selective YAP activation in Procr cells is essential for ovarian stem/progenitor expansion and epithelium repair.</a> Elife. 11, e75449(2022).</li>
<li>Wong, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+conditional+cadherin+expression+in+cultured+human+ovarian+surface+epithelium%3A+influence+of+family+history+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Constitutive and conditional cadherin expression in cultured human ovarian surface epithelium: influence of family history of ovarian cancer.</a> Int J Cancer. 81 (2), 180-188 (1999).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J., Nachtigal, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Res. 19 (2), 156-172 (2009).</li>
<li>Miettinen, P. J., Ebner, R., Lopez, A. R., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells%3A+involvement+of+type+I+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> J Cell Biol. 127 (6 Pt 2), 2021-2036 (1994).</li>
<li>Danielpour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwich+enzyme-linked+immunosorbent+assays+%28SELISAs%29+quantitate+and+distinguish+two+forms+of+transforming+growth+factor-beta+%28TGF-beta+1+and+TGF-beta+2%29+in+complex+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (SELISAs) quantitate and distinguish two forms of transforming growth factor-beta (TGF-beta 1 and TGF-beta 2) in complex biological fluids.</a> Growth Factors. 2 (1), 61-71 (1989).</li>
<li>Oida, T., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+TGF-beta+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Depletion of TGF-beta from fetal bovine serum.</a> J Immunol Methods. 362 (1-2), 195-198 (2010).</li>
<li>Halder, S. K., Beauchamp, R. D., Datta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+inhibitor+of+TGF-beta+receptor+kinase%2C+SB-431542%2C+as+a+potent+antitumor+agent+for+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A specific inhibitor of TGF-beta receptor kinase, SB-431542, as a potent antitumor agent for human cancers.</a> Neoplasia. 7 (5), 509-521 (2005).</li>
<li>Wang, J., Wang, D., Chu, K., Li, W., Zeng, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procr-expressing+progenitor+cells+are+responsible+for+murine+ovulatory+rupture+repair+of+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Procr-expressing progenitor cells are responsible for murine ovulatory rupture repair of ovarian surface epithelium.</a> Nat Commun. 10 (1), 4966(2019).</li>
<li>Kawata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+switching+of+ovarian+cancer+cell+clusters+via+SRC+family+kinase+is+involved+in+the+peritoneal+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Polarity switching of ovarian cancer cell clusters via SRC family kinase is involved in the peritoneal dissemination.</a> Cancer Sci. 113 (10), 3437-3448 (2022).</li>
<li>Davies, B. R., Worsley, S. D., Ponder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+E-cadherin%2C+alpha-catenin+and+beta-catenin+in+normal+ovarian+surface+epithelium+and+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Expression of E-cadherin, alpha-catenin and beta-catenin in normal ovarian surface epithelium and epithelial ovarian cancers.</a> Histopathology. 32 (1), 69-80 (1998).</li>
<li>Skory, R. M., Xu, Y., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+ovarian+cycle+using+in+vitro+follicle+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Engineering the ovarian cycle using in vitro follicle culture.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1386-1395 (2015).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li>
<li>Phan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+high-throughput+approach+identifies+actionable+drug+sensitivities+in+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids.</a> Commun Biol. 2, 78(2019).</li>
<li>Ducie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+high-grade+serous+ovarian+carcinoma+with+and+without+associated+serous+tubal+intra-epithelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of high-grade serous ovarian carcinoma with and without associated serous tubal intra-epithelial carcinoma.</a> Nat Commun. 8 (1), 990(2017).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> J Pathol. 211 (1), 26-35 (2007).</li>
<li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Curr Protoc Cell Biol. 83 (1), e82(2019).</li>
<li>Asseler, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-third+of+amenorrheic+transmasculine+people+on+testosterone+ovulate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Med%22%5BJournal%5D)">One-third of amenorrheic transmasculine people on testosterone ovulate.</a> Cell Rep Med. 5 (3), 101440(2024).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+androgen+exposure+in+female-to-male+transsexual+persons+of+reproductive+age+induces+hyperplasia+of+the+ovarian+cortex+and+stroma+but+not+polycystic+ovary+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Excessive androgen exposure in female-to-male transsexual persons of reproductive age induces hyperplasia of the ovarian cortex and stroma but not polycystic ovary morphology.</a> Hum Reprod. 28 (2), 453-461 (2013).</li>
<li>De Roo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Texture+profile+analysis+reveals+a+stiffer+ovarian+cortex+after+testosterone+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Texture profile analysis reveals a stiffer ovarian cortex after testosterone therapy: a pilot study.</a> J Assist Reprod Genet. 36 (9), 1837-1843 (2019).</li>
<li>Grimstad, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+histopathology+in+transmasculine+persons+on+testosterone%3A+A+multicenter+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sex+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian histopathology in transmasculine persons on testosterone: A multicenter case series.</a> J Sex Med. 17 (9), 1807-1818 (2020).</li>
</ol>

Technologia organoidów 3D staje się nieodzownym narzędziem w badaniach medycznych. Z jednej strony ta platforma in vitro oferuje możliwość badania podstawowych zagadnień mechanistycznych dotyczących regeneracji tkanek, gojenia się ran i rozwoju18. Z drugiej strony, organoidy 3D pochodzące z próbek pobranych od pacjentów umożliwiają badania medycyny spersonalizowanej, w tym diagnostykę, testowanie leków i terapię komórkową 12,13,14,37,38. W dziedzinie badań nad jajnikami hOSE zyskała duże zainteresowanie od czasu jej implikacji jako źródła nabłonkowych raków jajnika39. Chociaż uważa się, że większość surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSOC), jeden z najczęstszych nabłonkowych nowotworów jajnika, powstaje z jajowodów40, obecne badania na organoidach jajników 3D u myszy sugerują potencjalne podwójne pochodzenie HGSOC z OSE i jajowodu 15,16.
W tym miejscu opisaliśmy protokół wyprowadzania organoidów 3D hOSE i przedstawiliśmy jego zastosowanie w celu uzyskania nowej wiedzy mechanistycznej w regeneracji tkanki jajnika. Protokół ten obejmuje metodę krok po kroku izolowania pierwotnych komórek hOSE z ludzkich jajników i generowania organoidów 3D hOSE. Aby zapewnić skuteczne wyprowadzanie organoidów hOSE, kluczowe jest zminimalizowanie manipulacji jajników. Ze względu na swoje umiejscowienie na powierzchni jajnika i jednowarstwową organizację, hOSE jest podatny na uszkodzenia i utratę podczas wycięcia jajników i manipulacji narządów. Z tego powodu faworyzowaliśmy metodę enzymatyczną i skrobanie zastosowaną na całym jajniku w celu wyizolowania hOSE 2,8. W niniejszym protokole zastosowano łagodne leczenie enzymatyczne w celu przerwania połączeń międzykomórkowych hOSE, a następnie delikatne skrobanie powierzchni jajnika.
Porównując hodowlę 2D z 3D hOSE, należy zauważyć, że pomimo początkowego wysokiego tempa proliferacji komórek hOSE w hodowli 2D, ich charakterystyka komórkowa zmieniła się pod wpływem EMT, co sugeruje, że zastosowane warunki hodowli 2D nie są odpowiednie do utrzymania morfologii nabłonka. Dla porównania, organoidy 3D hOSE mogą być pasażowane co najmniej 4 razy bez oznak starzenia. Zastosowane OSE_3D pożywki do hodowli organoidów opierały się na pożywkach użytych przez Koppera i współpracowników do wyprowadzenia organoidów OC i zdrowych organoidów hOSE12 oraz przez Kesslera i współpracowników do wyprowadzenia ludzkich organoidów FT17. Główna różnica polegała na zastąpieniu ludzkich pożywek kondycjonowanych Wnt3a i R-Spondin-1 dostępnymi na rynku rekombinowanymi białkami w celu ułatwienia odtwarzalności.
Techniki immunofluorescencji zazwyczaj polegają na usunięciu próbki tkanki z płytki hodowlanej i przetworzeniu jej do parafiny lub kriosekcji. Podczas pracy z bardzo małymi strukturami ryzyko ich utraty podczas przetwarzania próbki jest wysokie. W tym protokole wyprowadzenie organoidów hOSE odbywa się na płytkach do hodowli komórkowych, które umożliwiają bezpośrednie obrazowanie mikroskopowe bez konieczności usuwania organoidów hOSE z matrycy BME. Co więcej, zastosowana tutaj metoda immunofluorescencji całej góry, opisana przez Rezanejada i współpracowników dla organoidów przewodowych trzustki41, umożliwiła obserwację in situ lokalizacji białek w morfologicznie nienaruszonych organoidach. Wykazaliśmy, że podczas wykonywania tego protokołu immunofluorescencji na organoidach hOSE pochodzących z szkiełek wielodołkowych występuje wysoce skuteczna penetracja przeciwciał przy bardzo niskim sygnale tła.
Chociaż większość organoidów hOSE uzyskanych tą metodą nie miała ekspresji CDH1, niektóre organoidy hOSE CDH1 + utworzyły się, osiągając większe rozmiary w porównaniu z organoidami cdh1- hOSE. Ekspresja CDH1 jest związana z nowotworowymi fenotypami hOSE 2,35. Jajniki użyte do izolacji hOSE zostały oddane przez zdrowych dawców transmęskich w wieku rozrodczym (27,1 ± 5 lat). Dawcy ci byli leczeni testosteronem przez okres 38 ± 15 miesięcy przed wycięciem jajników. Nie możemy odrzucić możliwości, że komórki hOSE CDH1 + na powierzchni jajnika można przypisać leczeniu testosteronem. Chociaż leczenie androgenami wiąże się ze zmianami w jajnikach, takimi jak brak owulacji42, przerost obszaru korowego43 i zwiększona sztywność kory44, ogólna patologia jajników pozostaje łagodna podczas stosowania testosteronu45.
Podsumowując, protokół ten podkreśla potencjał generowania organoidów 3D hOSE w celu rozszyfrowania mechanistycznych pytań dotyczących regeneracji tkanki jajnika. Co ważne, metoda ta może być również stosowana do wykrywania komórek złośliwych obecnych w biopsjach jajników od pacjentek zagrożonych rozwojem nowotworów. Reasumując, metoda ta wspiera potencjalne zastosowania tej innowacyjnej platformy in vitro zarówno do podstawowych badań funkcji jajników, jak i do zastosowań klinicznych w zindywidualizowanych terapiach medycznych.

Jajnik jest uważany za jeden z najbardziej dynamicznych organów w ciele, podlegający ciągłym cyklom gojenia się ran i przebudowy przez cały okres reprodukcyjnego życia osobnika. Głównym czynnikiem biorącym udział w regeneracji tkanki jajnikowej po każdym cyklu owulacyjnym jest nabłonek powierzchni jajnika (OSE)1. OSE to pojedyncza warstwa pochodząca z mezotelium zawierająca płaskie, prostopadłościenne i walcowate komórki nabłonkowe, które pokrywają całą powierzchnię jajnika2. Przed owulacją tkanka zrębu jajnika na powierzchni pęcherzyka owulacyjnego ulega zaburzeniu proteolitycznemu, aby umożliwić uwolnienie kompleksu wzgórek-oocyt. Zraniony obszar, znany jako znamię owulacyjne, jest następnie naprawiany, a całkowite zamknięcie powierzchni jajnika osiąga się w czasie krótszym niż 72 godziny u myszy3. Wysoce wydajna zdolność OSE do namnażania i zamykania rany owulacyjnej podkreśla domniemane istnienie rezydentnej populacji komórek macierzystych4. Ze względu na ograniczoną dostępność ludzkich jajników od dawców w wieku rozrodczym, większość wiedzy na temat mechanizmów naprawy OSE pochodzi z modeli zwierzęcych. Jednak cechy charakterystyczne dla danego gatunku utrudniają translację z badań nad jajnikami na badania nad jajnikami na ludzi5.
W badaniach in vitro głównie stosowano dwuwymiarową (2D) hodowlę komórkową ludzkiego OSE, w której komórki rosły w monowarstwie przymocowanej do powierzchni płytki hodowlanej, ze względu na jej opłacalność i łatwość hodowli6,7,8. Niemniej jednak podejście to ma ograniczenia odzwierciedlające złożoność dynamiki tkanki jajnika9. W związku z tym platformy hodowli komórkowych 3D, ze szczególnym naciskiem na organoidy jajników, zrewolucjonizowały badania nad jajnikami10. Organoidy tkankowe są miniaturyzowanymi reprezentacjami in vitro narządu, z którego pochodzą, wykazując zdolność do samoorganizacji 3D i naśladując kluczowe funkcje i struktury swoich odpowiedników in vivo11. Technologia ta daje możliwość rzucenia światła na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju, regeneracji i naprawy tkanek w ludzkim jajniku10. W ostatnich latach naukowcy wykorzystali również wiedzę na temat organoidów jajników do generowania specyficznych dla pacjenta organoidów raka jajnika (OC) do modelowania chorób i medycyny spersonalizowanej12,13,14.
Na podstawie różnych metod wykorzystywanych do generowania organoidów OSE myszy i organoidów jajowodów (FT)15,16 oraz ludzkich organoidów OSE12 i organoidów FT17, opisujemy tutaj protokół pozyskiwania ludzkich organoidów OSE z ludzkich jajników z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad regeneracją OSE. Protokół ten skutecznie izoluje pierwotne komórki OSE od całych ludzkich jajników i zawiera opis krok po kroku ekspansji komórek 2D i generowania organoidów 3D hOSE. Organoidy hOSE wykazywały (specyficzną dla dawcy) zmienność morfologii i wzrostu, co podkreśla ich przydatność w spersonalizowanych badaniach. Dodatkowo protokół ten obejmuje utrzymanie, pasażowanie i immunofluorescencję organoidów hOSE na tej samej płytce hodowlanej. Ponadto zawiera opis różnych morfologii, które mogą przyjmować organoidy hOSE, oraz charakteryzuje zmiany w immunofenotypie podczas hodowli. Wreszcie, wykazuje się użytecznością, badając wpływ sygnałów środowiskowych, takich jak hormony jajnikowe, na tworzenie i wzrost organoidów hOSE w oparciu o liczbę i rozmiar organoidów hOSE.
Zastosowanie technologii organoidów hOSE poszerzy nasze zrozumienie jajnika, ze szczególnym naciskiem na mechanizmy odpowiedzialne za jego niezwykłą zdolność regeneracyjną. Ponieważ modele 3D ludzkich jajników nadal ewoluują, zależność od modeli zwierzęcych w badaniach nad jajnikami zmniejszy się, co doprowadzi do innowacyjnych terapii w dziedzinie medycyny regeneracyjnej18.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Corning</td><td>3336</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>probówki 15 ml</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>skrobak do komórek 28 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>541070</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>szalka Petriego 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>72024</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany suplement DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td> perełkowa <td>M714</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Bufor dysocjacyjny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Kriopojemnik "Mr. Frosty"</td><td>BD Falcom</td><td>479-3200</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-kozi IgG Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Oślica IgG przeciw myszom Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-mysie IgG Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Mąka przeciw owcom IgG Alexa 647&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-21448</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4736401</td><td></td></tr><tr><td>Hormon folikulotropowy (FSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>6652995</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-CDH2 (N/R-kadheryna)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-1502</td><td>Komórki mezenchymalne; Wong i wsp. 1999 (człowiek)25</td></tr><tr><td>Goat anty-PODXL (podokalixin z GP135)</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>AF1658</td><td>Polaryzacja wierzchołkowa; Bryant i wsp. 2014 (pies)21</td></tr><tr><td>Goat anty-Rat IgG Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21434</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>R& D Systems</td><td>263-EG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS-X; 100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4736401</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II&nbsp; licznik komórek</td><td>Logos Biosystems</td><td>L40001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A Średni&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26600-023</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ITGB1 (integryna beta 1)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-53711</td><td>Polaryzacja podstawno-boczna; Bryant i wsp. 2014 (pies)21</td></tr><tr><td>Mysz anty-KRT8 (cytokeratyna 8)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-101459</td><td>Ogniwa OSE; Kopper i wsp. 2019 (człowiek)12</td></tr><tr><td>Mysz anty-VIM (wimentyna)</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB0809</td><td>Komórki mezenchymalne; Abedini i wsp. 2020 (mysz)19</td></tr><tr><td>Mycozap Plus-CL</td><td>Lonza</td><td>V2A-2011</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>OVITRELLE-Choriogonadotropina alfa (hCG)</td><td>Merk</td><td>G03GA08</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron&nbsp;( P4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ACTA2 (alfa aktyna mięśni gładkich)</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB5694</td><td>Komórki mezenchymalne; Abedini i in. 2020 (mysz)19</td></tr><tr><td>Królicza anty-CDH1 (E-kadheryna)</td><td>Sygnalizacja komórkowa&nbsp;</td><td>CST 3195S</td><td>Komórki nabłonkowe; Wong i wsp. 1999 (człowiek)25</td></tr><tr><td>Królik anty-LGR5</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB75850</td><td>Komórki progenitorowe OSE; Flesken-Nikitin i wsp. 2013 (mysz)22</td></tr><tr><td>Królicza sygnalizacja komórkowa</td> <td>anty-YAP</td>&nbsp;<td>14074S</td><td>Proliferacyjne środowisko operacyjne; Wang i in. 2022 (mysz) 24</td></tr><tr><td>Rat anty-CD44 PE sprzężone</td><td>eBioscience</td><td>12-0441-81</td><td>OSE Komórki progenitorowe; Bowen i wsp. 2009 (człowiek)20</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka heregulina&beta;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana rspondyna-1&nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>eBiosciences</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Revitacell (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A26445-01</td><td></td></tr><tr><td>DNAzyda wolna od RNAzy</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1624/10</td><td></td></tr><tr><td>Owca anty-COL1A1 (pro-kolagen 1 alfa 1)</td><td>R&;D Systemy&nbsp;</td><td>AF6220</td><td>Komórki mezenchymalne; Hosper i wsp. 2013 (człowiek)23</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol (E2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Slide 18-dołkowa płytka</td><td>hodowlana Ibidi</td><td>8181</td><td>Sterylna</td></tr></tbody></table>

organoidy nabłonka powierzchni jajników człowieka jako platforma do badania regeneracji tkanek

Human Ovarian Surface Epithelium Organoids as a Platform to Study Tissue Regeneration

Nabłonek powierzchniowy jajnika (OSE), najbardziej zewnętrzna warstwa jajnika, ulega pęknięciu podczas każdej owulacji i odgrywa kluczową rolę w gojeniu się ran jajników, przywracając integralność jajników. Dodatkowo OSE może służyć jako źródło nabłonkowych nowotworów jajnika. Chociaż właściwości regeneracyjne OSE zostały dobrze zbadane na myszach, zrozumienie dokładnego mechanizmu naprawy tkanek w ludzkim jajniku pozostaje utrudnione ze względu na ograniczony dostęp do ludzkich jajników i odpowiednie protokoły hodowli in vitro. Organoidy specyficzne dla tkanek, zminiaturyzowane modele in vitro odtwarzające zarówno strukturalne, jak i funkcjonalne aspekty oryginalnego narządu, oferują nowe możliwości badania fizjologii narządów, modelowania chorób i testowania leków. 
Tutaj opisujemy metodę izolowania pierwotnego ludzkiego OSE (hOSE) z całych jajników i tworzenia organoidów hOSE. Uwzględniamy charakterystykę morfologiczną i komórkową wykazującą niejednorodność między dawcami. Dodatkowo wykazujemy zdolność tej metody hodowli do oceny wpływu hormonów na wzrost organoidów OSE w okresie 2 tygodni. Metoda ta może umożliwić odkrycie czynników przyczyniających się do regeneracji OSE i ułatwić badania przesiewowe leków specyficznych dla pacjenta w kierunku złośliwego OSE.

Kultura hOSE 2D 
Świeżo wyizolowane komórki hOSE wysiano na płytkę 12-dołkową i hodowano przez 3 tygodnie. W tym okresie komórki pasażowano trzykrotnie (Rysunek 2A). Pierwotne komórki hOSE w hodowli wykazywały morfologię przypominającą brukowaną do pasażu 3 (P3), jednak później zaczęły wykazywać oznaki starzenia, co jest zgodne z wcześniejszymi wynikami wskazującymi na ograniczony czas pasażowania hOSE27. Ponadto wykazano, że mysie OSE przechodzi przejście epitelialno-mezenchymalne (EMT) in vitro, wykazując cechy fibroblastopodobne, takie jak reorganizacja cytoszkieletu aktynowego i odkładanie kolagenu I19. Zgodnie z tym, komórki ACTA2+CD44+ hOSE wykazały wyraźną nadekspresję COL1A1 pomiędzy P2 a P3 (Rysunek 2B), co sugeruje, że komórki hOSE przechodzą EMT podczas hodowli.
Sygnalizacja TGF-β jest głównym regulatorem EMT28, zdolnym do indukowania EMT w różnych typach komórek nabłonkowych29. Chociaż do pożywki OSE_2D nie dodano TGF-β, dodana FBS mogła zawierać wykrywalne poziomy tej cytokiny30,31. Z tego powodu zbadaliśmy, czy dodanie inhibitora receptora typu I TGF-β, SB-431542, może zapobiec EMT, umożliwiając przedłużoną hodowlę 2D. Co zaskakujące, suplementacja pożywki OSE_2D 10 µM SB-43154232 utrudniła proliferację komórek (Rysunek 2C). Wyciągnęliśmy wniosek, że sygnalizacja TGF-β jest niezbędna dla proliferacji OSE, i dalsze eksperymenty z hodowlą 2D przeprowadzono bez zastosowania inhibitora.
Kultura 3D organoidów hOSE 
W oparciu o opublikowane warunki hodowli służące do wzrostu ludzkich organoidów OSE12, otrzymaliśmy organoidy hOSE zatopione w kropelkach BME i hodowane w medium OSE_3D (zawierającym standardowe stężenie 100 nM estradiolu) przez maksymalnie 28 dni. W ciągu 7 dni wiele organoidów hOSE otrzymanych z bezpośrednio wyizolowanych komórek OSE miało charakter torbielowaty ze średnicą średnią wynoszącą 130 mm (Rycina 3A,B). Wyniki te były zbliżone do raportowanych przez Koppera i współpracowników w kontekście otrzymywania organoidów hOSE z posiekanej i enzymatycznie trawionej tkanki jajnika człowieka12. Co ciekawe, organoidy hOSE otrzymane z bezpośrednio wyizolowanych komórek OSE rosły bardziej (średnia średnica 160 mm) niż organoidy hOSE z komórek OSE namnażanych w 2D (średnia średnica 100 mm) po 14 dniach hodowli (Rycina 3B), co prawdopodobnie wynika z tendencji komórek OSE namnażanych w 2D do ograniczania proliferacji. Ponadto, podczas gdy wiele organoidów 3D hOSE składało się z jednowarstwy płaskich komórek nabłonkowych (Rycina 3C górny lewy panel), niektóre wykazywały obecność jednowarstwy komórek sześciennych (Rycina 3C górny prawy panel), inne były wielowarstwowe (Rycina 3C dolny prawy panel) lub tworzyły nieprześwitowy skup komórek (Rycina 3C dolny lewy panel).
Aby sprawdzić, czy organoidy hOSE mogą być również otrzymywane z wykorzystaniem medium OSE_2D, świeżo wyizolowane komórki hOSE osadzono w kropelkach BME i hodowano w mediach OSE_2D przez 12 dni. Po 6 dniach zaobserwowano komórki o wrzecionowatym kształcie, co sugeruje, że komórki hOSE przechodziły proces EMT w kropelkach. Co istotne, przy użyciu medium OSE_2D nie utworzyły się organoidy hOSE (Rycina 3D).
Charakterystyka komórkowa organoidów hOSE 
W ludzkim jajniku dorosłego osobnika keratyna 8 (KRT8) specyficznie znakuje populację OSE (Rycina 4A), w związku z czym organoidy hOSE zachowały ekspresję KRT8, co potwierdza tożsamość ich komórek (Rycina 4B). W komórkach OSE myszy lokalizacja jądrowa białka YAP1 (Yes1-associated protein) była specyficznie powiązana z komórkami macierzystymi/progenitorowymi OSE, zdolnymi do powiększania i regeneracji uszkodzonego obszaru po owulacji24,33. YAP wykazał lokalizację jądrową w większości komórek w organoidach hOSE, niezależnie od ich wielkości (Rycina 4B). Badano również inne markery, o których raportowano, że są ekspresowane w komórkach OSE myszy, takie jak CD4420 i LGR522. Co ciekawe, zarówno CD44, jak i LGR5 były ekspresowane w małych organoidach hOSE (średnica &lt;100 µm), podczas gdy w większych organoidach ekspresja CD44 i LGR5 wydawała się obniżona (Rycina 4B).
Następnie zbadaliśmy, czy organoidy hOSE wykazują polaryzację apikalno-bazalną typową dla organoidów zanurzonych w BME (polaryzacja apikalna do wewnątrz)34. Aby wykazać polarność komórek w organoidach hOSE, wykorzystano białko bazolateralne integrynę beta 1 (ITGB1) oraz białko apikalne podokalicsynę (PODXL), co potwierdziło wyraźną polaryzację apikalną do wewnątrz, niezależną od wielkości organoidów hOSE (Rysunek 4B).
Znane jest, że ludzkie OSE wykazuje ekspresję markera mezenchymalnego N-kadheryny (CDH2), podczas gdy ekspresja markera nabłonkowego E-kadheryny (CDH1) jest ograniczona do kolumnowych komórek OSE (Rysunek 4A)2. Co ciekawe, organoidy hOSE wyhodowane w tej pracy wykazywały ekspresję markerów mezenchymalnych CDH2 i wimentyny (VIM), a duże cystyczne organoidy hOSE z nabłonkiem sześciannym/kolumnowym były zarówno CDH1+, jak i CDH2+VIM+ (Rysunek 4C). Pozostaje niejasne, czy organoidy hOSE CDH1+ pochodziły z pierwotnych komórek OSE CDH1+, czy z komórek OSE CDH1-, które uległy różnicowaniu nabłonkowemu lub transformacji (neoplastycznej) in vitro25,35.
Prezentacja zastosowania organoidów hOSE: wpływ sygnałów owulacyjnych na organoidy hOSE 
Hormony takie jak hormon folikulotropowy i ludzka gonadotropina kosmórki trofoblastycznej mogą być stosowane do indukowania wzrostu pęcherzyków i owulacji, natomiast po owulacji następuje wyraźny wzrost stężenia hormonów produkowanych przez jajnik, takich jak progesteron i estradiol36. Aby wykazać przydatność organoidów hOSE jako platformy przesiewowej, zbadaliśmy wpływ tych hormonów na organoidy hOSE, przyjmując liczbę i rozmiar organoidów jako parametry ilościowe (z wykorzystaniem oprogramowania Fiji). W tym celu hodowano organoidy hOSE w pożywce OSE_3D pozbawionejエストradiolu (bez hormonów) oraz w pożywce OSE_3D zawierającej FSH, hCG, estradiol lub progesteron w różnych stężeniach (Rysunek 5A).
Liczba organoidów hOSE pochodzących z rozmrożonych komórek hOSE (niepoddanych ekspansji) od 3 różnych dawców (n=3) została określona dla każdej kropli po 7 dniach hodowli (Rycina 5A,B). Pożywkę hodowlaną wymieniano co 3 dni. Nie zaobserwowano istotnych różnic w całkowitej liczbie organoidów hOSE na kroplę, które utworzyły się w pożywce zawierającej hormony, w porównaniu z pożywką bez hormonów (Rycina 5A,B). Aby określić wpływ hormonów na wielkość organoidów, po 14 dniach hodowli wykonano obrazowanie każdej kropli (dla każdego wariantu), a następnie za pomocą programu Fiji zmierzono pole powierzchni 4 największych organoidów hOSE. Co ciekawe, generowanie organoidów hOSE od dwóch różnych dawców (n = 2) w obecności progesteronu (1000 nM) lub estradiolu (200 nM) doprowadziło do powstania co najmniej jednego bardzo dużego organoidu (o średnicy około 700 µm) na kroplę (Rycina 5C,D).
<img alt="Izolacja ludzkich komórek OSE; schemat monowarstwy 2D, hodowli organoidów 3D, procesu krio konserwacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczna reprezentacja izolacji komórek hOSE z całych jajników. Jajniki inkubowano w roztworze trawiennym przez 30 min w 37 °C. Komórki hOSE oddzielano od powierzchni jajnika poprzez delikatne skrobanie, a następnie krio konserwowano, wysiewano bezpośrednio do hodowli OSE 2D w monowarstwie lub osadzano w ekstrakcie błony podstawnej (BME) w celu hodowli organoidów hOSE 3D. Rozmrożone komórki hOSE po krio konserwacji mogą być wykorzystane do hodowli 2D lub tworzenia organoidów 3D, a komórki hOSE namnożone w 2D mogą służyć do generowania organoidów hOSE 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu komórek na obrazach mikroskopowych; analiza wpływu traktowania z użyciem markerów ACTIN, CD44, COL1A1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: 2D hodowla pierwotna komórek hOSE. (A) Obrazy w jasnym polu komórek hOSE w pasażach 0 (P0), 2 (P2) i 3 (P3), przedstawiające typową nabłonkową morfologię brukową. Paski skali wynoszą 750 µm na panelach górnych i 125 µm na panelach dolnych. (B) Immunofluorescencja dla ACTA2, CD44, COL1A1 w 2D komórek hOSE w P2 i P3. Paski skali wynoszą 50 µm. (C) Obrazy w jasnym polu komórek hOSE hodowanych z 10 µM SB-431542 w P0, P2 i P3. Komórki wykazywały oznaki starzenia od P2 i nie osiągnęły wysokiej konfluencji podczas hodowli. Paski skali wynoszą 750 µm na panelach górnych i 125 µm na panelach dolnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Fazy wzrostu organoidów in vitro, mikroskopia; wykres danych wzrostowych, postęp dni eksperymentalnych, badanie komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Charakterystyka morfologiczna organoidów hOSE. (A) Obrazy w jasnym polu trzech niezależnych pochodnych organoidów hOSE od trzech różnych dawców (tOVA86, tOVA87, tOVA88). Obrazy wykonano po osadzeniu komórek (D0), w dniu 7. (D7), dniu 14. (D14) i dniu 28. (D28) hodowli. Paski skali wynoszą 750 µm w D0 oraz 50 µm dla pozostałych. (B) Średnica organoidów hOSE pochodnych ze świeżo izolowanych komórek hOSE (linia przerywana) oraz z komórek hOSE rozszerzonych w 2D (linia ciągła). Przedstawiono średni rozmiar ± odchylenie standardowe zmierzone w D0, D7 i D14. Pokazano wyniki od dwóch różnych dawców (tOVA88 i tOVA89). (C) Obrazy w jasnym polu organoidów hOSE wykazujących różne morfologie: pojedynczą płaską warstwę (lewa góra), pojedynczą warstwę kolumnową (prawa góra), strukturę wielowarstwową (prawa dół) oraz nieprześwitowy agregat komórkowy (lewa dół). Paski skali wynoszą 100 µm. (D) Obrazy w jasnym polu komórek hOSE osadzonych w BME i hodowanych przez 12 dni w medium OSE_2D. Obrazy wykonano po osadzeniu komórek (D0), w dniu 6. (D6), dniu 9. (D9) i dniu 12. (D12). Komórki fibroblastopodobne zdominowały hodowlę i nie utworzyły się struktury przypominające organoidy. Paski skali wynoszą 750 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna; przekroje ludzkiego jajnika; obrazy immunofluorescencyjne; wizualizacja struktury tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Charakterystyka komórkowa organoidów hOSE. (A) Immunofluorescencja dla KRT8 i CDH1 w przekroju ludzkiego jajnika. Pasek skali na panelu lewym wynosi 500 µm, a na panelach środkowym i prawym 50 µm. (B) Immunofluorescencja dla KRT8 i YAP, LGR5 i CD44 oraz ITGB1 i PODXL w organoidach hOSE o różnych rozmiarach (&lt;50 µm, 50-75 µm, 75-100 µm, &gt;100 µm). Paski skali wynoszą 50 µm. (C) Immunofluorescencja dla VIM, CDH1, CDH2 w organoidach hOSE. Paski skali wynoszą 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy wydajności tworzenia organoidów oraz obrazy kropel z zastosowaniem hormonów i analizą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wpływ sygnałów owulacyjnych na tworzenie organoidów hOSE. (A) Całkowita liczba organoidów hOSE na kroplę utworzona w 7. dniu w różnych mediach hodowlanych. Organoidy hOSE pochodziły od trzech różnych dawców (tOVA77, tOVA79, tOVA83). Pogrubieniem zaznaczono medium OSE_3D użyte do hodowli organoidów. (B) Względna wydajność tworzenia organoidów w porównaniu do medium bez hormonów. Zestawione wartości dla organoidów hOSE pochodzących od trzech różnych dawców (tOVA77, tOVA79, tOVA83). (C) Wykres przedstawiający powierzchnię obrazu 4 największych organoidów hOSE w 14. dniu w każdej z badanych warunków eksperymentalnych u dwóch różnych dawców (tOVA77, tOVA83). (D) Obrazy w polu jasnym przedstawiające organoidy hOSE w 14. dniu hodowli w medium bez hormonów, z 200 nM E2 oraz 1000 nM P4 u dwóch różnych dawców (tOVA77, tOVA83). Paski skali wynoszą 750 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Skład roztworów roboczych użytych w badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/Table%201.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół opisuje tworzenie trójwymiarowych (3D) organoidów tkankowych z pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka powierzchniowego jajnika (hOSE). Protokół obejmuje izolację hOSE ze świeżo pobranych jajników, ekspansję komórkową hOSE, procedury krioprezerwacji-rozmrażania oraz wyprowadzanie organoidów. Uwzględniono immunofluorescencję, analizę ilościową i prezentację użyteczności jako platformy przesiewowej.

Organoidy nabłonka powierzchni jajników człowieka jako platforma do badania regeneracji tkanek

The ovarian surface epithelium (OSE), the outermost layer of the ovary, undergoes rupture during each ovulation and plays a crucial role in ovarian wound ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu funkcji jajników u ludzi. Ze względu na wciąż obecną lukę w wiedzy na temat zdrowia reprodukcyjnego kobiet, a także rosnące zapotrzebowanie na nowe technologie w leczeniu płodności. Naszym celem jest badanie różnych procesów, takich jak regeneza mieszków włosowych lub regeneracja tkanek, aby promować rozwój nowych protokołów klinicznych.W ostatnich latach byliśmy świadkami ogromnego postępu w protokołach hodowli tkankowych 3D. Osiągnięcia te umożliwiły na przykład stworzenie sztucznych jajników, które są strukturami podobnymi do pęcherzyków, zdolnymi do wspomagania dojrzewania całego miejsca w pełni in vitro. Dodatkowo widzimy również, jak organoidy lub nowotwory, które są zminiaturyzowanymi wersjami narządu lub tkanki.Widzimy, jak torują one drogę do dalszych badań nad biologią i chorobami jajników. Dostęp do próbek wariantów pochodzących od dawców w wieku rozrodczym nadal stanowi duże wyzwanie. Co więcej, wyniki uzyskane przy użyciu tego materiału wykazują dużą zmienność między dawcami, najprawdopodobniej ze względu na takie czynniki, jak różnice w wieku dawcy, stanie metabolicznym i funkcji endokrynologicznej.Ogólnie rzecz biorąc, ta niejednorodność utrudnia odtworzenie wyników i przełożenie protokołów na praktykę kliniczną. Mimo to jajniki wyróżniają się jako jedne z najbardziej dynamicznych i zmieniających się narządów w organizmie, ich mechanizmy regeneracyjne są wciąż bardzo słabo poznane i właściwie większość zdobytej do tej pory wiedzy. Nadal pochodzi z modeli zwierzęcych.Dzięki naszemu protokołowi OSC Organal zapewniamy platformę do badania roli ludzkiej warstwy OSC w regeneracji tkanki jajnikowej i gojeniu się ran. W porównaniu z innymi, nasz protokół został opracowany w oparciu o wykorzystanie próbek niepatologicznych. Pozwala to na jego zastosowanie w badaniach rozwojowych, które próbują znaleźć odpowiedzi na fundamentalne pytania mechanistyczne dotyczące funkcji jajników u ludzi.Aby rozpocząć transport ludzkich jajników do laboratorium w 0,9% chlorku sodu lub podobnym sterylnym roztworze soli fizjologicznej na lodzie. Przepłukać jajniki świeżym zimnym roztworem soli fizjologicznej na szalce Petriego. Przenieś każdy jajnik do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i dodaj dwa do trzech mililitrów pożywki trawiącej, aby przykryć jajnik.Umieść probówkę w kąpieli perełkowej, zahartowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie ostrożnie przenieś jajnik na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów pożywki zbiorczej. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie zetrzyj powierzchnię jajnika zawierającą komórki nabłonkowe powierzchni jajnika ludzkiego.Umyj skrobak w podłożu przed zeskrobaniem jeszcze co najmniej dwa razy. Przenieś komórki nabłonka powierzchni jajnika ludzkiego w pożywce do 15-mililitrowej probówki. Wiruj komórki w dwóch 40 G przez pięć minut.Jeśli osad ma czerwony kolor wskazujący na zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami, należy ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek. Następnie dodać cztery mililitry PBS z wapniem i magnezem i wirować w dwóch 40 G przez pięć minut. Kriokonserwuj osad komórek nabłonkowych powierzchni ludzkiego jajnika do wykorzystania w przyszłych hodowlach.Aby rozpocząć rozmrażanie kriokonserwowanych komórek nabłonka powierzchni jajników ludzkich. Wymieszaj komórki z 10 mililitrami środka myjącego. Po odwirowaniu komórki ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach nabłonka powierzchniowego jajnika lub pożywki OSE 2D i przenieś go do dwóch dołków na 12-dołkowej płytce.Dodaj jeden mililitr dodatkowej pożywki OSE 2D do studzienki i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 72 godziny. Przed pierwszą odnową pożywki należy zastosować barwienie na niebiesko trippin, aby policzyć świeżo wyizolowane lub kriokonserwowane, rozmrożone żywe komórki nabłonkowe powierzchni jajnika ludzkiego za pomocą automatycznego licznika komórek. Wymieszaj żądaną liczbę komórek w jednym mililitrze lodowatego podłoża zasadowego organoidu OSE i odwiruj probówkę przy dwóch 40 G przez pięć minut.Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad komórkowy w lodowatym, nierozcieńczonym roztworze ekstraktu z błony podstawnej. Aby uzyskać 10 000 komórek na 10 mikrolitrów, dodaj 10 mikrolitrów kropelek roztworu ekstraktu z błony podstawnej OSE na studzienkę do wstępnie ciepłego szkiełka wielodołkowego i umieść płytkę do góry nogami w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla na 15 minut. Po zestaleniu się żelu dodać 100 mikrolitrów pożywki OSE 3D i wyhodować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.Po usunięciu zużytego dodaj 100 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEMF 12 Do każdej studzienki. Zeskrob dno studzienek końcówką pipety P 1000, aby odłączyć kropelki żelu i przenieś każdą pływającą kroplę żelu do probówki o pojemności 1,5 mililitra Wirować probówkę przy dwóch 40 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach buforu dysocjacji komórek i umieścić probówki w ciepłej kąpieli perełkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć do 10 minut.Następnie dodać 300 mikrolitrów pożywki zasadowej dla ludzkiego organoidu OSE i odwirować w dwóch 40 G przez pięć minut. Na koniec ponownie zawieś osad w żądanej objętości nierozcieńczonego roztworu ekstraktu z błony podstawnej, aby ponownie zasiać je w odpowiednim stosunku do hodowli. Pierwotne ludzkie komórki OSE wykazywały morfologię podobną do bruku do trzeciego przejścia, ale później wykazywały oznaki starzenia.Ludzkie organoidy OSE ze świeżo wyizolowanych komórek OSE urosły większe niż te z komórek OSE ekspandowanych 2D po 14 dniach hodowli, w organoidach 3D OSE zaobserwowano różne morfologie, w tym torbielowate jednowarstwowe, wielowarstwowe i niealuminiowane klastry komórek.

human-ovarian-surface-epithelium-organoids-as-platform-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Opisujemy prosty protokół tworzenia organoidów nabłonkowych śluzowo-rzęskowych z głębokich komórek ektodermy wyizolowanych z zarodków Xenopus laevis. Multipotencjalne komórki progenitorowe regenerują prekursory nabłonkowych komórek kubkowych i umożliwiają śledzenie na żywo inicjacji i progresji przemian komórkowych na powierzchni organoidów.

Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) to trójwymiarowa (3D) hodowla, która może naśladować środowisko guza in vitro. W surowiczym raku jajnika o wysokim stopniu złośliwości PDO stanowią model do badania nowych biomarkerów i środków terapeutycznych.

Wytwarzanie i hodowla organoidów surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości pochodzących od pacjentów

Przedstawiamy protokół, który może być wykorzystany do przeprowadzenia testów leków terapeutycznych z organoidami raka jajnika pochodzącymi od pacjentek.

Modele organoidowe pochodzące od pacjentek z rakiem jajnika do przedklinicznych testów leków

Ten protokół oferuje systematyczne ramy do tworzenia organoidów raka jajnika z różnych stadiów choroby i rozwiązuje wyzwania związane ze zmiennością specyficzną dla pacjenta, aby zwiększyć wydajność i umożliwić solidną, długoterminową ekspansję dla kolejnych zastosowań. Zawiera szczegółowe kroki przetwarzania tkanek, wysiewu, dostosowywania wymagań dotyczących pożywek i barwienia immunofluorescencyjnego.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych organoidów nabłonka powierzchni jajników człowieka. Ta technika umożliwia badanie regeneracji tkanek jajnikowych i procesów związanych z płodnością.

Organoidy nabłonka powierzchni jajników człowieka jako platforma do badania regeneracji tkanek

Przeglądaj więcej filmów