Name: Witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Poznaj metodę witrifikacji tkanki kory jajnika jako alternatywę dla zamrażania powolnego w ochronie płodności pacjentek onkologicznych. Protokół ten poprawia przeżywalność pęcherzyków i zwiększa szanse na przyszłą ciążę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Carze Färber za korektę; Katharinie Wollersheim, Martinowi Mahlbergowi, Lei Korte i Jasmin Rebholz za pomoc techniczną.

Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyki w Szpitalu Uniwersyteckim w Bonn (007/09). Od każdego pacjenta uzyskano pisemną świadomą zgodę. Grupę badaną stanowiła ludzka tkanka jajnikowa od 50 pacjentek o średnim wieku 27,4 lat przed krioprezerwacją, jak wskazano na rysunku <silna klasa="xfig">Ryc. 1. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie urządzeń załadowczych
<ol>
	<li>Przygotuj nożyczki chirurgiczne i metalowe siatki do dostosowania. Pokrój oczka na paski o wymiarach 25 mm x 8 mm, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A.</li>
	<li>Umieść niestandardowe metalowe siatki w pojemniku do sterylizacji i autoklawie na 2 godziny (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B). Po sterylizacji w autoklawie umieścić pojemnik do sterylizacji i fiolki o pojemności 1,8 ml pod stołem z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Włącz naświetlanie ultrafioletem (UV) ławki laminarnej na 30 minut w celu dodatkowej sterylizacji przy długości fali 254 nm.</li>
	<li>Otwórz pojemnik do sterylizacji, wyjmij metalowe kratki i włóż je do nakrętek fiolek o pojemności 1,8 ml, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2C. Zamknąć fiolki 1,8 ml. 
	UWAGA: Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem do dezynfekcji powierzchni, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża do witryfikacji
<ol>
	<li>Przygotować jedną pipetę serologiczną o pojemności 10 ml, jedną elektroniczną pipetę i trzy probówki o pojemności 50 ml do roztworu do witryfikacji 1 (VS1), roztworu do witryfikacji 2 (VS2) i roztworu do witryfikacja 3 (VS3), a także do zapisywania daty przygotowania. Włącz promieniowanie ultrafioletowe (UV) stołu z przepływem laminarnym w celu dodatkowej sterylizacji.</li>
	<li>W przypadku VS1 (15 ml) należy odpipetować 12 ml pożywki do obsługi oocytów (uzupełnionej przez producenta albuminą surowicy ludzkiej), 1,5 ml SSS (suplementu zastępczego surowicy) i 1,5 ml glikolu etylenowego do jednej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>W przypadku VS2 (15 ml) należy odpipetować 10,5 ml pożywki do obsługi oocytów (uzupełnionej przez producenta albuminą surowicy ludzkiej), 3 ml glikolu etylenowego i 1,5 ml SSS do jednej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>W przypadku VS3 należy odpipetować 8,5 ml pożywki do obsługi oocytów (uzupełnionej przez producenta albuminą surowicy ludzkiej), 5,25 ml glikolu etylenowego i dodać 2,57 g sacharozy i 0,75 g poliwinylopirolidonu (PVP) do jednej probówki o pojemności 50 ml. Zobacz Rysunek 3, aby uzyskać szczegółowe informacje. Wymieszaj wszystkie roztwory, wirując z prędkością 3 000 obr./min. 
	UWAGA: Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem dezynfekującym, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do witryfikacji
<ol>
	<li>Stół z przepływem laminarnym należy czyścić środkiem do dezynfekcji powierzchni w jednorazowych rękawicach laboratoryjnych; zalecane są rękawice bezpudrowe.</li>
	<li>Przygotuj jedną płytkę 6-dołkową, sitko do komórek, skalpel, pęsetę, jeden dziurkacz do biopsji 2 mm i dwie naczynia okrągłodenne 90 mm. Przygotuj również podłoże: roztwór konserwujący do przeszczepu tkanek i VS1-3. Odpipetować 5 ml każdego schłodzonego roztworu (VS1-3) do oddzielnych studzienek i odczekać 30 minut, aż roztwory osiągną temperaturę pokojową.</li>
	<li>Sterylizować ciekły azot za pomocą automatycznego systemu naświetlania promieniami UV; alternatywnie można użyć promieniowania UV z okapu o przepływie laminarnym przez 120 minut.</li>
</ol>
4. Witryfikacja tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj tkankę kory jajnika, usuwając rdzeń. Ponieważ kora jest zwykle twardsza niż rdzeń, można je łatwo odróżnić i rozdzielić.
	<ol>
		<li>Wytnij tkankę kory jajnika na pożądane kształty (10 mm x 5 mm do przeszczepu; 2 mm x 2 mm stemple do liczenia żywotnych pęcherzyków przed i po witryfikacji), jak wskazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 4A. 
		UWAGA: Unikaj uszkodzenia tkanki przez zbyt mocne naciskanie i obchodź się z nią ostrożnie. Próbki tkanek mogą się różnić w zależności od pacjenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść sitko do komórek w pierwszym dołku płytki 6-dołkowej z VS1. Równoważyć tkankę kory jajnika przez 5 minut w 5 ml VS1 w dołku 1 na 6-dołkowej płytce za pomocą sitka komórkowego.
	<ol>
		<li>Następnie przenieś sitko komórkowe z tkanką kory mózgowej do dołka 2 zawierającego 5 ml VS2 i równoważ przez 5 minut. Na koniec zrównoważ przez 6 minut w 5 ml VS3, jak wskazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 3 i Tabela 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz przygotowane kriowialisty. Napełnij fiolki wysterylizowanym ciekłym azotem i umieść je w naczyniu kriogenicznym Dewara wypełnionym ciekłym azotem. Załaduj próbki tkanek na metalową siatkę urządzenia do witryfikacji w ciągu 1 minuty (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, C).
	<ol>
		<li>Umieść próbki tkanek załadowane na metalową siatkę do ciekłego azotu w przygotowanych kriowiach na bazie siatki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D). 
		UWAGA: Szybkie zamrożenie tkanki załadowanej na metalową siatkę ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tej metody. Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem do dezynfekcji powierzchni, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie podłoża do szybkiego nagrzewania
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory zgodnie z opisem w <silna klasa="xfig">Rysunek 5 i Tabela 2. Zważyć sacharozę jako roztwór do szybkiego nagrzewania (RWS) i roztwór równowagowy (ES) i przenieść je do probówki. Dodać pożywkę do badania oocytów (uzupełnioną przez producenta albuminą surowicy ludzkiej) za pomocą pipety serologicznej i przyrządu do pipetowania. Dodać SSS i sacharozę zgodnie z tabelą 2.</li>
	<li>Zamknąć probówki i pozostawić je na wytrząsarce do całkowitego rozpuszczenia. 
	UWAGA: Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem do dezynfekcji powierzchni, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.</li>
</ol>
6. Przygotowanie do szybkiego ocieplenia
<ol>
	<li>Na dzień przed szybkim podgrzaniem przygotuj materiały eksploatacyjne i odkaż je za pomocą światła UV w ławie laminarnej: Przygotuj zlewkę na próbkę do RWS, płytkę 6-dołkową dla ES, RS1 i RS2 oraz zlewkę na próbkę do transportu tkanek po szybkim podgrzaniu. Umieść sterylne, jednorazowe pęsety, sprzęt do pipetowania i inne materiały eksploatacyjne na stole z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Rozgrzej płytę grzewczą do temperatury 37,2 °C. Inkubować RWS w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotuj sterylną 6-dołkową płytkę z 6 ml ES, 6 ml RS dla "RS1" i kolejne 6 ml RS dla "RS2" w ławce laminarnej. Zapoznaj się z Rysunek 5 dla schematycznej ilustracji płytki 6-dołkowej. Pozwól im inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed ogrzaniem tkanki.</li>
	<li>Przenieść RWS do sterylnej zlewki na próbkę w sterylnych warunkach i umieścić ją na płycie grzewczej. RWS powinien być utrzymywany w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Szybkie ocieplenie wymaga szybkiego tempa nagrzewania. Bardzo ważne jest, aby utrzymać RWS w temperaturze 37 °C, aby zapewnić powodzenie pierwszego kroku.</li>
</ol>
7. Szybkie ocieplenie tkanki jajnikowej
<ol>
	<li>Przetransportować kriokonserwowane fiolki zawierające zeszkloną tkankę kory jajnika w ciekłym azocie do stołu laminarnego. Otworzyć fiolki, gdy są częściowo zanurzone w ciekłym azocie. Szybko zanurzyć siatkę z zeszkloną tkanką w RWS i pozostawić tkankę tam na 1 minutę w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Jest to najbardziej krytyczny krok podczas szybkiego ocieplenia i musi być przeprowadzony bez zwłoki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę do ES i inkubuj ją przez 3 minuty, delikatnie potrząsając nią na kołyszącym się shakerze.</li>
	<li>Płucz chusteczkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut za pomocą RS1 i RS2 na bujanym shakerze, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 5.</li>
	<li>Przenieść podgrzaną tkankę do sterylnej zlewki na próbkę zawierającej 5 ml roztworu konserwującego do przeszczepienia tkanki, która powinna być przechowywana w temperaturze 4 °C w celu transportu do miejsca przeszczepienia. 
	UWAGA: Wszystkie opisane powyżej prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. Wyczyść ławkę z przepływem laminarnym środkiem do dezynfekcji powierzchni, nosząc jednorazowe rękawice laboratoryjne; Zalecane są rękawice niepudrowane.</li>
</ol>
8. Określenie żywotności pęcherzyków
<ol>
	<li>Doprowadź dimetylosulfotlenek (DMSO) do temperatury pokojowej przez noc, aby uzyskać stan ciekły. Odpipetować 100 μl DMSO do jednej fiolki kalceiny i ponownie zawiesić w celu rozpuszczenia kalceiny. Pobrać pipetą 3 μl rozpuszczonej kalceiny na dno jednej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać fiolki w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Umieścić 0,007 g kolagenazy w jednej probówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Dodać 997 μl DPBS do wstępnie poddanego i zamrożonego 3 μl kalceiny w jednej probówce o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić do rozpuszczenia kalceiny. Dodać 0,007 g kolagenazy, aby uzyskać 1000 μl roztworu roboczego.</li>
	<li>Użyć 500 μl roztworu roboczego do wytrawienia dwóch kawałków 2 mm fragmentów kory jajnikowej przez 90 minut w temperaturze 37 °C, osłoniętych przed światłem, w naczyniu 4-dołkowym. Po 60 minutach i 70 minutach należy kilkakrotnie zawiesić roztwór. Na koniec określ żywotność pęcherzyków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 6.</li>
</ol>

Follicular Viability Assessment in Vitrified Human Ovarian Cortex Tissues

W tym miejscu przedstawiono protokół wysokoprzepustowej witryfikacji tkanki ludzkiej kory jajnika, odpowiedni do rutynowych zabiegów klinicznych. Podobnie jak w przypadku witryfikacji oocytów lub zarodków, pomyślne zastosowanie procedury wymaga szczegółowego przestrzegania protokołu dotyczącego temperatury roztworów witryfikacyjnych i rozgrzewających, a także okresu równowagi. Niezbędna jest również zgodność z dyrektywami UE w sprawie tkanek37 dotyczącymi jakości powietrza i sterylności.
W wyniku zabiegu witryfikacji uzyskuje się stan niekrystaliczny, amorficzny lub szklisty. Ogólnie rzecz biorąc, witryfikacja jest wszechstronnym procesem o znaczących implikacjach w różnych dziedzinach nauki i technologii. Podstawową zaletą witryfikacji jest jej zdolność do przekształcania tkanki w stan szklisty, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się kryształków lodu 38,39,40, które mogą negatywnie wpływać na integralność tkanki i jej składników.
Suplementacja środków krioprotekcyjnych (CPA) poliwinylopirolidonem (PVP) pozwala na zmniejszenie stężenia CPA bez pogorszenia jakości roztworów witryfikacyjnych41,42. Ponadto zastosowanie siatek metalowych zapewnia wysoką przewodność cieplną w porównaniu z systemami nośnymi na bazie tworzyw sztucznych. Struktura siatki ułatwia również przyleganie do powierzchni, zapewniając bezpieczną kriokonserwację próbek tkanek i małych stempli kory do pomiaru jakości. Jeśli używane są naczynia kriogeniczne innych producentów, ważne jest, aby wcześniej przetestować rozmiar metalowych siatek, aby zapewnić stabilność i odpowiednią przyczepność w pokrywie krionaczynia, a także dobre dopasowanie do naczynia.
Kluczowe kroki zapewniające pomyślną witryfikację obejmują szybką witryfikację poprzez zanurzenie tkanki w wysterylizowanym ciekłym azocie i natychmiastowe szybkie rozgrzanie, aby uniknąć niepożądanych wyników. Pod względem opłacalności witryfikacja tkanek jest mniej wymagająca w porównaniu z procedurą powolnego zamrażania, co może mieć wpływ na planowanie rozmieszczenia personelu. Dodatkowo witryfikacja eliminuje konieczność zakupu i serwisowania sprzętu wymaganego do powolnego zamrażania.
Pomiary biologiczne i metaanalizy wykazały porównywalność, a nawet zalety witryfikacji w porównaniu z powolnym zamrażaniem43 . Jednak różnice w wynikach po witryfikacji można przypisać brakowi standaryzacji zarówno w urządzeniu do witryfikacji, jak i w protokole, w tym w zastosowanych roztworach, które różnią się w zależności od badania. Przyszłe badania powinny zbadać potencjał hodowli pęcherzyków z witryfikowanej/szybko ogrzewanej tkanki do monitorowania wzrostu in vitro, co z powodzeniem wykazano w tkance jajnika myszy przez kilka grup 44,45,46,47,48,49,50.
Podsumowując, witryfikacja tkanki jajnikowej jest znaczącą alternatywą dla powszechnie stosowanego protokołu powolnego zamrażania, popartą pięcioma udanymi porodami zgłoszonymi przez Suzuki51 (Japonia), Silber52 (USA) i Sänger53 (Niemcy). W przeciwieństwie do dostępnych na rynku pożywek do witryfikacji i zestawów do komórek, istnieje niewiele zatwierdzonych przez FDA/CE systemów do tkanki jajnika, co może ograniczać ich zastosowanie w warunkach klinicznych. W związku z tym zaleca się opracowanie zatwierdzonych przez FDA/CE zestawów i pożywek do witryfikacji i szybkiego podgrzewania tkanki jajnikowej30.

Kriokonserwacja tkanki jajnika jest ważną opcją dla zachowania płodności. Eksplantowana tkanka zawierająca pęcherzyki jajnikowe, w których osadzone są oocyty, jest kriokonserwowana. Po przechowywaniu tkanka jajnika może zostać rozmrożona, ogrzana i ponownie wszczepiona pacjentce. W przypadku żywotnych komórek lub tkanek dostępne są dwie metody kriokonserwacji: powolne zamrażanie i witryfikacja1.
Witryfikacja służy do konserwacji materiałów biologicznych, takich jak zarodki i oocyty, o lepszych wskaźnikach przeżycia w porównaniu do protokołu powolnego zamrażania1,2,3,4. Powolne zamrażanie ma ograniczenia, takie jak tworzenie się kryształków lodu, które mogą potencjalnie uszkodzić struktury komórkowe i tkankowe. Jednak powolne zamrażanie jest ważnym podejściem do kriokonserwacji, które ułatwia długotrwałe przechowywanie próbek biologicznych, a funkcjonalność tej metody została szeroko udowodniona5. Witryfikacja indukuje szklisty stan agregacji, zapobiegając tworzeniu się kryształków lodu6,7. Na poziomie technicznym witryfikacja znacznie upraszcza procedurę kriokonserwacji, zmniejszając konserwację sprzętu, zmniejszając prawdopodobieństwo błędów technicznych i skracając czas trwania procesu kriokonserwacji8,9. W zachowaniu płodności kobiet, kriokonserwacja tkanki jajnika jest decydującym podejściem przed leczeniem raka10. Różne grupy z powodzeniem zademonstrowały koncepcję krioprezerwacji, rozmrażania i przeszczepiania tkanek w oparciu o protokół powolnego zamrażania11,12,13,14, który jest obecnie uważany za standardowe podejście15.
Witryfikacja tkanki jajnika jest uważana za obiecującą metodę alternatywną16,17,18,19,20,21, pod względem oszczędzania zasobów22, wskaźniki przeżywalności pęcherzyków, poziomy fragmentacji DNA i zrównoważony potencjał angiogenny23,24,25,26,27. Potwierdzają to udane dostawy w Japonii28, USA29 i Niemczech30.
Porównanie dwóch opcji kriokonserwacji tkanek jajnikowych (OTC) - witryfikacji w porównaniu ze standardową procedurą powolnego zamrażania - wyniki są częściowo sprzeczne w obecnych metaanalizach16. Mogło się do tego przyczynić kilka czynników, ponieważ obecne protokoły witryfikacji znacznie się różnią. Różnice te obejmują wybór krioprotektantu lub kombinacji środków ochronnych, ich stężenie, skład pożywek dostępnych bez recepty, wielkość fragmentów tkanek oraz urządzenie używane jako nośnik tkanek. W związku z tym nie ma ustandaryzowanego protokołu ocieplenia.
Ponieważ autorzy znaleźli metodę, która daje przekonujące wyniki pod względem obsługi, żywotności, początku apoptozy, uwalniania czynników angiogennych, a nawet raportu o porodzie po reimplantacji9,27, bardzo szczegółowy opis protokołu jest dostarczany. Opisana metoda oferuje ważny i skuteczny protokół, który może przyczynić się do standaryzacji witryfikacji tkanki jajnikowej.

<table><tbody><tr><td>Fiolki 1,8 ml</td><td>VWR International GmbH</td><td>479-6837</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 4-dołkowa</td><td>Gynemed</td><td>GYOOPW-FW04</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka</td><td>Sarstedt</td><td>62.559.001</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Bacillol AF</td><td>Hartmann</td><td>973385</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Merck</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ 1A</td><td>Merck</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Kriosure DMSO</td><td>WAK Chemie</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie</td><td>00867288</td><td></td></tr><tr><td>DPBS CTS</td><td>Gibco Life technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne Pipet aid</td><td>Starlab</td><td>S7166-0010</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Pojemnik do sterylizacji Sigma Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Euronda</td><td>Euronda</td><td>282021</td><td></td></tr><tr><td>G-MOPS+</td><td>Vitrolife</td><td>10130</td><td></td></tr><tr><td>Metal siatki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Metzenbaum</td><td>świat precyzyjne instrumenty</td><td>501262102</td><td></td></tr><tr><td>N-Bath System</td><td>Nterilizer</td><td>N-Bath 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon (PVP)</td><td>SAGE</td><td>ART-4005</td><td></td></tr><tr><td>Suplement zastępczy surowicy (SSS)</td><td>Fujifilm Irvine scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny kubek</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze sterylne</td><td>Carl Roth</td><td>KL05.1</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

Kriokonserwacja tkanek jajnika (OTC) jest ważną opcją dla zachowania płodności. Dla pacjentów, u których leczenia gonadotoksycznego nie można odroczyć, lub dla dziewcząt przed okresem dojrzewania, jest to często jedyna opcja ochrony płodności. Kriokonserwację można przeprowadzić przez witryfikację lub powolne zamrażanie. Powolne zamrażanie jest obecnie standardowym podejściem. Coraz więcej badań wskazuje, że witryfikacja może zastąpić powolne zamrażanie w najnowocześniejszych laboratoriach zapłodnienia in vitro (IVF), znacznie poprawiając wskaźniki przeżywalności po rozmrożeniu i upraszczając techniczne aspekty kriokonserwacji. Opisano oparty na metalowej, wysokoprzepustowej procedurze szybkiej witryfikacji tkanki kory jajnika, odpowiedni do rutynowych badań klinicznych. Sterylizacja siatek metalowych i ciekłego azotu zapewnia wysoką jakość, spełniając standardy dobrej praktyki produkcyjnej (GMP). Przeprowadzono witryfikację, aby zapewnić ultraszybkie tempo chłodzenia. Zamiast powoli rozmrażać próbki, były szybko podgrzewane. Aby ocenić żywotność pęcherzyków, barwienie kalceiną przeprowadzono zarówno przed kriokonserwacją, jak i po szybkim podgrzaniu. Doniesiono o udanym zastosowaniu witryfikacji i szybkiego ocieplenia za pomocą metalowych siatek. Nie zaobserwowano istotnych różnic w żywotności pęcherzyków przed witryfikacją i po szybkim ociepleniu. Wyniki te potwierdzają wysoką zdolność witryfikacji tkanek do rutynowych zastosowań klinicznych jako potencjalny substytut szeroko stosowanej metody powolnego zamrażania.

Niniejszy protokół przedstawia procedury przygotowania mediów do witryfikacji, urządzeń do załadunku, witryfikacji, przygotowania mediów do szybkiego ogrzewania, szybkiego ogrzewania oraz oceny żywotności pęcherzyków. Bezpośrednie porównanie żywotności pęcherzyków i czynników angiogennych pomiędzy powolnym zamrażaniem a witryfikacją zostało zwalidowane i opublikowane31,32.
Ogólną skuteczność opisanego protokołu witryfikacji oceniono poprzez porównanie liczby żywych mieszków przed i po witryfikacji oraz szybkim ogrzewaniem. Układ eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1, a wyniki zaprezentowano na Rysunku 6. U 50 pacjentek zaobserwowano średnią liczbę 77,98 żywych mieszków przed witryfikacją i 62,99 po witryfikacji/szybkim ogrzewaniu, co odpowiada przeżywalności na poziomie 80,8%. Różnica ta nie była istotna statystycznie zgodnie z testem Wilcoxona33.
Metalowe siatki są indywidualnie przycinane ostrymi nożyczkami do rozmiaru 25 mm x 8 mm, który pasuje do nakrętek probówek kriogenicznych o pojemności 1.8 mL, jak pokazano na Rysunku 2A,C. Po sterylizacji za pomocą autoklawowania parowego, siatki i nakrętki probówek 1.8 mL są montowane pod laminarnym przepływem powietrza, zgodnie z Rysunkiem 2B. Taki układ zapewnia stabilne utrzymanie w nakrętce bez konieczności podejmowania dodatkowych działań i oferuje wystarczającą powierzchnię dla tkanek o różnych rozmiarach. Zazwyczaj witryfikuje się fragmenty tkanek o wymiarach 5 mm x 10 mm do transplantacji oraz fragmenty o średnicy 2 mm do oceny liczby żywych mieszków po szybkim rozmrażaniu. Oba rozmiary idealnie mieszczą się na metalowych siatkach.
Równoważenie z roztworami do witryfikacji (VS1, VS2 i VS3) przeprowadza się w płytce 6-dołkowej na wytrząsarce kołyszącej w temperaturze pokojowej pod laminarnym przepływem powietrza, jak pokazano na Rysunku 3. Ramy czasowe przedstawione na schemacie zapewniają skuteczne pobieranie krioprotektora etylenoglikolu. Zaleca się stosowanie płytki 6-dołkowej zamiast pojedynczych naczyń, ponieważ ułatwia to szybkie przenoszenie tkanki między roztworami i pomaga zapobiec pomyłkom.
W celu szybkiej wertykalnej witryfikacji w ciekłym azocie, tkankę kory jajnika tnie się na odpowiednie fragmenty (Ryc. 4A). Próbki kory jajnika umieszcza się w urządzeniach do ładowania (Ryc. 4B,C) i zanurza pionowo w ciekłym azocie (Ryc. 4D), aby poprzez witryfikację uzyskać szklisty stan agregacji. Wybrane metalowe siatki umożliwiają pionowe operowanie tkanką, co przedstawiono na Ryc. 4D. Ponadto metalowe siatki charakteryzują się wysoką przewodnością cieplną, co zapewnia szybkie tempo chłodzenia od 22 °C do -196 °C, co jest krytycznie istotnym etapem procesu witryfikacji.
W celu szybkiego ogrzewania, RWS przygotowuje się w sterylnym kubku w temperaturze 37 °C. ES, RS1 oraz RS2 przygotowuje się w płytce 6-dołkowej na wytrząsarce kołyszącej w temperaturze pokojowej, jak pokazano na Rysunku 5. Duża objętość wstępnie ogrzanego RWS zapobiega nadmiernemu ochłodzeniu roztworu po dodaniu witryfikowanej tkanki i zapewnia stale ciepłe środowisko dla tkanki przez cały proces szybkiego ogrzewania.
Aby ocenić i zapewnić wysokie standardy jakości, wycinki biopsyjne o wymiarach 2 mm x 2 mm barwi się kalceiną przed witryfikacją oraz po szybkim ogrzewaniu, aby określić żywotność pęcherzyków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej34,35 (Rysunek 6). Żywotne pęcherzyki emitują zieloną fluorescencję przy 495 nm po wewnątrzkomórkowym pobraniu kalceiny. Alternatywnie żywotność pęcherzyków (Tabela 3) można ocenić przy użyciu barwników czerwieni neutralnej36.
Postępując zgodnie z opisanymi w niniejszym protokole krokami, tkanka jajnika zostaje przekształcona w szklisty stan agregacji, co sprzyja wysokiemu wskaźnikowi przeżywalności po szybkim ogrzewaniu, co potwierdzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
<img alt="Schemat próbki kory jajnika; szczegółowy proces hodowli tkankowej i badania żywotności biopsji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Projekt badania. Próbki kory jajnika od 50 pacjentek badano przed (świeżo) oraz po witryfikacji i szybkim ogrzewaniu w celu określenia liczby żywych pęcherzyków. W każdej grupie dwa fragmenty tkanki o średnicy 2 mm hodowano przez 24 h przed oceną liczby pęcherzyków. Tkankę trawiono kolagenazą i barwiono kalceiną w celu oceny żywotności. Liczbę żywych pęcherzyków określono przy użyciu mikroskopu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces przygotowania próbek z użyciem wyciągu dymów; narzędzia i sprzęt ochronny w konfiguracji eksperymentu laboratoryjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie urządzeń do załadunku. Metalowe siatki zostały docięte do rozmiaru 8 mm x 25 mm (A). Dostosowane metalowe siatki zostały wysterylizowane w autoklawie (B). Sterylne siatki metalowe zostały następnie włożone do nakrętek fiolek o pojemności 1.8 mL, przygotowując je do użycia (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu filtracji próżniowej ze zmiennymi objętości i czasu dla analizy rozdziału próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przygotowanie roztworów do witryfikacji. Roztwory do witryfikacji (VS) zostały przygotowane i przeniesione do płytki 6-dołkowej. Dołki wskazują objętość każdego roztworu oraz poszczególne czasy inkubacji zastosowane w protokole witryfikacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces hodowli tkankowej z użyciem szalki Petriego; manipulowanie próbkami za pomocą pincety; metoda biologii molekularnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obróbka i witryfikacja kory jajnika. Tkanka kory jajnika została przygotowana do krio konserwacji poprzez usunięcie rdzenia i pocięcie tkanki na fragmenty o wymiarach 5 mm x 10 mm (A). Po inkubacji w roztworach witryfikacyjnych przedstawionych na Rycini 3, tkankę umieszczono w urządzeniu do załadunku witryfikacyjnego (B,C). W celu szybkiej pionowej witryfikacji próbek kory jajnika, nakrętki z załadowaną tkanką zostały szybko zanurzone w sterylnym ciekłym azocie (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu chromatograficznego pokazujący czasy i objętości płukania oraz interakcji z próbką." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przygotowanie roztworów do szybkiego ogrzewania. Przygotowano roztwór do szybkiego ogrzewania (RWS), roztwór do równoważenia (ES) oraz roztwory do płukania (RS) 1 i 2, a następnie przeniesiono je do płytki 6-dołkowej. Naczynia i dołki wskazują objętość każdego roztworu oraz odpowiadające im czasy inkubacji. Należy zwrócić uwagę, że RWS jest utrzymywany w temperaturze 37.2 °C na płycie grzewczej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiają agregaty komórek, wskazując poziomy ekspresji białek, wyniki eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Ocena żywotności. Aby ocenić liczbę żywotnych pęcherzyków, fragmenty tkanki o średnicy 2 mm poddano trawieniu kolagenazą i barwieniu kalceiną. Reprezentatywne obrazy przedstawiają (A) barwienie kalceiną 3 odzyskanych pęcherzyków przed witryfikacją. (B) Odzyskany żywotny pęcherzyk po witryfikacji i szybkim ogrzewaniu. (C) Odzyskany żywotny pęcherzyk przed powolnym zamrażaniem. (D) Odzyskane żywotne pęcherzyki po powolnym zamrażaniu i rozmrażaniu. Żywotność pęcherzyków jest wskazana przez kalceinę, zielony barwnik fluorescencyjny, który emituje zieloną fluorescencję przy 495 nm po enzymatycznej konwersji przez żywe komórki. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >VS 1 (15 mL)</td>
			<td >Glikol etylenowy</td>
			<td >10%</td>
			<td >1.5 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >SSS</td>
			<td >10%</td>
			<td >1.5 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >G-MOPS+</td>
			<td ></td>
			<td >12 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >VS 2 (15 mL)</td>
			<td >Glikol etylenowy</td>
			<td >20%</td>
			<td >3 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >SSS</td>
			<td >10%</td>
			<td >1.5 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >G-MOPS+</td>
			<td ></td>
			<td >10.5 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >VS 3 (15 mL)</td>
			<td >Glikol etylenowy</td>
			<td >35%</td>
			<td >5.25 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >SSS</td>
			<td >10%</td>
			<td >1.5 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Sacharoza</td>
			<td >0.5 mol/L</td>
			<td >2.57 g</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >PVP</td>
			<td >5 % (w/v)</td>
			<td >0.75 g</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >G-MOPS+</td>
			<td ></td>
			<td >do 15 mL</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Skład roztworów do witryfikacji (VS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RWS (30 ml)</td>
			<td>Sacharoza</td>
			<td>0,8 mol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8,22 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>do 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES (15 ml)</td>
			<td>Sacharoza</td>
			<td>0,4 mol/L</td>
			<td>2,05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>do 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS 1&amp;2 (15 ml)</td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>do 15 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Skład roztworu do szybkiego ogrzewania (RWS), roztworu wyrównawczego (ES) i roztworów płuczących (RS). Tabela ta przedstawia składniki i stężenia dla roztworu do szybkiego ogrzewania (RWS), roztworu wyrównawczego (ES) oraz roztworów płuczących (RS) stosowanych podczas obróbki po witryfikacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>Świeży</td>
			<td>Odstęp</td>
			<td>Szybkie ogrzewanie po witryfikacji</td>
			<td>Przedział</td>
			<td>n</td>
			<td>*Pwartość p</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba żywych mieszków [n]</td>
			<td>77.98</td>
			<td>0-386</td>
			<td>62.99</td>
			<td>0.5-349</td>
			<td>50</td>
			<td>0.130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>77.95</td>
			<td></td>
			<td>80.02</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*test Wilcoxona</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Reprezentatywne wyniki żywotności mieszyków. Tabela ta przedstawia wyniki ocen żywotności mieszyków przed kriokonserwacją i po szybkim ogrzewaniu. Do policzenia liczby żywych mieszyków przed i po witryfikacji/szybkim ogrzewaniu wykorzystano dwa fragmenty tkanki o średnicy 2 mm na pacjentkę. Pary próbek tkanek od 50 pacjentek przeanalizowano przy użyciu testu Wilcoxona.

Przedstawiono protokół witryfikacji tkanki jajnikowej, jako alternatywną metodę kriokonserwacji do powszechnie stosowanego protokołu powolnego zamrażania.

Witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji

Ovarian tissue cryopreservation (OTC) is an important option for fertility preservation. For patients whose gonadotoxic treatments cannot be postponed or ...

Przedmiotem działalności naszej grupy badawczej jest ochrona płodności u młodych pacjentek z chorobą nowotworową. Ważne jest, aby ulepszyć istniejące protokoły, aby zwiększyć szanse na późniejszą ciążę. Obejmuje to witryfikację tkanki jajnikowej, a także wzrost pęcherzyków jajnikowych in vitro.W przypadku wzrostu pęcherzyków jajnikowych in vitro kluczowym punktem jest wieloetapowa hodowla tkankowa przed procedurą izolacji pęcherzyków, ponieważ tkanka kory jajnika jest bardzo gęsta i ogranicza wzrost pęcherzyków. Witryfikacja tkanek jest bardziej złożona niż procedura powolnego zamrażania, ale upraszcza cały proces i ma również inne zalety. Wykazaliśmy, że witryfikacja jest istotną alternatywą dla powszechnego protokołu powolnego zamrażania, który jest wspierany przez wcześniej zgłoszone pięć udanych porodów.Stres związany z zamrażaniem i rozmrażaniem, a także niedostateczna laktacja po reimplantacji, wraz z uszkodzeniem reperfuzyjnym, wpływa na przeżycie mieszków włosowych i prowadzi do znacznego zmniejszenia liczby pęcherzyków. Uważa się, że witryfikacja, ograniczając powodzenie opcji terapeutycznej, pozwala zachować mieszki włosowe z podobnym lub nawet większym powodzeniem w porównaniu z metodami powolnego zamrażania. W związku z tym dążymy do tego, aby witryfikacja znalazła się w warunkach przedklinicznych, co zapewni wszystkim kriobankom możliwość kriokonserwacji tkanek, pomimo wszelkich ograniczeń osobistych i finansowych.Na początek pokrój metalowe siatki w paski o wymiarach 25 na 8 milimetrów. Umieść dostosowane siatki w pojemniku do sterylizacji i autoklawie na dwie godziny. Po autoklawowaniu umieść pojemnik do sterylizacji i fiolki o pojemności 1,8 mililitra pod stołem z przepływem laminarnym.Otwórz pojemnik do sterylizacji i wyjmij metalową siatkę. Umieścić siatkę w nasadce fiolki o pojemności 1,8 ml i zamknąć fiolkę. Po pobraniu tkanki ludzkiej kory jajnikowej należy usunąć rdzeń i pociąć tkankę w pożądane kształty.Dodaj pięć mililitrów roztworu witryfikacyjnego jeden do pierwszego dołka z sześciodołkowej płytki. Za pomocą sitka komórkowego równoważ tkankę kory jajnika przez pięć minut w jednej z płytek. Przenieś sitko komórkowe z tkanką kory mózgowej do dołka drugiego, zawierającego pięć mililitrów roztworu witryfikacyjnego dwa i równoważ przez pięć minut.Następnie umieść sitko zawierające tkankę kory mózgowej w dołku trzecim z sześciodołkowej płytki zawierającej pięć mililitrów roztworu witryfikacyjnego trzy na sześć minut. Napełnij przygotowaną kriofiolkę wysterylizowanym ciekłym azotem i umieść ją w naczyniu kriodowy wypełnionym ciekłym azotem. W ciągu jednej minuty załadować próbki tkanek na metalową siatkę urządzenia do witryfikacji.Następnie włóż metalową siatkę do ciekłego azotu w fiolce kriogenicznej na bazie siatki. Dodaj sześć mililitrów roztworu równoważącego do studzienki jednej ze sterylnych sześciodołkowych płytek, a następnie przenieś po sześć mililitrów RS do studzienek drugiej i trzeciej. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.Podgrzewać szybko nagrzewający się roztwór w sterylnej zlewce na próbkę przez godzinę na płycie grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Pod ławką do przepływu laminarnego otwórz kriokonserwowane fiolki zawierające zeszkloną tkankę korową jajnika. Szybko przenieś siatkę do roztworu do szybkiego nagrzewania.Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę do roztworu równoważącego i inkubuj przez trzy minuty na kołyszącym się shakerze. Następnie płucz chusteczkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut za pomocą RS1 i RS2 na bujanym shakerze. Rozpuść kalceinę w 100 mikrolitrach DMSO.Przenieś trzy mikrolitry kalceiny na dno 1,5 mililitrowej probówki i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodaj 0,007 grama kolagenazy do 1,5 mililitrowej probówki i przechowuj probówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodaj 997 mikrolitrów DPBS do zamrożonych trzech mikrolitrów kalceiny i ponownie zawiesij, aby rozpuścić kalceinę.Następnie dodaj zimny proszek kolagenazy, aby uzyskać 1000 mikrolitrów roztworu roboczego. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roboczego roztworu kalceiny i przenieś dwa kawałki dwumilimetrowych fragmentów kory jajnikowej do studzienek naczynia z czterema dołkami, a następnie inkubuj przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Na koniec, pod mikroskopią fluorescencyjną, określ żywotność pęcherzyków.

vitrification-ovarian-cortex-tissue-to-achieve-glassy-state

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

Ten manuskrypt opisuje protokół minimalnej objętości witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów za pomocą laboratoryjnych pożywek na komercyjnych podłożach. Obejmuje każdy etap, od izolacji oocytów od gonad ex vivo po witryfikację i ocieplenie.

Minimalna objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów

Przedstawiono hodowlę in vitro kory jajników bydła oraz wpływ żywieniowej diety Stair-step na mikrośrodowisko jajników. Fragmenty kory jajnikowej hodowano przez siedem dni i oceniano steroidy, cytokiny i stadia pęcherzyków. Leczenie dietą Stair-Step miało zwiększoną steroidogenezę, co spowodowało progresję pęcherzyków w hodowli.

Posiewy tkankowe kory jajników bydła

Kriokonserwacja oocytów jest uznawana przez kilka międzynarodowych towarzystw naukowych za złoty standard zachowania płodności u kobiet po okresie dojrzewania. Odpowiednie strategie kliniczne i laboratoryjne zapewniają maksymalną skuteczność, efektywność i bezpieczeństwo zabiegów zachowujących płodność.

Zachowanie płodności poprzez witryfikację oocytów: perspektywy kliniczne i laboratoryjne

Protokół ma na celu dostarczenie standardowej metody witryfikacji oocytów dorosłych i młodych owiec. Obejmuje wszystkie etapy od przygotowania pożywki do dojrzewania in vitro do hodowli po ociepleniu. Oocyty są witryfikowane na etapie MII przy użyciu Cryotop, aby zapewnić minimalną niezbędną objętość.

Witryfikacja dojrzałych komórek jajowych pobranych in vitro z jajników dorosłych i przed okresem dojrzewania u owiec

Dedykowany zespół może zaoferować pacjentkom Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser możliwość przeprowadzenia kontrolowanej stymulacji jajników i kriokonserwacji oocytów podczas laparoskopowej plastyki pochwy.

Laparoskopowe pobieranie komórek jajowych i kriokonserwacja podczas waginoplastyki w leczeniu zespołu Mayera-Rokitansky'ego-Kustera-Hausera

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Opracowano dwumodalny system obrazowania do bezkontaktowej oceny utlenowania tkanek skóry oraz funkcji naczyniowej.

Obrazowanie dwutrybowe utlenowania tkanki skórnej i funkcji naczyniowej

Niniejsza praca przedstawia innowacyjne podejście wizualne (fotogłos lub fotoelicytacja), mające na celu zapewnienie sprawiedliwego procesu opieki klinicznej nad pacjentami z przewlekłymi schorzeniami, naświetlenie luk w wiedzy klinicznej, budowanie lepszych relacji terapeutycznych oraz identyfikację celów zorientowanych na pacjenta i możliwości leczenia.

Wykorzystanie metod wizualnych i narracyjnych w celu zapewnienia sprawiedliwego procesu w opiece klinicznej

Opisany tutaj test oczyszczania mezotelium wykorzystuje komórki znakowane fluorescencyjnie oraz mikroskopię wideo poklatkową do wizualizacji i ilościowego pomiaru interakcji między wielokomórkowymi sferoidami raka jajnika a monowarstwami komórek mezoteliów. Test ten modeluje wczesne etapy przerzutowania raka jajnika.

Test oczyszczania mezotelialnego in vitro modelujący wczesne etapy przerzutowania raka jajnika

Poznaj metodę witrifikacji tkanki kory jajnika jako alternatywę dla zamrażania powolnego w ochronie płodności pacjentek onkologicznych. Protokół ten poprawia przeżywalność pęcherzyków i zwiększa szanse na przyszłą ciążę.

Witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji

Przeglądaj więcej filmów