Name: Leczenie ogólnoustrojowe dorosłych myszy po porodzie, młodych i biegowych przez wstrzyknięcie do zatoki zagałkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia do zatoki zagałkowej u myszy do badań terapii genowej zaburzeń metabolicznych. Technika ta umożliwia skuteczną aplikację u małych osobników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy pomoc personelu mysiej placówki NHGRI, Laboratorium Patologii Molekularnej NCI, a szczególnie Andrew Warnera. R.J.C. jest wspierany przez Intramural Research Program NHGRI przez 1ZIAHG200318-16, a ta praca była częściowo finansowana przez National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Rysunek 2C został stworzony za pomocą BioRender.

Ten protokół i towarzyszący mu film są przeznaczone dla przestrzeni do iniekcji pozagałkowych u dorosłych myszy po urodzeniu, młodych osobników i biegach przez iniekcję do zatoki zagałkowej; protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (ACUC) przy Narodowym Instytucie Badań nad Genomem Ludzkim pod numerem protokołu G-03-4. Inne instytucje mogą mieć inne wymagania i ograniczenia, a ten protokół może wymagać modyfikacji w celu zatwierdzenia w Twoim instytucie. Uzyskaj zgodę ACUC swojej instytucji przed wykonaniem tej lub jakiejkolwiek innej procedury na zwierzętach.
1. Przygotowanie przed wstrzyknięciem
<ol>
	<li>Rozcieńczyć AAV do żądanej objętości i stężenia we wstrzyknięciu sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml do każdego wstrzyknięcia. Dodać dodatkowe 50% objętości do każdego wstrzyknięcia, aby umożliwić dokładne napełnienie sterylnej strzykawki jednorazowego użytku. 
	UWAGA: Tutaj rozcieńczamy reporter AAV8-CAG-eGFP, aby dostarczyć dawkę 1 × 1013genomów wirusa na kg masy ciała (vg/kg) w objętości 50 μL. Ilość AAV w 50 μl do wstrzyknięcia oblicza się na podstawie masy ciała zwierzęcia w momencie wstrzyknięcia. W tym filmie AAV jest wstrzykiwany drogą zagałkową w celu odtworzenia ogólnoustrojowego dostarczania u ludzi. Inne wektory terapii genowej (tj. lentiwirus, adenowirus), terapie RNA i małe cząsteczki mogą być dostarczane ogólnoustrojowo przy użyciu tej procedury.</li>
	<li>Upewnij się, że stołowy laboratoryjny system anestezjologiczny dla zwierząt (LAAS) jest prawidłowo skonfigurowany i działa prawidłowo zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Jeśli stosowana jest alternatywna metoda znieczulenia, należy upewnić się, że znieczulenie zostało przygotowane przed rozpoczęciem wstrzyknięć. Procedura wstrzyknięcia dogałkowego powinna być zgodna z większością środków znieczulających (np. wstrzykiwanych środków chemicznych, takich jak ketamina i ksylazyna).</li>
	<li>Przed napełnieniem jednorazowej sterylnej strzykawki (w tym przypadku strzykawki insulinowej, 31 g, 8 mm długości, pojemności 3/10 ml), należy kilkakrotnie przesunąć tłok w górę i w dół, aby zapewnić płynne wciśnięcie tłoka. Następnie napełnić strzykawkę do żądanej objętości, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Można wstrzykiwać objętości do 150 μl; nasze laboratorium zazwyczaj wstrzykuje objętość 50 μl.</li>
</ol>
2. Sedacja myszy poprzez podanie izofluranu za pomocą systemu znieczulenia zwierząt laboratoryjnych (LAAS)
<ol>
	<li>Upewnij się, że gaz przepływa tylko do komory indukcyjnej. Zamknąć dwukierunkowy zawór odcinający do obwodu bez ponownego oddychania (NRB).</li>
	<li>Włącz zielone pokrętło przepływu tlenu z przodu przepływomierza, tak aby natężenie przepływu wynosiło 1 l/min.</li>
	<li>Przekręć izofluran na ≤4%, naciskając dźwignię w górnej części waporyzatora i obracając pokrętło na żądane stężenie.</li>
	<li>Umieść mysz w przezroczystej komorze indukcyjnej. Uważnie obserwuj oddech i ruchy zwierzęcia. Gdy zwierzę znajdzie się w pozycji leżącej, przekręć pokrętło parownika do 2-2,5% izofluranu.</li>
	<li>Otwórz dwukierunkowy kran do obwodu NRB podłączonego do maski na twarz i zamknij dopływ gazu do skrzynki indukcyjnej.</li>
	<li>Usuń zwierzę i umieść je w masce na twarz obwodu NRB.</li>
	<li>Zmniejsz stężenie izofluranu do 1,5%-1,75%, zgodnie z reakcją na bodźce (np. uszczypnięcie palca u nogi lub ściśnięcie łapy).</li>
	<li>Zawsze stale monitoruj oddech myszy i kolor błony śluzowej (jeśli to możliwe). Jeśli oddychanie zwierzęcia staje się utrudnione lub kolor błony śluzowej nie jest różowy, zmniejsz stężenie środka znieczulającego.</li>
	<li>Utrzymuj zwierzę w cieple przez cały czas trwania zabiegu. Użyj ogrzewacza do rąk zawiniętego w ręcznik papierowy, który umieszcza się pod podkładką i znajduje się bezpośrednio pod myszką.</li>
	<li>Po zakończeniu zabiegu wyłącz tlen i parownik.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie zwierzęcia
<ol>
	<li>Jeśli jesteś praworęczny, wstrzyknij prawe oko myszy i ustaw mysz po jej lewej stronie z pyskiem skierowanym w prawą rękę. Jeśli jesteś leworęczny, wstrzyknij lewe oko myszy i ustaw mysz na jej prawym boku z pyskiem skierowanym w stronę lewej ręki.</li>
	<li>Nałóż jedną lub dwie krople znieczulenia okulistycznego na gałkę oczną, która ma zostać wstrzyknięta. Następnie usuń nadmiar znieczulającego okulistycznego roztworu za pomocą sterylnego, chłonnego gazika. Delikatnie uciskaj opuszkami palców skórę grzbietową i brzuszną oka, aby częściowo wystawać gałkę oczną myszy z oczodołu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A,B). 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na otaczające naczynia szyjki macicy podczas wysunięcia oka, ponieważ utrudni to przepływ krwi i wstrzyknięcie. Ponadto wywieranie nacisku na tchawicę może uniemożliwić myszowi oddychanie. Upewnij się, że mysz może oddychać przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Trzymaj igłę w pozycji skośnej pod kątem około 30° i umieść ją w kancie przyśrodkowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Głębokość umieszczenia igły w celu dotarcia do zatoki pozagałkowej będzie się różnić w zależności od wielkości zwierzęcia. Trzymanie igły w pozycji skośnej do dołu podczas wstrzykiwania zmniejsza ryzyko uszkodzenia oka. Należy uważać, aby nie umieścić igły zbyt głęboko i nie przebić oczodołu. Wstrzyknięcie powinno trwać krócej niż minutę.</li>
	<li>Powoli i płynnie naciskać na tłok strzykawki, aby wprowadzić wstrzyknięcie. Zmniejszy to ryzyko wynaczynienia.</li>
	<li>Wyjmować igłę powoli i płynnie.</li>
	<li>Zdejmij maskę na twarz z myszy, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu.</li>
</ol>
4. Po wstrzyknięciu
<ol>
	<li>Po zakończeniu zabiegu wyłącz tlen i parownik.</li>
	<li>Użyj sterylnej gazy, aby usunąć krew, jeśli wystąpi resztkowe krwawienie.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz znajduje się w ciepłym miejscu (około 37 °C), ale nie nadmiernie gorącym, aby zapobiec hipotermii podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.</li>
	<li>Obserwuj mysz w izolacji, aż do całkowitego wyzdrowienia przed powrotem myszy do klatki i stojaka. 
	UWAGA: Izolowanie myszy podczas rekonwalescencji zapobiega zranieniu myszy poddanej sedacji przez kolegów z klatki podczas rekonwalescencji.</li>
</ol>

Effective Systemic Delivery in Mice Using Retrobulbar Injection Technique

<ol><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Med+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Samelson-Jones, B. J., George, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+therapy+for+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia.</a> Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+for+methylmalonic+acidemia+using+the+novel+adeno-associated+viral+vector+44.9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+aav9+gene+therapy+improves+the+lifespan+of+mice+with+niemann-pick+disease%2C+type+c1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1.</a> Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).</li>
<li>Venturoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+advantage+of+corrected+hepatocytes+in+a+juvenile+model+of+methylmalonic+acidemia+following+liver+directed+adeno-associated+viral+mediated+nuclease-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing.</a> Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).</li>
<li>Ilyinskii, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immtor+nanoparticles+enhance+aav+transgene+expression+after+initial+and+repeat+dosing+in+a+mouse+model+of+methylmalonic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).</li>
<li>Davidson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+systemic+aav+gene+therapy+with+a+neurotrophic+capsid+in+niemann-pick+disease+type+c1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice.</a> Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040(2021).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+using+an+aav44.9+vector+rescues+a+neonatal+lethal+mouse+model+of+propionic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).</li>
<li>Rocha-Ferreira, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+rodent+model+of+retroorbital+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A neonatal rodent model of retroorbital vein injection.</a> J Vis Exp. (204), e65386(2024).</li>
<li>Bohnert, B. N., Artunc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+nephrotic+syndrome+in+mice+by+retrobulbar+injection+of+doxorubicin+and+prevention+of+volume+retention+by+sustained+release+aprotinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin.</a> J Vis Exp. (135), e57642(2018).</li>
<li>Bohnert, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+sinus+injection+of+doxorubicin+is+more+efficient+than+lateral+tail+vein+injection+at+inducing+experimental+nephrotic+syndrome+in+mice%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study.</a> Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).</li>
<li>Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+restraint+and+injection+methods+on+heart+rate+and+body+temperature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice.</a> Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).</li>
<li>Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+response+to+restraint+stress+by+salivary+corticosterone+levels+in+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice.</a> J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).</li>
<li>Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+routes+of+antibody+administration+in+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies.</a> Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aav+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic istotnego dla tej publikacji do ujawnienia.

Podczas gdy wstrzyknięcie pozagałkowe jest niezawodną metodą dostarczania małych cząsteczek, białek i terapii genomicznych, ćwiczenie tej techniki z barwnikiem jest konieczne, aby zapewnić niezawodne i powtarzalne dostarczanie ogólnoustrojowe. Stosowanie barwnika jest wysoce zalecane do ćwiczenia wstrzyknięć pozagałkowych u myszy przed użyciem tej drogi dostarczania w eksperymentach. Barwniki można wizualnie sprawdzić w tkankach myszy, aby zapewnić spójne dostarczanie ogólnoustrojowe.
W naszej demonstracji techniki wstrzykiwania zagałkowego, gaz izofluran został użyty do znieczulenia myszy przed zabiegiem. Przed zabiegiem można zastosować inne formy znieczulenia, ale ważne jest, aby upewnić się, że mysz nie dojdzie do siebie po sedacji przed zakończeniem wstrzyknięcia. Na szczęście samo wstrzyknięcie trwa zwykle mniej niż minutę, a czas, w którym mysz musi być w pełni znieczulona, jest krótki. Podczas wstrzyknięcia mysz powinna być całkowicie uspokojona, a znieczulenie powinno zostać ponownie podane, jeśli mysz odzyska przytomność przed wstrzyknięciem. Ponieważ stosowanie znieczulenia wiąże się z ryzykiem, czas trwania sedacji myszy powinien być zminimalizowany. Nie mieliśmy problemów ze stosowaniem izofluranu do uspokajania małych chorych myszy kwasicą metylomalonową i propionową. Jednak niektóre modele myszy mogą być bardziej wrażliwe na sedację i niektóre znieczulenia. Ten potencjalny problem należy rozważyć przed próbą zastosowania sedacji w badaniu. Wreszcie, zastosowanie sedacji w połączeniu z wstrzyknięciem dogałkowym znacznie zmniejsza pozorny niepokój, jaki wykazuje mysz podczas procesu wstrzykiwania, w porównaniu z TVI, w którym sedacja nie jest powszechnie stosowana.
Nie zaobserwowaliśmy żadnych problemów związanych z wstrzyknięciem, chociaż zakażenie stanowi potencjalne ryzyko w przypadku każdego wstrzyknięcia. Aby zmniejszyć ryzyko infekcji, stosuje się sterylną jednorazową strzykawkę i sterylny PBS do rozcieńczania oczyszczonego AAV. Wszystkie myszy w naszym obiekcie dla zwierząt są codziennie sprawdzane pod kątem oznak potencjalnych problemów zdrowotnych i otrzymują opiekę weterynaryjną w celu rozwiązania wszelkich problemów zdrowotnych, gdy jest to uzasadnione.
Alternatywą dla iniekcji do zatoki zagałkowej i szerzej stosowaną metodą ogólnoustrojowego podawania młodocianym i dorosłym myszom jest TVI. TVI i wstrzyknięcie do zatoki zagałkowej powodują podobną biodystrybucję w przypadku małych cząsteczek i przeciwciał, a ekstrapolując to samo, można by oczekiwać tego samego w przypadku wektorów wirusowych15,16. W literaturze nie znaleziono jednak przykładów porównujących ogólnoustrojowe dostarczanie wektorów terapii genowej przez TVI i wstrzyknięcie do zatoki zagałkowej. Naszym zdaniem iniekcje do zatoki zagałkowej są łatwiejsze do wykonania u myszy ze zmniejszonym fenotypem wzrostu i / lub wczesną śmiertelnością.
TVI jest często uważane za bardziej analogiczne do porodu ogólnoustrojowego u ludzi, mimo że ludzie mają zatokę zagałkową, ale nie mają ogona. W jednym aspekcie wstrzyknięcie do zatoki zagałkowej jest podobne do porodu ogólnoustrojowego u ludzi, ponieważ zastrzyk dostaje się do górnego układu żylnego w taki sam sposób, jak gdyby wstrzyknięcie zostało dostarczone człowiekowi za pomocą obwodowo wprowadzonego cewnika centralnego (linia PICC) lub cewnika dożylnego umieszczonego w ramieniu. I odwrotnie, wstrzykiwacz dostaje się do dolnego układu żylnego myszy po wstrzyknięciu żyły ogonowej. Niestety, żadna z tych metod nie replikuje dokładnie metody (metod) stosowanych do dostarczania ogólnoustrojowego u ludzi, ale obie są skutecznymi metodami dostarczania ogólnoustrojowego u myszy.

Mysie modele chorób genetycznych są powszechnie używane do demonstrowania skuteczności terapii małocząsteczkowych, genetycznych i komórkowych1. U myszy najczęściej stosowaną metodą replikacji ogólnoustrojowego dostarczania ludziom jest wstrzyknięcie do żyły ogonowej (TVI), które zwykle wykonuje się u dorosłych myszy w wieku około 6-8 tygodni, aby upewnić się, że żyła jest wystarczająco duża, aby uzyskać dostęp. TVI został z powodzeniem wykorzystany w licznych przedklinicznych badaniach potwierdzających zasadność chorób genetycznych, takich jak hemofilia, które wspierały badania kliniczne na ludziach dotyczące terapii genowej2. Jednak wiele mysich modeli chorób genetycznych ma fenotypy wzrostu i/lub wczesnej śmiertelności, które uniemożliwiają im osiągnięcie wieku lub rozmiaru dorosłej myszy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Leczenie takich myszy za pomocą TVI może być niezwykle trudne, jeśli nie niemożliwe, w zależności od wieku śmiertelności i/lub maksymalnej wielkości, jaką mogą osiągnąć zwierzęta.
Natomiast systemowe dostarczanie środka terapeutycznego przez retrogałkowe (często i błędnie określane jako retro-orbitalne) iniekcję do zatoki może być dość łatwo wykonane u myszy, niezależnie od wieku i rozmiaru3. Wstrzyknięcia retrogałkowe wirusa związanego z adenowirusem (AAV) są z powodzeniem stosowane w młodych, opóźnionych w rozwoju mysich modelach chorób genetycznych, takich jak kwasica metylomalonowa (MMA) i choroba Niemanna-Picka typu C4,5,6,7,8. (Ta procedura może być również użyta do wstrzykiwania noworodków3,4,9,10; jednak ta technika nie jest szczegółowo opisana w tym protokole ani w dołączonym filmie.) Nawet wysoce toksyczne substancje, takie jak doksorubicyna, mogą być bezpiecznie dostarczane przez wstrzyknięcie dogałkowe11,12. W przeciwieństwie do TVI, myszy są znieczulane podczas iniekcji do zatok zagałkowych, co sprawia, że procedura jest mniej stresująca dla myszy i łatwiejsza dla operatora, który nie musi fizycznie krępować myszy13,14. Dodatkowym problemem jest to, że TVI często używa lampy grzewczej do rozszerzania żyły ogonowej, co może potencjalnie powodować odwodnienie u młodych myszy i może być problematyczne w mysich modelach chorób genetycznych, które są bardziej podatne na stres związany z upałem. Innym problemem, który może pojawić się podczas korzystania z TVI, jest to, że żyła ogonowa może być szczególnie trudna do uwidocznienia u myszy o silnej pigmentacji. Jednak, podobnie jak TVI, iniekcje do zatok pozagałkowych powodują szeroką biodystrybucję ogólnoustrojową15,16.

<table><tbody><tr><td>AAV8-CAG-eGFP</td><td>Univ. Penn. Vector Core</td> Dostępne <td>są alternatywne źródła reporterów AAV na specjalne zamówienie i alternatywne reportery AAV</td><td></td></tr><tr><td>Wskazówki barierowe (filtrujące), 20 i mu; Rozmiar L</td><td>ThermoFisher</td><td>AM12645</td><td>do rozcieńczania AAV w celu zmniejszenia objętości i stężenia iniekcji</td></tr><tr><td>Końcówki barierowe (filtrujące), 100 &mu; Rozmiar L (sterylny)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM12648</td><td>do rozcieńczania AAV w celu zmniejszenia objętości i stężenia wtrysku</td></tr><tr><td>Podwójny obwód Prodedure&nbsp;</td>Można <td>zastosować alternatywną metodę znieczulenia</td> <td>VetEquip</td><td>921400</td></tr><tr><td>Pipeta Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>do rozcieńczania AAV do zmniejszenia objętości i stężenia iniekcji</td></tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic&nbsp; Pipeta P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td>do rozcieńczania AAV w celu zmniejszenia objętości i stężenia iniekcji</td></tr><tr><td>Ogrzewacze do rąk (HOTHANDS)</td><td>ULINE</td><td>S-1497B</td><td>do utrzymywania ciepła myszy podczas znieczulenia</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe, 31 G,&nbsp; 8 mm długości, pojemność 3/10 ml</td><td>Becton Dickson</td><td>328438</td><td>używany w filmie; jedna strzykawka na wstrzyknięcie</td></tr><tr><td>Izofluran (Fluriso)</td><td>VETONE</td><td>502017</td><td>Można zastosować alternatywne znieczulenie</td></tr><tr><td>Jednorazowe podkładki Medline Protection Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>23-666-062</td><td>do umieszczania myszy na wstrzykiwaniu</td></tr><tr><td>Oak Ridge Phlebotomy Pojemnik na ostre przedmioty z przezroczystą pokrywką</td><td>ThermoFisher</td><td>22-730-434</td><td>do usuwania igieł</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Aby rozcieńczyć AAV do pożądanego zagęszczenia i objętości</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Snap Cap o niskiej retencji (sterylne)</td><td>ThermoFisher</td><td>3451</td><td>do rozcieńczania AAV do objętości iniekcji i współtrwania</td></tr><tr><td>Sterylna gąbka z gazy 4"x"4</td><td>Covidien</td><td>3033</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek trekainy Okulistyczny (0,5%)</td><td>Ocenanside Pharmaceuticals</td><td>AK102D5DS</td><td>miejscowy&nbsp; znieczulający</td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa o masie 27,0 G (lub mniejszej)</td><td>Dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td>alternatywy dla strzykawki insulinowej używanej w filmie</td></tr><tr><td>VetEquip' s Podręcznik użytkownika i instrukcja obsługi do stołowego i mobilnego laboratoryjnego systemu znieczulenia zwierząt.&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf</td><td>link do podręcznika użytkownika i podręcznika</td></tr></tbody></table>

leczenie ogólnoustrojowe dorosłych myszy po porodzie, młodych i biegowych przez wstrzyknięcie do zatoki zagałkowej

Systemic Treatment for Postnatal, Juvenile, and Runted Adult Mice by Retrobulbar Sinus Injection

Podczas gdy zastrzyki do żyły ogonowej są często stosowane jako ogólnoustrojowa droga dostarczania u dorosłych myszy, zastrzyki pozagałkowe są alternatywną metodą dostarczania ogólnoustrojowego z mniejszymi ograniczeniami. Po pierwsze, zastrzyki do żyły ogonowej (TVI) są ograniczone do dorosłych myszy, u których rozmiar żyły ogonowej jest odpowiedni do dostępu. Ograniczenie się do leczenia dorosłych myszy może być problematyczne w przypadku modeli myszy, które nie dożywają dorosłości. Po drugie, TVI nie są wykonalne dla modeli mysich z fenotypami opóźnienia wzrostu, w których myszy nigdy nie osiągają wielkości dorosłych myszy typu dzikiego. Dlatego zastrzyki zagałkowe mogą być z powodzeniem stosowane w leczeniu zarówno młodych, jak i małych dorosłych myszy. Wreszcie, zastrzyki zagałkowe są wykonywane w znieczuleniu, co jest mniej stresujące dla myszy niż TVI, które są zwykle wykonywane bez znieczulenia. W artykule przedstawiono protokół i szczegółowe instrukcje dotyczące wstrzyknięć pozagałkowych, które można stosować do podawania ogólnoustrojowego małym i młodym myszom.

Wtryskiwanie do zatoki zaocznej było z sukcesem stosowane do systematycznego dostarczania małych cząsteczek, przeciwciał oraz wirusów towarzyszących adeno (AAV)4,5,9,15,16. Na Rysunku 3 pokazano wątrobę myszy traktowanej PBS (nośnikiem) oraz wątrobę myszy traktowanej AAV8 jako przykład wstrzyknięcia i ekspresji AAV po iniekcji zaocznej. AAV8, podobnie jak wiele naturalnie występujących wektorów AAV, wykazuje tropizm do wątroby. W związku z tym u myszy, która otrzymała dawkę systemową 5 × 1012vg/kg, oczekuje się znacznej transdukcji wątroby17. Duża liczba hepatocytów wykazujących ekspresję RNA mutazy metylomalonylo-CoA (MMUT) widoczna na Rysunku 3, która jest wyrażana przez transgen AAV, świadczy o prawidłowo wykonanym wtryśnięciu zaoczny.
<img alt="Porównanie masy ciała myszy z kwasicą propionową i myszy typu dzikiego, 4. tydzień życia, edukacyjne badanie biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Mysz z kwasicą propionową z zahamowanym wzrostem. Jest to przykład ekstremalnego zahamowania wzrostu, które może wystąpić w mysich modelach chorób genetycznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Metoda wstrzykiwania u myszy; A-B: trzymanie myszy, wprowadzanie igły; C: schemat techniki wstrzykiwania do jam czaszki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zdjęcia i schemat wstrzykiwania do zatoki zaocznej. (A) Zdjęcie rozmieszczenia palców na futrze w celu wysunięcia gałki ocznej (wskazane białą strzałką). (B) Zdjęcie wysunięcia gałki ocznej (wskazane białą strzałką) po zastosowaniu nacisku w dół na futro przed wprowadzeniem igły i wstrzyknięciem. (C) Schemat orientacji ścięcia igły (ścięcie skierowane w dół względem gałki ocznej), kąta wprowadzenia igły (30°) oraz miejsca wprowadzenia igły do zatoki zaocznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza histologiczna, obrazy mikroskopowe przekrojów tkankowych ukazujące struktury komórkowe i znakowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Hybrydyzacja in situ RNA po wtryskiwaniu AAV8 do zatoki zaoczne. Obrazy (A) 10x wątroba traktowana nośnikiem, (B) wątroba traktowana 10x AAV8, (C) 20x wątroba traktowana nośnikiem i (D) 20-krotne powiększenie wątroby leczonej AAV8, barwionej pod kątem RNA MMUT. Myszy z kwasicą metylomalonową leczono dawką 5 × 1012 vg/kg AAV8-LPS-MMUT lub kontroli nośnikowej (PBS) w 1. miesiącu życia. Tkankę wątroby pobrano 1 miesiąc po zastosowaniu leczenia. MMUT RNA zabarwione na brązowo (czarne strzałki wskazują obszary pozytywnego barwienia). Wątroba zabarwiona kontrastowo hematoksyliną. Paski skali = 100 µm powiększenie 10x dla obrazów, 50 µm dla obrazów z 20-krotnym powiększeniem (B). Skróty: AAV = wirus adeno-zależny; LPS = promotor specyficzny dla wątroby; MMUT = mutaza metylomalonylo-CoA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Ten artykuł zawiera protokół i towarzyszący mu film dotyczący iniekcji do zatoki zagałkowej o całkowitej objętości 150 μL dla dorosłych myszy po porodzie, młodych osobnikach i biegach. Procedura ta szczególnie dobrze nadaje się do wstrzykiwania małych myszy (15 g), gdy wstrzyknięcie do żyły ogonowej nie jest możliwe.

Leczenie ogólnoustrojowe dorosłych myszy po porodzie, młodych i biegowych przez wstrzyknięcie do zatoki zagałkowej

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for ...

Nasze badania obejmują rozwój terapii genowych rzadkich chorób genetycznych, w szczególności ze szczególnym uwzględnieniem grupy zaburzeń metabolicznych znanych jako kwasice organiczne. Celem naszych badań jest określenie, które podejścia mogą być najlepiej dostosowane do przejścia do badań klinicznych na ludziach. Wiele terapii genowych jest zatwierdzonych do leczenia różnych chorób genetycznych, co nie miało miejsca dziesięć lat temu.W rzeczywistości kilka badań klinicznych terapii genowej w kwasicy organicznej zostało zakończonych, trwa lub jest planowanych. Systemowe dostarczanie do lustrzanych modeli poważnych chorób genetycznych może być trudne, ponieważ myszy mogą nie osiągnąć dorosłego rozmiaru. Ten protokół wstrzyknięć pozagałkowych pozwoli na testowanie terapii genowych w modelach lustrzanych z ciężkimi fenotypami i, miejmy nadzieję, umożliwi opracowanie nowych terapii dla pacjentów.Na początek rozcieńczyć AAV do pożądanej objętości i stężenia wstrzyknięcia sterylnym PBS w sterylnej 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej do każdego wstrzyknięcia. Przed napełnieniem sterylnej strzykawki jednorazowego użytku należy kilkakrotnie przesunąć tłok w górę i w dół, aby zapewnić płynne wciśnięcie tłoka. Następnie napełnij strzykawkę do żądanej objętości, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.Jeśli jest praworęczna, ustaw znieczuloną mysz na lewym boku z pyskiem skierowanym w prawą rękę, aby wstrzyknąć prawe oko. Następnie nałóż jedną lub dwie krople znieczulenia okulistycznego na gałkę oczną, która ma zostać wstrzyknięta. Za pomocą sterylnego, chłonnego gazika usuń nadmiar znieczulającego roztworu okulistycznego.Delikatnie uciskaj opuszkami palców skórę, grzbietową i brzuszną do oka, aby częściowo wystawać gałkę oczną myszy z oczodołu. Teraz włóż igłę pod kątem 30 stopni do kantu przyśrodkowego. Powoli i płynnie naciskać na tłok strzykawki, aby wprowadzić wstrzyknięcie.Na koniec zdejmij maskę na twarz z myszy, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu. W hepatocytach zaobserwowano ekspresję RNA mutazy metylomalonylo-koenzymu CoA, co wskazuje na udane wstrzyknięcie zagałkowe.

systemic-treatment-for-postnatal-juvenile-runted-adult-mice

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Tutaj opisujemy indukcję eksperymentalnego zespołu nerczycowego u myszy 129S1/SvImJ poprzez szybkie retrogałkowe wstrzyknięcie doksorubicyny. Leczymy również myszy z nerczycami granulkami o przedłużonym uwalnianiu zawierającymi aprotyninę, aby zahamować aktywność proteazy serynowej w moczu i zapobiec zatrzymywaniu sodu.

Indukcja zespołu nerczycowego u myszy przez zagałkowe wstrzyknięcie doksorubicyny i zapobieganie utrzymaniu objętości przez aprotyninę o przedłużonym uwalnianiu

Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.

Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie powtarzalnej drogi podawania dożylnego, która może być stosowana u szczurów i myszy przez cały okres noworodkowy. Procedura ta jest ważna dla przedklinicznych badań na gryzoniach, które mają na celu odzwierciedlenie podawania leków na oddziałach opieki neonatologicznej, głównie przy użyciu podawania dożylnego.

Model iniekcji żyły zaoczodołowej u noworodków gryzoni

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

To badanie przedstawia metodologię dostarczania leków do siatkówki i nerwów wzrokowych dorosłego szczura. Dodatkowo wprowadzono unikalną metodę pobierania tkanek w celu odgórnego pobrania en bloc nerwu wzrokowego i siatkówki u dorosłego szczura.

Terapeutyczne dostarczanie do oczu i zaawansowane pobieranie tkanek u dorosłych szczurów

Poznaj metodę wstrzyknięcia do zatoki zagałkowej u myszy do badań terapii genowej zaburzeń metabolicznych. Technika ta umożliwia skuteczną aplikację u małych osobników.

Leczenie ogólnoustrojowe dorosłych myszy po porodzie, młodych i biegowych przez wstrzyknięcie do zatoki zagałkowej

Przeglądaj więcej filmów