Modelowanie in vitro odkładania się tłuszczu w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną

Naszym kierunkiem badawczym jest nauka o tradycyjnej medycynie mongolskiej. Ustanawiając model komórkowy stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną, bada się rolę i mechanizm powszechnej terapii. Wyniki badania nad obecnością przyczynią się w przyszłości do zwiększenia korzyści płynących z dysfunkcji metabolicznych i umożliwią opracowanie modeli komórkowych stłuszczeniowej choroby wątroby związanych z dysfunkcją metaboliczną oraz zbadanie mechanizmów leżących u jej podstaw.

Przyszłe badania zostaną przeprowadzone w oparciu o model komórkowy stłuszczeniowej choroby wątroby związany z dysfunkcją metaboliczną w celu zbadania mechanizmu działania obniżającego poziom ołowiu w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Na początek wysiewaj wyhodowaną przez noc kulturę HepG2 w 100 mikrolitrach DMEM w każdym dołku 96-dołkowej płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.

Następnego dnia wyrzucić supernatant i dodać 100 mikrolitrów kwasu oleinowego do studzienki zgodnie z określonym grupowaniem. Dla grupy kontrolnej dodaj 100 mikrolitrów DMEM do każdej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Po inkubacji dodaj 10 mikrolitrów obszaru zliczania komórek do każdej studzienki, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez dwie godziny w ciemności. Umieść płytkę w czytniku mikropłytek i zmierz absorbancję przy 450 nanometrach. Oblicz wartości GI'50 ogniw HepG2 zgodnie z gęstością optyczną.

W porównaniu z kontrolą, kwas oleinowy zmniejszał przeżywalność komórek HepG2 w stężeniach 0,125, 0,25, 0,5 i 1 milimola z istotnością statystyczną obserwowaną przy 0,5 i 1 milimolu. Na początek wysiewaj wyhodowaną przez noc kulturę HepG2 w DMEM na 6-dołkowej płytce. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Po inkubacji dodaj dwa mililitry pożywki do hodowli komórkowej zawierającej kwas oleinowy do każdej studzienki. Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyj komórki PBS.

Dodaj jeden mililitr utrwalacza Oil Red O do każdej studzienki i inkubuj przez 30 minut. Wyrzuć utrwalacz i dwukrotnie przemyj komórki wodą destylowaną. Dodaj jeden mililitr 60% izopropanolu do każdej studzienki i inkubuj przez 30 sekund.

Po odrzuceniu izopropanolu dodać jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu barwnika Oil Red O i inkubować przez 20 minut. Teraz dodaj jeden mililitr 60% izopropanolu i inkubuj przez 30 sekund. Umyj komórki pięć razy wodą, aby usunąć nadmiar barwnika.

Po obrazowaniu mikroskopowym obserwuj komórki pokryte wodą destylowaną na komputerze. Po zobrazowaniu usuń wodę z płytki i pozostaw do wyschnięcia. Dodaj dwa mililitry izopropanolu do każdej studzienki i potrząsaj płytką na wytrząsarce orbitalnej przez 10 minut.

Przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na 96-dołkową płytkę z 16 dołkami w każdej grupie na czytniku mikropłytek o długości 510 nanometrów. Zmierz gęstość optyczną, aby obliczyć zawartość lipidów. W porównaniu z komórkami kontrolnymi, komórki HepG2 traktowane kwasem oleinowym wykazywały zwiększoną intensywność czerwonego zabarwienia, co wskazuje na większe tworzenie kropelek lipidów.

Kropelki lipidów i lipidy w komórkach HepG2 zwiększały się wraz ze wzrostem stężenia kwasu oleinowego. Na początek zrównoważ całkowity zestaw triglicerydów w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Zebrać supernatant komórek HepG2 wyhodowanych przez noc i odwirować przy 1,570 G przez 10 minut.

Ustawić studzienki wzorcowe i testowe próbki. Dodaj 50 mikrolitrów kwasu oleinowego do standardowych oznaczonych studzienek. Oprócz studzienek ślepych i standardowych dodaj 10 mikrolitrów kultury komórkowej do studzienek na próbki.

Następnie dodaj 40 mikrolitrów rozcieńczalnika do próbek do każdej studzienki. Teraz dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wykrywającego peroksydazę chrzanową do każdej studzienki. Uszczelnić membraną płytkową i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w piecu o stałej temperaturze.

Po godzinie wyrzuć supernatant i osusz na papierze bezpyłowym. Dodaj roztwór myjący do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Teraz dodaj 50 mikrolitrów substratu A i 50 mikrolitrów substratu B do każdej studzienki.

Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu do terminacji. W ciągu 15 minut zmierz gęstość optyczną przy 450 nanometrach.

Wykreślić stężenie wzorca wzdłuż osi X i odpowiadającą mu wartość absorbancji wzdłuż osi Y, przeprowadzić regresję liniową i wyprowadzić równanie krzywej, aby obliczyć wartość stężenia każdej próbki. W porównaniu z grupą kontrolną, leczenie komórek HepG2 różnymi stężeniami kwasu oleinowego spowodowało znaczny wzrost całkowitej zawartości trójglicerydów w supernatancie komórki.