Name: Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy przy użyciu elastazy i BAPN. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów pękania i rozwoju nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health (NIH) pod numerem 1R01HL149404-01A1 (BL), oraz Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 HL 007936 dla University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (JB). Rysunki były tworzone lub edytowane za pomocą Biorender.com. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 10.

Abdominal Aortic Aneurysm Development in Mice Using the Elastase and BAPN Method

<ol><li>Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms.</a> New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).</li>
<li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Society+for+Vascular+Surgery+Guidelines+on+the+management+of+aorto-iliac+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Vasc+Endocasc+Surg%22%5BJournal%5D)">European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms.</a> Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).</li>
<li>Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cellular+immune+responses+in+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).</li>
<li>Shen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+aneurysms+and+dissections+series%5BTitle%5D)+AND+%22ArteriosclerThromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Aortic aneurysms and dissections series.</a> ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).</li>
<li>Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Therapy+in+Vascular+and+Endovascular+Surgery+E-Book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Current Therapy in Vascular and Endovascular Surgery E-Book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2014).</li>
<li>Morgan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+novel+mechanisms+of+abdominal+aortic+aneurysm+via+unbiased+proteomics+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Identifying novel mechanisms of abdominal aortic aneurysm via unbiased proteomics and systems biology.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 889994(2022).</li>
<li>Yin, L., Kent, E. W., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+murine+models+of+ruptured+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 950018(2022).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chronic+advanced+stage+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model.</a> J Vasc Surg. 66 (1), 232-242 (2017).</li>
<li>Berman, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+aortic+aneurysm+severity+and+growth+depend+on+topical+elastase+concentration+and+lysyl+oxidase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition.</a> Sci Rep. 12 (1), 99(2022).</li>
<li>Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm</a> (2015).</li>
<li>Dansey, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+endovascular+and+open+repair+for+abdominal+aortic+aneurysms+in+the+United+States+from+2004+to+2015+and+implications+for+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening.</a> J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).</li>
<li>Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).</li>
<li>Busch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysm+to+the+translational+needs+of+vascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22JVS+Vasc+Sci%22%5BJournal%5D)">Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery.</a> JVS Vasc Sci. 2, 219-234 (2021).</li>
<li>Anidjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).</li>
<li>Bhamidipati, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+murine+model+of+aortic+aneurysms+using+peri-adventitial+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase.</a> Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).</li>
<li>Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model+induced+by+perivascular+application+of+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase.</a> J Vis Exp. (180), e63608(2022).</li>
</ol>

Autorzy tego manuskryptu nie mają żadnych konfliktów interesów, o których mogliby zadeklarować.

Zrozumienie złożonej patofizjologii tętniaka aorty ma kluczowe znaczenie dla poprawy leczenia choroby tętniaka aorty. Podczas gdy nowsze strategie są aktywnie opracowywane w celu poprawy wyników chirurgicznych, AAA pozostają powszechne w naszym starzejącym się społeczeństwie, a pęknięcie tętniaka pozostaje główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych10. W związku z tym niezaspokojone potrzeby w zakresie strategii wykrywania, zapobiegania i leczenia tętniaków AAA uzasadniają dalsze podstawowe badania nad tętniakami11.
Modele zwierzęce, które dokładnie i skutecznie podsumowują cechy i zachowania ludzkich AAA, są niezbędne do mechanistycznych badań patofizjologii tętniaków i identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych. Podczas gdy obecne modele zwierzęce mogą naśladować główne aspekty zmian tętniakowych, które występują w chorobach ludzkich, żaden pojedynczy model nie reprezentuje w pełni prawdziwej złożoności ludzkich tętniaków. Obecnie myszy są najszerzej akceptowanym gatunkiem do modelowania AAA u zwierząt. Badacze powinni rozważyć różne mocne i słabe strony każdego modelu mysiego dla konkretnego badania tętniaka, takie jak te fachowo opisane w przeglądach Daugherty'ego i wsp. oraz Buscha i wsp.12,13.
Zastosowanie elastazy do indukcji AAA u gryzoni zostało po raz pierwszy opisane przez Anidjara i wsp. w 1990roku. Perfuzja aorty elastazą trzustkową świni za pomocą pompy strzykawkowej powoduje początkowe rozszerzenie w przybliżeniu od 50% do 70%, a rozszerzone segmenty korzystnie wykazują podobne cechy patologiczne ludzkich tętniaków, takie jak zwyrodnienie przyśrodkowe i zapalenie przybyszowe. Klasyczny model perfuzji jest jednak prawdopodobnie najtrudniejszym technicznie modelem tętniaka, a tętniaki, które zwykle powstają w drugim tygodniu, zaczynają stopniowo ustępować. Bhamidipati i in. w 2012 roku wykazali, że przypadkowe stosowanie elastazy może również z powodzeniem wywołać podobne tętniaki, które są bardziej powtarzalne w rozmiarze15. Znacznie mniej wymagający model, miejscowy model elastazy stał się szeroko stosowany w badaniach nad tętniakami. Dodatkowa metodologia i zalety miejscowego modelu elastazy zostały omówione w artykule metodowym autorstwa Xue i współpracowników16.
Model elastazy/BAPN mysiego AAA został opracowany przez Lu i współpracowników w 2017 roku8. Wprowadzenie wody pitnej o stężeniu 0,2% BAPN poprawiło wiele krytycznych uwag dotyczących klasycznego modelu elastazy miejscowej, obecnie powodując tętniaki, które stale się rozszerzają, aż do punktu pęknięcia AAA. W badaniu z 2017 r. wykazali, że myszy w grupie leczonej elastazą/BAPN miały znacznie wyższe wskaźniki tworzenia AAA w porównaniu z grupą elastazy (93% vs 65%, P < 0,01), które były również bardziej zaawansowanymi AAA. W ciągu 100-dniowego okresu badania AAA w grupie elastazy/BAPN nadal rozszerzały się do >800% średnicy wyjściowej i tworzyły skrzeplinę śródświateł (53,8%), a 46,2% spontanicznie pękło przed końcem eksperymentu. Model ten pozwolił naukowcom na zbadanie czynników, które mogą wpływać na postęp tętniaka i stabilność w czasie.
Berman i wsp. dalej badali model elastazy/BAPN, zmieniając stężenie miejscowej elastazy, czas trwania badania, czas podawania BAPN i wpływ płci zwierząt9. Leczenie 5 μl elastazy o wyższym stężeniu (5 mg/ml lub 10 mg/ml) powodowało większe tętniaki niż 2,5 mg/ml w ciągu 56 dni. Częstość powstawania skrzepliny wewnątrzświetlnej zależała również od stężenia elastazy, które wystąpiło u 28,6% myszy leczonych dawką 5 mg/ml i 62,5% myszy leczonych dawką 10 mg/ml. Wykazali również, że model elastazy/BAPN może indukować tętniaki u samic myszy. Chociaż badano tylko kilka samic myszy (n = 5), stwierdzono, że tętniaki u samic były bardziej podatne na pęknięcie (2 z 5 myszy) i były znacznie większe niż u samców AAA po 56 dniach.
W tym artykule staramy się przedstawić metodę rozwiązania jednego z największych ograniczeń modelowania chirurgicznego, jakim jest zmienność procedury chirurgicznej. Bez wyraźnego konsensusu co do stopnia rozwarstwienia i obszaru aorty poddanego działaniu elastazy, wyniki tego modelu mogą się znacznie różnić w zależności od zwierząt, badaczy i instytucji. Zaobserwowaliśmy liczne różnice anatomiczne między myszami, w tym między innymi liczbę i wielkość tętnic i żył lędźwiowych oraz lokalizację IMA, start lewej żyły gonadalnej, co może być ograniczające przy próbie leczenia tylko części lub określonego odcinka aorty podnerkowej. Tutaj pokazujemy, że obwodowe rozwarstwienie całej długości aorty podnerkowej od lewej tętnicy nerkowej proksymalnie do dystalnego rozwidlenia aorty pomaga zapewnić powtarzalne stopnie ekspozycji aorty pomimo różnic anatomicznych, jednocześnie zwiększając powodzenie indukcji tętniaka i zapewniając jasne granice dla operatora. Ponadto rozmiar i bardziej przednie położenie IVC ma tendencję do pokrywania większości aorty, co może wpływać na ilość leczonej aorty, jeśli nie zostanie odizolowana od IVC. Chociaż konieczne jest usunięcie powięzi zaotrzewnowej w celu odsłonięcia aorty, ważne jest, aby nie preparować w pełni tkanki łącznej przydanki z aorty i odsłaniać żadnej z warstw pożywki, ponieważ zwykle powoduje to pęknięcie podczas 5-minutowego okresu inkubacji elastazy. Może to służyć jako dodatkowa kontrola wewnętrzna stopnia rozbioru za pomocą tego modelu, ale może być frustrującą krzywą uczenia się przy przyjmowaniu tego modelu. Operatorzy dodatkowo poznają obszary podwyższonego ryzyka (ryc. 4), które mogą łatwo ulec uszkodzeniu podczas operacji i doprowadzić do niekontrolowanego krwotoku.
Chociaż ważne jest, aby kroki proceduralne tego modelu były spójne, czas trwania badania i czas ultrasonografii interwałowej mogą się różnić w zależności od celu badania. Rozszerzenie aorty rozpoczyna się natychmiast po zastosowaniu elastazy, jednak badania wykorzystujące ten model zwykle obserwuje myszy przez 28 dni po operacji7, jak w tym przykładowym eksperymencie. Wydłużenie czasu trwania badania powinno być brane pod uwagę w przypadku badania zaawansowanych tętniaków, długoterminowego wzrostu, tworzenia się skrzepliny śródświetlnej lub pęknięcia.
Dodatkowe środki okołooperacyjne, takie jak utrzymanie temperatury ciała zwierzęcia i stanu nawodnienia, mogą pomóc w poprawie przeżywalności zwierząt po tej inwazyjnej procedurze. Użycie poduszki grzewczej podczas operacji i umieszczenie w ciepłej klatce rekonwalescencji może pomóc uniknąć hipotermii. Sól fizjologiczną należy podgrzać przed użyciem do płukania jamy brzusznej. Podskórny bolus płynowy bezpośrednio po operacji może odpowiadać za niewyczuwalne straty płynów podczas operacji i pomóc zwierzęciu w utrzymaniu odpowiedniego nawodnienia w bezpośredniej fazie rekonwalescencji. Dzięki starannemu obchodzeniu się z tkankami i konsekwentnemu podejściu metodycznym, model elastazy/BAPN może być wykonywany przez doświadczonego operatora od 30 do 45 minut na mysz i niezawodnie wytwarza AAA przy bardzo niskiej liczbie powikłań okołooperacyjnych.
Nasze wyniki pokazują, że połączenie BAPN wraz z obwodowym rozwarstwieniem aorty podnerkowej przed zastosowaniem elastazy powoduje powstawanie dużych, stale rozszerzających się tętniaków tętniaka o większych średnicach i częstości pęknięć w krótszych okresach. W tym eksperymencie AAA zostały z powodzeniem wywołane u wszystkich samców (6 z 6) i samic (6 z 6) myszy leczonych aktywną elastazą. Ekspozycja na elastazę przez 5 minut spowodowała natychmiastowy wzrost średnicy aorty o około 30-40%, co jest pomocne w potwierdzeniu skutecznego i konsekwentnego stosowania elastazy w grupach leczonych. Podobnie jak Berman i wsp., wykazaliśmy, że ten model może indukować AAA u samic myszy, które również mają większą reakcję na pęknięcie niż samce. Połowa samic myszy (3 z 6) pękła w ciągu 28 dni, w porównaniu do 0 z 6 samców, jednak samice myszy ważą mniej niż samce. Samce myszy wykazały wzrost średnicy AAA o 257% w porównaniu z -4% samców z grupy kontrolnej, podczas gdy samice, które przeżyły, wykazały wzrost średnicy o 417%, w porównaniu do -16% samic z grupy kontrolnej. Średnice aorty nie różniły się znacząco między samcami i samicami, które przeżyły po 28 dniach, ze względu na większą liczbę pęknięć w grupie żeńskiej. Spekulujemy, że myszy pozorowane wykazują mniejsze średnice aorty pod koniec badania, ponieważ aorta ma tendencję do niewielkiego rozszerzania się podczas początkowego rozwarstwienia, a następnie tworzy tkankę bliznowatą przez 28 dni.
Model elastaza/BAPN ma pewne ograniczenia. Obwodowe rozwarstwienie aorty wymaga doskonałych umiejętności chirurgicznych, ale pomaga poprawić powtarzalność i stopień indukcji tętniaka. Podobnie jak w przypadku miejscowego modelu elastazy, występuje również efekt wsadowy w aktywności enzymu elastazy, który, jak wspomniano wcześniej, jest dlatego ważne jest, aby użyć tej samej butelki elastazy dla wszystkich zwierząt w danym doświadczeniu. Chociaż częstość występowania zakrzepów śródświetlnych i pęknięcia tętniaka AAA wzrasta wraz z upływem czasu i nasileniem tętniaka, w tym modelu nie są one gwarantowane ani w pełni przewidywalne.
Podsumowując, model elastazy/BAPN wytwarza duże, prawdziwe podnerkowe tętniaki tętniakowe zarówno u samców, jak i samic myszy, które stopniowo rozszerzają się w czasie, tworzą śródświetlną skrzeplinę i są zdolne do pęknięcia. Te mocne strony tego mysiego modelu pomagają lepiej podsumować niektóre zachowania i cechy tętniaków u ludzi. Chociaż jest to technicznie trudne, staranne i dokładne rozwarstwienie aorty może zwiększyć odpowiedź tętniaka. Obecnie metoda elastazy/BAPN jest zaawansowanym modelem do badania tętniaków aorty brzusznej podnerkowej.

Tętniak jest definiowany jako patologiczne rozszerzenie naczynia krwionośnego większe niż 50% średnicy zdrowego naczynia1. Pomimo tego, że tętniaki aorty brzusznej (AAA) są powszechnie spotykanym schorzeniem w starzejącej się populacji, z częstością występowania około >5% mężczyzn > 65 roku życia, nie ma ukierunkowanych strategii terapeutycznych w leczeniu AAA1. Obecne leczenie AAA ogranicza się do redukcji czynników ryzyka i naprawy chirurgicznej za pomocą chirurgii otwartej lub wewnątrznaczyniowej w oparciu o średnicę aorty lub szybkość wzrostu2. Największym zagrożeniem związanym z AAA jest pęknięcie tętniaka, które jest śmiertelne, jeśli nie jest leczone, a naprawa w tym nagłym przypadku może nieść ze sobą ryzyko śmiertelności nawet o 90%1.
Patofizjologia AAA jest skomplikowana, wieloczynnikowa i nie do końca zrozumiała3. Cechy ludzkiego AAA obejmują prawdziwe tętniakowe rozszerzenie ściany aorty z naciekiem komórek zapalnych, obecność skrzepliny śródświetlnej i postępujące poszerzenie, które prowadzi do ostatecznego pęknięcia3,4. Ponadto AAA są związane z zaawansowanym wiekiem, mają przewagę płci męskiej i żeńskiej 9:1 i najczęściej występują w aorcie podnerkowej5. Modelowanie wszystkich cech i zachowań ludzkich AAA u zwierząt pozostaje ciągłym wyzwaniem6.
Obecne modelowanie AAA jest głównie prowadzone u myszy, a tętniaki są zwykle indukowane przy użyciu jednej z trzech metod - przez infuzję angiotensyny II (AngII) przez podskórnie wszczepioną pompę osmotyczną, oraz przez bezpośrednie zastosowanie chlorku wapnia (CaCl2) lub elastazy do aorty7. W tej drugiej metodzie elastaza trzustkowa świni (PPE) jest nakładana na odcinek aorty podnerkowej i powoduje enzymatyczną degradację włókien elastyny w elastycznej blaszce osłonki środkowej. To uszkodzenie strukturalne powoduje osłabienie ściany aorty i rozszerzenie tętniaka na zewnątrz. Stosowanie samej elastazy miejscowej powoduje jednak powstawanie stosunkowo małych tętniaków podnerkowych, które z czasem nie powiększają się ani nie pękają. Niedawno Lu i in. ulepszyli ten model, dodatkowo podając β-aminopropionitryl (BAPN), nieodwracalny inhibitor oksydazy lizylowej, myszom leczonym elastazą8. Zapobiegając sieciowaniu włókien elastyny i kolagenu, suplementacja BAPN powoduje stopniowe rozszerzanie się aort uszkodzonych przez elastazę aż do momentu pęknięcia. Model elastazy/BAPN ma dodatkowo wyższy wskaźnik zapadalności na AAA niż miejscowy model elastazy, a wytwarzane tętniaki są również większe i zawierają skrzeplinę wewnątrzświetlną8.
W modelu elastazy/BAPN, stopień chirurgicznego rozwarstwienia i wystawienie aorty na elastazę może mieć wpływ na sukces i powtarzalność tego modelu. W tym artykule opisujemy, że jednoczesne podawanie wody pitnej BAPN i miejscowe stosowanie elastazy do aorty po obwodowej izolacji całego podnerkowego odcinka aorty poprawia powtarzalność, uwzględnia różnice anatomiczne między zwierzętami i skutkuje większą częstością indukcji AAA, rozmiarami tętniaków i częstością pęknięć. W tym artykule opiszemy ustandaryzowane podejście do niezawodnego wywoływania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy przy użyciu kombinacji miejscowej wody uzupełnionej elastazą i BAPN.

<table><tbody><tr><td>Komora indukcyjna 0,5 l</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO-0530XXS</td><td>komora indukcyjna anestezjologiczna</td></tr><tr><td>0,9% chlorku sodu do wstrzykiwań, USP, 20 ml</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-03</td><td>sól fizjologiczna zwykła</td></tr><tr><td>strzykawka 3 ml Końcówka Luer-Lok z igłą BD PrecisionGlide 22 G x 3/4</td><td>BD</td><td>REF 309569</td><td>strzykawka, igła 22 G</td></tr><tr><td>Fumaran 3-aminopropionitrylu</td><td>TCI</td><td>A0796</td><td>BAPN</td></tr><tr><td>3-aminopropionitryl sól fumaranu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3134-25G</td><td>BAPN</td></tr><tr><td>Avant Delux gąbki z gazy, 2" x 2" 4-warstwowe</td><td>gąbki z gazy</td><td>Medline</td><td>NON26224</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia łysienia</td><td>Whal Clipper Corporation</td><td>8110</td><td>maszynka do strzyżenia włosów</td></tr><tr><td>betadyna peeling chirurgiczny (powidon-jod, 7,5%)</td><td>Avrio</td><td>NCD 67618-154-16</td><td>betadyna szorowanie chirurgiczne</td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5130</td><td>kleszcze</td></tr><tr><td>Buprenorfina ER-lab</td><td>ZooPharm</td><td>BERLAB0.5</td><td>buprenorfina</td></tr><tr><td>karprofen</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-131-11</td><td>karprofen</td></tr><tr><td>CASTROVIEJO 5,75" prosty z zamkiem</td><td>ROBOZ</td><td>RS-6412</td><td>Castroviejo igłownik</td></tr><tr><td>aplikatory drewniane z bawełnianą końcówką, 6"</td><td>Dynarex</td><td>nr 4302</td><td>aplikatory do drewna z końcówką bawełnianą</td></tr><tr><td>Kącik DESMARRES 5,5'&nbsp;</td><td>Ściągacz do skóry ROBOZ</td><td>RS-6672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>suwmiarka cyfrowa, 0-150 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td>suwmiarka cyfrowa</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Elastaza z trzonki świni Typ I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1250-10MG</td><td>elastaza >4,0 jednostek/mg białka</td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Decon Labs, Inc</td><td>2701</td><td>etanol rozcieńczony do 70%</td></tr> <tr><td>lubrykantu do oczu</td><td>Optixcare</td><td>14716</td><td>smar do oczu</td></tr><tr><td>Suchy sterylizator Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific, Inc</td><td>5-1450</td><td>sterylizator suchych kulek</td></tr><tr><td>mata do terapii cieplnej</td><td>Adroit Medical Systems</td><td>V016</td><td>mata do terapii cieplnej</td></tr> pompa <tr><td>do terapii cieplnej</td><td>Adroit Medical Systems</td><td>HTP-1500</td><td>pompa do terapii cieplnej</td></tr><tr><td>izofluran, USP</td><td>Akorn Animal Health</td><td>NCD 59399-106-01</td><td>izofluran</td></tr><tr><td>Pipeta L-10</td><td>Pipeta</td><td>Rainin LTS 0,5-10 uL</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowa maska anestezjologiczna, mała</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO-0801</td><td>znieczulenie stożek nosowy</td></tr><tr><td>nożyczki mikro dysektorowe</td> Mikroskop <td>nożycowy mikro dyparowy</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5619</td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>S9i</td></tr><tr><td>Oświetlacz LED o wysokiej intensywności Oświetlacz LED o wysokiej intensywnościŚwiatło wyjściowe LED</td><td>Nikon Instruments, Inc</td><td>83359 NII-LED</td><td>zewnętrzna preparacja lekka</td></tr><tr><td>nylonowa 5-0 monofilamentowa, niewchłanialna szew</td><td>Oasis</td><td>MV-661-V</td><td>5-0 nylonowe</td></tr><tr><td>rękawice chirurgiczne z poliizoprenu, GAMMEX Non-Latex PI Micro, rozmiar 7,5</td><td></td><td>Nielateksowe rękawice chirurgiczne</td><td>Ansell</td> 20685975</tr><tr><td>Klipsy do ran ze stali nierdzewnej Reflex 7 mm</td><td>CellPoint Scientific, Inc</td><td>203-1000</td><td>rana Skala klipsów</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Ohaus Compass CR2200</td><td>skala</td></tr><tr><td>SomnofFlo Zestaw akcesoriów</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>10-8000-71</td><td>rurka do parownika elektronicznego&nbsp;</td></tr><tr><td>Waporyzator elektroniczny SomnoFlo</td> Kent <td>Scientific Corporation</td><td>SF2992</td><td>parownik elektroniczny o niskim przepływie</td></tr><tr><td>Przełącznik przepływu SomnoPath</td> Przełącznik przepływu <td>Kent Scientific Corporation</td><td>SP1016</td><td>do parownika elektronicznego</td></tr><tr><td>Kleszcze ostre SS/45</td><td>Ostre</td> kleszcze <td></td>Nożyczki chirurgiczne ROBOZ <td>RS-4941</td></tr><tr><td></td><td>Nożyczki</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>chirurgiczne ROBOZ RS-6010SCkleszcze do naczyń</td><td>Dumont</td><td>VES 0,35</td><td>kleszcze do naczyń</td></tr></tbody></table>

zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

Advanced Abdominal Aortic Aneurysm Modeling in Mice by Combination of Topical Elastase and Oral &#223;-aminopropionitrile

Miejscowy mysi model tętniaka aorty brzusznej (AAA) z elastazy jest wzmocniony w połączeniu z wodą pitną uzupełnianą ß-aminopropionitrylem (BAPN), aby niezawodnie wytwarzać prawdziwe tętniaki podnerkowe z zachowaniami naśladującymi ludzkie tętniaki aorty. Miejscowe zastosowanie elastazy do przydanki aorty podnerkowej powoduje strukturalne uszkodzenie elastycznych warstw ściany aorty i inicjuje rozszerzenie tętniaka. Jednoczesne podawanie BAPN, inhibitora oksydazy lizylowej, sprzyja trwałemu zwyrodnieniu ścian poprzez zmniejszenie sieciowania kolagenu i elastyny. Ta kombinacja powoduje powstawanie dużych tętniaków, które stopniowo rozszerzają się, tworzą śródświetlną skrzeplinę i są zdolne do pęknięcia. Udoskonalenie technik chirurgicznych, takich jak izolacja obwodowa całego odcinka aorty podnerkowej, może pomóc w standaryzacji procedury w celu spójnego i dokładnego stosowania elastazy trzustkowej świń pomimo różnych operatorów i różnic anatomicznych między myszami. Dlatego model elastazy/BAPN jest wyrafinowanym podejściem do chirurgicznej indukcji AAA u myszy, które może lepiej podsumować ludzkie tętniaki i zapewnić dodatkowe możliwości badania wzrostu tętniaka i ryzyka pęknięcia.

W badaniu wykorzystano samce i samice myszy C57BL/6J w wieku 22-24 tygodni. Aorty podnerbowe poddano działaniu 5 µL enzymu elastazy (6,9 mg białka/mL, 6 jednostek/mg białka) lub denaturowanej elastazy przez 5 min. U samców traktowanych elastazą odnotowano wzrost średnicy aorty o 43,4% po 5 min ekspozycji na elastazę w porównaniu do bazowej średnicy aorty przed zabiegiem, natomiast u samic traktowanych wzrost ten wyniósł 33,6% (P = 0,0342). Średnice aorty w grupie kontrolnej (sham) nie wykazały istotnych zmian podczas 5 min ekspozycji na denaturowaną elastazę (samce 0,5%; samice -2,8%). Wśród 12 myszy traktowanych i 6 myszy z grupy kontrolnej nie wystąpiły zgony związane z zabiegiem chirurgicznym. Dane z badania 28-dniowego przedstawiono w Tabeli 1. Wśród traktowanych samic 3 z 6 myszy padły w wyniku pęknięcia tętniaka aorty brzusznej (AAA); jedna w 20. dobie pooperacyjnej i dwie w 28. dobie (Rycina 6). Wśród traktowanych samców nie wystąpiły pęknięcia AAA. Tętniaki AAA (zdefiniowane jako wzrost średnicy aorty o &gt;50% względem wartości bazowej lub zgon z powodu pęknięcia AAA) wywołano z powodzeniem u wszystkich traktowanych myszy (12 z 12). Po 28 dniach średnia średnica AAA u traktowanych samców wynosiła 2,86 ± 0,31 mm, przy średniej procentowej zmianie 257 ± 54%, natomiast średnice AAA u przeżyjących traktowanych samic wynosiły 3,60 ± 1,87 mm, przy średniej procentowej zmianie 417 ± 286% (Rycina 7). U myszy z grupy kontrolnej nie odnotowano istotnych zmian średnic aorty.
<img alt="Wykres analizy przeżywalności z przekrojem myszy B6 wykazującym porównanie rozwoju narządów w 28. dniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przeżywalność samców i samic myszy B6 podczas 28-dniowego modelu AAA indukowanego elastazą/BAPN. (A) Pęknięcie AAA wystąpiło u 3 z 6 leczonych samic (u jednej myszy w 20. dniu, następnie u dwóch myszy w 25. dniu), podczas gdy wśród 6 leczonych samców nie stwierdzono pęknięć w 28. dniu. (B) Reprezentatywne obrazy z sekcji zwłok samicy myszy, która padła w wyniku pęknięcia AAA. Pęknięcie AAA jest widoczne jako duży krwiak zaotrzewnowy (lewo) oraz obecność podnerkowego AAA z defektem ściany (prawo). Skróty: BAPN = ß-aminopropionitrylowy; AAA = tętniak aorty brzusznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki średnicy aorty; wykres słupkowy i przekroje próbek; porównanie grupy SHAM i leczonej ELASTAZĄ/BAPN." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Maksymalne średnice aorty u samców i samic myszy B6 w grupie leczonej elastazą/BAPN oraz grupie sham w 28. dniu. (A) Myszy leczone wykazują znacznie większe średnice w odcinku podnerkowym w 28. dniu w porównaniu z grupą sham. (B) Połączenie elastazy i BAPN skutecznie wywołuje duże tętniaki aorty brzusznej w odcinku podnerkowym u samców i samic myszy B6. Skróty: BAPN = ß-aminopropionitryl; AAA = tętniak aorty brzusznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3"></td>
			<td>B6 samiec Sham</td>
			<td>B6 samica Sham</td>
			<td>samce B6 Elastaza/BAPN</td>
			<td>Samicze myszy B6 Elastaza/BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Liczba myszy</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Wiek (tygodnie)</td>
			<td>22.3 ± 0.0</td>
			<td>22.7 ± 0.7</td>
			<td>23.1 ± 0.2</td>
			<td>23.2 ± 0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Masa (g; podczas operacji)</td>
			<td>36.3 ± 2.5</td>
			<td>23.7 ± 1.2</td>
			<td>32.8 ± 1.7*</td>
			<td>23.7 ± 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Średnica aorty przed leczeniem (mm)</td>
			<td>0.89 ± 0.02</td>
			<td>0.75 ± 0.04</td>
			<td>0.81 ± 0.07</td>
			<td>0.73 ± 0.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Średnica aorty po leczeniu (mm)</td>
			<td>0.90 ± 0.03</td>
			<td>0.73 ± 0.01</td>
			<td>1.15 ± 0.03**</td>
			<td>0.98 ± 0.12**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Procentowa zmiana po 5-minutowej obróbce (%)</td>
			<td>0.5 ± 4.4</td>
			<td>-2.8 ± 5.3</td>
			<td>43.4 ± 10.2***</td>
			<td>33.6 ± 4.5***</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">częstość występowania tętniaka aorty brzusznej (%)</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>6 / 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Pęknięcia tętniaka aorty brzusznej (AAA) w ciągu 28 dni</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przeżywalność do 28. dnia</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Maksymalna średnica aorty w 28. dniu (mm)</td>
			<td>0.85 ± 0.01</td>
			<td>0.64 ± 0.01</td>
			<td>2.86 ± 0.31*</td>
			<td>3.60 ± 1.87**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Procentowa zmiana średnicy aorty w 28. dniu (%)</td>
			<td>-4 ± 2</td>
			<td>-16 ± 2</td>
			<td>257 ± 54*</td>
			<td>417 ± 286**</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wyniki 28-dniowego modelu tętniaka aorty brzusznej (AAA) u myszy indukowanego elastazą/BAPN.Dane przedstawiono jako średnia ± SD. *P&lt;0,05, **P&lt;0,005, ***P&lt;0,0001 w porównaniu do grupy sham tej samej płci przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) testem Fischera. Skróty: BAPN = ß-aminopropionitryl; AAA = tętniak aorty brzusznej.

Ten protokół opisuje metodyczne podejście chirurgiczne do modelowania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy poprzez kombinację bezpośredniego stosowania elastazy do aorty podnerkowej i podawania ß-aminopropionitrylu przez wodę pitną.

Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

Nasze badania mają na celu zrozumienie patofizjologii tętniaka aorty brzusznej. W szczególności lubimy wiedzieć w pojęciu molekularnym, jak pęka tętniak. Wierzymy, że modelowanie tętniaka aorty u myszy, samców i samic, pomoże nam opracować nowe leczenie tej wysoce śmiertelnej choroby, która pilnie wymaga leczenia farmakologicznego.Patofizjologia tętniaka aorty brzusznej jest wieloczynnikowa i złożona, co utrudnia modelowanie zwierzęce. Model elastazy/BAPN niezawodnie wytwarza jednak tętniaki u myszy, które modelują wiele cech i cech choroby ludzkiej. Połączenie wody pitnej BAPN z miejscową chirurgią elastazy może spowodować powstanie dużych tętniaków prawdziwej podnerki, które tworzą skrzeplinę śródświetlną, stopniowo rozszerzają się i ostatecznie pękają.Daje to naukowcom możliwość zbadania takich cech, jak ryzyko pęknięcia i wzrost tętniaka.

advanced-abdominal-aortic-aneurysm-modeling-mice-combination-topical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie pokazano, jak indukować tętniaki aorty brzusznej (AAA) u myszy poprzez przejściową infuzję wewnątrznaczyniową elastazy trzustkowej pochodzenia świńskiego do odcinka podnerkowego aorty brzusznej. Model ten pozwala na uzyskanie szerokiego wglądu w patobiologię AAA dzięki dostępności licznych myszy transgenicznych i z nokautem genowym.

Wytwarzanie eksperymentalnych tętniaków aorty brzusznej u myszy z użyciem elastazy

Opisujemy protokół chirurgiczny mający na celu konsekwentne wywoływanie silnych tętniaków aorty piersiowej u myszy. Zabieg polega na tym, że torakotomia lewa strona, odsłonięcie aorty piersiowej i umieszczenie gąbki nasączonej elastazą trzustkową świni na ścianie aorty.

Mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą

Ten nowatorski model tworzy silne tętniaki aorty podnerkowej u świń za pomocą kombinacji angioplastyki balonowej, perfuzji elastazy/kolagenazy, miejscowego stosowania elastazy i doustnego podawania związków β-aminopropionitrylu, które zakłócają sieciowanie kolagenu.

Świński model tętniaka aorty brzusznej

Obecny protokół opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgiczną dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie elastazy do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej indukowany przez okołonaczyniowe zastosowanie elastazy

Ten manuskrypt przedstawia protokół tworzenia mysiego modelu tętniaka aorty brzusznej myszy przy użyciu chlorku wapnia i elastazy, łącząc zalety poprzednich metod modelowania. Model ten można wykorzystać do badania mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tętniaków aorty brzusznej.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej za pomocą okołoprzybytkowego nacieku chlorku wapnia i elastazy

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw przerostu mięśnia sercowego i rozwoju niewydolności serca. W niniejszym materiale opisujemy procedury zwężania aorty w celu wywołania powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Opracowano wydajną metodę wprowadzania pojedynczych mutacji genowych w całym genomie, wykorzystując Streptococcus sanguinis jako organizm modelowy. Metoda ta została osiągnięta dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowych reakcji PCR rekombinacyjnego oraz transformacji.

Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Poznaj zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy przy użyciu elastazy i BAPN. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów pękania i rozwoju nowych terapii.

Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu (Wideo) | JoVE Journal

Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

Przeglądaj więcej filmów