Rurociąg do wieloskalowych trójwymiarowych badań anatomicznych ludzkiego serca
28 czerwca 2024
Ten protokół przedstawia kompleksowy potok do analizy próbek pobranych z ludzkich serc, które obejmują mikroskopijne i makroskopowe skale.
Znajomość anatomii serca ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia fizjologii serca. Badania anatomii funkcjonalnej obejmowały skalę od mikro do makro, ale w dużej mierze wykorzystywały serca zwierząt. Systematyczne badania ludzkich serc dawców, które nie zostały poddane przeszczepowi, stanowią wyjątkową okazję do opracowania kompleksowego atlasu, który obejmuje zarówno skale mikroskopowe, jak i makroskopowe.
Poprzez badania ludzkiego serca w różnych skalach wykazaliśmy wyjątkową innowacyjność serca, zidentyfikowaliśmy struktury anatomiczne serca w celu poprawy metod chirurgicznych i interwencyjnych oraz opracowaliśmy zasoby do edukacji anatomicznej. Zaletą badania ludzkiego serca w różnych skalach jest to, że szczegółowe badanie struktur mikroskopowych można umieścić w kontekście anatomii ogólnej. Zastosowanie fiksacji profuzji ciśnieniowej utrzymuje fizjologicznie istotną morfologię serca.
Na początek użyj skalpela, aby wypreparować 4% utrwaloną w paraformaldehydzie ludzką tkankę serca, aby zmieścić się w komorze do mikroskopii konfokalnej. Odwodnić próbki serca w serii stopniowanego metanolu przez jedną godzinę każda w temperaturze pokojowej z mieszaniem, a następnie zanurzyć na noc w 66% roztworze dichlorometanu i 33% metanolu z mieszaniem. Następnego dnia wybiel próbkę, wykonując wskazane czynności.
Następnie ponownie uwodnić próbkę za pomocą serii stopniowanych metanoli przez jedną godzinę z mieszaniem. Po znakowaniu immunologicznym wykonaj następujące kroki, aby przygotować tkankę do obrazowania. Przymocuj komorę zawierającą klej do szkiełka i nałóż lakier do paznokci na obwodzie komory.
Włącz pionowy laserowy skaningowy mikroskop konfokalny wyposażony w obiektyw 5X. Korzystając z linii laserowych odpowiednich dla widm emisyjnych użytych fluoroforów, uzyskaj skan kafelków i obrazy stosu Z w rozdzielczości 1024 na 1024. Na poziomie mikroskali oczyszczanie tkanek z próbek serca umożliwia wizualizację zwojów nerwowych zawierających neurony sercowe i wzorce neuronalne unerwienia mięśnia sercowego.
Po włączeniu mikroskopu stereoskopowego należy przeprowadzić delikatne sekcje na tkance ludzkiego serca utrwalonej paraformaldehydem, koncentrując się na strukturach takich jak węzeł komorowy przedsionkowy, tętnica węzła komorowego przedsionkowego i splot nerwowy sercowy. Umieść próbkę serca na łóżku skanera, aby uzyskać obraz CT próbki serca. Za pomocą francuskiej kaniuli chirurgicznej od 20 do 24 kanalizuj żyłę główną górną w celu perfuzji prawego serca, a następnie zatkaj żyłę główną dolną i inną tętnicę płucną sznurkiem.
Następnie należy wykonać postępującą sekcję tkanki serca z nagraniami fotograficznymi na każdym etapie sekcji. Korzystając z wielu paneli świetlnych z diodami elektroluminescencyjnymi ustawionych na stojakach C z szeroką czarną tkaniną z dywidendą, sfotografuj serce za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej. Zawieś próbkę serca na stole obrotowym, aby uzyskać setki wielokierunkowych zdjęć za pomocą smartfona.
W oprogramowaniu Scaniverse i Polycam wygeneruj model 3D serca w formacie FBX. Zawiesić próbkę serca na belce w poprzek górnej części pojemnika. Użyj tomografu komputerowego z wieloma detektorami, aby przeprowadzić tomografię komputerową serca.
Po wygenerowaniu wirtualnych obrazów preparacji serca, wizualizuj niewzmocnione ściany, przegrody i zastawki za pomocą wirtualnej sekcji, aby uzyskać obrazy podobne do grubej sekcji.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół analizy próbek ludzkiego serca w skalach mikroskopowej i makroskopowej. Wykorzystując serca dawców odrzucone do transplantacji, badanie ma na celu stworzenie kompleksowego atlasu anatomii serca, który usprawni podejścia chirurgiczne i edukacyjne.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Anatomia serca
- Fizjologia serca
- Analiza ludzkiego serca
Wstęp
- Badania nad anatomią funkcjonalną koncentrowały się zazwyczaj na sercach zwierząt.
- Systematyczna analiza ludzkich serc może dostarczyć nowych informacji na temat struktur serca.
- Innowacje w dziedzinie anatomii serca mogą pomóc w doskonaleniu praktyk chirurgicznych.
Zastosowane metody
- Metodyka fiksacji poprzez perfuzję ciśnieniową
- Próbki ludzkiej tkanki serca
- Mikroskopia konfokalna i techniki obrazowania 3D
Główne wyniki
- Udokumentowano szczegóły strukturalne ludzkiego serca.
- Opracowano zasoby obrazowe do celów edukacyjnych.
- Wykazano związek między mikroskopową a makroskopową anatomią serca.
Wnioski
- Badanie ustanawia ramy dla zrozumienia struktury serca w wielu skalach.
- Wnosi znaczący wkład w badania nad sercem oraz edukację kardiologiczną.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wieloskalowa trójwymiarowa analiza anatomii ludzkiego serca umożliwia bezprecedensowe mapowanie strukturalne, wspierając badania translacyjne oraz mechanistyczną redukcję ryzyka w odkryciach sercowo-naczyniowych. Integracja technik klarowania tkanek, immunoznakowania i zaawansowanego obrazowania dostarcza kompleksowego punktu odniesienia anatomicznego dla walidacji celów terapeutycznych i modelowania chorób. Ten proces zwiększa pewność prognostyczną w wczesnym etapie badań i rozwoju (R&D) nad sercem oraz dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania interdyscyplinarnych decyzji dotyczących portfolio projektów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szczegółową analizę mikro- i makroarchitektury serca w celu walidacji funkcjonalnych celów terapeutycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kontekstualizację cech neuronalnych i naczyniowych w obrębie nienaruszonej tkanki ludzkiej.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną translacyjnych modeli sercowych dzięki odniesieniu wyników do ludzkiej anatomii.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane referencje anatomiczne do opracowywania fizjologicznie istotnych testów przesiewowych.
- Standaryzuje protokoły obrazowania i sekcji w celu zapewnienia powtarzalności między badaniami.
- Generuje ilościowe zestawy danych 3D dla solidnego benchmarkingu testów i ponownego wykorzystania platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli przedklinicznych do ludzkiej struktury serca w celu zwiększenia istotności badania w kontekście chorób.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez integrację anatomicznych danych wielkoskalowych.
- Wspiera progresję z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez doprecyzowanie anatomicznych punktów końcowych oraz biomarkerów translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten wielkoskalowy potok analiz anatomicznych łączy wczesne odkrycia, walidację celów oraz badania przedkliniczne w obszarze rozwoju i badań nad układem sercowo-naczyniowym.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie sieci neuronalnych i naczyniowych in situ.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do opracowywania i walidacji testów.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze modele 3D oraz pomiary ilościowe do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Opiera wyniki przedkliniczne na ludzkich punktach odniesienia anatomicznych, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny, zestandaryzowany przepływ pracy dla bieżących badań nad sercem i integracji międzyprogramowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów kardiologicznych.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności badań anatomicznych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka biologicznego na późnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów sercowo-naczyniowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie utwardzania tkanek (tissue clearing), immunomarkowania oraz zaawansowanych metod obrazowania.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii konfokalnej, tomografii komputerowej (CT) oraz oprogramowania do modelowania 3D.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów sekcji i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych obszarów serca lub stanów chorobowych.
- Realizacja zależy od dostępności odpowiednich preparatów ludzkiego serca do przeprowadzenia kompleksowej analizy.
