Name: Modyfikowanie poziomów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wpływu niedoborów na wyniki zdrowotne potomstwa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 19 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji diety matki w celu zbadania wpływu niedoborów kwasu foliowego i choliny na zdrowie potomstwa u myszy. To podejście pozwala ocenić długoterminowe konsekwencje odżywiania w ciąży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten protokół został zatwierdzony, a wszystkie zwierzęta zostały wykorzystane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Midwestern (Protokół 2983). W badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6J w wieku 2 miesięcy (masa ciała, ~20 g). Ogólnie rzecz biorąc, można używać samic myszy w wieku rozrodczym10. Aby uniknąć skutków miotu, dla każdej diety należy użyć wielu samic11. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Zaopatrz się w dietę ubogą w kwas foliowy lub cholinę od komercyjnych producentów karmy dla gryzoni. Patrz Tabela 1, aby uzyskać szczegółową listę mikro- i makroelementów, w tym dokładną ilość kwasu foliowego lub choliny potrzebnej w diecie z niedoborami. 
	UWAGA: Należy również zamówić odpowiednią dietę kontrolną; szczegółowe informacje przedstawiono w tabeli 1. Diety te były oparte na AIN93G i zawierały zalecane składniki odżywcze dla gryzoni10.</li>
	<li>We współpracy z producentem określ kolorystykę diet, ponieważ może to pomóc w dystrybucji prawidłowych diet podczas badań eksperymentalnych. W tym badaniu użyto koloru zielonego dla diet z niedoborem kwasu foliowego, żółtego dla choliny i białego dla diety kontrolnej. Wszystkie są łatwe do odróżnienia. 
	UWAGA: Nie ma ograniczeń w zużyciu wody. Woda nie zawiera kwasu foliowego, choliny ani innych metabolitów 1C.</li>
</ol>
2. Wywoływanie niedoboru kwasu foliowego lub choliny w diecie
<ol>
	<li>Przed umieszczeniem samic na diecie zważ wszystkie zwierzęta. Będzie ona określana jako masa wyjściowa.</li>
	<li>W zależności od indywidualnej konfiguracji klatki laboratoryjnej (wentylowana lub niewentylowana, patrz Tabela materiałów), wymieniaj lub uzupełniaj specjalne granulki dietetyczne dla każdej klatki kilka razy w tygodniu. Nie przepełniaj koszy na karmę w klatkach specjalną dietą, ponieważ może to prowadzić do pogorszenia jakości granulek w przypadku interakcji ze śliną zwierząt i zepsucia się z czasem. 
	UWAGA: Upewnij się, że zapas diety jest przechowywany zgodnie z wytycznymi producenta i zużyty przed upływem daty ważności.</li>
	<li>Utrzymuj samice myszy na diecie przez 4-6 tygodni przed kryciem.</li>
	<li>Wprowadź samce myszy do klatek żeńskich w celu krycia. Upewnij się, że samce są umieszczane w klatkach dla samic po tym, jak samice były na specjalnej diecie przez co najmniej 4-6 tygodni. Wprowadź jednego samca do jednej klatki na jeden do kilku dni. 
	UWAGA: W obecnym badaniu samce były trzymane z samicami przez cały czas trwania eksperymentu (~ 4 miesiące), aby zwiększyć liczbę młodych produkowanych, ponieważ krycie u myszy może nastąpić po urodzeniu12. Kobiety w wieku powyżej 6 miesięcy nie były wykorzystywane do żadnych badań.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj samice myszy pod kątem korka kopulacyjnego, który wskazuje, że doszło do rozmnażania.</li>
	<li>Zbieraj pomiary masy ciała samic myszy co tydzień, aby śledzić ich stan zdrowia i stan ciąży. 
	UWAGA: Utrzymanie diety przez kobiety w okresie ciąży (~21 dni) i laktacji (~21 dni) jest bezpieczne.</li>
	<li>Kiedy potomstwo zostanie odsadzone od matki (~21 dni po urodzeniu), umieść je na diecie ubogiej w kwas foliowy i cholinę, a także na diecie kontrolnej. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji wyników. 
	UWAGA: Podczas badania wpływu diety matki na wyniki zdrowotne potomstwa, zaleca się, aby potomstwo zostało umieszczone na diecie kontrolnej po odsadzeniu. Dieta kontrolna musi zawierać odpowiednią ilość witamin i składników odżywczych do przetrwania.</li>
	<li>Pod koniec badania (określając tygodniową wagę w celu monitorowania ogólnego stanu zdrowia samic utrzymywanych na diecie z niedoborem kwasu foliowego lub choliny), należy poddać matki eutanazji za pomocą przedawkowania CO2 (dawka, 10%-30% przemieszczenia objętości na minutę, zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) i pobrać tkanki (krok 3) w celu potwierdzenia niedoborów w diecie.</li>
</ol>
3. Pobieranie tkanek do pomiarów 1C i pokrewnych metabolitów
UWAGA: Podczas eutanazji zwierząt ważne jest, aby upewnić się, że zwierzęta nie reagują na uszczypnięcie palca u nogi. Gdy zwierzęta przestaną reagować, można rozpocząć sekcję tkanek. Tkanka, która zostanie poddana sekcji, musi być wcześniej określona13,14, a materiały muszą być przygotowane. Materiały te obejmują rurki do przechowywania, odpowiednie narzędzia do preparowania oraz suchy lód lub ciekły azot.
<ol>
	<li>Zbierz tkanki krwi i wątroby zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami15,16.
	<ol>
		<li>Zbierz ~500-1000 μL krwi za pomocą nakłucia serca, wykonując poniższe czynności. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z Parasuraman et al.17:
		<ol>
			<li>Wykonaj nacięcie w kształcie litery V przez skórę i ścianę brzucha. Odsuń narządy jamy brzusznej na bok i wprowadź igłę przez przeponę do serca, aby pobrać próbkę krwi.</li>
			<li>Umieść próbki krwi w probówkach pokrytych EDTA. Probówkę można pozostawić w temperaturze pokojowej do czasu pobrania wszystkich próbek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odwirować próbki krwi w wirówce o stężeniu 1000-2000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C w celu wyizolowania osocza krwi. Zebrać osocze do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, a następnie przechowywać ją w temperaturze -80 °C do czasu analizy.</li>
		<li>Aby usunąć wątrobę, otwórz jamę brzuszną i przeprowadź sekcję całej wątroby zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem15.
		<ol>
			<li>Po wyjęciu wątroby z jamy ciała pokrój tkankę na mniejsze kawałki małymi nożyczkami i zamroź je za pomocą suchego lodu lub ciekłego azotu. 
			UWAGA: Zamrożone kawałki tkanki można umieścić w kriogenicznej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Effect of Maternal Folic Acid and Choline Deficiencies on Offspring Health

<ol><li>Van Gool, J. D., Hirche, H., Lax, H., De Schaepdrijver, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folic+acid+and+primary+prevention+of+neural+tube+defects%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Folic acid and primary prevention of neural tube defects: A review.</a> Reprod Toxicol. 80, 73-84 (2018).</li>
<li>Ali, S. A., Economides, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folic+acid+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Folic acid supplementation.</a> Curr Opin Obstet Gynecol. 12 (6), 507-512 (2000).</li>
<li>Osterhues, A., Ali, N. S., Michels, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+folic+acid+fortification+in+neural+tube+defects%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Food+Sci+Nutr%22%5BJournal%5D)">The role of folic acid fortification in neural tube defects: a review.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (11), 575966(2013).</li>
<li>Hurley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+dietary+deficiencies+in+folic+acid+and+choline+result+in+larger+damage+volume%2C+reduced+neuro-degeneration+and+-inflammation+and+changes+in+choline+metabolites+after+ischemic+stroke+in+middle-aged+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Maternal dietary deficiencies in folic acid and choline result in larger damage volume, reduced neuro-degeneration and -inflammation and changes in choline metabolites after ischemic stroke in middle-aged offspring.</a> Nutrients. 15 (7), 1556(2023).</li>
<li>Clementson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+dietary+deficiencies+in+folic+acid+or+choline+worsen+stroke+outcomes+in+adult+male+and+female+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal dietary deficiencies in folic acid or choline worsen stroke outcomes in adult male and female mouse offspring.</a> Neural Regen Res. 18 (11), 2443-2448 (2023).</li>
<li>Pull, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+maternal+dietary+folic+acid+or+choline+dietary+deficiencies+on+vascular+function+in+young+and+middle-aged+female+mouse+offspring+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impact of maternal dietary folic acid or choline dietary deficiencies on vascular function in young and middle-aged female mouse offspring after ischemic stroke.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (6), H1354-H1359 (2023).</li>
<li>Virdi, S., Jadavji, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+maternal+folates+on+brain+development+and+function+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">The impact of maternal folates on brain development and function after birth.</a> Metabolites. 12 (9), 8766(2022).</li>
<li>Barker, D. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+nutrition+and+cardiovascular+disease+in+later+life%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Fetal nutrition and cardiovascular disease in later life.</a> Br Med Bull. 53 (1), 96-108 (1997).</li>
<li>Barker, D. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+nutrition%2C+fetal+nutrition%2C+and+disease+in+later+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Maternal nutrition, fetal nutrition, and disease in later life.</a> Nutrition. 13 (9), 807-813 (1997).</li>
<li>Jackson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+age+matter%3F+The+impact+of+rodent+age+on+study+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Does age matter? The impact of rodent age on study outcomes.</a> Lab Anim. 51 (2), 160-169 (2017).</li>
<li>Jiménez, J. A., Zylka, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+litter+effects+to+enhance+rigor+and+reproducibility+with+rodent+models+of+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurodev+Disords%22%5BJournal%5D)">Controlling litter effects to enhance rigor and reproducibility with rodent models of neurodevelopmental disorders.</a> J Neurodev Disords. 13 (1), 2(2021).</li>
<li>Breeding and Reproduction of Mice - All Other Pets. Merck Veterinary Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckvetmanual.com/all-other-pets/mice/breeding-and-reproduction-of-mice">https://www.merckvetmanual.com/all-other-pets/mice/breeding-and-reproduction-of-mice</a> 159-185 (2024).</li>
<li>Jena, S., Chawla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Essentials+of+Laboratory+Animal+Science%3A+Principles+and+Practices%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the laboratory mouse.</a> Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , 159-185 (2021).</li>
<li>The anatomy of the laboratory mouse. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.informatics.jax.org/cookbook/imageindex.shtml">https://www.informatics.jax.org/cookbook/imageindex.shtml</a> (2024).</li>
<li>Mortimer, T., Welz, P. S., Benitah, S. A., Sassone-Corsi, P., Koronowski, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+mouse+livers+for+transcriptome+analysis+of+daily+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Collecting mouse livers for transcriptome analysis of daily rhythms.</a> STAR Protoc. 2 (2), 100539(2021).</li>
<li>Aboghazleh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+brain+extraction+and+dissection%3A+A+comprehensive+approach%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach.</a> MethodsX. 12, 102516(2024).</li>
<li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parmacol+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> J Parmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).</li>
<li>Jadavji, N. M., Deng, L., Malysheva, O. V., Caudill, M. A., Rozen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTHFR+deficiency+or+reduced+intake+of+folate+or+choline+in+pregnant+mice+results+in+impaired+short-term+memory+and+increased+apoptosis+in+the+hippocampus+of+wild-type+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MTHFR deficiency or reduced intake of folate or choline in pregnant mice results in impaired short-term memory and increased apoptosis in the hippocampus of wild-type offspring.</a> Neuroscience. 300, 1-9 (2015).</li>
<li>Pickell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+intake+of+folic+acid+disrupts+embryonic+development+in+mice.+Birth+defects+research%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+A+Clin+Mol+Teratol%22%5BJournal%5D)">High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice. Birth defects research.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 91 (1), 8-19 (2011).</li>
<li>Mikael, L. G., Deng, L., Paul, L., Selhub, J., Rozen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderately+high+intake+of+folic+acid+has+a+negative+impact+on+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+A+Clin+Mol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Moderately high intake of folic acid has a negative impact on mouse embryonic development.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (1), 47-52 (2013).</li>
<li>Mikael, L. G., Pancer, J., Wu, Q., Rozen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+one-carbon+metabolism+causing+adverse+reproductive+outcomes+in+mice+is+associated+with+altered+expression+of+apolipoprotein+ai+and+inflammatory+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Disturbed one-carbon metabolism causing adverse reproductive outcomes in mice is associated with altered expression of apolipoprotein ai and inflammatory mediators.</a> J Nutr. 142 (3), 411-418 (2012).</li>
</ol>

Podczas wdrażania tego protokołu w laboratoriach badawczych istnieje kilka ważnych uwag, które badacze muszą wziąć pod uwagę przed rozpoczęciem eksperymentów. Po pierwsze, w produkcji diety należy zapewnić wystarczającą ilość czasu na wyprodukowanie diety przed rozpoczęciem badania eksperymentalnego. Czas realizacji może się różnić w zależności od firmy, należy również wziąć pod uwagę wysyłkę diety. Samice myszy w wieku rozrodczym (~2-2,5 miesiąca) można wprowadzić na dietę 4-6 tygodni przed kryciem 4,6,14. W poprzednich badaniach używano tylko myszy C57Bl / 6J 4,5,6,18, ale inne grupy używały myszy BALB / c w podobnych badaniach 19,20,21.
Wytworzona dieta zastosowana w tym badaniu zawiera 1% sukcynylosulfatiazolu, który pomaga zmniejszyć syntezę kwasu foliowego przez florę jelitową; Jest to kolejny powód, dla którego należy stosować dietę kontrolną, ponieważ zawiera ona te same antybiotyki, które są obecne w dietach z niedoborami. Po wyprodukowaniu i wysłaniu diety jej przechowywanie jest niezbędne. Ważne jest, aby postępować zgodnie z instrukcjami producenta, aby dieta mogła trwać przez czas trwania badania eksperymentalnego. Ważne jest, aby pamiętać, że standardowa karma dla myszy zawiera podwyższony poziom kwasu foliowego i choliny, aby wspierać ciążę i ogólny stan zdrowia kolonii myszy. W związku z tym należy stosować dietę kontrolną w badaniach mających na celu przede wszystkim zbadanie skutków niedoboru kwasu foliowego i/lub choliny. W przypadku takich badań eksperymentalnych zaleca się stosowanie od producentów diet kontrolnych zawierających minimalną zalecaną ilość kwasu foliowego (2,0 mg/kg) lub dwuwinianianu choliny (1150 mg/kg)10 (Tabela 1).
Co więcej, połączenie zarówno dietetycznego kwasu foliowego, jak i niedoboru choliny u kobiet nie zostało jeszcze wypróbowane. Zarówno kwas foliowy, jak i cholina są ważnymi dawcami metylu i istnieje na nie duże zapotrzebowanie w czasie ciąży dla rozwijającego się potomstwa. Wcześniejsze prace wykazały, że metabolizm kwasu foliowego i choliny jest ściśle związany z prawidłowym funkcjonowaniem mózgu16,17. Zostało to również wykazane przez innych w innych tkankach 18,19. Nie wiadomo, czy dieta uboga w kwas foliowy i cholinę wyda zdolne do życia potomstwo.
Rozważając projekt eksperymentalny, należy zauważyć, że stwierdzono, że niedobory w diecie 1C u samców negatywnie wpływają na wyniki zdrowotne potomstwa11. Jest to ważny punkt, który należy wziąć pod uwagę przy umieszczaniu samców w klatkach z samicami, które są karmione dietą ubogą w kwas foliowy lub cholinę. W tym momencie wpływ krótkotrwałych niedoborów żywieniowych u mężczyzn pozostaje nieznany.
Udana hodowla myszy może stanowić wyzwanie dla postępu eksperymentalnego. Zaleca się skonsultowanie się z personelem zajmującym się opieką nad zwierzętami w instytucji lub literaturą, w tym ze sprzedawcami, którzy z powodzeniem hodują myszy. Ważenie samic co tydzień pomogło monitorować postęp ciąży.
Długoterminowy wpływ niedoborów 1C u matki w czasie ciąży na wyniki zdrowotne potomstwa wymaga dalszych badań 4,14. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wywołać niedobory kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w modelu mysim, a także jak to potwierdzić. W celu określenia innych potencjalnych markerów niedoborów kwasu foliowego lub choliny w diecie, należy zapoznać się z rysunkiem 2 18. Ten eksperymentalny model ułatwia badanie niedoborów kwasu foliowego lub choliny w diecie matek w czasie ciąży i laktacji w odniesieniu do długoterminowych wyników zdrowotnych potomstwa.

Żywienie matki w czasie ciąży i laktacji odgrywa istotną rolę w rozwoju potomstwa. Metabolizm jednowęglowy (1C) to kluczowa sieć metaboliczna, która integruje sygnały odżywcze z biosyntezą, homeostazą redoks i epigenetyką. Kwas foliowy i cholina są głównymi składnikami 1C, które odgrywają ważną rolę w zamykaniu cewy nerwowej. Powszechnie zaleca się, aby kobiety suplementowały kwas foliowy i cholinę w okresie rozrodczym1. Chociaż kluczowa rola kwasu foliowego w rozwoju płodu jest wyraźnie ustalona, mechanizmy leżące u jego podstaw pozostają niejasne. Kobietom w okresie rozrodczym zaleca się przyjmowanie kwasu foliowego przed zajściem w ciążę, ponieważ zamknięcie cewy nerwowej następuje w pierwszym trymestrze ciąży2. Ciężarne matki, które mają niedobór kwasu foliowego lub innych składników 1C, takich jak cholina, mają większą częstość urodzenia potomstwa z wadami cewy nerwowej ze względu na wysokie zapotrzebowanie na syntezę nukleotydów i inne procesy wymagane we wczesnym okresie ciąży3.
Długoterminowy wpływ diety matki ubogiej w metabolizm 1C na wyniki zdrowotne potomstwa jest słabo poznany. Badania z naszych laboratoriów, a także inne, wykazały, że dieta matki uboga w kwas foliowy lub cholinę rzeczywiście wpływa na wyniki zdrowotne potomstwa po udarze niedokrwiennym mózgu przy użyciu modeli przedklinicznych4,5,6. Wpływ diety matki wykazano również w badaniach klinicznych, w których opisano mniejszą objętość mózgu i zmienione poziomy metylacji7. Teoria Rozwojowego Pochodzenia Zdrowia i Choroby (DOHaD) sugeruje, że potencjalne choroby przewlekłe są programowane w macicy8,9, a dieta matki odgrywa ważną rolę.
Ten protokół ma na celu nakreślenie metody zmiany spożycia 1C przez samice myszy przed ciążą, w celu zbadania wpływu żywienia matki na wyniki zdrowotne potomstwa.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Samice myszy Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Charles</td><td>River</td><td>27</td><td>Myszy można również hodować w domu.</td></tr><tr><td>Dieta z niedoborem choliny</td><td>Envigo</td><td>TD.06119</td><td></td></tr><tr><td>Dieta kontrolna</td><td>Envigo</td><td>TD.190790</td><td></td></tr><tr><td>Probówki EDTA Dieta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>z niedoborem kwasu foliowego</td><td>Envigo</td><td>TD.01546</td><td></td></tr><tr><td>Pryzmat</td><td></td><td></td> GraphPad <td>https://www.graphpad.com/features</td></tr><tr><td>Chusta dla gryzoni</td><td>Lab Products, LLC</td><td>One KlatkaWentylowane stojaki i Koszyki</td><td></td></tr><tr><td>Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS)</td><td>SCIEX, Framingham, MA</td><td>5500 QTrap</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sprawna chromatografia cieczowa (UPLC)</td><td>Shimadzu, Columbia, MD, USA</td><td>Nexera</td><td></td></tr></tbody></table>

modyfikowanie poziomów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wpływu niedoborów na wyniki zdrowotne potomstwa

Modifying Levels of Maternal Dietary Folic Acid or Choline to Study the Impact of Deficiencies on Offspring Health Outcomes

Żywienie matki w czasie ciąży i laktacji odgrywa ważną rolę w neurorozwoju potomstwa. Metabolizm jednowęglowy (1C), który koncentruje się wokół kwasu foliowego i choliny, a także innych witamin z grupy B, odgrywa kluczową rolę podczas zamykania cewy nerwowej rozwijającego się płodu. Jednak wpływ tych niedoborów żywieniowych matki w czasie ciąży na wyniki zdrowotne potomstwa po urodzeniu pozostaje stosunkowo nieokreślony. Co więcej, niedobory kwasu foliowego lub choliny w diecie matki mogą wpływać na inne wyniki zdrowotne u potomstwa - co czyni ten model cennym. Protokół ten ma na celu nakreślenie procedury wywoływania niedoboru metabolizmu 1C u samic myszy poprzez modyfikacje diety. Samice są umieszczane na diecie po odsadzeniu, do 2 miesiąca życia, na 4-6 tygodni przed kryciem i pozostają na diecie przez całą ciążę i laktację. Potomstwo tych samic może być oceniane pod kątem wyników zdrowotnych. Samice mogą być wielokrotnie wykorzystywane do generowania potomstwa, a tkanki od samic mogą być pobierane w celu zmierzenia metabolitu 1C. Protokół ten zawiera przegląd sposobów wywoływania niedoborów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wyników zdrowotnych potomstwa.

Celem niniejszego badania było zbadanie wpływu niedoborów kwasu foliowego lub choliny w diecie matek na wyniki zdrowotne potomstwa. Co tydzień wyznaczano masę ciała, aby monitorować ogólny stan zdrowia samic utrzymywanych na dietach z niedoborem kwasu foliowego lub choliny. W naszych poprzednich pracach nie zaobserwowano zmian w masie ciała pomiędzy grupami dietetycznymi matek4. Rycina 1 przedstawia masę wyjściową i tygodniową samic utrzymywanych na diecie kontrolnej lub dietach z niedoborem choliny lub kwasu foliowego w ciągu czterech tygodni poprzedzających kojenie (F (1.144,4.577) = 11.96, p = 0.196). Ogólną obserwacją jest to, że liczba potomstwa przy tych specjalnych dietach jest mniejsza w porównaniu z dietą opartą na standardowej karmie dla myszy. Nie ustalono jednak, aby było to statystycznie istotne.
Gdy samice myszy są karmione dietami ubogimi w 1C, tj. kwas foliowy lub cholinę, dochodzi do zmian w metabolitach w tkankach organizmu przetwarzających 1C. Pomiary 1C oraz pokrewnych metabolitów można przeprowadzić za pomocą różnych technik. W niniejszym badaniu zastosowano chromatografię cieczową sprzężoną z tandemową spektrometrią mas z wykorzystaniem ultra-wydajnej chromatografii cieczowej (UPLC), zgodnie z wcześniejszym opisem12. Przedstawiono pomiary 1C w wątrobie (Tabela 2) oraz w osoczu (Tabela 3) dla całkowitej homocysteiny, S-adenozylometioniny (SAM), S-adenozylohomocysteiny (SAH), metioniny, cystationiny, betainy i choliny. Istnieje wiele sposobów pomiaru tych metabolitów; LC-MS jest tylko jedną z tych metod.
Dane przedstawione w Tabeli 2 oraz Tabeli 3 wykazują niewielkie zmiany w poziomach metabolitów. Obecne pomiary wykonano w czasie, gdy samice kopulowały na dietach przez 6 miesięcy. Właściwsze mogłoby być zmierzenie poziomów metabolitów po 4 tygodniach lub po jednej do dwóch cykli ciąż. Dane z wątroby i osocza przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) oraz oprogramowania do analizy statystycznej i tworzenia wykresów. Wyznaczono istotne efekty diety w analizie ANOVA z zastosowaniem testów post-hoc Tukeya, a także przeprowadzono porównania parzyste między dietą kontrolną a dietami z niedoborem kwasu foliowego lub choliny.
<img alt="wykres przyrostu masy ciała, porównanie CD FADD ChDD, czas vs masa, wykres liniowy, analiza danych badawczych" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66827/66827fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Masa ciała samic myszy utrzymywanych na dietach wystarczających i niedoborowych w jednostkach węglowych. Masa ciała samic myszy przed rozpoczęciem specjalnie sformułowanych diet (poziom bazowy), a następnie cotygodniowe pomiary masy ciała przez 4 tygodnie przy zastosowaniu diety kontrolnej (CD) oraz diet z niedoborem kwasu foliowego (FADD) i choliny (ChDD). Dane przedstawiono jako średnią + błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66827/66827fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat metylacji i syntezy nukleotydów z drogami kwasu foliowego i cyklem metioninowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66827/66827fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Metabolizm jednego węgla i powiązane role biologiczne (metylacja i synteza nukleotydów). Enzymy zaznaczono czarnymi kółkami. Skróty: BHMT, betainowa homocysteina metylotransferaza; CHDH, dehydrogenaza choliny; COMT, katecholo-O-metylotransferaza; DHFR, reduktaza dihydrofolianowa; dTMP,tzymidynomonofosforan; dTTP,tzymidyntryfosforan; dUMP,deksyurydynomonofosforan; dUTP,deksyurydyntryfosforan; FR, receptor folianowy; MTHFR, reduktaza metylenotetrahydrofolianu; MTR, syntaza metioninowa; MTRR, reduktaza syntazy metioninowej; RFC, transporter zredukowanych folianów; SAM, S-adenozylo-L-metionina; SAH, S-adenozylohomocysteina; oraz TS, syntaza tymidylanowa. Rycina zmodyfikowana na podstawie pracy Jadavjiet al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66827/66827fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Lista zawartości mikro- i makroskładników w dietach kontrolnych metabolizmu jednego węgla, dietach z niedoborem kwasu foliowego oraz dietach z niedoborem choliny.Dieta z niedoborem kwasu foliowego zawiera 0,3 mg/kg kwasu foliowego. Dieta z niedoborem choliny zawiera 300 mg/kg bitartratu choliny. Wartości są wymienione w tabeli w czerwonych wyróżnieniach w nawiasach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66827/Table%201.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Stężenia macierzystych metabolitów jednego węgla w izolowanej tkance wątroby. Dane te zostały opracowane na podstawie publikacji Hurley et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66827/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Stężenia matczynych metabolitów jednego węgla w wyizolowanej plazmie. Dane te zostały opracowane na podstawie pracy Hurley et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66827/Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół opisuje metodę zmniejszania spożycia kwasu foliowego lub choliny u samic myszy przed ciążą w celu zbadania wpływu diety matki na wyniki zdrowotne potomstwa.

Modyfikowanie poziomów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wpływu niedoborów na wyniki zdrowotne potomstwa

Maternal nutrition during pregnancy and lactation plays an important role in the neurodevelopment of offspring. One-carbon (1C) metabolism, which centers ...

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, w jaki sposób niedobory kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w czasie ciąży i laktacji wpływają na długoterminowe wyniki zdrowotne potomstwa. Wiemy, że kwas foliowy jest bardzo ważny dla zamknięcia cewy nerwowej w macicy, ale moje laboratorium jest zainteresowane tym, jakie role odgrywa po urodzeniu. Czytamy badania, które pokazują, że dieta matki w czasie ciąży i laktacji odgrywa ważną rolę w zdrowiu potomstwa.Zmiany w diecie obejmują wysoką zawartość tłuszczu, metabolizm jednego węgla i tak dalej. Zmiany te są czasami obserwowane w kilku pokoleniach potomstwa. Używamy różnych narzędzi, aby zrozumieć długoterminowy wpływ na potomstwo matek z niedoborami kwasu foliowego i choliny w diecie.Nasze najnowsze badanie dotyczy zmian metabolitów w próbkach kału potomstwa. Korzystamy z neuronauki behawioralnej, testów biochemicznych, biologii molekularnej i narzędzi epigenetycznych. Moja grupa badawcza jest pierwszą, która wykazała, że niedobory kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w czasie ciąży i laktacji skutkują gorszymi wynikami udaru u potomstwa płci żeńskiej i męskiej.Jesteśmy naprawdę zainteresowani zrozumieniem długoterminowej roli, jaką niedobory kwasu foliowego lub choliny w diecie matki mają na wyniki zdrowotne potomstwa. Kwas foliowy jest dobrze znany ze swojej roli w zamykaniu cewy nerwowej w macicy. Wpływ niedoborów po urodzeniu na funkcjonowanie mózgu nie jest dobrze zdefiniowany.

modifying-levels-maternal-dietary-folic-acid-or-choline-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji1. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Pokazujemy budowę komór parowych z użyciem łatwo dostępnych materiałów, które jednocześnie mieszczą 6 klatek dla myszy. Dalej opisujemy ich zastosowanie w mysim modelu ekspozycji płodu na alkohol równoważnej we wszystkich 3 trymestrzech ciąży ludzkiej. Ten paradygmat eksponuje zwierzęta w czasie ciąży i w dniach poporodowych 1-12.

Budowa komór parowych używanych do wystawiania myszy na działanie alkoholu w czasie odpowiednika wszystkich trzech trymestrów rozwoju człowieka

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest opisanie procedur wystawiania szczurów na umiarkowane poziomy alkoholu podczas prenatalnej ewolucji mózgu oraz ilościowe określenie wynikających z tego zmian w zachowaniach społecznych w wieku dorosłym.

Umiarkowana prenatalna ekspozycja na alkohol i kwantyfikacja zachowań społecznych u dorosłych szczurów

Aktywacja immunologiczna matki (MIA) jest modelem środowiskowego czynnika ryzyka autyzmu i schizofrenii. Celem tego artykułu jest przedstawienie krok po kroku procedury, w jaki sposób indukować MIA u ciężarnych myszy w celu zwiększenia odtwarzalności tego modelu.

Indukcja matczynej aktywacji immunologicznej u myszy w połowie ciąży za pomocą wirusowego poli(I:C)

Klasyczne warunkowanie (ECC) zostało użyte do oceny zależnego od hipokampa uczenia się asocjacyjnego u dorosłych szczurów, którym podawano wysokie stężenie (11,9% v/v) alkoholu podczas wczesnego rozwoju mózgu noworodka. Ogólnie rzecz biorąc, procedury ECC są solidnymi narzędziami diagnostycznymi do wykrywania dysfunkcji mózgu w wielu środowiskach psychologicznych i biomedycznych.

Zastosowanie klasycznego warunkowania śladowego mrugnięcia okiem do oceny dysfunkcji hipokampa w szczurzym modelu zaburzeń ze spektrum alkoholowych płodów

Ta praca opisuje protokół ilościowego oznaczania poziomu etanolu w zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy, od właściwych metod ekspozycji do przetwarzania zarodków i analizy etanolu.

Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.

Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

W tym protokole opisujemy metodę jednoczesnego pobierania tkanki mózgowej płodu, jak również wysokiej jakości, niehemolizowanej surowicy z tego samego zarodka myszy. Wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania, w jaki sposób narażenie matki na dietę wpływa na profile makroskładników odżywczych i rozwój neurologiczny płodu u myszy heterozygotycznych pod kątem Nf1 (nerwiakowłókniakowatość typu 1).

Równoczesne pobieranie płodu mysiego mózgu i surowicy w celu oceny wpływu diety matki na odżywianie i rozwój neurologiczny w nerwiakowłókniakowatości typu 1

Procedura ta ma na celu identyfikację metabolitów przenoszonych z plemników do oocytów podczas zapłodnienia za pomocą znakowania stabilnymi izotopami za pomocą 2H2O lub U13C Glukozy, a następnie analizy metabolomicznej. Buhaje znakowane deuterem są kojarzone z matkami nieoznakowanymi. Pobrane zarodki przedimplantacyjne są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu oddzielenia metabolitów ojcowskich (deuterowanych) od matczynych (niedeuterowanych).

Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia

Artykuł zawiera kompleksowy protokół do wygenerowania modelu mysiego aktywacji immunologicznej matki (MIA) w celu zbadania wpływu wczesnego zapalenia w czasie ciąży na neurorozwój, w tym kluczowe wskaźniki, aby zapewnić niezawodność i powtarzalność.

Generowanie wczesno-ciążowego modelu aktywacji odporności matczynej u myszy w celu oceny prenatalnego stanu zapalnego na neurorozwój

Poznaj metodę modyfikacji diety matki w celu zbadania wpływu niedoborów kwasu foliowego i choliny na zdrowie potomstwa u myszy. To podejście pozwala ocenić długoterminowe konsekwencje odżywiania w ciąży.

Modyfikowanie poziomów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wpływu niedoborów na wyniki zdrowotne potomstwa (Wideo) | JoVE Journal

Modyfikowanie poziomów kwasu foliowego lub choliny w diecie matki w celu zbadania wpływu niedoborów na wyniki zdrowotne potomstwa

Przeglądaj więcej filmów