Name: Trójkolorowy transgeniczny model myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj trójkolorowy model transgeniczny myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej. Wykorzystuje fluorescencyjne markery do mapowania odpowiedzi komórkowych podczas gojenia i testowania nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z National Institutes of Health, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) 1R21AR079153 oraz grant University of Connecticut Research Enhancement Program (REP). Autorzy dziękują za pomoc Renacie Rydzik z University of Connecticut MicroCT Imaging Core facility.

Precise Growth Plate Injury Study Using Trilineage Fluorescent Mice

<ol><li>Iannotti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Growth plate physiology and pathology.</a> Orthop Clin North Am. 21 (1), 1-17 (1990).</li>
<li>Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+responses+and+repair+mechanisms+of+the+injured+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).</li>
<li>Salter, R. B., Harris, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injuries+involving+the+epiphyseal+plate%5BTitle%5D)+AND+%22JBJS%22%5BJournal%5D)">Injuries involving the epiphyseal plate.</a> JBJS. 45 (3), 587-622 (1963).</li>
<li>Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classifications+in+brief%3A+Salter-harris+classification+of+pediatric+physeal+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Classifications in brief: Salter-harris classification of pediatric physeal fractures.</a> Clin Orthop Relat Res. 474 (11), 2531-2537 (2016).</li>
<li>Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+analyses+of+bone+bridge+formation+within+the+growth+plate+injury+site+and+cartilage+degeneration+at+the+adjacent+uninjured+area%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area.</a> Bone. 49 (4), 904-912 (2011).</li>
<li>Shaw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+approaches+for+the+treatment+of+pediatric+physeal+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries.</a> Tissue Eng Part B Rev. 24 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Xian, C. J., Zhou, F. H., Mccarty, R. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembranous+ossification+mechanism+for+bone+bridge+formation+at+the+growth+plate+cartilage+injury+site%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site.</a> J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).</li>
<li>Muruganandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+foxa2%2B+long-term+stem+cell+population+is+necessary+for+growth+plate+cartilage+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A foxa2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury.</a> Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).</li>
<li>Coleman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+small+animal+growth+plate+injury+model+using+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography.</a> Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).</li>
<li>Lee, E. H., Gao, G. X., Bose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+partial+growth+arrest%3A+Physis%2C+fat%2C+or+silastic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Orthop%22%5BJournal%5D)">Management of partial growth arrest: Physis, fat, or silastic.</a> J Pediatr Orthop. 13 (3), 368-372 (1993).</li>
<li>Planka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+mesenchymal+stem+cells+with+chondrocytes+in+prevention+of+partial+growth+plate+arrest+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pap+Med+Fac+Univ+Palacky+Olomouc+Czech+Repub%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs.</a> Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).</li>
<li>Foster, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimplantation+of+growth+plate+chondrocytes+into+growth+plate+defects+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Reimplantation of growth plate chondrocytes into growth plate defects in sheep.</a> J Orthop Res. 8 (4), 555-564 (1990).</li>
<li>Erickson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+tibial+growth+plate+injury+model+to+characterize+repair+mechanisms+and+evaluate+growth+plate+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies.</a> J Vis Exp. (125), e55571(2017).</li>
<li>Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+effect+of+bone+marrow-derived+stem+cell+implantation+after+epiphyseal+plate+injury+is+abrogated+by+chondrogenic+predifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation.</a> Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).</li>
<li>Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+autologous+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+an+ovine+model+of+growth+plate+cartilage+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Orthop+J%22%5BJournal%5D)">Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury.</a> Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+mandibular+condylar+cartilage+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations.</a> Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).</li>
<li>Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+differentiation+of+fluorescent+multireporter+cells+on+zonally-organized+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+type+i+collagen+green+fluorescent+protein+transgenes+to+identify+subpopulations+of+cells+at+different+stages+of+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Use of type i collagen green fluorescent protein transgenes to identify subpopulations of cells at different stages of the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 17 (1), 15-25 (2002).</li>
<li>Maye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+col10a1-mcherry+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice.</a> Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).</li>
<li>Chokalingam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+effects+of+compression+and+time+in+culture+on+aggregate+modulus+and+on+gene+expression+and+protein+content+of+collagen+type+ii+in+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes.</a> Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).</li>
<li>Dutta, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Men+and+mice%3A+Relating+their+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Men and mice: Relating their ages.</a> Life Sci. 152, 244-248 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multi-image+cryohistology+of+mineralized+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">multi-image cryohistology of mineralized tissues.</a> J Vis Exp. (115), e54468(2016).</li>
<li>Chavez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+micro-computed+tomography+analysis+of+rodent+dentoalveolar+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22JBMR+Plus%22%5BJournal%5D)">Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues.</a> JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).</li>
<li>Chung, R., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+research+on+the+growth+plate%3A+Mechanisms+for+growth+plate+injury+repair+and+potential+cell-based+therapies+for+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Recent research on the growth plate: Mechanisms for growth plate injury repair and potential cell-based therapies for regeneration.</a> J Mol Endocrinol. 53 (1), T45-T61 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Innowacyjne zastosowanie myszy reporterowych z trójkolorowym kolagenem umożliwia tworzenie defektów płytki wzrostowej o z góry określonym rozmiarze i lokalizacji, znacznie zwiększając dokładność mysich modeli eksperymentalnych dla urazów płytki wzrostowej. Biorąc pod uwagę niewielki rozmiar 2-tygodniowych myszy, bardzo ważne jest, aby użyć małego wiertła 0,5 mm, aby spowodować uraz, aby uniknąć osłabienia kończyny i spowodowania złamania o pełnej grubości. Chirurg musi również wywierać wystarczający nacisk podczas tworzenia wady, aby uniknąć zbyt głębokiego wiercenia w kości z tego samego powodu. Użycie periosondy ma kluczowe znaczenie dla potwierdzenia stałej głębokości urazu.
Podobnie jak w przypadku każdej operacji, ważne jest, aby potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia, potwierdzoną przez sporadyczne szczypanie palca u nogi, a sterylność jest zachowana przez cały czas. Innym ważnym punktem chirurgicznym jest to, że opisano rozwarstwienie za pomocą rzeźbiarza, ponieważ pozwala to uniknąć uszkodzenia tkanek miękkich i pomaga zapewnić, że myszy są w stanie poruszać się natychmiast po wyzdrowieniu ze znieczulenia, aby dotrzeć do matki myszy w celu odżywienia i komfortu. Z naszego doświadczenia wynika, że rany zamknięte szwami pozostały skutecznie zamknięte i klipsy do ran nie są wymagane. Zaleca się operację na myszach w wieku 2 tygodni, aby jak najlepiej naśladować małe dziecko, które doświadcza złamań płytki wzrostowej. Jedną z wad tego protokołu jest to, że biorąc pod uwagę nieprzewidywalną naturę porodu, użycie tego mysiego modelu wymaga dostępności chirurga w krótkim czasie.
Jeśli chodzi o umiejscowienie wiertła w celu wytworzenia defektu, protokół opisuje tworzenie urazu za pomocą zestawu czerwonych filtrów mCherry / Texas, który oświetla strefę przerostową w płytce wzrostowej ze względu na jasność fluorescencji kolagenu X. Aby upewnić się, że uraz powstał w obrębie płytki wzrostowej piszczelowej, korzystne jest lekkie przesunięcie otworu tkanki miękkiej w lewo i w prawo, aby potwierdzić, że widoczna jest bliższa płytka wzrostowa piszczelowej, a nie kość udowa. Przełączanie między kanałami zestawu filtrów w celu oświetlenia proliferacyjnej strefy chondrocytów lub sąsiednich odcinków kości jest przydatne do potwierdzenia dokładnego położenia względem lokalizacji strefy proliferacyjnej i sąsiednich odcinków kości.
Podczas gdy proliferacyjna strefa chondrocytów oraz kość nasadowa i przynasadowa można rozróżnić pod mikroskopią fluorescencyjną u żywych myszy, rzeczywista wartość reporterów kolagenu typu II i typu I jest realizowana podczas analizy histologicznej płytki wzrostu. Biorąc pod uwagę wodny charakter procesów kriohistologicznych, tradycyjne protokoły wytrącania barwników chromogennych są nieodpowiednie ze względu na potencjalną niewspółosiowość koloru z obrazowaniem fluorescencyjnym spowodowaną etapami odwadniania. Chociaż protokół wodny daje wzory barwienia podobne do tych w skrawkach parafiny, szybkie obrazowanie po barwieniu jest niezbędne, aby zapobiec dyfuzji barwnika z tkanki. Wykorzystanie 30% glicerolu w wodzie destylowanej jako medium montażowego może spowolnić tę dyfuzję, umożliwiając wielokrotne barwienie chromogenne na tym samym odcinku, w tym chrząstki za pomocą Safranin O/Fast Green.
Proces kostnienia śródchrzęstnego jest wyraźnie widoczny z czerwonymi chondrocytami wyściełającymi rozwijający się most kostny (ryc. 6). Dodatkowe zastosowanie technik immunohistochemicznych, dla których dostępnych jest wiele mysich przeciwciał, może jeszcze bardziej wzmocnić badania mechanistyczne prowadzone na tych transgenicznych myszach. Podsumowując, połączenie technik faksytronu, mikrotomografii komputerowej i obrazowania kriohistologicznego w tym transgenicznym modelu myszy oferuje kompleksowe zrozumienie makroskopowych i mikroskopowych zmian, które zachodzą w odpowiedzi na uszkodzenia płytki wzrostu, torując drogę dla przyszłych interwencji terapeutycznych w celu złagodzenia takich niekorzystnych wyników. Dalsze manipulacje genetyczne tych transgenicznych myszy mogą zostać przeprowadzone, aby umożliwić badania nad śledzeniem linii w celu zrozumienia pochodzenia komórek, które są czasowo i przestrzennie zaangażowane w gojenie. Eksperymenty na myszach z dodatkowymi modyfikacjami pozwoliłyby na badanie chorób chrząstki, takich jak osteochondroma - przerost chrząstki i kości w pobliżu płytki wzrostowej.
Spójność naszego modelu przejawia się w powtarzalnym tworzeniu mostów kostnych u wszystkich myszy bez konieczności odrzucania jakichkolwiek myszy z grupy z powodu uszkodzenia chrząstki stawowej. Jest to poprawa w stosunku do poprzednich modeli, które zbliżały się do płytki wzrostowej z okna korowego poniżej płytki wzrostowej i ustawiały ostre narzędzie lub wiertło w górę w kierunku płytki wzrostowej i czasami przestrzeliwały w chrząstkę stawową. Dodatkowy uraz chrząstki stawowej nie naśladuje powszechnie występujących urazów płytki wzrostowej u dzieci. Bardziej precyzyjne uszkodzenie tego modelu zwierzęcego zmniejsza liczbę myszy wymaganych na eksperyment i jest to kolejna poprawa. Wykorzystanie myszy transgenicznych pozwala badaczowi skupić uraz na pododcinkach płytki wzrostu, takich jak obszar przerostowy/tymczasowo zwapniały lub nasada/strefa spoczynku/obszar strefy proliferacyjnej, bez wpływu na chrząstkę stawową. Ograniczeniem tego modelu jest jednak zmienność objętości mostu kostnego, która może różnić się nawet o 30% wśród rannych zwierząt. W związku z tym wykrycie klinicznie istotnego wpływu na tworzenie się mostków kostnych nadal wymaga dużej liczby zwierząt, aby osiągnąć znaczenie statystyczne.
Korzyści dla modelu mysiego, jak opisano tutaj, w porównaniu z modelami uszkodzeń płytki wzrostu szczurów lub królików wcześniej opublikowanymi 7,9,10,14, obejmują mniejszą liczbę wykorzystanych zwierząt, redukcję kosztów, wydajną wielkość repliki dzięki odtwarzalnemu tworzeniu się prętów kostnych, krótsze ramy czasowe badania i bardziej precyzyjne umieszczanie urazów dzięki obrazowaniu na żywo potrójnie transgenicznych myszy. Chociaż nie omówiono tego szczegółowo, ten model myszy może być używany do testowania implantów inżynierii tkankowej lub biomateriałów dostarczających czynniki wzrostu. Znaczącym ograniczeniem tej mysiej metody jest to, że rozmiar implantu używanego do dostarczania leków lub komórek terapeutycznych jest ograniczony do objętości ubytku kuli o średnicy około 0,5 mm. Tylko większe modele zwierzęce są w stanie pomieścić taką ilość badanego materiału, jaka zostałaby użyta u ludzi. Wada wiertła powstała w tym protokole nie ma tej samej geometrii co cienkie złamanie, a zatem różni się od rzeczywistych obrażeń u ludzi. Niemniej jednak korzyści płynące z tego modelu myszy są liczne, a podejście boczne pozwala uniknąć uszkodzenia chrząstki stawowej, które miałoby miejsce, gdyby zbliżać się na ślepo powyżej lub poniżej płytki wzrostowej w linii z długą osią piszczeli. Metodologia ta stanowi znaczący krok naprzód w badaniach nad uszkodzeniami płytki wzrostowej, zapewniając szczegółową i powtarzalną metodę badania patologii i oceny nowych strategii terapeutycznych.

Płytki wzrostu kości odgrywają kluczową rolę w podłużnym wzroście kości długich w dzieciństwie i okresie dojrzewania1. Znajdująca się na końcach kości długich płytka wzrostowa składa się z wielu stref, w których chondrocyty są kluczowymi składnikami komórkowymi odpowiedzialnymi za wytwarzanie i utrzymywanie tego dynamicznego obszaru wzrostu. Kostnienie śródchrzęstne płytki wzrostowej następuje w celu wydłużenia i rozszerzenia kości poprzez sekwencyjną proliferację chondrocytów, przerost, apoptozę, inwazję naczyń krwionośnych, rekrutację komórek osteoprogenitorowych i wreszcie tworzenie kości2. Ponieważ płytka wzrostowa jest stosunkowo bardziej miękka niż kość, jest bardzo podatna na złamania, gdy kości są przeciążone podczas uprawiania sportu lub innych aktywności. Klasyfikacja Saltera-Harrisa przedstawia pięć różnych typów urazów płytki wzrostowej3. Złamanie typu II w strefie przerostowej płytki wzrostu i przylegającej dolnej tkanki kostnej jest najbardziej rozpowszechnione4. Most kostny często tworzy się w odpowiedzi na urazy strefy przerostowej lub sąsiedniej kości i prowadzi do przedwczesnego zrostu sąsiednich odcinków kości długiej5. Mostki kostne utrudniają normalne rozszerzanie się płytki wzrostowej. Obecnie nie są dostępne żadne metody leczenia profilaktycznego w przypadku powstania mostu kostnego, a niektóre z nich pozostają nieleczone w zależności od wieku pacjenta oraz rozmiaru i lokalizacji mostu kostnego6. Gdy wada rozwojowa kończyny jest poważna, opcje chirurgiczne obejmują usunięcie, a następnie wszczepienie materiałów interpozycyjnych, takich jak tłuszcz lub kauczuk silikonowy, lub osteotomię korekcyjną i zabiegi wydłużania kości; Jednak kościsty most może się jeszcze zreformować6. Potrzebne są dalsze badania, aby zapobiec tworzeniu się mostów kostnych i poprawić wyniki leczenia dzieci z urazami płytki wzrostowej kości.
Stworzono kilka modeli zwierzęcych w celu zbadania podstawowych mechanizmów i opracowania nowych strategii zapobiegania upośledzeniu mostków kostnych płytek wzrostowych po urazie7,8,9,10,11,12. Te modele zwierzęce często koncentrują się na bliższej płytce wzrostu kości piszczelowej i dystalnej płytce wzrostu kości udowej jako głównym miejscu urazu, biorąc pod uwagę, że jest to zwykle miejsce, w którym dochodzi do urazów u ludzi. Ubytki kości zwierzęcych są tworzone albo przez podejście boczne podobne do rzeczywistej ścieżki złamania, albo przez podejście z góry lub poniżej płytki wzrostowej, prowadzące do centralnego otworu w płytce wzrostowej. We wcześniej opisanym modelu szczurzym ubytek płytki wzrostowej jest tworzony przez wprowadzenie wiertła dentystycznego przez okienko korowe w środkowej części kości piszczelowej i wiercenie w górę przez szpik w kierunku stawu kolanowego, aby centralnie uszkodzić płytkę wzrostową7,13. Alternatywnie, niedawny model myszy wykorzystuje podejście boczne z igłą o małym otworze, aby utworzyć płaską ścieżkę igły przez płytkę wzrostu8. W szeroko stosowanym modelu szczurzym wada powstaje w płytce wzrostowej dystalnej części kości udowej poprzez przewiercenie się przez chrząstkę stawową między kłykciami9,14. U większych zwierząt, takich jak króliki i owce, wady płytki wzrostowej zostały zarówno wywołane bocznie bezpośrednio w bliższej kości piszczelowej, jak i w dystalnej kości udowej poprzez wiercenie lub nacinanie płytki wzrostowej lub zbliżanie się od dołu i tworzenie centralnego defektu, pozostawiając krawędzie płytki wzrostu niezmienione10,11,12,15.
Mysie modele uszkodzeń płytki wzrostowej są korzystne dla badań mechanistycznych, które można przeprowadzić na genetycznie zmodyfikowanych myszach, takich jak badania nad śledzeniem linii komórek macierzystych8. Jednak poważnym wyzwaniem w modelach zwierzęcych mysich lub szczurów jest osiągnięcie spójnego i precyzyjnego uszkodzenia określonego podregionu płytki wzrostu. Uszkodzenie poszczególnych stref płytki wzrostowej i przylegającej kości jest wymagane do naśladowania jednej z klinicznie istotnych ścieżek złamania opisanych przez klasyfikacje Saltera-Harrisa. Dotychczasowe wyzwania związane z modelami gryzoni wynikają przede wszystkim z braku wizualnych środków identyfikacji podłoża płytki wzrostowej podczas chirurgicznego tworzenia urazu. Protokół ten opisuje udoskonaloną technikę tworzenia defektów płytki wzrostu w docelowych podłożach mysiej płytki wzrostowej poprzez wykorzystanie potrójnych transgenicznych myszy, które wyrażają fluorescencyjne reportery kolagenu I, II i X16,17,18. Różna kolorowa fluorescencja tych kolagenów w każdej z podstawowych stref płytki wzrostowej umożliwia wizualną dyskryminację różnych odcinków płytki wzrostowej pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym podczas chirurgicznego tworzenia urazu płytki wzrostowej. Zastosowanie tych transgenicznych myszy pozwala na bezprecedensową precyzję obrażeń u młodej myszy na porównywalnym etapie rozwoju do dzieci, które są ranne.

<table><tbody><tr><td>2-metylo-butan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholowe podkładki antyseptyczne</td><td>Acme United Corporation</td><td>H305-200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie AxioVision</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Betadine (10% jodu powidonu)</td> <td>Avrio Health L.P.</td><td>67618-150-01</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów CFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td> Ostrza kriostatu Thermo Scientific 3051835 Sekcja kriotaśmy <td></td></tr><tr><td></td><td>Lab Cryofilm</td><td>2C</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Zakrzywiony drobny <td></td></tr><tr><td> Nożyczki&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze hemostatyczne do komarów</td><td>HuFriedyGroup</td><td>H3</td><td></td></tr><tr><td>cy5 zestaw</td><td>filtrów Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr> Zestaw filtrów <tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Chroma</td><td>Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne (średnica 0,5 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dentystyczny cleoid dyskoidalny rzeźbiarz</td><td>ACE Surgical Supply Inc.</td><td>6200097A-EA</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator suchych kulek szklanych (Inotech Steri 350)</td><td>Inotech Bioscience, LLC</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do uszu</td><td>Fine Science Tools</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna poduszka</td><td></td><td></td><td></td>grzewcza</tr><tr><td>Elektroniczny sterownik</td><td>nożny Nouvag AG</td><td>1866nou</td><td></td></tr><tr><td>Silniki elektroniczne 31 ESS</td><td>Nouvag AG</td><td>2063nou</td><td></td></tr><tr><td>Środowiskowa bariera powierzchniowa (rura 3 x 12 cali sox)</td><td>Patterson Companies, Inc.</td><td>BB-0312H</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR (zawiesina do wstrzykiwań buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu) 1,3 mg/ml</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>86084-100-30</td><td></td></tr><tr><td>Szafa rentgenowska Faxitron</td><td>Kubtech Scientific</td><td>Parameter</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>zestaw filtrów Chroma Korporacja Technologiczna</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Lodowcowy kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść (kątnica 32:1 przycisk)</td><td>Nouvag AG</td><td>5201</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka sterująca systemem implantologii/chirurgii jamy ustnej (Straumann)</td><td>Nouvag AG</td><td>SEM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Woreczek do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem z podwójnymi wewnętrznymi/zewnętrznymi wskaźnikami procesu (3 1/2 x 5 1/4&nbsp; cale)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-50</td><td></td></tr><tr><td>Woreczek do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem z podwójnymi wewnętrznymi/zewnętrznymi wskaźnikami procesu (5 4/1 x 10 cali)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa (29 G)</td><td>Exel International</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran& nbsp;</td><td>Dechra Pharmaceuticals plc</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr>System <td></td><td></td><td></td><td>znieczulający izofluranem</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów mCherry</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>39010</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparowania</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Igła (20 G)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>HuFriedyGroup</td><td>NHCW</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna buforowana formalina (10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Niesterylne waciki do aplikatorów</td><td>Allegro Industries</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>Gaza włókninowa (3 x 3 cale)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028560</td><td></td></tr><tr><td>Klej optyczny Norland, 61</td><td>Klej optyczny Norland</td><td>Optical</td>, 61 <td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna (lubrykant do oczu Optixcare)</td><td>CLC Medica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Sonda periodontologiczna</td><td>HuFriedyGroup</td><td>PQW</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4 (1x)</td><td>Gibco, firmy Life Technologies</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szkiełka mikroskopowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71890-01</td><td></td></tr><tr><td>Profesjonalna maszynka do strzyżenia/trymer (Wahl Classic Peanut)Wahl</td> <td>Clipper Corporation</td><td>8685</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>62800-46</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Scanco Medical</td><td>SCANCO Medical</td><td>Scanco &mu; CT 50</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Azotyn sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td></td></tr><tr><td>Winian sodu dwuwodny dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td></td></tr><tr><td>Dysk z próbką</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne ze stali nierdzewnej #15&nbsp;</td><td>Aspen Surgical Products, Inc.</td><td></td><td></td>371615</tr><tr><td>Sterylne rękawice chirurgiczne</td><td>Cardinal Health, Inc.</td><td>2D72PT65X</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna zasłona na ręcznik (18 x 26 cali)</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S9378</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (1 ml)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Niebarwiony pleciony powlekany szew vicryl (5-0)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>J490G</td><td></td></tr><tr><td>UV czarne światło</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr></tbody></table>

trójkolorowy transgeniczny model myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

Płytki wzrostu chrząstki w kościach dzieci umożliwiają wydłużenie kończyn, ale są słabe w stosunku do kości, co czyni je podatnymi na złamania, gdy kości są przeciążone. Potrzebne są lepsze metody leczenia poważnie złamanych płytek wzrostu, ponieważ odpowiedzią na uraz jest mostek kostny, który przedwcześnie zrasta się z płytką wzrostową, prowadząc do karłowatych i/lub krzywych kończyn. Mysie modele uszkodzenia płytki wzrostowej są korzystne w badaniach mechanistycznych, ale stanowią wyzwanie, ponieważ trudno jest zobrazować i precyzyjnie uszkodzić małe płytki wzrostu u młodych myszy. Opisujemy tutaj ulepszony model uszkodzenia płytki wzrostowej przy użyciu myszy transgenicznych z trójliniowymi fluorescencyjnymi reporterami dla typów kolagenu I, II i X.
Te myszy wykazują natywną fluorescencję związaną z trzema głównymi podłożami płytki wzrostu. Uraz płytki wzrostowej podobny do urazu typu II Saltera-Harrisa jest tworzony w sposób powtarzalny za pomocą wiertła wykorzystującego przerostową część płytki wzrostowej jako odniesienie podczas obrazowania na żywo pod kontrolą mikroskopii stereoskopowej fluorescencji. Zamrożona analiza histologiczna natywnej fluorescencji upraszcza ocenę odpowiedzi komórkowej na uszkodzenie. Metodologia ta stanowi znaczący krok naprzód w badaniach nad uszkodzeniami płytki wzrostowej, zapewniając szczegółową i powtarzalną metodę badania patologii i oceny nowych strategii terapeutycznych.

Niniejszy protokół wykorzystuje myszy z fluorescencyjnym reporterem trzech linii w celu precyzyjnego wywołania ubytku bocznego w płytce wzrostu proksymalnej części piszczeli, wykorzystując naturalną czerwoną fluorescencję emitowaną przez kolagen typu X jako prowadnicę chirurgiczną. Obraz widoczny dla chirurga podczas obserwacji przez okular stereomikroskopu z zastosowanym filtrem mCherry przedstawiono na Rycina 2DNaturalna fluorescencja typu X pozwala chirurgowi na umieszczenie wiertła w strefie hipertroficznej i wywołanie uszkodzenia, które naśladuje częsty typ urazu płytki wzrostu prowadzący do powstania mostka kostnego. (Rysunek 2F)Fluorescencja w kanale czerwonym jest najsilniejsza, dlatego zaleca się jej stosowanie podczas umieszczania wiertła. Alternatywnie, tworzenie defektu można prowadzić w oparciu o inne kolory natywnej fluorescencji potrójnie transgenicznych myszy, jeżeli celem eksperymentu jest badanie uszkodzeń innych stref płytki wzrostu niż strefa hipertroficzna i przyległy obszar skalcyfikowany.
Utworzenie ubytku przypominającego typ II według klasyfikacji Saltera-Harrisa w strefie przerostu płytki wzrostu oraz w przyległej tkance kostnej poniżej, z wykorzystaniem wiertła dentystycznego o średnicy 0,5 mm, zostało zwalidowane za pomocą mikro-tomografii komputerowej (microCT) oraz obrazowania krio-histologicznego uszkodzonych (czas 0) kości piszczelowych bliższych w porównaniu z nieuszkodzonymi kontrolami bocznymi u N = 3 myszy (Rysunek 4). Ubytki były trudne do zauważenia na trójwymiarowych obrazach microCT, lecz były wykrywalne na dwuwymiarowych przekrojach poprzecznych (Rysunek 3A,B,E,F). Rysunek 3G przedstawia rozmieszczenie komórek kostnych produkujących kolagen typu I (zielona fluorescencja), proliferujących chondrocytów produkujących kolagen typu II (cyjanowa fluorescencja) oraz chondrocytów przerostowych produkujących kolagen typu X. Na obrazie uszkodzonej myszy (Rysunek 4G) widoczne jest przerwanie strefy przerostu, warstwy przejściowo zwapniałej oraz części nowo powstałej kości w stosunku do kontroli, przy czym strefa proliferacyjna jest jedynie lekko zaburzona. Barwienie Safranin O/Fast Green (Rysunek 4H) najlepiej ilustruje lokalizację ubytku w uszkodzonej płytce wzrostu, ponieważ wszystkie komórki są wyraźnie widoczne.
Analiza rentgenowska u żywych myszy pozwala ocenić wpływ tego rodzaju uszkodzenia płytki wzrostu na długość kości piszczelowej oraz tworzenie się mostka kostnego w czasie (Rysunek 3). Porównanie obrazowania nieuszkodzonych (Rysunek 3A) i uszkodzonych (Rysunek 3B) kości piszczelowych, wykonane przed operacją oraz 3 tygodnie po niej, wykazuje znaczny wzrost kończyny, pocienienie płytek wzrostu oraz wyraźny obszar nieprzezroczysty, który pojawił się w miejscu uszkodzenia płytki wzrostu w 3. tygodniu. Taka nieprzezroczystość w obrębie płytki wzrostu nie występuje w przypadku kontrolnym ani u myszy przed operacją. System Faxitron stanowi zatem sposób obserwacji zmian patologicznych wywołanych urazem u żywych myszy, takich jak formowanie się mostka kostnego i zmiany długości kończyn.
Obrazowanie MicroCT wypreparowanych kości pozwala na szczegółową wizualizację formowania się mostków kostnych w obrębie uszkodzonych płytek wzrostu trzy tygodnie po operacji (Rysunek 5). Jak widać na obrazach sześciu różnych myszy z uszkodzeniem przedstawionych na Rysunku 5, we wszystkich osobnikach występuje spójny rozwój mostków kostnych. Przy użyciu oprogramowania Scanco Medical obliczono objętość mostka kostnego poprzez analizę każdego przekroju proksymalnej płytki wzrostu kości piszczelowej, wyznaczenie obszaru mostka kostnego (Rysunek 5B) za pomocą narzędzia wyboru, a następnie zintegrowanie pola powierzchni każdego przekroju w całej objętości płytki wzrostu w celu uzyskania całkowitej objętości24. Objętość mostka kostnego obliczona w ten sposób wyniosła 0,0761 mm3 ± 0,0246 (średnia ± odchylenie standardowe, N = 6). Większość mostków kostnych formuje się w pobliżu środka płytki wzrostu, pomimo zastosowania podejścia bocznego, które uszkadza zarówno krawędź zewnętrzną, jak i środek płytki wzrostu. Zjawisko to można przypisać faktowi, że za formowanie mostków kostnych odpowiedzialne są mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) z szpiku kostnego, a nie z okochrząstki25.
W przypadku tych tricolor myszy transgenicznych analiza krio-histologiczna uszkodzonej płytki wzrostu jest wzbogacona przez natywną fluorescencję kolagenu (Rycina 6)Ujawnia ono złożone oddziaływanie komórek kostnych i chondrocytów w miejscu urazu. Obrazy mikro-tomografii komputerowej (microCT) przedstawione w Rycina 6J,K przekazano technikowi histologowi w celu przeprowadzenia procesu zatapiania i krojenia. Komórki kostne produkujące kolagen typu I widoczne są w Rycina 6L,O,P (zielona fluorescencja), natomiast proliferujące chondrocyty produkujące kolagen typu II widoczne są w Rysunek 6L,O,Q (fluorescencja cyjanowa). Chondrocyty hipertroficzne produkujące kolagen typu X widoczne są w Rysunek 6L,O,R (czerwona fluorescencja). Ta wielobarwna metoda fluorescencyjna umożliwia szczegółowe badanie różnicowania chondrocytów po operacji w obrębie mostka kostnego na tle zmineralizowanej tkanki. Barwienie DAPI zastosowano w celu potwierdzenia rozmieszczenia wszystkich typów komórek w obszarze płytki wzrostu (Rysunek 6M)Barwienie Safraniną O/Fast Green obrazuje organizację strukturalną i kompozycyjną chrząstki oraz kości w obrębie uszkodzonej płytki wzrostu. (Rysunek 6N)Obrazowanie tych barwionych przekrojów przy użyciu zestawu filtrów Cy5 wyraźnie rozjaśnia komórki strefy spoczynkowej na styku kostnej części nasady i chrząstki.
<img alt="Porównanie wzrostu kości, obrazy rentgenowskie, uszkodzone vs nieuszkodzone, długości w mm, badanie rozwoju kości piszczelowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Obrazy rentgenowskie przeciwstawnej kontroli oraz uszkodzonych kości piszczelowych myszy. (AZdjęcia rentgenowskie przeciwległej kości piszczeli kontrolnej wykonuje się bezpośrednio przed urazem, gdy myszy mają 2 tygodnie, oraz 3 tygodnie po operacji, gdy myszy mają 5 tygodni, co pozwala zobrazować zakres wzrostu zachodzącego w tym okresie.B) Uszkodzona kość piszczelowa od tej samej myszy w tych samych punktach czasowych co w (A). Punktami orientacyjnymi wykorzystanymi do pomiaru długości kości piszczelowej są wierzchołek bliższego końca głowy kości piszczelowej oraz koniec kości piszczelowej w stawie skokowym (czerwone strzałki dwukierunkowe). W 5. tygodniu w uszkodzonej bliższej płytce wzrostu kości piszczelowej widoczny jest nieprzezroczysty mostek kostny. Paski skali = 5,00 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie defektu kostnego, przekroje histologiczne, brak defektu vs z defektem, kolorowe obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazy mikro-TK i histologiczne przeciwstawnych kości piszczelowych myszy w czasie zero: kontrolne i uszkodzone. (A,E) oraz (B,F) przedstawiają trójwymiarowe i poprzeczne dwuwymiarowe widoki mikro-TK, gdzie defekt zaznaczono czerwonymi strzałkami na (E) i (F). (C,G) Złożone, zlewne obrazy krio-histologiczne łączące trzy warstwy fluorescencji endogennej z warstwą tkanki zmineralizowanej. Zielone komórki (Col3.6GFPtpz) to komórki kostne produkujące kolagen typu I, komórki koloru cyjanowego (Col2A1GFPcyan) to proliferujące chondrocyty produkujące kolagen typu II, a czerwone komórki (Col10A1RFPchry) to hipertroficzne chondrocyty produkujące kolagen typu X. (D,H) Barwienie Safraniną O i Fast Green tego samego obszaru co na (C) i (G). Paski skali = 1.0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obrazy z tomografii komputerowej struktur kostnych, podkreślające wzorce beleczkowe i obszary korowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Obrazy MicroCT mostków kostnych utworzonych zgodnie z tym protokołem. (A,C,E,G,I,K) Przekroje poprzeczne bliższej części płytki wzrostu kości piszczelowej u sześciu różnych myszy 3 tygodnie po wykonaniu defektu otworu. Mostek kostny zaznaczono czerwoną linią przerywaną w (A). (B,D,F,H,J,L) Rekonstrukcje 3D z wyciętą płaszczyzną podłużną. Mostek kostny zaznaczono czerwoną linią przerywaną w (B). Paski skali = 1.0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza histologiczna zmineralizowanej tkanki; barwienie fluorescencyjne; mikroskopia; Col3.6, Col2A1, Col10A1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Obrazy microCT i histologiczne przeciwstawnej kontroli oraz uszkodzonej bliższej części kości piszczelowej myszy z formowaniem się mostka kostnego. (A,J) i (B,K) przedstawiają trójwymiarowe (3D) i poprzeczne dwuwymiarowe (2D) widoki microCT, gdzie mostek kostny wskazano żółtymi strzałkami na panelach (J) i (K). (C,L) Złożone, połączone obrazy kriohistologiczne łączące trzy warstwy fluorescencji wrodzonej z warstwą tkanki zmineralizowanej. Zielone komórki (Col3.6GFPtpz) to komórki kostne produkujące kolagen typu I, komórki w kolorze cyjanowym (Col2A1GFPcyan) to proliferujące chondrocyty produkujące kolagen typu II, a czerwone komórki (Col10A1RFPchry) to hipertroficzne chondrocyty produkujące kolagen typu X. Biała ramka wskazuje większe powiększenie pokazane na panelach F i O. (D,M) Tkanka zmineralizowana i barwienie DAPI w obszarze płytki wzrostu z paneli C i L. (E,N) Barwienie Safranin O/Fast Green tego samego obszaru co na panelach (D) i (M), skanowane z fluorescencją cy5. (F,O) Większe powiększenie obszaru płytki wzrostu na obrazie połączonym z paneli C i L. (G-I,P-R) Poszczególne kanały fluorescencji wrodzonej pokazane na tle tkanki zmineralizowanej. Paski skali = 1.0 mm (A-E) i (J-N), = 250 µm w (F-I) i (O-R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje ulepszony model myszy do urazów płytki wzrostu kości u nastolatków. Używając transgenicznych myszy z trójliniowymi fluorescencyjnymi reporterami dla kolagenu typu I, II i X, pierwotnych matryc związanych z trzema różnymi podłożami płytki wzrostowej, umieszczanie urazów jest kierowane przez natywną fluorescencję pod mikroskopem.

Trójkolorowy transgeniczny model myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

Chcę opracować lepsze leczenie dla dzieci ze złamanymi kośćmi. W szczególności chcę zapobiec tworzeniu się kości w złamanej płytce wzrostowej chrząstki, ponieważ w przeciwnym razie. Złamana kończyna nie wydłuża się normalnie.Pierwszym krokiem było opracowanie dokładniejszego modelu mysiego, aby przetestować nowe terapie i określić mechanizm działania. Konwencjonalne metody leczenia polegają na resekcji mostu kostnego po urazie i wprowadzeniu materiałów interpozycyjnych, takich jak tkanka tłuszczowa. Metody te nie regenerują chrząstki płytki wzrostowej i często wymagają dodatkowych operacji.Jednak nowe podejścia inżynierii tkankowej, które obecnie testujemy, obejmują zlokalizowane cząsteczki, które przyspieszają regenerację chrząstki, jednocześnie zapobiegając tworzeniu się mostów kostnych. Modele zwierzęce są niezbędne do testowania podejść inżynierii tkankowej do regeneracji uszkodzonej chrząstki płytki wzrostowej. Istnieją kompromisy między precyzją a kosztami.Większe zwierzęta, takie jak owce, oferują większą precyzję i spójność w modelowaniu urazów, ale są znacznie droższe niż mniejsze zwierzęta, takie jak myszy. Celem naszych wysiłków jest zrozumienie komórkowych podstaw tej odpowiedzi tkankowej, która nastąpiła po uszkodzeniu płytki wzrostowej. Korzystając z naszych trójkolorowych myszy fluorescencyjnych, jesteśmy w stanie zmapować komórki, które emitują te kolory, wraz z innymi barwnikami fluorescencyjnymi i minerałami somatycznymi z przeciwciał, i zmapować je z powrotem do znajomej barwie chromogennej.To pozwala nam docenić dynamikę naprawy i zidentyfikować komórki, które są odpowiedzialne za tę odpowiedź tkankową. Natywna fluorescencja przerostowych chondrocytów u tych młodych myszy transgenicznych pozwala badaczowi na podstawie obrazowania na żywo precyzyjnie stworzyć klinicznie istotne uszkodzenie płytki wzrostu, które naśladuje uraz dziecka. Ponadto chrząstka stawowa pozostaje nieuszkodzona, a obszerne odczynniki dostępne do badań mechanistycznych na myszach mogą być wykorzystane.Na początek ułóż trzy znieczulone myszy równolegle na brzuchu w komorze rentgenowskiej. Rozchyl nogi myszy tak, aby kości piszczelowe nie były pod nimi zasłonięte. Aby zarejestrować początkową długość kończyny, umieść nieprzepuszczającą promieni rentgenowskich skalę w pobliżu myszy i wykonaj obrazowanie rentgenowskie z napięciem 26 kilowoltów i 800 miliamperów, aby uchwycić ich obrazy piszczeli.W gabinecie chirurgii dla zwierząt zmontuj elektroniczny szybki system wiercenia dentystycznego. Podłącz elektroniczny sterownik nożny i rękojeść do jednostki sterującej i przykryj przewód rękojeści skarpetami z rurki barierowej zdezynfekowanej powierzchni. Ustaw sterownik na przełożenie napędu jeden do jednego z maksymalną prędkością 30 000 obrotów na minutę.Następnie umieść elastyczny wąż maszynowy z izofluranem pokryty zdezynfekowaną rurką na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego stereo. Na początek określ początkową długość kończyny myszy za pomocą obrazowania rentgenowskiego. Przymocuj sterylne okrągłe wiertło dentystyczne o średnicy 0,5 milimetra do rękojeści i wybierz inne potrzebne narzędzia chirurgiczne.Po znieczuleniu zwierzęcia należy natychmiast podać podskórnie połowę przepisanej dawki buprenorfiny. Nałóż smar do oczu, aby chronić oczy myszy przed wysuszeniem i przenieś mysz w pozycji leżącej na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Zdezynfekuj kolejno prawą tylną kończynę, okolicę miednicy, przednią część lewej tylnej kończyny i ogon jodopowidonem, a następnie 70% etanolem.W jasnym świetle oświetlonym za pomocą skalpela numer 15 wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie skóry tuż pod stawem kolanowym, aby odsłonić proksymalny koniec prawej kości piszczelowej. Utrzymuj lewą przeciwległą kość piszczelową nieuszkodzoną, aby służyła jako wewnętrzna nieuszkodzona kontrola. Następnie, używając tylnej strony ostrza skalpela numer 15, wykonaj pionową sekcję przez leżący mięsień u bliższej części kości piszczelowej, usuwając tkankę miękką w celu wyraźnego odsłonięcia głowy piszczelowej.Po wyłączeniu świateł w sali operacyjnej wybierz odpowiedni kanał fluorescencyjny, aby oświetlić żądany obszar płytki wzrostowej. Następnie dostosuj otwór skóry myszy nieco bardziej proksymalny, a następnie dystalny, aby upewnić się, że widoczny jest przerostowy obszar płytki wzrostowej kości piszczelowej, a nie płytki wzrostu kości udowej. Aby utworzyć zmianę podobną do zmiany typu II Saltera-Harrisa, umieść 0,5-milimetrowe wiertło dentystyczne pośrodku strefy przerostowej płytki wzrostu.Utrzymuj wiertło i kończynę równolegle do powierzchni roboczej, tak aby ścieżka wejściowa wiertła nie była pod kątem w nasadę ani nie przechodziła przez całą miękką płytkę wzrostową. Naciskaj pedał wiertła, aby zainicjować obrót wiertła i delikatnie wciśnij wiertło w płytkę wzrostową, zatrzymując się, zanim wada wejdzie głębiej niż średnica wiertła. Przepłukać miejsce zmiany kroplą sterylnego PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.Za pomocą sondy periodontologicznej upewnij się, że głębokość wad wynosi 0,5 milimetra. Następnie ostrożnie wyrównaj krawędzie skóry. Następnie zastosuj technikę przerywanego szycia za pomocą szwów z kwasem poliglikolowym 5-0, aby uszczelnić nacięcie skóry.W celu wypreparowania tkanek należy odizolować obie nienaruszone kończyny tylne od zwierzęcia poddanego eutanazji oraz usunąć skórę i mięsień z obszaru kości i torebki kolana. Następnie za pomocą mikronożyczek preparacyjnych ostrożnie wytnij rzepkę. Użyj strzykawki insulinowej o rozmiarze 29, aby dokładnie rozprowadzić zimną 10% buforowaną formalinę we wszystkich obszarach jamy kolana.Na koniec odetnij obszar trzonowy kości udowej i piszczelowej, aby poprawić dostęp utrwalający do przestrzeni szpiku. Przywiąż tkankę stawową gazą do cienkiego kołka. Umieść tylne kończyny w utrwalaczu i umieść tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby utrzymać ją w całkowicie rozciągniętej pozycji przez 24 do 36 godzin.Uszkodzone piszczele wykazywały zmniejszony wzrost długości w porównaniu z nieuszkodzonymi kontrolami po trzech tygodniach od operacji w przekrojach 2D kości. Uszkodzone płytki wzrostowe wykazywały przerwanie strefy przerostowej i prowizorycznie zwapniałą warstwę z niewielkimi tylko zaburzeniami w strefie proliferacyjnej. Tworzenie się mostków kostnych w uszkodzonych płytkach wzrostowych było konsekwentnie obserwowane u wszystkich sześciu myszy, a większość z nich uformowała się w pobliżu środka płytki wzrostu, pomimo podejścia bocznego.Podejście oparte na fluorescencji wielobarwnej umożliwiło szczegółowe zbadanie różnicowania chondrocytów w obrębie mostka kostnego.

tricolor-transgenic-murine-model-for-studying-growth-plate-injury

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ilościowy pomiar funkcji progenitora kości w gojeniu złamań wymaga technologii obrazowania seryjnego o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiono protokoły wykorzystujące mikroskopię przyżyciową i śledzenie linii kostnych w celu sekwencyjnego obrazowania i ilościowego określenia migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych / progenitorowych w procesie naprawy złamań kości.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do naśladowania poważnych uszkodzeń kości w badaniach biomedycznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, ustalenie ustabilizowanych zmian kostnych u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W tym artykule opisujemy prostą metodę ustalania i analizowania eksperymentalnych wad kości udowej u myszy.

Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Przedstawiamy protokół do preparowania i hodowli embrionalnych kości śródstopia z dnia 15 (E15). Ten wysoce fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego ex vivo zapewnia warunki bliższe sytuacji in vivo niż komórki w hodowli jednowarstwowej lub 3D i jest niezbędnym narzędziem do badania wzrostu i rozwoju kości.

Hodowla mysich embrionalnych kości śródstopia: fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Płytka wzrostu to obszar chrzęstny w kościach długich dzieci, gdzie występuje wzrost podłużny. Po zranieniu może powstać tkanka kostna i upośledzać wzrost. Opisujemy szczurzy model uszkodzenia płytki wzrostowej, który prowadzi do naprawy tkanki kostnej, umożliwiając badanie mechanizmów naprawczych i strategii regeneracji płytki wzrostowej.

Model uszkodzenia płytki piszczelowej szczura w celu scharakteryzowania mechanizmów naprawczych i oceny strategii regeneracji płytki wzrostowej

Ta metoda opisuje użycie modelu myszy R26R-Confetti (Confetti) do badania zmineralizowanych tkanek, obejmując wszystkie etapy od strategii hodowlanej do pozyskiwania obrazów. Dołączony jest ogólny protokół, który można zastosować do wszystkich tkanek miękkich oraz zmodyfikowany protokół, który można zastosować do tkanek zmineralizowanych.

Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Ten protokół opisuje wykrywanie migracji komórek macierzystych okostnej szkieletu za pośrednictwem CCL5 w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii intravital żywych zwierząt.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Ten protokół ustanawia model pełnogrubych wad chrząstki (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej szczurów i mierzenie późniejszego zachowania bólowego i zmian histopatologicznych.

Opracowanie i ocena szczurzego modelu ubytków chrząstki pełnej grubości

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Poznaj trójkolorowy model transgeniczny myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej. Wykorzystuje fluorescencyjne markery do mapowania odpowiedzi komórkowych podczas gojenia i testowania nowych terapii.

Trójkolorowy transgeniczny model myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej

Przeglądaj więcej filmów