Name: Ocena cech strukturalnych Triticum aestivum i Zea mays dla różnicowania fotosyntetycznego C3 i C4 przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Poznaj różnice anatomiczne między liśćmi C3 i C4 u Triticum aestivum i Zea mays przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich. Ta metoda pozwala badać efektywność fotosyntezy i odporność upraw na zmiany klimatu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają Program Unii Europejskiej H2020 (projekt GAIN4CROPS, GA nr 862087). Centrum Doskonałości AgroCropFuture Agroecology i nowe uprawy w przyszłych klimatach jest finansowane przez Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Estonii. Pragniemy podziękować profesor Evelin Loit-Harro za dostarczenie nasion T. aestivum i Z. mays, Pauli Palmet i Vaiko Vainola za pomoc w przygotowaniu przekrojów liści oraz João Paulo de Silva Souza za pomoc w analizie. Wszystkie obrazy zostały uzyskane z zakładu mikroskopii Estońskiego Uniwersytetu Przyrodniczego w ramach różnych projektów.

1. Warunki wzrostu roślin
<ol>
	<li>Wybrać pszenicę (Triticum aestivum L. Var. Pszenica ozima, "Fredis") i kukurydzę (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") jako reprezentatywne odpowiednio rośliny C3 i C4. Uprawiaj oba gatunki roślin w kontrolowanej przez środowisko komorze wzrostu z nasion.</li>
	<li>Utrzymuj wilgotność względną na poziomie 55% przy temperaturze powietrza 25 °C/18 °C (dzień/noc) przy 12-godzinnym okresie świecenia. Utrzymuj gęstość strumienia fotonów fotosyntetycznych (Q) na powierzchni rośliny na poziomie 1200 μmol/m2/s, aby odzwierciedlić ich naturalne warunki wzrostu. Uprawiaj wszystkie rośliny przy stężeniu CO2 w otoczeniu wynoszącym 400 μmol/mol.</li>
	<li>Podlewaj rośliny co 2dni wodą destylowaną i nawozić roztworem Hoaglanda 10 dni po wzejściu siewki. Hoduj rośliny w określonych warunkach przez 60 dni i używaj w pełni rozwiniętych liści do analiz mikroskopowych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i oglądanie sekcji z wolnej ręki
<ol>
	<li>Wybierz 3 dojrzałe, niestarzejące się liście z każdej rośliny i trzymaj je w wodzie destylowanej. Za pomocą nowej jednostronnej żyletki wykonaj jedno cięcie wyrównujące, aby utworzyć kąt prosty z powierzchnią skrzydła, aby zapewnić, że sekcje są przekrojami poprzecznymi prostopadłymi do powierzchni skrzydła.</li>
	<li>Umieść próbkę liścia na szklanej płytce na kawałku wosku dentystycznego, aby ustabilizować próbkę i uniknąć poślizgnięcia. Tnij, przesuwając ostrze prosto w dół na próbce liścia, aby czysto przeciąć komórki. Utrzymuj przekroje w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Zamontuj próbki na szkiełku podstawowym, umieszczając je na kropli wody i przykrywając szklanym szkiełkiem nakrywkowym do oglądania i obrazowania pod mikroskopem. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zobacz szkiełko pod złożonym mikroskopem świetlnym w powiększeniu 10x i 20x. Zapisz obrazy zgodnie z przewodnikiem po oprogramowaniu wraz z odpowiednią skalą.</li>
</ol>
3. Przygotowanie przekrojów półcienkich
<ol>
	<li>Wyciąć odcinki o wymiarach około 3 mm x 5 mm z obszarów międzyżebrowych wzdłuż nerwu środkowego z liści zarówno Z. mays, jak i T. aestivum na szklanej płytce, jak w kroku 2.2. Upewnij się, że długość ciętego odcinka biegnie wzdłuż słojów liścia.</li>
	<li>Umieścić materiał roślinny w strzykawce z 1 ml buforu utrwalającego (4% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym, pH = 6,9, Tabela 1).</li>
	<li>Trzymać strzykawkę pionowo, usunąć powietrze i trzymając palec na końcówce, pompować strzykawkę, aby wytworzyć podciśnienie. Powtarzać tę czynność, aż próbki znajdą się na dnie strzykawki, co wskazuje na pomyślną infiltrację.</li>
	<li>Przenieść zawartość strzykawki do oznaczonej szklanej fiolki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 48 godzin przed następnym krokiem (Tabela 2).</li>
	<li>Dla każdej fiolki delikatnie usunąć utrwalacz za pomocą pipety i dodawać bufor fosforanowy, aż próbka zostanie pokryta. Pozostaw na 30 min. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	<li>Usunąć bufor fosforanowy za pomocą pipety i dodawać tetratlenek osmu (UWAGA), aż próbka zostanie pokryta. Próbki i inna materia organiczna zmienią kolor na. Używaj podwójnych rękawiczek. Pozostaw na 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć poprzedni roztwór za pomocą pipety i zalać próbki wodą destylowaną. Pozostaw na 30 minut Powtórz ten krok 3 razy i użyj podwójnych rękawiczek.</li>
	<li>Usunąć poprzedni roztwór za pomocą pipety i przykryć próbki roztworem wody destylowanej i etanolu w proporcji 50/50. Pozostaw na 30 min. Powtórzyć ten krok z destylowanymi roztworami woda-etanol w następujących seriach: 30/70, 20/80, 10/90 i 2x przy 100 % etanolu. Próbki w każdym z tych roztworów można pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć poprzedni roztwór za pomocą pipety i przykryć próbki 1/3 roztworem żywicy i etanolu. Umieścić próbki na płycie mieszalnika i pozostawić na 2 godziny. Powtórzyć ten krok z roztworami żywicy i etanolu w następujących seriach: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 i 2x przy 100% żywicy. Próbki w każdym z tych roztworów można pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przykryj wnęki płaskiej formy do zatapiania (16 wgłębień, wymiary wnęki: 14 dł. x 4,8 szer. x 3 gł. (mm)) 100% żywicą i umieść próbki na jednym końcu wnęki. Przygotuj papierowe etykiety ołówkiem dla każdej próbki i umieść je na drugim końcu wnęki.</li>
	<li>Całkowicie wypełnij wszystkie wnęki 100% żywicą i wyprostuj próbki i etykiety, jeśli się przesunęły. Przykryj formę folią do zatapiania i polimeryzuj w piekarniku zgodnie z wytycznymi dotyczącymi żywicy akrylowej.</li>
	<li>Umieść spolimeryzowany blok z próbką w uchwycie na próbkę ultramikrotomu. Przytnij blok za pomocą szorstkiego noża do szkła, aż tkanka stanie się widoczna, a nadmiar żywicy zostanie usunięty.</li>
	<li>Półcienkie odcinki należy ciąć poprzecznie (1 μm) za pomocą noża szklanego lub diamentowego. Zbierz skrawki za pomocą metalowej pętli zaszczepiającej z powierzchni wody i umieść je na szklanym szkiełku. Wysuszyć szkiełko na płycie grzejnej (60 °C), aby przymocować sekcje do szkła.</li>
	<li>Zabarwić stałe sekcje błękitem toluidynowym (1% roztwór wodny) przez 5 sekund, a następnie spłukać wodą destylowaną i ponownie wysuszyć na płycie grzejnej. 
	UWAGA: Upewnij się, że proces utrwalania chemicznego odbywa się pod wyciągiem. Noże szklane należy okresowo wymieniać, aby zapewnić ostre cięcia, które pozwalają na uzyskanie sekcji bez rozdarć i zniekształceń.</li>
</ol>
4. Obrazowanie próbek
<ol>
	<li>Obrazowanie świeżych skrawków liści
	<ol>
		<li>Skonfiguruj złożony mikroskop świetlny z dołączonym oprogramowaniem zgodnie z instrukcją.</li>
		<li>Umieść szklane szkiełko na stoliku. Wyreguluj okular i view przekrój pod kątem 10x, aby uzyskać przegląd, a następnie przy obiektywach 20x i 40x.</li>
		<li>Przy każdym celu poruszaj się po kanale na żywo, skup się na obszarze zainteresowania i zlokalizuj komórki osłonki pęczka wokół żyły.</li>
		<li>Po ustawieniu fokusu kliknij przycisk Zamroź i dodaj skalę, naciskając przycisk Pasek skali na karcie Narzędzia. Zapisz obraz w programie . Format TIF do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie skrawków nasączonych żywicą
	<ol>
		<li>Zainstaluj automatyczny mikroskop świetlny w połączeniu z dołączonym oprogramowaniem na komputerze.</li>
		<li>Załaduj przezroczysty kanał i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Skoncentruj się na przekroju za pomocą 40-krotnego powiększenia obiektywu i dostosuj jasność, aby wszystkie struktury komórkowe były widoczne.</li>
		<li>Ustaw obszar lokalizacji sekcji za pomocą funkcji nawigatora, aby upewnić się, że cała sekcja jest zobrazowana, a następnie kliknij przycisk Zszyj.</li>
		<li>Kliknij Gotowe, a następnie Start, aby umożliwić mikroskopowi zobrazowanie całej sekcji. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i otwórz kafelki wykonane przez mikroskop.</li>
		<li>Korzystając z funkcji Wyrównaj, upewnij się, że kafelki nie zachodzą na siebie. Po wygenerowaniu obrazu dostosuj położenie, jasność i obrót za pomocą karty Dopasuj.</li>
		<li>Wydrukuj skalę na obrazie przed zapisaniem w programie . w formacie TIF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary anatomiczne za pomocą oprogramowania ImageJ
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie ImageJ i załaduj obraz, przeciągając go do okna.</li>
		<li>Za pomocą narzędzia Linia skalibruj skalę w następujący sposób: Narysuj linię nad podziałką liniową, wybierz opcję Analizuj > Ustaw skalę, zmień znaną odległość na długość podziałki liniowej i zmień jednostkę długości na odpowiednią jednostkę.</li>
		<li>Zmierz potencjalną cechę, wybierając narzędzie Linia, rysując linię w poprzek obszaru zainteresowania i naciskając M.</li>
		<li>Aby dokonać pomiarów powierzchni, wybierz narzędzie Zaznaczanie wielokątów i obrysuj interesującą Cię tkankę. Zakończ, naciskając M. Pomiary są wyświetlane jako wyskakujące okienko, które można skopiować do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Microscopical Analysis for Enhancing Photosynthetic Efficiency in C4 Crops

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym artykule omawiamy zarówno ilościowe, jak i jakościowe metody pomiaru anatomii liści oraz sposoby ich optymalizacji. Ponadto metodologię tę stosuje się do reprezentatywnych gatunków roślin uprawnych w celu określenia, które cechy anatomiczne są najbardziej przydatne w rozróżnieniu przekrojów C3 i C4 . Zrozumienie tych cech jest niezbędne, ponieważ gatunki hybrydowe, określane jako fotosyntezaC2 , stają się coraz bardziej obiecującą drogą badań. Do tej pory zidentyfikowano tylko jeden gatunek roślin uprawnych, Diplotaxis tenuifolia (rukola ), który wykorzystuje fotosyntezę C2 , ale jest prawdopodobne, że jest ich więcej niż wskazują obecne dane25. Wysoki poziom wewnątrzgatunkowej różnorodności i plastyczności fotosyntetycznej występuje w liniach C2 . Oznacza to, że potwierdzenie wystąpienia fotosyntezyC2 wymaga wielu linii dowodowych, takich jak punkt kompensacji CO2 , analizy ultrastrukturalne i immunohistochemia30.
Odręczne i półcienkie przekroje są używane do identyfikacji i pomiaru określonych tkanek roślinnych od wielu lat, ale niniejszy artykuł ma na celu omówienie szczególnego przypadku użycia anatomicznych struktur liści, które wpływają na fotosyntetyczne różnicowanie między roślinami uprawnymi C3 i C4 . Istnieją zastrzeżenia dotyczące zarówno przekroju odręcznego, jak i półcienkiego, które należy wziąć pod uwagę. Sekcje z wolnej ręki, choć szybkie do uzyskania, mogą skutkować niespójnymi grubościami skrzydeł, co utrudni analizy ilościowe. Można tego uniknąć, stosując specjalistyczny sprzęt do cięcia świeżego materiału roślinnego (np. wibratorom lub kriostat). Grubsze sekcje z ręcznego cięcia mogą powodować powstawanie wielu warstw komórek jedna na drugiej, rozmywając komórki, a tym samym anatomię. Jeśli cel przekroju jest czysto jakościowy, przekroje odręczne mają tę zaletę, że są przeznaczone do chemicznej obróbki tkanek roślinnych (tj. histochemii)31. Pozwala to na jakościowe wskazanie obecności poszczególnych związków w komórkach roślinnych. I odwrotnie, sekcje półcienkie prawie zawsze skutkują konsekwentnie grubymi sekcjami. Procesy są jednak dłuższe, delikatne, a przez to podatne na błędy. Problemy, które mogą się pojawić, a także sposoby ich unikania, są omawiane dalej.
Ustalające Świeży materiał musi być używany zarówno do odcinków odręcznych, jak i półcienkich, tj. liści roślin, które są wystarczająco nawodnione. Skrawki zwiędłych liści nie mają integralności strukturalnej, ponieważ komórki mają zmniejszone ciśnienie turgoru. W przypadku uzyskiwania półcienkich odcinków z materiału zatopionego w żywicy bardzo ważne jest, aby upewnić się, że sekcje skrzydła są zamocowane w próżni, aby zastąpić powietrze wewnątrz skrzydła. Pozwala to na zachowanie integralności strukturalnej i osmozy podczas procesu infiltracji. Jeśli ten krok nie zostanie wykonany prawidłowo, komórki prawdopodobnie zapadną się, co doprowadzi do przekrojów, które nie oddają dokładnie rzeczywistej struktury liścia, a następnie do nieprawidłowych pomiarów anatomicznych32.
I odwrotnie, wysokie ciśnienie podciśnienia może uszkodzić liście z tkankami miękkimi (takimi jak liścienie), powodując skurczenie się komórek lub zniszczenie próbek. Można tego uniknąć, stosując odpowiednie ustawienie pompy próżniowej lub całkowicie ją pomijając i po prostu mocząc próbki w roztworze utrwalającym. Jeśli to ostatnie jest preferowane, próbki można ciąć ze wszystkich stron, aby ułatwić infiltrację utrwalacza do tkanki.
Wstępna infiltracja Grubość ściany komórkowej i tkanka sklereidowa są najbardziej wpływowymi cechami anatomicznymi na przenikanie roztworów, które pozwalają na optymalne utrwalenie i infiltrację próbki. Zadaniem sklereidów w tkance roślinnej jest mechaniczne wsparcie i ochrona, które mogą wpływać na proces infiltracji33. Ponieważ tkanki te mają silnie pogrubione, zdrewniałe ściany komórkowe, przenikanie roztworów może być utrudnione. Próbki, które mają problemy z infiltracją, skutkują półcienkimi skrawkami z popękanymi komórkami i rozdarciami żywicy (ryc. 5C,D). Przekrój podłużny powoduje zniekształcenie komórek, powodując odchylenia w analizach anatomicznych i pomiarach cech liści, takich jak rozmiar komórki i gęstość komórek (ryc. 5F-H).
Infiltracja żywicy Wysokiej jakości przekroje mają zasadnicze znaczenie dla obserwacji tkanek anatomicznych, na które bezpośredni wpływ ma pożywka, w której osadzona jest próbka. Najczęstszymi podłożami do zatapiania stosowanymi w histologii roślin są parafina, wosk, żywice epoksydowe i akrylowe34,35. Osadzanie w wosku wymaga przygotowania próbek za pomocą chemicznego utrwalacza i infiltracji płynnym woskiem, który utwardza się w temperaturze pokojowej. Cięcia te zazwyczaj skutkują sekcjami o grubości 5-10 μm, które, jak pokazano tutaj, można równie dobrze uzyskać ręcznie (rysunek 2) i wymagają one jedynie nieutrwalonej świeżej tkanki. W tym przypadku rozmieszczenie komórek wokół osłony wiązki ma zasadnicze znaczenie dla rozróżnienia roślin C3 i C4, co wymaga użycia bardziej wytrzymałych i sztywnych pożywek do zatapiania. W tym badaniu przetestowano żywicę epoksydową (żywica Spurra36) i żywicę akrylową (LR White) zarówno pod kątem twardości, trwałości, infiltracji próbki, jak i trwałości cięcia. Żywica epoksydowa jest stosowana do zatapiania materiału biologicznego od dziesięcioleci37 lat. Żywice akrylowe są stosunkowo nowe i początkowo były brane pod uwagę do osadzania próbek roślin ze względu na ich odporność w czasie, ponieważ w przeciwieństwie do żywic epoksydowych nie odbarwiają się w wyniku ekspozycji na promieniowanie UV i są mniej podatne na kurczeniesię 38. Żywica akrylowa LR White (twarda) została wybrana ze względu na jej nietoksyczność i formułę odporną na promieniowanie UV. Żywice akrylowe są zwykle znacznie mniej lepkie niż żywice epoksydowe, co pozwala na szybszą infiltrację próbki, a twardość materiału pozwala na czystsze cięcie za pomocą mikrotomu39. Rysunek 5C,D przedstawia wyniki żywicy epoksydowej w próbkach liści z dużą ilością tkanki strukturalnej, gdzie rozdarcia są nieuniknione ze względu na miękkość żywicy epoksydowej w porównaniu z żywicą akrylową (ryc. 3).
Ultramikrotomia Odcięcie nadmiaru żywicy może spowodować pęknięcia żywicy, które wnikną do próbki. Aby tego uniknąć, należy wziąć pod uwagę gęstość i kruchość żywicy wybranej do zatapiania. Głębsze cięcie sekcji powinno unikać wszelkich artefaktów spowodowanych ręcznym lub szorstkim przycinaniem nożem. Próbka powinna być ustawiona prostopadle do uchwytu próbki i zwalidowana poprzez zwiększenie powiększenia przez okular, a także obejrzenie stałego i zabarwionego przekroju. Komórki roślinne, które nie są przecięte pod idealnie prostym kątem, wyglądają jak komórki stożkowe, w których jeden koniec jest większy niż drugi40.
Po barwieniu Błękit toluidynowy (1% w roztworze wodnym) użyto do barwienia półcienkich odcinków wyciętych na ultramikrotomie. Jeśli plama zostanie pozostawiona do wyschnięcia na przekroju zbyt długo, spowoduje to nadmierne przebarwienie, powodując przesycenie przekroju podczas obrazowania (Rysunek 5A). Gdy plama nie jest dobrze filtrowana, powoduje to wysychanie nierozpuszczonych cząstek na przekroju, co utrudnia wizualizację struktur anatomicznych (ryc. 5B). Tego problemu można uniknąć, stosując dokładny filtr podczas sporządzania roztworu błękitu toluidynowego, a także ograniczając ekspozycję przekroju na plamę. Próbki suszy się na gorącej płycie w temperaturze 60 °C przed barwieniem, aby upewnić się, że wycinek wiąże się ze szklanym szkiełkiem mikroskopowym, ale nie powinny być wystawione na działanie błękitu toluidynowego przez więcej niż 10 sekund przed spłukaniem i ponownym wysuszeniem41.
Rozważania na temat pomiarów anatomicznych Pomiary przedstawione w tym artykule są tylko przykładem wielu cech anatomicznych, które można ocenić ilościowo za pomocą półcienkich odcinków, w tym ułamka międzykomórkowej przestrzeni powietrznej, średniej grubości mezofilu (bez tkanki naczyniowej) i powierzchni mezofilu wystawionej na międzykomórkowe przestrzenie powietrzne na jednostkę powierzchni liścia42. Jednakże, podczas gdy wielkość komórki osłonki pęczka Hisa jest ważnym wskaźnikiem różnicowania metabolizmu C3 i C4, grubość ściany komórkowej osłonki pęczka Hisa jest kolejną ważną cechą, której nie można zobaczyć na podstawie samej mikroskopii świetlnej, ponieważ określa stopień nieszczelności komórek osłonki pęczka Hisa, tj. ilość CO2 dyfunduje z powrotem do komórek mezofilu42, Lokal mieszkalny 43. Wysoka nieszczelność zmniejsza wydajność fotosyntezy, ponieważ duża część energii zużywanej do wiązania CO2 przez karboksylazę PEP jest tracona 44,45,46. Do takich analiz ultrastrukturalnych wymagana jest transmisyjna mikroskopia elektronowa i analizy obrazu. Chociaż w niniejszym badaniu rozważano tylko mikroskopię świetlną, protokół obejmuje leczenie tetratlenkiem osmu, środkiem kontrastującym i utrwalającym, który jest kamieniem węgielnym mikroskopii TEM. Spolimeryzowane próbki mogą być zatem nadal wykorzystywane do analizy TEM, gdy tylko zajdzie taka potrzeba, nawet jeśli nie są brane pod uwagę w momencie przygotowania.
Chociaż diagnostyka anatomiczna może łatwo wykryć struktury podobne do Kranza, obecność C4 można dodatkowo zdiagnozować za pomocą pomiarów wymiany gazowej, które mogą wykazać typową fizjologię C4, tj. niski punkt kompensacji CO2 , ograniczone hamowanie O2 fotosyntezy i różny skład izotopów węgla2,4,47.
Należy również zauważyć, że anatomia Kranza nie jest konieczna do rozwoju fotosyntezy C4, jak wykazało odkrycie jednokomórkowych roślin C4 48,49,50. Sama analiza anatomiczna może zatem nie wystarczyć do wykrycia fizjologii C4 u mniej badanych taksonów. Połączenie charakterystyki anatomicznej z analizą fizjologiczną oferuje potężne narzędzia do badania cech liści i ich relacji struktura-funkcja zarówno u roślin uprawnych, jak i dziko rosnących.

Fotosynteza to podstawowy proces, w którym energia świetlna jest przekształcana w energię chemiczną, służąc jako kamień węgielny naziemnych sieci troficznych. Większość roślin podąża szlakiem fotosyntezyC3, w którym głównym produktem fotosyntezy jest trójwęglowy związek glicerynianu 3-fosforanu. Fotosynteza C3 wyewoluowała ponad 2 miliardy lat temu w atmosferze obfitującej w CO2 i niskiej w O21. Kluczowy enzym fotosyntetyczny karboksylaza/oksygenaza rybulozo-1,5 bisfosforanu (Rubisco), który wyewoluował w tych warunkach, jest nieoptymalny dla obecnych warunków niskiego poziomu CO2 i wysokiego O2 , ponieważ konkurencyjnie reaguje z O2, inicjując fotooddychanie2. Fotooddychanie to marnotrawna ścieżka, która zużywa energię zamiast ją wytwarzać i uwalniać CO2 jako produkt uboczny. W związku z tym ważne jest, aby utrzymać wysokie stężenie CO2 wokół Rubisco w chloroplastach, aby zapobiec natlenieniu3,4. Ze względu na niezdolność roślin C3 do koncentracji CO2 dochodzi do znacznego spadku CO2 z otaczającego powietrza do chloroplastów, co ogranicza fotosyntezę i wpływa na wzrost roślin i produkcję biomasy2,5,6.
W roślinach C3 fotosynteza jest ograniczona przez wejście CO2 przez aparaty szparkowe, jego dyfuzję przez mezofil i aktywność biochemiczną enzymów fotosyntetycznych. Wnikanie CO2 jest najpierw ograniczone przez przewodność szparkową, która jest kontrolowana przez warunki środowiskowe, takie jak temperatura i wilgotność powietrza. Następnie CO2 dyfunduje przez wewnętrzną fazę gazową i ciekłą liścia do Rubisco7. W roślinachC3 wszystkie etapy fotosyntezy zachodzą w chloroplastach komórek mezofilu, a rośliny muszą utrzymywać stały napływ CO2 z atmosfery do chloroplastów. Zależność dostępności CO2 w chloroplastach od otwartości aparatów szparkowych, architektury mezofilu oraz indywidualnych cech komórek i chloroplastów sprawia, że rośliny są podatne na ograniczenia środowiskowe, które ostatecznie wpływają na fotosyntezę, takie jak niska dostępność wody i wysokie temperatury7,8,9,10, szczególnie podkreślając ich podatność na warunki związane ze zmianami klimatu11.
Biorąc pod uwagę wyzwania wynikające z nieefektywności szlaku C3, jak również ograniczenia w utrzymaniu optymalnego poziomu CO2 i podatności na czynniki środowiskowe, w niektórych roślinach rozwinął się inny szlak, szlak fotosyntezy C4. Charakterystyczne jest, że rośliny C4 mają dwa przestrzennie oddzielone szlaki biochemiczne; początkowe wiązanie CO2 zachodzi w komórkach mezofilu przez karboksylazę fosfoenolopirogronianową, która ma większe powinowactwo do CO2 niż Rubisco, a także nie ma aktywności natleniającej. Utworzony produkt C4 jest dalej transportowany do komórek osłonki wiązki, gdzie jest dekarboksylowany, a CO2 jest ponownie uwalniany i utrwalany przez Rubisco (fotosynteza C3) 12,13,14. Większe powinowactwo karboksylazy PEP do CO2 i grube ściany komórkowe komórek osłonki pęczka Hisa pozwala na stężenie CO2 w komórkach osłonki pęczka His, a tym samym roślinyC4 minimalizują fotooddychanie poprzez przestrzenną segregację wiązania CO2 i cyklu Calvina. Przyjęcie ścieżki C4 pokazuje adaptacyjną reakcję natury na ograniczenia środowiskowe, oferując wgląd w potencjalne strategie poprawy wydajności i odporności upraw w zmieniających się warunkach klimatycznych15.
Wyspecjalizowana anatomia struktury liści w roślinach C4 charakteryzuje się żyłami otoczonymi powiększonymi komórkami osłonki pęczka krwionośnego zawierającymi chloroplasty oraz promienistym układem komórek mezofilu w zewnętrznym pierścieniu tworzącym wzór wokół komórek osłonki pęczka His. Komórki mezofilu znajdują się w bliskiej odległości od komórek osłonki pęczka Hisa, co umożliwia szybki i ciągły transport metabolitów między dwoma typami komórek. Układ tej komórki jest typowy dla roślin C4 i jest określany jako Kranz anatomy16. U gatunkówC3 specjalizacja i rozmieszczenie komórek mezofilu mogą się różnić, ale komórki osłonki pęczka Hisa są wyraźnie mniejsze i mają kilka chloroplastów lub w ogóle nie mają chloroplastów. Specyficzna anatomia Kranza pozwala na koncentrację CO2 w chloroplastach w komórkach osłonki pęczka His, w których znajduje się enzym 3-karboksylujący C Rubisco, skutecznie utrudniając fotooddychanie4, 17, 18. Pomimo pozornie złożonego układu, zmiany te zachodziły niezależnie od siebie wiele razy w ewolucji roślin okrytozalążkowych, co wskazuje, że jest to stosunkowo realna ścieżka ewolucyjna19,20,21, a różne taksony okazały się znajdować na pośrednim etapie między metabolizmem węgla C3 i C4, określanym jako C3-C 4 lub C2, posiadający zdolność koncentracji i ponownego przyswojenia CO222,23,24,25.
Wiele roślin C4 to uprawy o dużym znaczeniu gospodarczym, a genetycznie modyfikowane uprawy C3, takie jak ryż, w celu poprawy ich odporności na zmiany klimatu i zabezpieczenia plonów były przedmiotem zainteresowania w ostatnich dziesięcioleciach26,27. Jednak wysiłki inżynieryjne wymagają szczegółowego zrozumienia wyspecjalizowanej anatomii C4 i tego, jak kontroluje ona fotosyntezę2,28.
Ustanowienie anatomii Kranza C4 jest warunkiem wstępnym do osiągnięcia ambitnego celu, jakim jest wprowadzenie fotosyntezy C4 do upraw C325. Jednak obecna wiedza na temat regulacji anatomii Kranza i metod szybkiego badania przesiewowego jej kluczowych cech anatomicznych jest ograniczona, co utrudnia identyfikację gatunków hybrydowych. Wcześniejsze badania wykazały, że kluczowe cechy regulujące wydajność fotosyntezy w roślinach C3 i C4 obejmują odległość międzynerwową, średnicę kompleksu osłonki pęczka Bun oraz rozmiar komórek osłonki pęczka Hisa14,29. Cechy te można łatwo przesiewać za pomocą przekrojów odręcznych i analizować ilościowo za pomocą przekrojów półcienkich. W tym miejscu opisano metodę oceny cech, które pozwalają na diagnostykę różnicowania anatomicznego C3 i C4 za pomocą swobodnej mikroskopii krzyżowej i świetlnej, a mianowicie obszar osłonki pęczka Hisa, odległość międzynerwowa i częstość żył.

<table><tbody><tr><td>Wodorofosforan disodowy dwuwodny (Na2HPO42H2O) czysty</td><td>PENTA, CZ</td><td>10028-24-7</td><td></td></tr><tr><td>Folia do zatapiania, grubość 7,8 mil, 8 x 12,5, (203 x 318mm)</td><td>ACLAR, US</td><td>10501-10</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, abs. 100% a.r.</td><td>Chem-Lab NV, BE</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Niebezpieczeństwo: Wysoce łatwopalna ciecz i pary.</td></tr><tr><td>System obrazowania EVOS Invitrogen FL Auto 2</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płaska forma PTFE z metalową ramą, 16 wnęk</td><td>PELCO, US</td><td>10501</td><td></td></tr><tr><td>Szklana fiolka 2 ml</td><td>VWR Life Science, US</td><td>548-0045</td><td></td></tr><tr><td>50% roztwór aldehydu glutarowego</td><td>VWR Life Science, US</td><td>23H2856331</td><td>Niebezpieczeństwo: Śmiertelne w przypadku wdychania. Działa toksycznie po połknięciu. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Nosić rękawice ochronne, odzież ochronną, ochronę oczu i twarzy.</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>Histo Diatome, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEICA EM UC7</td><td>Leica Wiedeń, AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LR Biała żywica twarda</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, US</td><td>14383</td><td>Niebezpieczeństwo: Powoduje podrażnienie skóry. Działa drażniąco na oczy Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może powodować senność lub zawroty głowy Nosić rękawice ochronne, odzież ochronną, ochronę oczu i twarzy.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Normax, PT</td><td>5470308A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600 i Nikon DS0Fi1 5 MP</td><td>Nikon Corporation, JP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide (OsO4)</td><td>Agar Scientific Ltd, GB</td><td>R1019</td><td>Niebezpieczeństwo: Śmiertelne w przypadku połknięcia, kontaktu ze skórą lub wdychania. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu Nosić podwójne rękawice ochronne, odzież ochronną, ochronę oczu i twarzy.</td></tr><tr><td>Pipety i końcówki do pipet</td><td>Thermo Scientific, FI</td><td>KJ16047</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu dwuwodny (NaH2PO4 . 2H2O) czysty</td><td>PENTA, CZ</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>Ecoject, DE</td><td>20010</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy, ogólnego przeznaczenia</td><td>Fisher Scientific, GB</td><td>2045836</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena cech strukturalnych triticum aestivum i zea mays dla różnicowania fotosyntetycznego c3 i c4 przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich

Assessing Structural Traits in Triticum aestivum and Zea mays for C3 and C4 Photosynthetic Differentiation Using Free-hand and Semi-thin Sections

Zwiększona wydajność fotosyntezy C4, w porównaniu do mechanizmu C3, wynika z jej zdolności do koncentracji CO2 w komórkach osłonki pęczka Hisa. Skuteczność fotosyntezyC4 i wewnętrzna efektywność wykorzystania wody są bezpośrednio związane z udziałem mezofilu i komórek liści pęczka Hisa, wielkością i gęstością osłonek pęczka Hisa oraz wielkością, gęstością i grubością ścianki komórkowej komórek osłonki pęczka Hisa. Szybka analiza mikroskopowa tych cech może być przeprowadzana na odręcznych i półcienkich skrawkach przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, dostarczając cennych informacji na temat wydajności fotosyntezy w uprawach C4 poprzez identyfikację i badanie określonych typów komórek. Dodatkowo pokazano błędy w przygotowaniu odręcznych i półcienkich przekrojów, które mają wpływ na pomiary anatomiczne i diagnozy typu komórki, a także sposoby uniknięcia tych błędów. To mikroskopowe podejście oferuje skuteczny sposób gromadzenia informacji na temat aklimatyzacji fotosyntetycznej do zmian środowiskowych i pomaga w szybkim badaniu przesiewowym upraw pod kątem przyszłych klimatów.

Rycina 1A przedstawia prawidłową orientację liścia podczas przygotowywania przekrojów zarówno do analizy na świeżo, jak i do mikroskopii świetlnej. Metodę wycinania świeżych przekrojów przy użyciu jednostronnej żyletki i arkusza wosku dentystycznego pokazano na Rycini 1B. Uzyskane przekroje przedstawiono na Rycini 1C.
Rysunek 2 przedstawia przekroje wykonane ręcznie reprezentatywnych liści rośliny C3 T. aestivum oraz rośliny C4 Z. mays. Wokół żyłki widoczne są komórki pochewki wiązkowej; u kukurydzy komórki te są bardziej okrągłe i zielone, co wskazuje na większą obecność chloroplastów. Na podstawie tych obrazów można wyznaczyć grubość liścia oraz całkowitą powierzchnię pochewek wiązkowych, jednak ta metoda nie pozwala na dalszą charakterystykę mezofilu.
Rysunek 3 przedstawia półcienkie przekroje poprzeczne T. aestivum oraz Z. mays. Dzięki tej metodzie wszystkie tkanki liścia są widoczne i mierzalne. W przypadku Z. mays widoczna jest anatomia Kranza, z komórkami mezofila rozmieszczonymi wokół żyłek. Pochwy wiązek są powiększone i wypełnione chloroplastami, które są wyraźnie skoncentrowane w stronę komórek mezofila. Umożliwia to szybką wymianę metabolitów pomiędzy komórkami pochwy wiązki a komórkami mezofila. Na podstawie tych obrazów zmierzono następujące cechy strukturalne liścia: odległość międzyżyłkową między małymi a dużymi żyłkami, średnicę pochwy wiązki, całkowitą powierzchnię pochwy wiązki, powierzchnię żyłek, frakcję powierzchni komórek pochwy wiązki, powierzchnię komórek pochwy wiązki, częstotliwość występowania żyłek na odcinku 500 µm oraz grubość liścia. Wykresy pudełkowe na Rysunku 4 pokazują różnice w tych cechach pomiędzy T. aestivum a Z. mays. Wszystkie cechy, z wyjątkiem jednej – odległości międzyżyłkowej między dużymi żyłkami – różnią się istotnie przy 95% przedziale ufności z wartością p &lt; 0,05.
Rysunek 4 przedstawia zestaw wykresów pudełkowych obrazujących różnice w cechach anatomicznych między T. aestivum a Z. mays, co egzemplifikuje różnice między strukturami pochew wiązkowych roślin C3 i C4. Występuje istotna różnica w odległościach międzyżyłkowych u badanych gatunków uprawnych, średnicy pochewy wiązkowej (w tych samych warunkach wzrostu), udziale komórek pochewy wiązkowej i materiału niefotosyntetycznego (tj. żyłek) oraz częstotliwości występowania żyłek w przekroju o szerokości 500 µm – wszystkie te parametry są silnymi wskaźnikami cech oczekiwanych dla anatomii liści roślin C3 i C4.
Rysunek 5 przedstawia przykłady błędów, które mogą wystąpić podczas cięcia lub przygotowywania próbek. Anatomia liścia na tych obrazach jest zamaskowana lub zniekształcona, przez co nie nadaje się do charakteryzacji. Do nadbarwienia błękitem toluidyny może dojść w przekrojach wykonanych ultramikrotomem, jeśli barwnik pozostanie w tkance zbyt długo, co prowadzi do zatarcia struktury komórkowej (Rysunek 5A,B). Częste błędy mogą pojawić się podczas protokołu infiltracji, gdy żywica nie przenika w pełni tkanek liścia (Rysunek 5C,D). Przekroje poprzeczne liścia wykonane wzdłuż włókien skutkują powstaniem wydłużonych komórek, w których nie można zlokalizować ani poprawnie zmierzyć komórek mezofilu i pochewki wiązkowej (Rysunek 5F,G,H).
Analizy statystyczne przeprowadzono w programie R (wersja 4.3.1) w celu utworzenia wykresów pudełkowych. Cechy anatomiczne liści mierzono w trzech powtórzeniach (3 liście na roślinę, 3 rośliny na gatunek).
<img alt="Proces krojenia liścia, schemat; przygotowanie próbki roślinnej, cięcie, ustawienie zlewki do analizy chemicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Prawidłowa metoda wykonywania poprzecznych przekrojów świeżych liści. (A) Orientacja przekrojów liścia w celu uzyskania przekroju poprzecznego. (B) Technika krojenia liści przy użyciu jednostronnego ostrza żyletki na kawałku płaskiego wosku dentystycznego. (C) Powstałe przekroje poprzeczne mają postać cienkich plastrów liścia, gotowych do zamocowania na szkiełku przedmiotowym i obserwacji pod mikroskopem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopowy obraz przekroju poprzecznego rośliny przedstawiający mezofyl i wiązki przewodzące w tkance bogatej w chlorofil." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przekroje ręczne reprezentatywnych liści. (A) Roślina C3 Triticum aestivum (powiększenie 400x); oraz (B) roślina C4 Zea mays przy (powiększeniu 200x). Typy komórek są zaznaczone strzałkami, gdzie V = żyłka, BSC = komórka pochewki wiązki, a MC = komórka mezofylu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat anatomii liścia z warstwami tkanek i układem naczyniowym, opisany przekrój poprzeczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Półcienkie przekroje poprzeczne. (A) Zea mays oraz (B) Triticum aestivum obrazujące różnice w pochewkach wiązek i położeniu chloroplastów u gatunków C4 z anatomią Kranza (A) oraz gatunków C3 bez anatomii Kranza (B). Skróty: Tl = grubość liścia, BS = pochewka wiązki, SV = mała żyłka, ID = odległość międzyżyłkowa, LV = duża żyłka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wykresów pudełkowych danych biologicznych; wyniki testu t; dziewięć zmiennych; porównanie T. aestivum i Z. mays." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wykresy pudełkowe przedstawiające różnice w cechach anatomicznych między Triticum aestivum a Zea mays. (A) odległość międzyżyłkowa między małymi żyłkami, (B) odległość międzyżyłkowa między dużymi żyłkami, (C) średnica pochewki wiązki, (D) całkowita powierzchnia pochewki wiązki, (E) powierzchnia żyłek, (F) ułamek powierzchni komórek pochewki wiązki, (G) powierzchnia komórek pochewki wiązki, (H) częstotliwość występowania żyłek w obrębie 500 µm oraz (I) grubość liścia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopowe przekroje poprzeczne tkanek roślinnych, barwione, podkreślona struktura komórkowa, skala 50-100µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przykłady typowych błędów, które mogą wystąpić podczas przetwarzania tkanek, wskazane czerwonymi strzałkami. Przebarwienie w próbkach zatopionych w żywicy akrylowej LR White (A) Triticum aestivum i (B) Zea mays; pęknięcia żywicy w skrawkach zatopionych w żywicy epoksydowej Spurra (C) Ceratozamia robusta i (D) Dioon mejiae; skrawki T. aestivum wykonane ręcznie, przedstawiające (E) przekrój poprzeczny i (F) przekrój podłużny; błąd w cięciu wynikający z ukośnych nacięć w (G) Annona muricata i (H) Encephalartos villosus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66843/66843fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór</td>
			<td colspan="3">Przygotowanie</td>
			<td>Objętość końcowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baza dla buforu 1</td>
			<td colspan="3">Rozpuścić 7,12 g Na2HPO4 · 2H2O w 200 ml wody destylowanej</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baza do buforu 2</td>
			<td colspan="3">Rozpuścić 7,12 g NaH2PO4 . 2H2O w 200 ml wody destylowanej</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór buforu fosforanowego</td>
			<td colspan="3">Wymieszać 36 ml Bazy 1, 14 ml Bazy 2 oraz 50 ml wody destylowanej</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór utrwalający</td>
			<td colspan="3">Wymieszać 9,25 ml 5% glutaraldehydu (ostrożnie: patrz tabela materiałów), 12,5 ml buforu fosforanowego oraz 28,25 ml wody destylowanej. Przechowywać w 4 °C.</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład roztworu utrwalającego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">Krok</td>
			<td colspan="6">Opis</td>
			<td>Czas trwania</td>
			<td>Powtórzenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">Płukanie buforem</td>
			<td colspan="6">Ostrożnie usunąć utrwalacz za pomocą pipety i dodać bufor fosforanowy, aż próbka zostanie całkowicie zakryta. Pozostawić na 30 min.</td>
			<td>30 min</td>
			<td>3x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">Barwienie 1% tlenkiem osmu</td>
			<td colspan="6">(Uwaga: patrz Tabela materiałów): Usunąć bufor fosforanowy za pomocą pipety i dodać tlenek osmu, aż próbka zostanie zakryta. Próbki oraz inne materie organiczne zabarwią się na czarno. Należy używać podwójnych rękawiczek.</td>
			<td>60 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">Płukanie próbek wodą destylowaną</td>
			<td colspan="6">Usunąć poprzedni roztwór za pomocą pipety i zakryć próbki wodą destylowaną. Pozostawić na 30 min. Powtórzyć ten krok 3x. Należy używać podwójnych rękawiczek.</td>
			<td>30 min</td>
			<td>3 razy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">Infiltracja serią etanolową</td>
			<td colspan="6">Usunąć poprzedni roztwór za pomocą pipety i zakryć próbki roztworem wody destylowanej i etanolu 50/50. Pozostawić na 30 min. Powtórzyć ten krok z roztworami wody destylowanej i etanolu w następującej serii: 30/70, 20/80, 10/90 oraz 100% etanolu.</td>
			<td>30 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">Infiltracja serią żywica-etanol</td>
			<td colspan="6">Usunąć poprzedni roztwór za pomocą pipety i zakryć próbki roztworem żywicy i etanolu w proporcji 1/3. Umieścić próbki na mieszalniku i pozostawić na 2 h. Powtórzyć ten krok z roztworami żywicy i etanolu w następującej serii: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 oraz 100% żywicy.</td>
			<td>120 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="6">Przechowywać w lodówce przez 72 h przed polimeryzacją</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="6">Przeprowadzić polimeryzację zinfiltrowanych przekrojów liści zgodnie ze specyfikacją produktu, aby uzyskać próbki zatopione w żywicy.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Protokół infiltracji żywicą.

Ocena różnic anatomicznych między przekrojami poprzecznymi liści C3 i C4 pomaga zrozumieć efektywność fotosyntezy. W artykule opisano przygotowanie i badanie przekrojów poprzecznych liści z wolnej ręki i półcienkiej, wraz z zastrzeżeniami dotyczącymi przygotowania dla gatunków roślin uprawnych Triticum aestivum i Zea mays.

Ocena cech strukturalnych Triticum aestivum i Zea mays dla różnicowania fotosyntetycznego C3 i C4 przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The ...

Nasze badania koncentrują się na relacjach funkcji struktury rośliny. Naszym celem jest lepsze zrozumienie ograniczeń fotosyntezy w różnych typach funkcjonalnych roślin oraz tego, jak można je poprawić w przypadku upraw odpornych na zmiany klimatu. Nowe technologie w oprogramowaniu są drogie i często niedostępne, co wymaga pewnego stopnia prób i innowacji, aby osiągnąć te same rozdzielczości w obrazowaniu różnych typów funkcjonalnych roślin.Identyfikacja struktur anatomicznych różnicujących liście C3 i C4, szczególnie u Triticum aestivum i Zea mays, a także rozwiązywanie problemów związanych z etapami przygotowawczymi do mikroskopii. Na początek uprawiaj gatunki pszenicy i kukurydzy w komorze wzrostu kontrolowanej przez środowisko. Wybierz trzy dojrzałe, niestarzejące się liście pszenicy i trzymaj je w wodzie destylowanej.Następnie umieść próbkę liścia na szklanej płytce na kawałku wosku dentystycznego, aby ustabilizować próbkę i uniknąć poślizgnięcia. Przesuń ostrze prosto w dół na próbce liścia, aby czysto przeciąć komórki i utrzymać przekroje w wodzie destylowanej. Aby zamontować próbki na szkiełku podstawowym, umieść je na kropli wody i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania mikroskopowego.Teraz obejrzyj szkiełko pod złożonym mikroskopem świetlnym w powiększeniu 10x i 20x. Zapisz obrazy zgodnie z przewodnikiem po oprogramowaniu wraz z odpowiednią skalą. Odręczne odcinki liści rośliny C3 Triticum aestivum i rośliny C4 Zea mays ujawniły, że komórki pochewki pęczka kukurydzy są bardziej okrągłe i zielone, co wskazuje na wyższą obecność chloroplastów.Zacznij od wycięcia odcinków z obszarów międzyżebrowych wzdłuż nerwu środkowego liści Triticum aestivum na szklanej płytce. Upewnij się, że długość ciętego odcinka biegnie wzdłuż słojów liścia. Następnie umieść materiał roślinny w strzykawce z jednym mililitrem buforu utrwalającego.Trzymać strzykawkę pionowo, usunąć powietrze i pompować strzykawkę, aby wytworzyć podciśnienie, trzymając palec na końcówce. Po wykonaniu pełnego protokołu infiltracji zgodnie z instrukcjami producenta żywicy, przykryj wnęki płaskiej formy do zatapiania 100% żywicą i umieść próbki na jednym końcu wnęki. Przygotuj papierowe etykiety ołówkiem dla każdej próbki i umieść je na drugim końcu wnęki.Wyprostuj próbki i etykiety, jeśli się przesunęły. Przykryj formę folią do zatapiania i polimeryzuj w piekarniku zgodnie z wytycznymi dotyczącymi żywicy akrylowej. Następnie umieść spolimeryzowany blok z próbką w uchwycie na próbkę ultramikrotomu.Za pomocą szorstkiego noża do szkła przycinaj blok, aż tkanka stanie się widoczna, a nadmiar żywicy zostanie usunięty. Następnie za pomocą noża szklanego lub diamentowego wytnij półcienkie odcinki poprzecznie. Za pomocą metalowej pętli do zaszczepiania zbierz skrawki z powierzchni wody i umieść je na szklanym szkiełku.Wysuszyć szkiełko na gorącej płycie, aby przymocować sekcje do szkła. Zabarwić stałe sekcje toluidyną na niebiesko przez pięć sekund. Półcienkie przekroje Triticum aestivum i Zea mays wykazały, że wszystkie tkanki liści były widoczne i mierzalne.Zea mays wykazywała anatomię Kranza z komórkami mezofilu wokół żył i wypełnionymi chloroplastami osłonkami pęczków rolnych ułatwiającymi szybką wymianę metabolitów. Po zabarwieniu przekroju liścia Triticum aestivum błękitem toluidynowym umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Korzystając z 40-krotnego powiększenia obiektywu, skup się na sekcji i dostosuj jasność, aby wszystkie struktury komórkowe były widoczne.Następnie użyj funkcji Nawigator, aby ustawić obszar lokalizacji sekcji, aby upewnić się, że cała sekcja jest zobrazowana, a następnie kliknij przycisk Zszyj. Następnie kliknij Gotowe i Uruchom, aby umożliwić mikroskopowi zobrazowanie całej sekcji. Otworzyłem oprogramowanie do analizy obrazu i płytki pobrane przez mikroskop.Korzystając z funkcji Wyrównaj, upewnij się, że kafelki nie zachodzą na siebie. Po wygenerowaniu obrazu dostosuj położenie, jasność i obrót za pomocą karty Dopasuj. Następnie wydrukuj skalę na obrazie przed zapisaniem go w formacie TIFF.Otwórz oprogramowanie ImageJ i przeciągnij obraz do okna, aby go załadować. Za pomocą narzędzia Linia narysuj linię nad podziałką liniową, wybierz opcję Analizuj i kliknij przycisk Ustaw skalę. Zmień znaną odległość do długości podziałki liniowej i jednostkę długości na właściwą jednostkę.Aby zmierzyć potencjalną cechę, wybierz narzędzie Linia, narysuj linię w poprzek obszaru zainteresowania i naciśnij M. Aby wykonać pomiary powierzchni, użyj narzędzia Zaznaczanie wielokątów, aby obrysować tkankę, która Cię interesuje, a następnie naciśnij M, aby zakończyć. Pojawi się wyskakujące okienko wyświetlające pomiary, które można skopiować do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy danych.Wykresy pudełkowe zilustrowały istotne różnice anatomiczne między Triticum aestivum i Zea mays, szczególnie w odległościach międzynerwowych, średnicy osłonki pęczka Bunka, frakcji komórek pochewki pęczka His, materiale niefotosyntetycznym i częstości występowania żył, odzwierciedlając oczekiwane różnice w anatomii liści C3 i C4.

assessing-structural-traits-triticum-aestivum-zea-mays-for-c3-c4

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Ten protokół opisuje prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut, która jest przydatna dla opornych tkanek roślinnych. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania anatomiczne i inne badania biologiczne, w tym hybrydyzację in situ (ISH).

Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

Kwantyfikacja podziału i ekspansji komórek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu całej rośliny. W tym miejscu przedstawiamy protokół obliczania parametrów komórkowych określających tempo wzrostu liści kukurydzy i podkreślamy wykorzystanie tych danych do badania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez kierowanie strategiami pobierania próbek specyficznymi dla danego etapu rozwoju.

Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays

Oferujemy nowatorską metodę poprawy kontrastu absorpcji promieniowania rentgenowskiego tkanki kukurydzy, odpowiednią do zwykłego skanowania metodą tomografii mikrokomputerowej. Na podstawie obrazów CT wprowadzamy zestaw procesów przetwarzania obrazów dla różnych materiałów kukurydzianych, aby skutecznie wyodrębnić mikroskopijne fenotypy wiązek naczyniowych kukurydzy.

Techniki fenotypowania w skali mikronowej wiązek naczyniowych kukurydzy w oparciu o rentgenowską tomografię mikrokomputerową

Ten protokół pozwala na przygotowanie przekrojów nasion zbóż (np. ryżu) do analizy morfologii bielma i granulek skrobi za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Przekroje poprzeczne dojrzałego ryżu (Oryza sativa L.) Ziarna do obrazowania w skaningowej mikroskopii elektronowej z wykorzystaniem końcówek do pipet jako wspomagania immobilizacji

Ta technika pozwala na szybkie i proste przygotowanie sekcji żywicy o rozmiarach całych nasion do obserwacji i analizy komórek, granulek skrobi i ciał białkowych w różnych regionach nasion.

Prosta metoda cięcia na sucho w celu uzyskania całego przekroju żywicy wielkości nasion i jej zastosowania

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Przedstawiono metodę taniego obrazowania roślin do pomiaru fenotypów, wraz z najlepszymi praktykami przechwytywania obrazów i potokiem analizy obrazu do ilościowego określania cech roślin. Metody te zastosowano do pomiaru fenotypów kukurydzy (Zea mays) w warunkach upałów, suszy i połączonego stresu abiotycznego.

Obrazowanie i analiza w celu ilościowego określenia fenotypów stresu abiotycznego kukurydzy (Zea mays)

Protokół ten przedstawia porównawczą metodę oceny cech szparkowych i naskórkowych u dwóch odrębnych gatunków za pomocą peelingów naskórnych, technik oczyszczania oraz analizy obrazowej wspomaganej przez AI. Celem jest umożliwienie wysokoprzepustowej, powtarzalnej ilościowej identyfikacji struktur komórkowych leżących u podstaw funkcji szparków szparkowych dla zastosowań rolniczych oraz szerokich badań roślinnych.

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Poznaj różnice anatomiczne między liśćmi C3 i C4 u Triticum aestivum i Zea mays przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich. Ta metoda pozwala badać efektywność fotosyntezy i odporność upraw na zmiany klimatu.

Ocena cech strukturalnych Triticum aestivum i Zea mays dla różnicowania fotosyntetycznego C3 i C4 przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich (Wideo) | JoVE Journal

Ocena cech strukturalnych Triticum aestivum i Zea mays dla różnicowania fotosyntetycznego C₃ i C₄ przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich

Przeglądaj więcej filmów