Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Aby komórka mogła funkcjonować i przetrwać po okresie stresu fizjologicznego, musi być w stanie zaspokoić zapotrzebowanie na energię wymaganą do przywrócenia homeostazy. W naszym laboratorium staramy się określić, w jaki sposób mitochondria reagują i dostosowują się do stresorów żywieniowych, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób mitochondria pośredniczą w ryzyku rozwoju choroby. Obecne metody badania bioenergetyki PBMC polegają na pomiarze wydolności oddechowej po dodaniu inhibitorów i rozprzęgaczy.

Metody te pomogły nam zrozumieć znaczące zmiany bioenergetyczne w PMBC w różnych stanach chorobowych. Potencjał błonowy jest niezbędny do syntezy ATP i reguluje procesy, takie jak strumień oddechowy, reaktywne formy tlenu i autofagia. Jednak nadal mamy ograniczoną wiedzę na temat tego, w jaki sposób oddychanie mitochondrialne i potencjał błonowy razem reagują na fizjologiczne stężenia substratów w PBMC.

Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na zintegrowaną analizę potencjału błony mitochondrialnej i zużycia tlenu w ludzkim PBMC w odpowiedzi na rosnące poziomy ADP. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie wrażliwości mitochondriów na zmianę zapotrzebowania na energię. Aby rozpocząć, zainstaluj komory o pojemności 0,5 mililitra w respirometrze O2k zgodnie z instrukcjami producenta.

Włącz instrument i podłącz go do dostarczonego oprogramowania w celu akwizycji danych. Umyj komory trzykrotnie wodą dejonizowaną. Zastąp wodę 0,54 mililitra MIR O-5 i całkowicie zamknij korki.

Po usunięciu nadmiaru buforu podnieść korki, aby umożliwić zrównoważenie tlenu w pomieszczeniu z tlenem w komorze. Umieść kolumnę w polu magnetycznym magnetycznego separatora komórek magnetycznych i umyj kolumnę trzema mililitrami RP-5. Ponownie zawiesić świeżo wyizolowaną komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej (PBMC) w 80 mikrolitrach RP-5 wraz z 20 mikrolitrami mikrogranulek anty-CD14.

Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozcieńczyć komórki jednym mililitrem RP-5 przed załadowaniem zawiesiny na kolumnę. Zbierz nieoznakowane komórki, które przepływają do 15-mililitrowej stożkowej rurki, oznaczonej jako przepływ przez jeden.

Umyj kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami RP-5, aby zebrać przepływ przez ciecz. Ostrożnie usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na nowej stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Po dodaniu pięciu mililitrów RP-5 wciśnij tłok do kolumny, aby zebrać zawartość do probówki.

Po odwirowaniu przepływu przez jedną probówkę powtórz etapy izolacji za pomocą mikrogranulek anty-CD3 z komórkami w celu uzyskania limfocytów T. Odwirować komórki zawierające limfocyty T CD3-dodatnie i monocyty CD14-dodatnie. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze RP-5.

Za pomocą hemocytometru określ stężenie komórek. Dodać 2,5 miliona monocytów i 5 milionów limfocytów T do nowych probówek wirówkowych. Zdegranuluj ogniwa i ponownie zawieś je w 20 mikrolitrach MIR O-5.

Zainstaluj czujniki fluorescencyjne i uruchom plik eksperymentalny na respirometrze O2k. Korzystając z zielonych czujników fluorescencyjnych LED z zestawem filtrów AMR, wyreguluj wzmocnienie fluorometru i intensywność na 1 000. Ustaw objętość komory na 0,5 mililitra.

I dostosuj układ, aby zobaczyć zarówno strumień tlenu, jak i fluorescencję TMRM. Gdy strumień tlenu się ustabilizuje, przeprowadź kalibrację tlenu w powietrzu zgodnie z protokołem producenta. Zamknij korki, aby uszczelnić komorę.

Za pomocą strzykawki Hamilton wstrzyknij 2,5 mikrolitra 0,05 milimolowego estru metylowego tetrametylorodaminy lub TMRM cztery razy. Skalibrować czujnik przepływu za pomocą sygnału fluorescencyjnego dla każdego wstrzyknięcia reprezentującego zero, 0,25, 0,5, 0,75 i 1,0 mikromola TMRM. Wstrzyknij 20 mikrolitrów MIR O-5, aby przeprowadzić ślepy eksperyment.

Po ustabilizowaniu się strumienia tlenu wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnał TMRM jako pre-komórkę. Wstrzyknąć 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej zawierającej komórki i odmierzać przez około 10 minut. Następnie wybierz i oznacz zarówno strumień tlenu, jak i sygnały TMRM jako komórki.

Następnie powtórz kroki dla każdego zabiegu sekwencyjnie i odpowiednio oznacz strumień tlenu i sygnał TMRM. Gdy strumień tlenu się ustabilizuje, wstrzyknij jeden mikrolitr 1,25 milimolowej antymycyny A, aby zahamować oddychanie mitochondrialne. Dla każdego ślepego eksperymentu ustaw stężenie TMRM przed próbką na jeden, aby obliczyć współczynnik tła.

Oblicz późniejszy proporcjonalny spadek TMRM i średni współczynnik tła ze wszystkich ślepych eksperymentów. Następnie pomnóż TMRM przed próbką eksperymentu z próbką przez średni stosunek tła dla każdego wstrzyknięcia każdego eksperymentu z próbką. Odejmij tło eksperymentu od zmierzonych wartości TMRM próbki.

Następnie odejmij skorygowany potencjał błony mitochondrialnej FCCP od każdego wstrzyknięcia. Aby znormalizować spadek zależny od ADP, ustaw najwyższy i najniższy potencjał błony odpowiednio na 100% i 0%. I dopasuj dane do nieliniowego modelu regresji dopasowania.

Badania porównawcze zmian w limfocytach T i monocytach od zdrowych ochotników wywołanych przez ADP wykazały, że monocyty wykazywały większą utratę potencjału błony mitochondrialnej w porównaniu z limfocytami T. Połowa maksymalnego hamującego stężenia ADP na potencjale błony mitochondrialnej była niższa dla monocytów w porównaniu z limfocytami T. Typowy wzrost wskaźników zużycia tlenu w odpowiedzi na dawkę z ADP nie został wykryty w żadnym typie komórki.