ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom Barna Lab za pomocne dyskusje.

1. hodowla komórek mESC
UWAGA: Przed aktywacją ALIBi i lizą komórki mESC należy obsługiwać stosując standardową sterylną technikę hodowli komórek. Wirowanie nietkniętych komórek mESC powinno odbywać się w warunkach 200 × g przez 3 min w temperaturze pokojowej, o ile nie określono inaczej. Przed użyciem nagrzewać media do 37 °C w kąpieli wodnej, o ile nie określono inaczej. Komórki mESC należy przesadzać do świeżej płytki hodowlanej pokrytej żelatyną na noc (patrz krok 1.1).
<ol>
	<li>Na dzień przed rozmrożeniem komórek mESC L31-FTA, pokryj dno 10-centymetrowej płytki 5 ml 0,1% żelatyny. Inkubacja w 37 °C przez noc.</li>
	<li>Połącz składniki mediów mESC (Tabela 2) i przefiltruj przez filtr o rozmiarze 0,2 μm. Przechowuj w 4 °C do 1 miesiąca.</li>
	<li>W dniu rozmrożenia, rozgrzej 5 ml alikwot mediów do rozcieńczania rozmrożonych komórek i 10 ml alikwot do ich zasiewu.</li>
	<li>Pobierz kriowialkę zawierającą ~5 × 106 komórek mESC L31-FTA z cieczy azotu i natychmiast rozmroź przez obracanie dnem kriowialki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj 0,5-1 ml mediów z alikwotem 5 ml z zawartością kriowialki, o ile pojemność kriowialki to pozwala, a następnie przenieś zawartość kriowialki z powrotem do 5 ml mediów.</li>
	<li>Odwiruj komórki. Odsącz nadstan.</li>
	<li>Resuspenduj pellet komórek z 10 ml alikwotem mediów.</li>
	<li>Odsącz żelatynę z 10 cm płytki i natychmiast przenieś zawiesinę komórek do płytki. Inkubacja w 37 °C.</li>
	<li>Co 24 godziny (z wyjątkiem dni przesadzania), odsącz stare medium z płytki i wymień na 10 ml świeżego mediów.</li>
	<li>Kiedy kolonie osiągają 70-80% konfluencji (zwykle 48 godzin po zasianiu), odsącz stare medium i dwukrotnie przepłucz 10 ml buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS).</li>
	<li>Po odsączeniu DPBS, pokryj płytkę 2 ml 0,05% trypsyny (Tabela 2). Inkubacja w 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Neutralizuj trypsynę dodając 4 ml zimnego mediów mESC do płytki. Natychmiast użyj 5 lub 10 ml pipety serologicznej do przepompowywania w górę i w dół 15x w płytce, aby odłączyć kolonie w jednokomórkową zawiesinę.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę do stężonej epruwetki. Opcjonalnie, pobierz alikwot do zliczenia komórek za pomocą licznika komórek.</li>
	<li>Odwiruj komórki. Odsącz nadstan.</li>
	<li>Resuspenduj pellet komórek w świeżym medium. Przesadź 5 × 106 komórek (zwykle stosunek przesadzania 1:6) do świeżej pokrytej żelatyną 10 cm płytki i inkubacja w 37 °C. Powtórz kroki 1.9-1.15 w miarę potrzeby, aż będzie gotowy do przejścia do transfekcji.</li>
	<li>Aby zamrozić kultury komórek, trypsynizuj płytkę mESC (jak w krokach 1.10-1.14). Resuspenduj pellet komórek w medium do zamrażania (250-500 μl na 5 × 106 komórek), podziel na kriowialki i powoli zamroź w pojemniku do zamrażania komórek w -80 °C przez noc przed przeniesieniem do cieczy azotu.</li>
</ol>
2. Transfekcja
UWAGA: Przeprowadź transfekcję w dniu, w którym komórki mESC są gotowe do przesadzenia. Plasmidy mogą zacząć się ekspresować już 3-5 godzin po transfekcję. Po rozpoczęciu ekspresji zalecamy obsługę komórek w ciemności i minimalizowanie narażenia na temperatury poniżej 37 °C, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji, ponieważ wcześniejsze prace wykazały, że domeny optogenetyczne Magnet dimerizują nie tylko pod wpływem niebieskiego światła, ale także po ekspozycji na zimno31. Trzymaj płytki w dedykowanym inkubatorze lub zabezpiecz półkę w wspólnym inkubatorze przed światłem folią aluminiową. Podczas obsługi komórek spoza inkubatora, włącz lub zablokuj wszystkie światła w pokoju i okna przed ręką, a do widzenia użyj czerwonego lampki na głowę. Nie zostawiaj otwartych drzwi inkubatora dłużej niż konieczne. Wyjmuj tylko małe partie płytek z inkubatora na raz i opieraj płytki na izolującej powierzchni (np. czysta pokrywa pudełka styropianowego), podczas gdy obsługujesz, aby zminimalizować kontakt z powierzchniami roboczymi w temperaturze pokojowej. W pełni rozgrzej medium przed użyciem. Nie inspekcjonuj płytek w mikroskopie emitującym światło.
<ol>
	<li>Na dzień przed transfekcją, pokryj 10 cm płytkę żelatyną.</li>
	<li>W dniu transfekcji, odsącz żelatynę z płytki i dodaj 7,5 ml mediów do nagrzania w 37 °C. Nagrzej zredukowane medium bez surowicy w 37 °C do resuspendowania komórek.</li>
	<li>Rozcień 18,75 μl reagentu transfekcyjnego w 250 μl zredukowanego medium bez surowicy. Delikatnie potnij, aby wymieszać

<ol>
	<li>Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.</li>
	<li>Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.</li>
	<li>Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.</li>
	<li>Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.</li>
	<li>Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.</li>
	<li>Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.</li>
	<li>Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.</li>
	<li>Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.</li>
	<li>Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.</li>
	<li>Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.</li>
	<li>Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.</li>
	<li>Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.</li>
	<li>Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.</li>
	<li>Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.</li>
	<li>Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.</li>
	<li>Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.</li>
	<li>Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.</li>
	<li>Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.</li>
	<li>Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.</li>
	<li>Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.</li>
	<li>Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.</li>
	<li>Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.</li>
	<li>Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.</li>
	<li>Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.</li>
	<li>Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.</li>
	<li>Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.</li>
	<li>Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.</li>
	<li>Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.</li>
	<li>Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.</li>
	<li>Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.</li>
	<li>Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.</li>
	<li>Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.</li>
	<li>Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.</li>
	<li>Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.</li>
	<li>Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.</li>
	<li>Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.</li>
	<li>Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.</li>
	<li>Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.</li>
	<li>Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.</li>
	<li>Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.</li>
	<li>Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.</li>
	<li>Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.</li>
	<li>Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.

ALIBi oferuje kilka zalet w stosunku do istniejących technik badania translacji subkomórkowej i ma potencjalne przyszłe zastosowania w biologii rybosomów i poza nią. Ten protokół wymaga podobnego lub mniejszej ilości czasu w porównaniu z sekwencyjnym lizysem i wirowaniem21,22 i jest potencjalnie stosowany do każdego subkomórkowego zespołu, który może być genetycznie ukierunkowany za pomocą sekwencji peptydowej lokalizacyjnej. W porównaniu z konstytutywnie aktywny...

Istnieje istotna potrzeba narzędzi, które mogą izolować próbki biologiczne z określonych podkomórkowych działów, aby lepiej zbadać, jak organizacja podkomórkowa i transport wpływają na procesy komórkowe. Translacja mRNA jest kluczowym przykładem takiego procesu: rosnące dowody sugerują, że translacja jest wysoce skomponowana i w szczególności, że wiele mRNA jest zlokalizowanych w organellach, gdzie będą przebywać ich zakodowane białka1,2. Jednakże mniej wiadomo o podkomórkowej lokalizacji maszyn translacyjnych. Rybosomy zaczynają swoje istnienie w jądełku i jądrze, gdzie zaczyna się ich montaż z białek rybosomalnych (RP) i rybosomalnych RNA (rRNA). Następnie są eksportowane do cytoplazmy na końcowe etapy montażu, po których zaczynają translację mRNA3,4. Kanoniczne miejsca translacji obejmują cytoplazmę i siateczkę śródplazmatyczną; w tej ostatniej syntetyzowane są białka integralne błony i białka przeznaczone do organelli związanych z błoną lub wydzielania pozakomórkowego5. Niedawno zidentyfikowane miejsca lokalnej translacji obejmują mitochondria, peroksysomy i przewody neuronalne6,7,8,9,10,11,12. Interesujące jest to, że pojawiają się również dowody na to, że cechy maszyn translacyjnych, takie jak białka związane z rybosomami, modyfikacje posttranslacyjne, modyfikacje rRNA i niekanoniczne stechiometrie rdzeniowych białek rybosomalnych, są zaangażowane w mechanizmy regulacyjne, które rządzą translacją określonych mRNA oraz parametrami takimi jak wierność i szybkość translacji13,14,15,16,17,18,19,20. Na przykład zidentyfikowano setki białek, które współpracują z rybosomem i mogą potencjalnie prowadzić do różnic w składzie podkomórkowych rybosomów13. Jednakże techniki izolowania subkomórkowych populacji rybosomów były ograniczone do tej pory; tym samym wiele pozostaje nieznane na temat tego, jak skład maszyn translacyjnych przyczynia się do regulacji lokalnej translacji mRNA. Pojawienie się wszechstronnych metod izolowania subkomórkowych populacji rybosomów, szczególnie tych kompatybilnych z modelowymi systemami ssaków, pozwoli na badanie tych cech maszyn translacyjnych na poziomie subkomórkowym.
Najstarsze metody izolowania subkomórkowych ułamków zawierających rybosomy były oparte na zasadach sekwencyjnej lizy i wirowania21,22. Zazwyczaj te metody są ograniczone do określonych organelli i często wymagają długiego czasu przetwarzania. Nowsza metoda opiera się na ligazie biotynowej BirA, która specyficznie biotynyluje substrat peptydu AviTag10,23,24. BirA może być genetycznie zlokalizowany w organelli zainteresowania w komórkach, gdzie rybosomy zostały oznaczone AviTag. Jednakże, ponieważ BirA jest aktywna w fizjologicznych stężeniach biotyny, konieczne jest hodowanie komórek w warunkach niedoboru biotyny, aby uniknąć konstytutywnego i niespecyficznego biotynylacji rybosomów z AviTag10,24. To ogranicza użycie BirA w typach komórek, które są wrażliwe na niedobór biotyny25. Wreszcie, opracowano promiskualne metody biotynylacji, które wykorzystują inżynieryjne enzymy takie jak BioID, TurboID i APEX26,27,28. Po indukcji, te enzymy produkują reaktywny produkt pośredni biotyny, który kowalenie modyfikuje dowolne reszty lizyny w promieniu enzymu. Promiskualne metody biotynylacji są bardzo przydatne do mapowania proteomów podkomórkowych, ale mniej pokazujące na różniczenie białek w ogólnej okolicy zlokalizowanego rybosomów w przeciwieństwie do białek, które są w bliższej odległości z nimi.
Tutaj, prezentujemy naszą niedawno opracowaną metodę oznakowania i izolowania subkomórkowych populacji rybosomów, zwaną AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi). Ta metoda wykorzystuje inżynieryjny podzielony BirA związany z optogenetycznie ulepszonymi przełącznikami Magnet (eMag) (Rysunek 1A), które heterodimeryzują pod oświetleniem niebieskim29; i tag peptydu składający się z epitopu FLAG, miejsca kleizenia proteazy wirusa wycięcia tytoniu (TEV) i AviTag (FTA) związanego z białkiem rybosomalnym Rpl31 (Rysunek 1B). Podzielony enzym może być genetycznie ukierunkowany na wybrane organelle, jest nieaktywny w fizjologicznych stężeniach biotyny i może być odtworzony w ciągu kilku minut po oświetleniu niebieskim i dodaniu suplementacji biotyny (Rysun

<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C składowanie</td><td></td><td></td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>0,1% żelatyna w wodzie</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>Filtry 0,2 &micro;m</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>0,5% trypsyna-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7,5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>Opcjonalnie: do wstawiania FTA w endogenne locus białka rybosomalnego</td></tr><tr><td>1,5 i 2 mL probówki mikrowirówkowe, autoklawowane</td><td></td><td></td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>1,5, 2 mL i 5 mL probówki mikrowirówkowe do białek o niskiej adsorpcji</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>10 cm naczynia do hodowli tkankowej</td><td></td><td></td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>10x bufor Tris/glicyna/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>37 &deg;C inkubator do hodowli tkankowej x 2</td><td></td><td></td><td>Do hodowania komórek. Jeden z nich służy jako główny inkubator do hodowli komórek i iluminacji transfekowanych komórek. Tymczasowa przestrzeń jest potrzebna w drugim inkubatorze w dniu aktywacji ALIBi, aby pomieścić transfekowane komórki podczas przygotowywania transiluminatora w głównym inkubatorze.</td></tr><tr><td>37 &deg;C kąpiel wodna</td><td></td><td></td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>50 mM biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>6x bufor Laemmli</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td>Do dezynfekcji</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej</td></tr><tr><td>Zestaw AcTEV proteazy</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>Plasmid ALiBi C-fragment</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>Do transfekcji potrzebny jest zestaw midi-prep</td></tr><tr><td>Plasmid ALiBi N-fragment</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>Do transfekcji potrzebny jest zestaw midi-prep</td></tr><tr><td>Guma aluminiowa</td><td></td><td></td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>Bicarbonat amonowy</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-FLAG</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GAPDH</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Rpl12</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Rpl31</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Rpl5</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-V5</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Apyraza</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>Beta-merkatoprol (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>Światło transiluminatora niebieskiego</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (mały) lub DR196 (duży)</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>Albumina bydlęca (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Wstążki C18 (OMIX C18 tips)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej</td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania komórek</td><td></td><td></td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>Wirówka do probówek mikrowirówkowych o pojemności 15 mL i/lub 50 mL</td><td></td><td></td><td>Do hodowania komórek</td></tr><tr><td>Wirówka do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5-2 mL</td><td></td><td></td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego. Powinna być wydajna do chłodzenia do 4 C i prędkości do 17 000 g. Idealnie znajduje się w pomieszczeniu, które można tymczasowo zaciemnić podczas przenoszenia probówek wewnątrz i na zewnątrz.</td></tr><tr><td>Zestaw Clarity ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Zestaw Criterion gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>Do Western blot</td></tr><tr><td>Zestaw Criterion TGX wstępnie żelowanych żeli, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>Do Western blot. Dostępne dodatkowe rozmiary i układy formacji</td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>Deoksicholan</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>Do lizy i czyszczenia pokrewnego</td></tr><tr><td>Dytiotreitol</td><td>ThermoFisher</td><td>

izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Rosnące dowody sugerują, że translacja mRNA jest procesem silnie skompartmentalizowanym w komórce, a subkomórkowe transportowanie i lokalizacja określonych mRNA jest kluczowym czynnikiem dla zapewnienia, że białka o funkcjach specyficznych dla kompartmentów są produkowane w idealnym środowisku i w odpowiednich ilościach. Jednak techniki do subkomórkowego izolowania i charakteryzacji rybosomów, które translacjują te mRNA, były do tej pory ograniczone, co oznacza, że wiele pozostaje nieznane w kwestii tego, jak skład maszyn translacyjnych przyczynia się do regulacji zlokalizowanej translacji mRNA.
Przedstawiamy tutaj AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi), metodę łączącą tagowanie epitopowe, nowo opracowaną optogenetycznie aktywowaną podzieloną ligandę biotyny oraz afinicyjną czyszczenie, aby szybko i specyficznie oznaczyć i odizolować rybosomy zlokalizowane w dowolnym subkomórkowym oddziale zainteresowania. Po pierwsze, edycja CRISPR/Cas9 jest używana do fuzji peptydu AviTag, miejsca kleienia proteazy z wirusa wycinarki tytoniu (TEV) oraz epitope tag FLAG z białkiem rybomalnym. Podzielona liganda biotyny, zfuzjonowana z domeną ukierunkowaną na organelle, jest ekspresowana w tej linii komórkowej i jest nieaktywna pod normalnymi stężeniami biotyny. Po aktywowaniu przez suplementacyjną biotynę i niebieskie światło, ligaza biotynyluje rybosomy z tagiem Avi w bezpośrednim otoczeniu, umożliwiając afinicyjne czyszczenie biotynylowanych rybosomów oraz skojarzonych białek i mRNA na perłach pokrytych streptawidyną. Niedenaturująco eluowane za pomocą kleienia proteazy TEV daje próbki nadające się do dalszej charakteryzacji białek rdzeniowych rybosomów, białek skojarzonych z rybosomami oraz wiązanych z rybosomami mRNA za pomocą sekwencjonowania RNA lub proteomiki spektrometrii mas.
W tym protokole przeglądamy zasady projektowania fuzji AviTag z białkiem rybomalnym oraz ukierunkowania enzymu podzielonej ligandy biotyny na organelle zainteresowania. Demonstrujemy aktywację systemu ALIBi, lizę komórkową, afinicyjne czyszczenie oraz eluowane próbek. Na koniec omawiamy typowe wyniki i rozwiązywanie problemów.

Western blot (sekcja 6 protokołu) jest najszybszym sposobem wstępnej oceny powodzenia eksperymentu. Po inkubacji membran ze streptawidyną-HRP, lizat z komórek, w których obecne były wszystkie komponenty systemu, powinien zawierać prążek odpowiadający biotynglowanemu L31-FTA (Rysunek 2A, ścieżka 20). Ten sam prążek, zazwyczaj o większym natężeniu, powinien być obecny, jeśli komórki zostały transfektowane pełnowymiarową BirA jako kontrolą pozytywną (Rysunek 2A, śc...

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis buffer, and wash buffers. Using a pipette, mix buffers containing dense or viscous components to ensure even mixing. Chill the prepared buffers on ice before use.Re-suspend the stock bottle of streptavidin beads by gentle pipetting or rocking. Transfer 450 microliters of beads into a protein low binding tube for each 10 centimeter plate of cells. Place the re-suspended beads on the magnetic rack for one minute, or until the beads have fully migrated.Aspirate and discard the bead storage buffer without touching the bead pellet. Wash the beads two times with 900 microliters of RNAs removal buffer. Wash the beads once with 900 microliters of salt wash.Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer. Store the beads in the wash I buffer at four degrees Celsius while performing activation and cell lysis. Add biotin and CHX to the warmed aliquot of media and keep at 37 degrees Celsius until use.Add CHX to the cold DPBS aliquot and keep it chilled until use. Aspirate the media from the transfected plates. Immediately add 10 milliliters of warm media containing CHX with or without Biotin to each plate.Place negative control plates in a dark incubator. Place the remaining plates directly on top of the transilluminator. Turn on the transilluminator and incubate the plates for 15 minutes.Wash each plate two times with the 10 milliliters of cold DPBS containing CHX. Place the plates on ice between and after washes. After aspirating the second wash, tilt the plate and aspirate any residual DPBS.Keeping the plate flat on ice, add two milliliters of ice-cold lysis buffer and incubate the plate on ice for five minutes. Tap the plate two to three times during incubation to dislodge cells. Using a micropipette, pipette the lysate up and down across the plate surface to dislodge any remaining cells.Transfer the lysate to a chilled labeled protein low binding tube. In difficult to lyse organelles, sonicate all samples for 45 seconds at four degrees Celsius. And if required, transfer the lysate into a larger tube before sonication.Transfer the sonicated lysate into a two-milliliter tube. Incubate the lysate on ice for 15 minutes. Centrifuge the lysate at 17, 000 G for three minutes at four degrees Celsius.Transfer the supernatant into a chilled protein low binding tube without disturbing the pellet. Using a magnetic rack, pellet the washed strepped avident beads. Aspirate the wash one buffer.Transfer 1, 200 microliters of clarified lysate to the tube containing the washed beads. Pipette up and down gently to re-suspend the beads. Store the remaining clarified lysate at minus 80 degrees Celsius.Incubate the lysate with the beads at four degrees Celsius in the dark on a tube rotator for one hour. During the incubation, prepare the Tobacco Etch Virus, or TEV elution buffer. Pellet the beads on a magnetic rack.Transfer the supernatant to a chilled protein low binding tube. Store the supernatant at minus 80 degrees Celsius. Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer and once with 900 microliters of wash II buffer.Add 450 microliters of TEV elution buffer to the beads. Incubate the beads in TEV elution buffer for one hour at room temperature on a tube rotator. Pellet the beads on the magnetic rack.Transfer the elute to a protein low binding tube. Store the eluate at minus 80 degrees Celsius if proteomics analysis or Western blot is intended. Cells containing all system components showed a L31-FTA band, which was stronger with full length burray and faint or absent when components were omitted.Endogenous biotinilated carboxylase proteins were detected in all lysates at 70 to 80 kilodaltons and 120 to 130 kilodaltons. ANTV5 probing confirmed expression of the split bore fragments. Biotinillated L31FTA decreased in the flow through relative to the lysate.No biotinillated L31-FTA was present in the eluate following TEV-mediated elution. Anti-flag probing showed a cleaved L31-FTA band at a lower molecular weight than intact L31-FTA ribosomal protein. S12 probing demonstrated the presence of the small ribosomal subunit in the eluate.Anti-V5 probing showed that proteins that do not bind the ribosome were absent from the eluate. When 2.5 fold more lysate was used with the same 450 microliters of streptavidin coated beads, a substantial amount of biotinilated L31-FTA remained in the flow through. Endogenous biotinilated proteins were partially depleted in the flow through.Endogenous biotinillated proteins were absent from the eluet, but were recovered after heating post-dilution beads in lambly buffer. Anti-flag probing detected cleaved L31-FTA at a lower molecular weight than intact L31-FTA. Anti-V5 probing showed that the split burray fragments were absent from the eluate.ALIBi enables the identification of ribosome-bound proteins and mRNAs in specific subcellular regions, revealing differences in translation regulation. The key challenge is maintaining specific proximity labeling through careful control of targeting construct expression and illumination conditions. Following this protocol, affinity purified ribosomes and associated mRNAs can be analyzed using quantitative proteomic and transcriptomic approaches.

isolation-subcellular-ribosome-subpopulations-based-on-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo stosowana do izolacji stabilnie związanych kompleksów powstającego łańcucha rybosomalnego (RNCs). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że sekwencja „zatrzymująca” SecM o długości 17 aminokwasów może wstrzymać elongację translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wstawiona do niemal każdego białka (lub połączona z jego końcem C).

Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Stanford School of Medicine.  AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) is a novel optogenetically activated method developed for labeling and affinity-purifying subcellular populations of ribosomes for downstream sequencing and proteomic analysis.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Przeglądaj więcej filmów