Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej
21 czerwca 2024
Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.
Naszym nadrzędnym celem jest zbadanie, w jaki sposób komórki układu odpornościowego i komórki glejowe w ośrodkowym układzie nerwowym przyczyniają się do rozwoju i progresji zaburzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Mikroskopia immunofluorescencyjna jest standardową i szeroko stosowaną techniką w różnych dyscyplinach biologicznych i ma zasadnicze znaczenie dla neuronauki i badań immunologicznych. Jednym z głównych problemów, które nękają badaczy, jest to, że mikroskopia immunofluorescencyjna jest zazwyczaj ograniczona pod względem liczby sond, które można obrazować za jednym razem, ze względu na ograniczenia konwencjonalnych mikroskopów.
W tym protokole opisano metodę zwiększania liczby sond, które wiele mikroskopów może obrazować jednocześnie, oraz zapewniamy potok analizy do przetwarzania obrazów o dużej gęstości informacji. Zaletą tego protokołu jest to, że można go dostosować do wielu powszechnie dostępnych mikroskopów i jest łatwy do wykonania, co sprawi, że multipleksowa analiza histologiczna będzie dostępna dla większej liczby laboratoriów. Aby rozpocząć, ustaw mikroskop fluorescencyjny do obrazowania.
Włożyć całkowicie wybarwione szkiełko z sekcjami tkanki barwienia immunologicznego. Po ustawieniu celu naciśnij przycisk na żywo, a następnie skup się na próbce. Użyj ikony autoskalowania, aby ocenić, czy kanały są odpowiednio nasycone sygnałem.
Po sfinalizowaniu ustawień mikroskopu załaduj do mikroskopu jednokolorowe szkiełka kontrolne. Skoncentruj się poniżej próbki i naciśnij opcję rozpoczęcia w menu stosu Zs, aby rozpocząć konfigurowanie stosu Z. Następnie ustaw ostrość nad próbką i naciśnij opcję końca.
Aby skompensować fluorescencję obrazów, otwórz jeden z pojedynczych obrazów kontrolnych. Obserwuj okna skali szarości dla każdego kanału dla sygnału w nieodpowiednim kanale. Aby usunąć, ręcznie wprowadź liczby do matrycy, a następnie naciśnij Zastosuj, aby sprawdzić, czy została ona odpowiednio usunięta.
Następnie zbierz wszystkie wartości z każdej kontrolki w jedną macierz. Nałożyć tę matrycę na całkowicie wybarwioną próbkę. Uruchom oprogramowanie ilastik i otwórz plik TIFF tkanek.
Kliknij kartę treningu, a następnie użyj narzędzia pędzel, aby podświetlić poszczególne komórki na obrazach. Upewnij się, że podświetlisz komórki tak, aby wnętrze i błona komórkowa były uwzględnione. Następnie użyj etykiety drugiej, aby podświetlić wszystko, co nie jest interesującymi komórkami.
Teraz uruchom oprogramowanie 3 i otwórz obraz IMS tkanki zawierającej wszystkie barwniki fluorescencyjne. Wybierz opcję maski nad jądrami jako kanał źródłowy do wykrywania jąder, a następnie wybierz opcję zaawansowaną do rozdzielania jąder według punktów zarodkowych. Ustaw wartość średnicy jądra.
Sprawdź obraz pod kątem połączonych wielu komórek lub brakujących komórek. Następnie kliknij obiekt utworzonych komórek, a następnie zakładkę tworzenia, a następnie opcję zapisz parametry dla partii, aby zapisać ustawienia użytkowania. Uruchom program Anaconda, a następnie uruchom program Jupyter Lab w programie Anaconda.
Otwórz dodatkowy plik kodowania, a następnie naciśnij uruchom wszystkie komórki lub uruchom wybrane komórki w menu uruchom. Gdy pojawi się monit, wprowadź katalog plików dla wyeksportowanych wartości fluorescencji. Następnie wprowadź katalog plików dla dowolnej lokalizacji odpowiedniej do zapisania przetworzonych plików.
Uruchom następną sekcję kodu, aby dodać adnotacje do danych z nazwami każdego kanału. Po ustaleniu strategii bramkowania kliknij prawym przyciskiem myszy populację w menu, a następnie wybierz eksport. Wyeksportuj parametry jako plik CSV z dołączonymi nagłówkami.
Uruchom ponownie Jupyter Lab w Anakondzie. Następnie otwórz skrypt w dodatkowym pliku kodowania drugim i uruchom kod. Po wyświetleniu monitu o wprowadzenie lokalizacji pliku oprogramowania czterech, wprowadź katalog plików wyeksportowanych plików CSV.
Następnie, po wyświetleniu monitu o dodanie lokalizacji wyjściowej, wybierz wybrany katalog plików i upewnij się, że katalog plików zawiera nazwę pliku na końcu. Uruchom pozostałą część kodu. Teraz skopiuj tekst w pliku txt i otwórz odpowiedni plik IMS w oprogramowaniu trzecim.
Kliknij na sprzedaj obiekt w pliku. Przejdź do zakładki statystyk, a następnie wklej tekst w pasku wyszukiwania i rozpocznij wyszukiwanie. Wszystkie interesujące komórki zostaną teraz podświetlone.
Widmowo nakładające się barwniki fluorescencyjne zostały skutecznie oddzielone w tkance, która została zabarwiona wieloma barwnikami. Rozdzielenie barwników wyraźnie różnicowało różne typy komórek w tkance limfatycznej. Zdefiniowane przez użytkownika uczenie maszynowe zostało wykorzystane do rozdzielenia komórek nawet wtedy, gdy są blisko siebie zagęszczone.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje metodę obrazowania wielu parametrów fluorescencyjnych z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej, wraz z procedurą analizy danych z pojedynczych komórek. Metoda ta rozszerza tradycyjne możliwości obrazowania, umożliwiając identyfikację subpopulacji komórek związanych z funkcjami komórek odpornościowych i glejowych w zaburzeniach neurologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Mikroskopia immunofluorescencyjna jest kluczową techniką w neuronaukach i immunologii.
- W konwencjonalnych mikroskopach istnieją ograniczenia dotyczące liczby sond, które można obrazować jednocześnie.
- Zaproponowana metoda ma na celu przełamanie tych ograniczeń i zwiększenie dostępności wielokrotnej analizy histologicznej.
Cel badania
- Opracowanie protokołu umożliwiającego obrazowanie i analizę wielu znaczników fluorescencyjnych.
- Stworzenie potoku analizy wspierającego analizę pojedynczych komórek, podobną do cytometrii przepływowej.
- Umożliwienie lepszego zrozumienia roli komórek odpornościowych i glejowych w zaburzeniach neurologicznych.
Zastosowane metody
- Do analizy barwionych przekrojów tkanek wykorzystano mikroskopię immunofluorescencyjną.
- W badaniu szczegółowo opisano podejście krok po kroku w zakresie konfiguracji mikroskopu oraz przeprowadzania kompensacji fluorescencji.
- Analiza obrazów obejmowała wykorzystanie narzędzi programistycznych do separacji i etykietowania pojedynczych komórek.
- Protokół umożliwia adaptację do różnych powszechnie stosowanych mikroskopów.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie różnicuje poszczególne typy komórek w barwionej tkance chłonnej.
- Wykorzystano uczenie maszynowe, aby skutecznie oddzielić gęsto upakowane komórki.
- Analiza dostarczyła istotnych informacji na temat populacji komórek w przekrojach tkankowych.
Wnioski
- Niniejszy protokół rozszerza możliwości tradycyjnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Ustanowiony schemat analizy usprawnia analizy pojedynczych komórek, umożliwiając szerszy dostęp do histologii multipleksowej.
- Wyniki te mogą poprawić nasze zrozumienie mechanizmów komórkowych zaangażowanych w zaburzenia neurologiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wieloparametrowe obrazowanie histologiczne z wykorzystaniem histocytometrii przepływowej rozwiązuje krytyczny problem w profilowaniu komórek odpornościowych, umożliwiając multipleksową analizę przestrzenną z rozdzielczością pojedynczych komórek. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego, szczególnie w przypadku złożonych tkanek, takich jak OUN. Podejście to wspiera decyzje dotyczące portfela badań poprzez integrację kontekstu przestrzennego z ilościową analizą podgrup komórek odpornościowych, dostarczając istotnych informacji na etapie wczesnego odkrywania oraz badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie różnorodności komórek odpornościowych i glejowych w obrębie nienaruszonej architektury tkanki.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie podzbiorów komórek i ich oddziaływań przestrzennych.
- UłatwiaB ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki wysokotreściowej, multipleksowej analizie markerów.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów w procesach neuroimmunologicznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Przygotowuje zwalidowane, bogate w informacje systemy tkankowe do dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Standaryzuje ilościowe wyniki dla pojedynczych komórek przy użyciu strategii bramkowania podobnych do tych stosowanych w cytometrii przepływowej.
- Umożliwia powtarzalne profilowanie populacji komórek w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.
- Wspiera skalowalny rozwój testów dzięki możliwości adaptacji do powszechnie dostępnych platform mikroskopowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie mapowania podzbiorów komórek odpornościowych do modeli tkanek OUN istotnych dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość przestrzenną i fenotypową od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną.
- Umożliwia zaawansowanie badań z uwzględnieniem oceny ryzyka poprzez ilościowe określenie liczebności typów komórek i oddziaływań tkankowych.
- Dostarcza translacyjnych informacji o biomarkerach na potrzeby badań nad zaburzeniami neurologicznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesną fazę odkryć z badaniami translacyjnymi, łącząc obrazowanie wieloparametryczne z analizą pojedynczych komórek, co wspiera przepływy pracy – od testowania hipotez po walidację modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia weryfikację hipotez, umożliwiając multipleksowe profilowanie przestrzenne i fenotypowe komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych z pojedynczych komórek, co pozwala na rzetelny rozwój testów.
- Analityka: Zapewnia bramkowanie podobne do cytometrii przepływowej oraz wyniki statystyczne do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy dane dotyczące subpopulacji komórek odpornościowych z środowiskiem tkankowym istotnym dla przebiegu choroby.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje szeroko adaptowalny proces obrazowania i analizy dla różnorodnych układów tkankowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad komórkami odpornościowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie i analizę multipleksową pomiędzy platformami i zespołami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów z zakresu OUN i immunologii w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie mikroskopii immunofluorescencyjnej i rozdzielania widmowego (spectral unmixing).
- Wymaga dostępu do kompatybilnych mikroskopów oraz zaawansowanego oprogramowania do analizy obrazu.
- Wymaga standaryzacji protokołów barwienia, obrazowania i bramkowania między zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych typów tkanek, lecz może wymagać optymalizacji dla konkretnych modeli.
- Praktycznymi kwestiami są złożoność analizy obrazu oraz biegłość w obsłudze oprogramowania.
