Name: Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Odkryj metodę analizy wysokoparametrowych obrazów histologicznych przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej i potoku obliczeniowego. Ta technika umożliwia identyfikację podzbiorów komórek odpornościowych i glejowych w chorobach neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Zaawansowanej Platformie Mikroskopowej Instytutu Mózgu Hotchkiss za infrastrukturę obrazowania i wiedzę. RWJ był wspierany przez stypendia podoktorskie z programu University of Calgary Eyes High oraz przez Multiple Sclerosis Society of Canada i nieograniczone stypendium edukacyjne Roche Canada. VWY otrzymało wsparcie płacowe w ramach programu Canada Research Chair Tier 1. Praca ta była wspierana przez fundusze operacyjne z Kanadyjskiego Instytutu Zdrowia Grant 1049959, Stwardnienia Rozsianego Towarzystwa Kanadyjskiego Grant 3236 oraz Departamentu Obrony USA w ramach Kongresowo Kierowanego Programu Badań nad Stwardnieniem Rozsianym. Rysunek 1 jest tworzony za pomocą BioRender.com. Rysunki zaadaptowane w tej publikacji zostały pierwotnie opublikowane w The Journal of Immunology. Rajiv W. Jain, David A. Elliott i V. Wee Yong. 2023. Analiza pojedynczych komórek wysokoparametrowych obrazów histologicznych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. J. Immunol. 210: 2038-2049. Prawa autorskie © [2023]. Amerykańskie Stowarzyszenie Immunologów, Inc.

Immunofluorescent Microscopy and Analysis for High-Parameter Tissue Imaging

<ol><li>Bar-Or, A., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunology+of+relapsing+multiple+sclerosis%3A+interactions%2C+checks%2C+and+balances%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances.</a> Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).</li>
<li>Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Immune+and+non-immune+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglia: Immune and non-immune functions.</a> Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).</li>
<li>Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-immune+cell+interactions+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology.</a> Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).</li>
<li>Absinta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lymphocyte-microglia-astrocyte+axis+in+chronic+active+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis.</a> Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).</li>
<li>Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+transcriptomics%3A+Deciphering+brain+complexity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease.</a> Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).</li>
<li>Schirmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+vulnerability+and+multilineage+diversity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis.</a> Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).</li>
<li>Jain, R. W., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+in+central+nervous+system+disease%3A+Diversity%2C+locations+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology.</a> Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).</li>
<li>Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+multiple+sclerosis%3A+Protectors+turn+destroyers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers.</a> Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).</li>
<li>Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practitioner%27s+view+of+spectral+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practitioner's view of spectral flow cytometry.</a> Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).</li>
<li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).</li>
<li>Ramaglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+immune+cells+in+staged+multiple+sclerosis+lesions+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry.</a> Elife. 8, e48051(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+staining+by+sequential+immunostaining+and+antibody+removal+on+routine+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections.</a> J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+An+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-cytometry%3A+A+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chrysalis%3A+A+new+method+for+high-throughput+histo-cytometry+analysis+of+images+and+movies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies.</a> J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).</li>
<li>Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+high-parameter+histology+images+using+histoflow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry.</a> J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Laboratory+Techniques.+Histological+Sample+Preparation+for+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+Interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Ruhlandt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantum+yield+measurements+of+fluorescent+proteins+using+a+plasmonic+nanocavity%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity.</a> Commun Biol. 3 (1), 627(2020).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+A+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. 79, 1-25 (2017).</li>
<li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+Principles+and+modern+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Guidance+for+quantitative+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+A+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

W tym miejscu opisano zastosowanie cytometrii przepływowej, techniki, która została wcześniej zwalidowana18. Wykazano, że podczas barwienia skrawków tkanek barwnikami nakładającymi się spektralnie, przesączanie się przez kanały można usunąć za pomocą kompensacji spektralnej, co skutkuje wyraźną rozdzielczością większej liczby parametrów fluorescencyjnych, niż byłoby to normalnie możliwe przy użyciu konwencjonalnych metod. Ponieważ obrazy histologiczne o wysokich parametrach są trudne do analizy przy użyciu konwencjonalnych metod, dostępny jest potok analizy w celu segmentacji poszczególnych komórek na podstawie tych obrazów. Eksportując sygnatury fluorescencyjne z tych pojedynczych komórek, wykazano, że analizy pojedynczych komórek, takie jak te przeprowadzane za pomocą cytometrii przepływowej, można podobnie zastosować do obrazów histologicznych. Chociaż cytometria przepływowa nie obejmuje analizy przestrzennej, wykazano, że cytometria przepływowa może mapować populacje zidentyfikowane za pomocą strategii bramkowania z powrotem na skrawkach tkanek w celu oceny ich lokalizacji przestrzennej. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że cytometria przepływowa łączy w sobie mocne strony cytometrii przepływowej i histologii.
Chociaż cytometria przepływowa ma tę zaletę, że zachowuje informacje przestrzenne, ma również wiele takich samych ograniczeń, jak konwencjonalna histologia. Podczas gdy cytometria przepływowa doskonale nadaje się do ilościowego oznaczania komórek w całej tkance, histologia jest zwykle przeprowadzana przez analizę małej próbki odcinków tkanki, które są uważane za reprezentatywne dla tkanki. Aby histologia mogła dokładnie określić ilościowo liczbę komórek w tkance, należałoby zobrazować każdy wycinek tkanki pobrany z tkanki i określić ilościowo liczbę komórek w każdym z nich, co byłoby niepraktyczne. Inną kwestią jest to, że niektóre komórki zostaną podzielone na pół podczas cięcia tkanki i nie ma możliwości zrekonstruowania tych komórek. Rzeczywiście, ograniczeniem wymienionego tutaj protokołu jest to, że nie zawiera on żadnych metod wykluczania komórek na krawędziach tkanki. Pomimo tych ograniczeń, jedną z zalet cytometrii przepływowej w porównaniu z cytometrią przepływową jest to, że nie ma potrzeby dysocjacji tkanek na zawiesiny jednokomórkowe, co może wprowadzać odchylenia do populacji, które są izolowane lub nie są odpowiednio wychwycone22. Tak więc, chociaż cytometria przepływowa ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową, uzyskanie pomiarów w całej tkance nadal będzie wyzwaniem.
W tym miejscu wykazano, że można rozdzielić osiem spektralnie nakładających się parametrów fluorescencyjnych; Jednak innym udało się oddzielić 13 barwników fluorescencyjnych17. Liczba barwników, które można rozdzielić, zależy od właściwości mikroskopu, w którym zbierane są dane. Barwniki fluorescencyjne różnią się optymalnymi długościami fal wzbudzenia i najczęstszymi długościami fal emisji. Mikroskopy, które wykorzystują te właściwości, wykorzystując szeroki zakres długości fal wzbudzenia w celu dokładniejszego dopasowania optymalnych długości fal wzbudzenia fluoroforów oraz dostrajając detektory emisji tak, aby precyzyjnie pasowały do najczęściej emitowanych długości fal, zmaksymalizują separację barwników fluorescencyjnych. Minimalizacja nakładania się widm jest niezbędna do generowania wysokiej jakości danych, ponieważ kompensacja przebijania przez kanały może potencjalnie wpływać na dynamiczny zakres wykrywania fluoroforów oddziałujących ze sobą, a zatem separacja oparta na emisji i wzbudzeniu jest krytycznym pierwszym krokiem w separacji fluoroforów. W zależności od właściwości mikroskopu i liczby parametrów fluorescencyjnych, które należy zobrazować, może być konieczne umieszczenie wielu fluoroforów, które mają te same długości fal wzbudzenia, ale różnią się długościami fal emisyjnych, na tych samych liniach laserowych. Zwykle osiąga się to poprzez stosowanie podstawowych barwników fluorescencyjnych w połączeniu ze sprzężonymi barwnikami fluorescencyjnymi, w których sprzężone barwniki emitują na dłuższych falach, a zatem można je odróżnić na podstawie ich długości fal emisyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, barwniki muszą różnić się albo częstotliwościami wzbudzenia, albo emisji, aby zapewnić skuteczną separację.
Uzyskanie idealnej kompensacji jest skomplikowane ze względu na kilka czynników, w tym aspekt przestrzenny kompensacji. Po pierwsze, to, czy fluorofor emituje foton, jest częściowo oparte na przypadku23, gdzie zebrane fotony na każdym obrazie są odchylone w kierunku miejsc gęstego zabarwienia. Jednak mniej zabarwione obszary mogą przypadkowo wyemitować foton, który pojawia się w jednym z nakładających się na siebie kanałów, ale nie w kanale głównym. Ponieważ kompensacja jest stosowana na podstawie wokseli, nakładanie się widma nie zostanie usunięte podczas kompensacji z powodu braku kolokalizacji przestrzennej. Można to zobaczyć na rysunku 2, gdzie kompensacja powoduje zmniejszenie miejsc gęstego zabarwienia (krawędzie koralików), ale nie środka koralików, gdzie występuje minimalne zabarwienie i słabe zachodzenie na kanały z przebijaniem. To zabarwienie w środku koralików jest prawdopodobnie spowodowane innym problemem, który może wpływać na kompensację, a mianowicie, że fotony wytwarzane poza płaszczyzną ogniskową mogą pojawiać się w wokselach w płaszczyźnie ogniskowej, które prawdopodobnie nie zostaną odtworzone zarówno w kanale głównym, jak i w kanale, który musi być skompensowany24. W związku z tym ten "hałas" nie zostanie skutecznie usunięty za pomocą kompensacji bez wprowadzenia nadmiernej kompensacji. Problemy te można częściowo rozwiązać, stosując średnią liniową, wielokrotnie mierząc wartości fluorescencji pojedynczego woksela i używając średniej do ograniczenia wpływu przypadkowych zdarzeń. W przypadku korzystania z mikroskopu konfokalnego rozmiar otworu można również zmniejszyć, aby wykluczyć włączenie nieostrych fotonów do obrazów25,26. Korzystanie z tych poprawek odbywa się kosztem dodatkowego czasu akwizycji obrazu, który może stać się długi.
Chociaż technika ta została opracowana przy użyciu obrazów wykonanych z mikroskopu konfokalnego, będzie działać z innymi typami mikroskopów. Inni, stosując podobne metody, zastosowali te metodologie do obrazów wykonanych z mikroskopów dwufotonowych17 z dużym sukcesem. Chociaż technika ta może być stosowana do obrazów wykonanych z mikroskopów szerokokątnych, istnieje kilka zalet związanych z mikroskopami konfokalnymi, które poprawiają rozdzielczość, czy foton pochodzi z płaszczyzny ogniskowej. Ponieważ dokładna rozdzielczość lokalizacji fotonów (tj. przekrój optyczny) poprawia jakość kompensacji, oczekuje się, że jakość kompensacji będzie stosunkowo niska. Temu problemowi można potencjalnie zaradzić, wykorzystując dekonwolucję do usuwania nieostrych fotonów w celu poprawy rozdzielczości obrazów szerokokątnych27. Ważnym zastrzeżeniem, które określi, czy dekonwolucja jest kompatybilna z tym protokołem, jest to, czy wartości fluorescencji w każdym kanale pozostają proporcjonalne do siebie na wszystkich analizowanych obrazach. Jeśli wartości fluorescencji po dekonwolucji staną się dowolne, to ta sama macierz kompensacji wygenerowana na jednym obrazie prawdopodobnie nie zostanie pomyślnie zastosowana do innych obrazów. Ogólnie rzecz biorąc, najważniejszym czynnikiem, który decyduje o tym, czy mikroskop może korzystać z tego przepływu pracy, jest to, czy mikroskop ten ma detektory, których zakres wykrywania można elastycznie dostrajać. Jeśli jest to możliwe, wówczas wielokrotne fluorofory stymulowane przez to samo wzbudzenie można rozwiązać poprzez wykrycie ich widm emisyjnych w różnych oknach detekcji.
Liczba parametrów fluorescencyjnych może być jeszcze bardziej zwiększona w połączeniu z technikami seryjnego barwienia tej samej tkanki wielokrotnie13, takimi jak IBEX14,15. Za pomocą barwienia szeregowego można mierzyć skutecznie nieograniczoną liczbę parametrów; Może to być jednak bardzo czasochłonne. Zastosowanie kombinacji omówionych tutaj metod kompensacji i barwienia szeregowego może znacznie skrócić czas potrzebny na wykonanie tych obrazów, ponieważ dla każdej rundy barwienia można obrazować jednocześnie więcej kanałów. Opisany tutaj potok analizy będzie skalowany dla dowolnej liczby markerów i będzie kompatybilny z seryjnie barwionymi skrawkami tkanek.
Kluczowym krokiem w tym procesie analizy jest segmentacja pojedynczych komórek na podstawie obrazów histologicznych. Znalezienie skutecznych strategii dokładnej segmentacji komórek na podstawie obrazów histologicznych jest częstym problemem28, a nowsze metody są stale opracowywane. Chociaż ta metoda może skutecznie oddzielić pojedyncze komórki od ciasno upakowanych komórek, dokładne granice komórek są często niedoskonałe. Dlatego zaleca się, aby użytkownicy ograniczyli analizę tylko do populacji komórek, które ich interesują, ponieważ im mniej komórek należy rozdzielić, tym dokładniejsze będą granice komórek. Użytkownicy mogą również osiągnąć lepszą separację komórek, definiując wiele populacji w ilastik, co pozwala programowi na segmentację różnych populacji komórek. Jednym z problemów związanych z tym podejściem jest to, że komórki zdefiniowane w ten sposób nie mogą być połączone w ten sam obiekt "komórki" w oprogramowaniu 3 i mogą prowadzić do podwójnego zliczania komórek. Niemniej jednak, jeśli dokładniejsze granice komórek mają kluczowe znaczenie dla eksperymentu, można zastosować to podejście. Zachęca się, aby użytkownicy eksperymentowali z nowszymi algorytmami segmentacji w miarę ich opracowywania i włączali je do tego potoku, aby uzyskać jeszcze lepsze wyniki.
Podczas opracowywania nowego panelu cytometrii przepływowej może pojawić się kilka problemów. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby różne markery fluorescencyjne wytwarzały mniej więcej podobne ilości fluorescencji. Jeśli jeden fluorofor jest znacznie jaśniejszy od drugiego, może to być problematyczne, jeśli ten fluorofor przenika do innego fluoroforu, ponieważ przesączanie może wyprzedzić rzeczywiste barwienie w tym kanale. Jest to widoczne na rysunku 3, gdzie Alexa Fluor 546 mocno przenika do PE-eFluor 610. Chociaż kompensacja może nadal usunąć to krwawienie, często nadal będzie utrzymywać się fluorescencja z powodu nieostrego światła, które nie zostanie usunięte, co może sprawić, że kompensacja będzie niepełna. Co więcej, większość detektorów stosowanych w mikroskopach nie ma szerokich zakresów dynamiki, takich jak w cytometrach przepływowych. W rezultacie, wraz ze wzrostem krwawienia w kanale, większa część zakresu dynamicznego w tym detektorze będzie nasycona sygnałami z innych fluoroforów, a mniejsza z fluoroforu będącego przedmiotem zainteresowania. Gdy kompensacja zostanie usunięta z takiego kanału z rozległym krwawieniem, prawdziwy sygnał może zostać rozwiązany; Jednak różnica między komórkami dodatnimi dla tego markera a tymi ujemnymi dla niego stanie się mniejsza i może skutkować niezdolnością do rozwiązania stanów pośrednich lub potencjalnie nawet rozwiazania dodatnich od ujemnych. W związku z tym należy unikać nakładania się kanałów. Po drugie, jasność markerów może się zmieniać między różnymi tkankami. Na przykład panel markerów, który działa na węzły chłonne, może już nie działać, gdy jest stosowany na śledzionie lub ośrodkowym układzie nerwowym, ponieważ marker może stać się zbyt jasny lub przyciemniony, co powoduje, że ten kanał nadmiernie krwawi do innych kanałów lub zostaje przytłoczony przez krwawienie z innych kanałów. W takim przypadku może być konieczna zamiana fluoroforów na markerach lub przełączenie stosowania pierwszorzędowych przeciwciał sprzężonych na stosowanie przeciwciał drugorzędowych. Wreszcie, cenne może być wykorzystanie różnic w lokalizacji znaczników, gdy występuje nadmierne nakładanie się kanałów. Jeśli dwa kanały mocno na siebie nakładają się, ale jeden jest markerem jądrowym, a drugi markerem powierzchni komórki, to nakładanie się widma będzie miało minimalny wpływ na siebie nawzajem, ponieważ kompensacja nie wpłynie na te same woksele. Jeśli to możliwe, panele powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby nakładające się na siebie kanały różniły się lokalizacją lub aby znaczniki były wyrażone w oddzielnych komórkach.
Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że cytometria przepływowa jest wszechstronną techniką analizy obrazów histologicznych na poziomie pojedynczej komórki. Podczas gdy starsze techniki mogą być ograniczone do analizy komórek, które nie mają bezpośredniego kontaktu komórka-komórka, ten proces analizy może rozdzielać komórki w kontakcie, co czyni go odpowiednim do badania komórek w tkankach w homeostazie lub podczas zapalenia, gdy komórki odpornościowe skupiają się w miejscach uszkodzenia.

Stan zapalny wywołany przez komórki układu odpornościowego i komórki glejowe może przyczyniać się do przewlekłych zaburzeń OUN, gdzie każda populacja może promować aktywność drugiej1,2,3. Zrozumienie, w jaki sposób układ odpornościowy oddziałuje z tymi elementami OUN w celu promowania zapalenia OUN, jest obecnie głównym tematem zainteresowania i zostało znacznie ułatwione dzięki technikom o wysokich parametrach, takim jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek. Dzięki sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki odkryliśmy, że istnieje rozległa komunikacja zachodząca między komórkami glejowymi a układem odpornościowym w kilku zaburzeniach OUN4,5,6. Zrozumienie, w jaki sposób te interakcje wpływają na te zaburzenia, będzie miało kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia biologii tych chorób.
Jednym z problemów związanych z analizami sekwencjonowania pojedynczych komórek jest to, że techniki te wymagają uszkodzenia tkanki w celu uzyskania pojedynczych komórek lub jąder, co skutkuje całkowitą utratą informacji przestrzennej. Wiedza o tym, gdzie w tkance znajduje się komórka, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli komórki w napędzaniu stanu zapalnego. Na przykład komórki odpornościowe, takie jak limfocyty B, mogą koncentrować się w OUN podczas zapalenia nerwów; jednak rzadko dostają się do miąższu OUN i zamiast tego koncentrują się w barierach OUN7. Biorąc pod uwagę ich lokalizację, jest mało prawdopodobne, aby komórki te przyczyniały się do zapalenia OUN poprzez fizyczną interakcję z komórkami glejowymi w miąższu OUN, co sugeruje, że wszelkie interakcje, które mogą mieć z komórkami glejowymi, zachodzą poprzez wydzielane czynniki. Dodatkowo, patologia występująca w zaburzeniach OUN często ma structure8,9 tak, że lokalizacja komórki w tkance może krytycznie określić, czy aktywnie przyczynia się ona do zaburzenia, czy też jest osobą postronną. W związku z tym niezbędne jest wykorzystanie orientacji przestrzennej do oceny roli komórki w patologii.
Badanie komórek w tkance zazwyczaj odbywa się za pomocą immunohistochemii lub immunologicznej mikroskopii fluorescencyjnej. Problem z tymi technikami polega na tym, że zazwyczaj mogą one obrazować tylko do czterech parametrów jednocześnie. Jest to główne ograniczenie tych technik, ponieważ wiemy z analiz cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, że wiele populacji komórek wymaga dwóch lub więcej parametrów do ich identyfikacji; Ponadto liczba wymaganych parametrów zwykle wzrasta podczas wyszukiwania określonych podzbiorów typu komórki10. W związku z tym niepraktyczne jest stosowanie standardowych technik obrazowania do badania, w jaki sposób podzbiory komórek mogą oddziaływać w tkance.
Ten problem został częściowo rozwiązany dzięki nowszym metodom o wysokich parametrach, które mogą zachować informacje przestrzenne, takim jak sekwencjonowanie przestrzenne RNA11 i obrazowanie cytometrii masowej12. Chociaż techniki te są cenne, mają kilka problemów, takich jak brak powszechnej dostępności, redukcja danych trójwymiarowych do dwóch wymiarów i wymaganie znacznej wiedzy specjalistycznej do wykonania. Inna technika znana jako barwienie sekwencyjne, w której tkanki są barwione jednym zestawem przeciwciał, a następnie inaktywacja poprzedniego zestawu przeciwciał przed barwieniem innym zestawem przeciwciał, może osiągnąć wysokoparametrową histologię bez potrzeby specjalistycznego sprzętu lub specjalistycznej wiedzy13,14,15. Jednak barwienie sekwencyjne może być niezwykle pracochłonne i wymaga dużej ilości czasu mikroskopowego, co może być niepraktyczne dla laboratoriów, które nie posiadają osobistego mikroskopu. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na techniki, które mogą rozszerzyć liczbę parametrów fluorescencyjnych, które można obrazować w tym samym czasie na mikroskopach, które są powszechnie dostępne i w odpowiednim czasie.
Po uzyskaniu danych o wysokich parametrach, pojawia się kolejny problem: konwencjonalne metody analizy obrazu raczej nie pozwolą skutecznie przeanalizować danych. Techniki takie jak ręczne zliczanie lub progowanie są opłacalne tylko wtedy, gdy analiza składa się z jednego parametru lub jeśli wiele markerów ma tę samą lokalizację, w której zliczane są tylko nakładające się sygnały. To ograniczenie sprawia, że tradycyjna analiza nie nadaje się do pracy z zestawami danych o wysokich parametrach. Udana analiza tych zbiorów danych została osiągnięta poprzez segmentację pojedynczych komórek na podstawie obrazów histologicznych, a następnie przeprowadzenie strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej w celu identyfikacji typów komórek16,17. Jednak inną kwestią, która wpływa na te analizy, jest to, że działają one tylko w przypadku zestawów danych, w których wszystkie komórki będące przedmiotem zainteresowania są fizycznie oddzielone od siebie, ponieważ techniki te nie wykorzystują metod, które mogłyby dokładnie oddzielić komórki, które są w kontakcie fizycznym. W związku z tym potrzebna jest nowsza metoda, która może przeprowadzać analizy pojedynczych komórek na skrawkach histologicznych, nawet jeśli komórki są w kontakcie fizycznym.
W tym artykule opisany jest prosty protokół zwany cytometrią przepływową, który został wcześniej wprowadzony18, który rozszerza liczbę parametrów fluorescencyjnych, które mogą być jednocześnie obrazowane za pomocą powszechnie dostępnych mikroskopów. Protokół ten działa poprzez barwienie tkanek spektralnie nakładającymi się barwnikami, a następnie wykorzystanie kompensacji spektralnej do usunięcia krwawienia z nakładających się kanałów w celu uzyskania wyraźnych pojedynczych plam. Aby ułatwić analizę wysokoparametrowych obrazów histologicznych, opisano szczegółowy potok analizy, który wyodrębnia pojedyncze komórki z odcinków tkanek w celu sortowania komórek w odrębne populacje przy użyciu strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej. Protokół ten działa w tkankach, w których komórki są rozproszone oraz w tkankach, w których komórki są ściśle zagęszczone razem, dzięki czemu technika ta jest wszechstronna w badaniu tkanek takich jak OUN zarówno w homeostazie, jak i zapaleniu nerwów. Cytometria przepływowa jest zatem przydatną techniką do badania interakcji między złożonymi typami komórek, które wymagają wielu markerów komórkowych do zdefiniowania komórek przy jednoczesnym zachowaniu informacji przestrzennych.

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma</td><td>676829-1L</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Anakonda</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.anaconda.com/download <tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna z plam rybnych na zimno&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Sortowanie wielokanałowych danych ze skryptu Imaris.ipynb</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Konwertuj</td></tr> <tr><td>dane wyjściowe FlowJo na plik txt w celu wyboru komórki w skrypcie Imaris.ipynb</td><td>N</td><td>/A N/A</td><td>https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Donkey</td></tr> <tr><td>anti-rat Alexa Fluor 647</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>1:300 stężenie</td></tr><tr><td>Osioł anty-szczurzy DyLight 405</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-475-153</td><td>1:200</td></tr><tr><td>stężenie Surowica osła</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2-koza anty-mysie IgG PerCP-eFluor 710</td><td>Thermofisher</td><td>46-4010-82</td><td>1:25 stężenie</td></tr><tr><td>FIDŻI</td><td>N/</td><td>A NIE DOTYCZY</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Oprogramowanie 4</td></tr><tr><td>Przeglądarka</td><td></td><td></td> spektrawizora fluorescencji <td>https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/</td></tr> <tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Świeżo mrożone ludzkie odcinki migdałków</td><td>amsbio</td><td>HF-707</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-ludzka IgA Alexa Fluor 488</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>109-546-011</td><td>1:400</td></tr><tr><td>stężenie Koza anty-ludzka IgG Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>709-166-098</td><td>1:400</td></tr><tr><td>stężenie Koza anty-ludzka IgM Dylight 405</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>109-476-129</td><td>1:300</td></tr><tr><td>stężenie Kozia anty-królik A546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11035</td><td>1:250 stężenie</td></tr><tr><td>Koza anty-królik IgG PE-Alexa Fluor 610</td><td>Thermofisher</td><td>A-20981</td><td>stężenie 1:250</td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>Ilastik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ilastik.org/ <tr><td>Ilastik FIJI</td><td>plugin N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin<tr><td>Imaris File Converter</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Software 2</td></tr><tr><td>Imaris z modułem komórkowym</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Software 3</td></tr><tr><td>kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>LasX Life Science software</td><td>Leica</td><td></td><td>Software 1</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD20</td><td>VWR</td><td>CA95024-322</td><td>1:40 stężenie</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD38 APC-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>564980</td><td>Stężenie 1:20</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica myszy</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>015-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica królika</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>011-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica szczura</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>012-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Yellow</td><td>Abcam</td><td>ab138903</td><td>Rozpuścić w DMSO w stężeniu 2 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4&deg; C w ciemności</td></tr><tr><td>Długopis PAP</td><td>Cedarlane</td><td>MU22</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>1:500 stężenie</td></tr><tr><td>Królik anty-mysz Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:500 stężenie</td></tr><tr><td>Szczur anty-ludzki Sterowiec1</td><td>Thermofisher</td><td>14-5963-82</td><td>1:40 stężenie</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz B220 Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>103226</td><td>stężenie 1:250</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz CD138</td><td>Biolegend</td><td>142502</td><td>stężenie 1:200</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz CD3 PE-eFluor 610</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61-0032-82</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD4 Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td></td><td>100529 stężenie 1:200</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD45 allofikocyjanina-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>565478</td><td>stężenie 1:50</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysi IgD PerCP-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5993-82</td><td>1:50 stężenie</td></tr><tr><td>SP8 Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Trueblack</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Kulki koralikowe Sigma</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultracomp</td><td>Thermofisher</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Generating and Analyzing High-Parameter Histology Images with Histoflow Cytometry

Użycie histologii do badania różnorodności komórek odpornościowych w sekcjach tkankowych, takich jak te pochodzące z ośrodkowego układu nerwowego (OUN), jest krytycznie ograniczone przez liczbę parametrów fluorescencyjnych, które mogą być obrazowane w tym samym czasie. Większość podzbiorów komórek odpornościowych została zdefiniowana za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu złożonych kombinacji markerów białkowych, często wymagających czterech lub więcej parametrów do jednoznacznej identyfikacji, co wykracza poza możliwości większości konwencjonalnych mikroskopów. Ponieważ cytometria przepływowa dysocjuje tkanki i traci informacje przestrzenne, istnieje zapotrzebowanie na techniki, które mogą zachować informacje przestrzenne podczas badania ról złożonych typów komórek. Zagadnienia te zostały tutaj rozwiązane poprzez stworzenie metody rozszerzania liczby parametrów fluorescencyjnych, które można obrazować, zbierając sygnały spektralnie nakładających się fluoroforów i wykorzystując demiksowanie widmowe do oddzielenia sygnałów każdego pojedynczego fluoroforu. Obrazy te są następnie przetwarzane przy użyciu potoku analitycznego w celu wykonania wysokoparametrowych obrazów histologicznych i wyodrębnienia pojedynczych komórek z tych obrazów, tak aby unikalne właściwości fluorescencyjne każdej komórki mogły być analizowane na poziomie pojedynczej komórki. Korzystając ze strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, komórki można następnie profilować w podzbiory i mapować z powrotem na skrawki histologiczne, aby nie tylko określić ilościowo ich liczebność, ale także ustalić, w jaki sposób oddziałują ze środowiskiem tkankowym. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano prostotę i potencjał wykorzystania cytometrii przepływowej do badania złożonych populacji immunologicznych w sekcjach histologicznych.

<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat pracy histoflow cytometrii. Przekroje tkankowe są barwione barwnikami o nakładających się widmach (krok 1). Obrazy są zbierane przy użyciu poszczególnych laserów wzbudzających w połączeniu z regulowanymi filtrami przepustowymi w celu zminimalizowania przenikania spektralnego między fluoroforami (krok 2). Przenikanie spektralne między kanałami jest korygowane na podstawie macierzy kompensacyjnej wygenerowanej przy użyciu kontrolek tkankowych barwionych pojedynczym kolorem (krok 3). Jądra i komórki na obrazach są następnie identyfikowane przy użyciu oprogramowania ilastik (krok 4) i dzielone na pojedyncze komórki w Software 3 (krok 5). Przed eksportem wszystkich danych z Software 3 do Software 4 w celu przeprowadzenia analizy cytometrycznej wprowadzane są dodatkowe parametry. Następnie tożsamości komórek są eksportowane z Software 4 i przypisywane z powrotem do identyfikatorów komórek w oryginalnej tkance, aby określić lokalizację przestrzenną komórek w przekrojach tkankowych (krok 6). Symbole pieniędzy oznaczają oprogramowanie komercyjne wymagające zakupu, a symbole komputerów oznaczają oprogramowanie bezpłatne. Przybliżony czas każdego kroku jest wskazany obok klepsydry. Oprogramowanie komercyjne jest wymienione w Tabeli materiałów. Rycina została opracowana na podstawie pracy Jain i wsp.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Na Rycynie 3 tkanki węzłów chłonnych zabarwiono przeciwciałem szczurzym anty-mysim CD138 w połączeniu z wtórnym przeciwciałem osiołkowym anty-szczurzym Dylight 405, barwnikiem Nuclear Yellow, przeciwciałem szczurzym anty-mysim CD4 sprzężonym z Alexa Fluor 488, przeciwciałem szczurzym anty-mysim IgD sprzężonym z PerCP-eF710, przeciwciałem króliczym anty-mysim Iba1 w połączeniu z wtórnym przeciwciałem osiołkowym anty-króliczym Alexa Fluor 546, przeciwciałem szczurzym anty-mysim CD3ε sprzężonym z PE-eF610, przeciwciałem szczurzym anty-mysim B220 sprzężonym z Alexa Fluor 647 oraz przeciwciałem szczurzym anty-mysim CD45 sprzężonym z APC-R700. Do wzbudzenia barwników Dylight 405 i Nuclear Yellow użyto fioletowego lasera 405 nm, a ich emisję wykrywano odpowiednio w zakresach 408-438 nm i 460-530 nm. Do wzbudzenia barwników Alexa Fluor 488 i PerCP-eF710 użyto zielonego lasera 488 nm, a ich emisję wykrywano odpowiednio w zakresach 495-545 nm i 682-750 nm. Do wzbudzenia barwników Alexa Fluor 546 i PE-eF610 użyto żółto-zielonego lasera 552 nm, a ich emisję wykrywano odpowiednio w zakresach 557-600 nm i 615-652 nm. Do wzbudzenia barwników Alexa Fluor 647 i APC-R700 użyto czerwonego lasera 640 nm, a ich emisję wykrywano odpowiednio w zakresach 647-682 nm i 700-750 nm.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Przykłady błędnej i prawidłowej kompensacji. Kuleczki zostały zabarwione przeciwciałem sprzężonym z PE-eFluor 610, a obrazy wykonano w kanałach odpowiadających PE-eFluor 610 (PE-eF610) oraz Alexa Fluor 546 (A546). Do tego samego obrazu w kanale A546 zastosowano różne stopnie kompensacji (redukcja o 10% dla niedokompensacji, 28% dla prawidłowej kompensacji oraz 60% dla nadkompensacji), aby usunąć przesączanie sygnału (bleed-through) z fluoroforu PE-eF610, co doprowadziło do różnych stopni separacji. W celu lepszej wizualizacji stopni kompensacji przedstawiono rozjaśnioną wersję obrazów przesączania. Żółta strzałka wskazuje ten sam obszar na każdym obrazie, odpowiadający miejscu, w którym występuje rzeczywiste zabarwienie w kanale PE-eF610. Paski skali: 4 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig03.jpg" /> 
Rycina 3: Kompensacja fluorescencji z wykorzystaniem barwionych przekrojów tkanek. (A-C) Przekroje tkanek węzła chłonnego zabarwiono pojedynczymi przeciwciałami sprzężonymi z wymienionymi fluoroforami. Próbki z pojedynczym barwieniem bez kompensacji obrazowano we wszystkich kanałach (A, góra), a następnie zastosowano kompensację w kontrolach jednobarwnych (A, dół). (B) Przenikanie sygnału (bleed-through) między kanałami w (A) zostało ilościowo określone (średnia intensywność fluorescencji aktualnego obrazu podzielona przez średnią intensywność fluorescencji kanału aktualnego fluoroforu) i przedstawione na mapach ciepła. Białe kwadraty reprezentują wartości przekraczające 100% przenikania. (C) Nakładanie się widm oceniono w warunkach bez kompensacji oraz kompensacji opartej na komórkach poprzez porównanie separacji widmowej Iba1-A546 i CD3-PEeF610 w próbkach w pełni zabarwionych. Paski skali: 30 µm. Rycina została opracowana na podstawie pracy Jain i wsp.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Postępując zgodnie z niniejszym protokołem (podsumowanym na Ryc. 1), barwniki fluorescencyjne o nakładających się widmach powinny zostać skutecznie rozdzielone, co przedstawiono na Ryc. 3A,B. Choć całkowite rozdzielenie barwników może nie być możliwe, separacja powinna być wystarczająca, aby wyraźnie odróżnić różne typy komórek (Ryc. 3C). Jeśli w innym kanale nadal widoczne są cienie komórek o nakładających się widmach, może to wskazywać na wciąż występujący efekt przenikania sygnału (bleed-through), co może wymagać ponownego przetworzenia obrazów (Ryc. 2). Ponadto nadkompensacja będzie widoczna, jeśli obszar skompensowany spadnie poniżej poziomów fluorescencji związanych z barwieniem tła i pojawi się w postaci czarnych obszarów w miejscach, w których wcześniej występowało przenikanie sygnału (Ryc. 2). Nadkompensacja może prowadzić do utraty rzeczywistego sygnału w kanale, w którym zastosowano kompensację, i należy jej unikać. Niemniej jednak, jeśli protokół został przeprowadzony prawidłowo, nie powinny wystąpić problemy z kompensacją, a zatem badacz powinien rozważyć, czy widoczne przenikanie sygnału jest artefaktem, czy elementem biologii.
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Przykład detekcji jąder komórkowych i komórek w programie ilastik. Żółte barwienie jąder (lewy górny róg) posłużyło do zidentyfikowania jąder (prawy górny róg, kolor żółty) oraz obszarów niebędących jądrami (kolor niebieski). Reprezentatywne barwienie CD45 (lewy dolny róg) wykorzystano do zidentyfikowania komórek (prawy dolny róg, kolor żółty) oraz obszarów niebędących komórkami (kolor niebieski). Rysunek został opracowany na podstawie pracy Jain i wsp.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Po dokładnym rozdzieleniu barwników niezbędne jest rozbicie tkanki na pojedyncze komórki w celu przeprowadzenia analiz jednokomórkowych. Protokół opisany w niniejszym opracowaniu wykorzystuje zdefiniowane przez użytkownika uczenie maszynowe (Rysunek 4) do rozdzielania komórek, nawet gdy są one ściśle upakowane, co pokazano w przypadku węzłów chłonnych na Rysunku 6.
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Ocena poprawności ustawienia bramki. Przedstawiono reprezentacyjne barwienie CD138 (kolor cyjanowy) w węźle chłonnym; w celu zidentyfikowania komórek CD138+ w tkance utworzono trzy oddzielne bramki (wykres kropkowy po lewej stronie). Zbyt konserwatywną ocenę liczby komórek CD138+ przedstawiono jako niebieską bramkę i naniesiono na tkankę kolorem niebieskim. Zrównoważoną ocenę komórek CD138+ przedstawiono jako zieloną bramkę i naniesiono na tkankę kolorem zielonym. Zbyt liberalną ocenę komórek CD138+ przedstawiono jako czerwoną bramkę i naniesiono na tkankę kolorem czerwonym. Żółte koło oznacza obszar, w którym komórki CD138+ nie zostały zidentyfikowane przez zbyt konserwatywną bramkę, a purpurowe koło oznacza obszar bez komórek CD138+, który został uznany za zawierający komórki CD138+ przez zbyt liberalną bramkę. Paski skali: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Należy zachować ostrożność podczas określania precyzyjnych pozycji bramek w analizie cytometrii przepływowej (pokazanej na Rysunku 5), aby upewnić się, że bramki te nie zawyżają ani nie zaniżają liczebności komórek. Powinno to zostać zweryfikowane poprzez mapowanie komórek z powrotem na tkankę, jak na Rysunku 5, w celu sprawdzenia, czy komórki wykazujące ekspresję interesujących nas markerów są uwzględniane w analizie. Jeśli wybieranych jest zbyt wiele komórek (na przykład komórki niewykazujące ekspresji CD138 są kwalifikowane jako CD138+), należy przesunąć bramki tak, aby były mniej dopuszczalne; natomiast jeśli wybieranych jest zbyt mało komórek, należy zwiększyć ich dopuszczalność. Bramki powinny być optymalizowane pod kątem selektywności w taki sposób, aby w pierwszej kolejności zoptymalizować bramki nadrzędne, a następnie każdą kolejną bramkę w łańcuchu. Ostatecznie skuteczna optymalizacja strategii bramkowania powinna umożliwiać wyodrębnienie interesujących nas subpopulacji komórek (Rysunek 6 i Rysunek 7).
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Identyfikacja komórek w przekrojach tkanek w oparciu o cytometrię przepływową. (A) Wartości fluorescencji wyeksportowane z pojedynczych komórek z oprogramowania Software 3 w przekrojach węzłów chłonnych zostały przeanalizowane w oprogramowaniu Software 4 w celu zidentyfikowania określonych populacji komórek na podstawie przedstawionej strategii bramkowania. (B) Populacje zidentyfikowane w Software 4 zostały naniesione z powrotem na ten sam przekrój tkanki i wygenerowano powierzchnie dla każdej populacji. Barwienie CD45 nie jest pokazane. Pasek skali: 30 µm. Rysunek został zaadaptowany z pracy Jain et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig07.jpg" /> 
Rysunek 7: Analiza poszczególnych barwień i populacji w węzłach chłonnych myszy. W górnych panelach przedstawiono pojedyncze barwienia markerów komórek odpornościowych, a poniżej każdego z nich odpowiadającą im populację wyodrębnioną (gate), zidentyfikowaną na Rysunku 6A. Pasek skali: 30 µm, widoczny w górnym lewym panelu. Rysunek został zaadaptowany z pracy Jain et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Technika ta była wcześniej wykorzystywana18 do charakteryzacji nacieków komórek odpornościowych do rdzeni kręgowych podczas neurostanu zapalnego; potwierdzono, że przy zastosowaniu histoflowcytometrii i cytometrii przepływowej uzyskuje się równoważne proporcje naciekających komórek odpornościowych. Technika ta została również zwalidowana, wykazując skuteczność w śledzionach i mózgach myszy oraz zdolność do identyfikacji różnic między warunkami traktowania, co zostało odtworzone w identycznych eksperymentach z zastosowaniem cytometrii przepływowej (niepublikowane). Metoda ta była również stosowana do analizy rdzeni kręgowych myszy poddawanych stereotaktycznym wtryskiwaniom w modelach OUN.
<img alt="Rycina 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig08.jpg" /> 
Rycina 8: Rozdzielenie 8 barwników w przekroju ludzkiego ciała migdałkowatego. Przekroje ludzkiego ciała migdałkowatego zabarwiono CD20 w celu identyfikacji limfocytów B oraz IgM, IgA i IgG w celu identyfikacji komórek plazmatycznych. Wprowadzono barwienia Blimp1 i CD38 w celu dalszej walidacji tożsamości komórek plazmatycznych oraz Ki67 do identyfikacji komórek proliferujących. Barwienie Nuclear yellow nie jest pokazane na obrazie złożonym. Pasek skali: 22 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Niniejszą technikę można również zastosować do analizy przekrojów tkanek ludzkich. Jako przykład barwienia w tkankach ludzkich, przekroje migdałka ludzkiego zabarwiono przy użyciu wybranych 8 markerów: przeciwciała koziego przeciwko ludzkim IgM sprzężonego z Dylight 405, Nuclear Yellow, przeciwciała koziego przeciwko ludzkim IgA sprzężonego z Alexa Fluor 488, przeciwciała mysiego przeciwko ludzkiemu CD20 w połączeniu z fragmentem F(ab')2 koziego przeciwciała przeciwko mysiem sprzężonym z PerCP-eFluor 710, przeciwciała koziego przeciwko ludzkim IgG sprzężonego z Cy3, przeciwciała króliczego przeciwko ludzkiemu Ki67 w połączeniu z przeciwciałem kozim przeciwko króliczym sprzężonym z PE-Alexa Fluor 610, przeciwciała szczurzego przeciwko ludzkiemu Blimp1 w połączeniu z przeciwciałem osiołkowym przeciwko szczurzym sprzężonym z Alexa Fluor 647 oraz przeciwciała mysiego przeciwko ludzkiemu CD38 sprzężonego z APC-R700. Po kompensacji można zaobserwować separację tych markerów w przekroju migdałka (Rysunek 8). Demonstruje to użyteczność tej techniki w różnych tkankach i gatunkach.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa roztworu</td>
			<td colspan="2">Skład</td>
			<td colspan="4">Jak przygotować</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor blokujący</td>
			<td colspan="2">10% surowicy końskiej, 1% BSA i 0,1% żelatyny do barwienia ryb (cold fish stain gelatin) w PBS</td>
			<td colspan="4">Dodać 5 ml surowicy konia, 0,5 g BSA, 50 &#956;L do 45 mL PBS dodać żelatynę do barwienia zimnych ryb. Rozdzielić ten roztwór do probówek o pojemności 15 mL i przechowywać w temperaturze -20 &#176;C do momentu użycia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do permeabilizacji i blokowania</td>
			<td colspan="2">10% surowicy konia, 1% BSA, 0,1% zimnej żelatyny barwiącej ryby, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween-20 w PBS</td>
			<td colspan="4">Dodać 5 ml surowicy konia, 0,5 g BSA, 50 &#956;L żelatynowe barwienie zimnych ryb, 50 &#956;L Triton X-100 oraz 25 &#956;L Tween-20 do 45 ml PBS. Rozdziel ten roztwór do probówek o pojemności 15 ml i przechowuj w temperaturze -20 &#176;C do momentu użycia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do permeabilizacji i barwienia</td>
			<td colspan="2">1% BSA, 0,1% zimna żelatyna z barwnikiem do ryb, 0,5% Triton X-100 w PBS</td>
			<td colspan="4">Dodać 0,5 g BSA, 50 &#956;L żelatynowe barwienie zimnych ryb oraz 250 &#956;L Triton X-100 do 50 ml PBS. Rozdziel ten roztwór do probówek o pojemności 15 ml i przechowuj w temperaturze -20 &#176;C do momentu użycia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor gaszący</td>
			<td colspan="2">5% Trueblack, 66,5% etanolu, 28,5% wody</td>
			<td colspan="4">Podgrzać roztwór Trueblack do temperatury 70 &#176;C przez 5 min. Następnie dodać 50 &#956;L z Trueblack na 950 &#956;L 70% etanolu w celu przygotowania buforu Trueblack. Należy przygotowywać go na świeżo przed każdym użyciem. Będą potrzebne około500 &#956;L na slajd, choć konkretne ilości będą zależeć od rodzaju badanych tkanek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor barwiący</td>
			<td colspan="2">1% BSA i 0,1% żelatyny barwiącej ryby (cold fish stain gelatin) w PBS</td>
			<td colspan="4">Dodać 0,5 g BSA i 50 &#956;L barwnik do zimnych ryb z żelatyną do 50 ml PBS. Rozdziel ten roztwór do probówek 15 ml i przechowuj w temperaturze -20 &#176;C do momentu użycia.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista roztworów i ich składów niezbędnych do barwienia przekrojów tkanek.
Uzupełniający plik z kodem 1: Skrypt w języku Python, który zbiera wartości fluorescencji z każdego kanału i tworzy jeden plik podsumowujący. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/Supplementary Coding File 1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający z kodem 2: Skrypt Python, który tworzy listę wszystkich numerów ID bramkowanych komórek w pliku tekstowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/Supplementary Coding File 2v2.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.

Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

The usage of histology to investigate immune cell diversity in tissue sections such as those derived from the central nervous system (CNS) is critically ...

Naszym nadrzędnym celem jest zbadanie, w jaki sposób komórki układu odpornościowego i komórki glejowe w ośrodkowym układzie nerwowym przyczyniają się do rozwoju i progresji zaburzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Mikroskopia immunofluorescencyjna jest standardową i szeroko stosowaną techniką w różnych dyscyplinach biologicznych i ma zasadnicze znaczenie dla neuronauki i badań immunologicznych. Jednym z głównych problemów, które nękają badaczy, jest to, że mikroskopia immunofluorescencyjna jest zazwyczaj ograniczona pod względem liczby sond, które można obrazować za jednym razem, ze względu na ograniczenia konwencjonalnych mikroskopów.W tym protokole opisano metodę zwiększania liczby sond, które wiele mikroskopów może obrazować jednocześnie, oraz zapewniamy potok analizy do przetwarzania obrazów o dużej gęstości informacji. Zaletą tego protokołu jest to, że można go dostosować do wielu powszechnie dostępnych mikroskopów i jest łatwy do wykonania, co sprawi, że multipleksowa analiza histologiczna będzie dostępna dla większej liczby laboratoriów. Aby rozpocząć, ustaw mikroskop fluorescencyjny do obrazowania.Włożyć całkowicie wybarwione szkiełko z sekcjami tkanki barwienia immunologicznego. Po ustawieniu celu naciśnij przycisk na żywo, a następnie skup się na próbce. Użyj ikony autoskalowania, aby ocenić, czy kanały są odpowiednio nasycone sygnałem.Po sfinalizowaniu ustawień mikroskopu załaduj do mikroskopu jednokolorowe szkiełka kontrolne. Skoncentruj się poniżej próbki i naciśnij opcję rozpoczęcia w menu stosu Zs, aby rozpocząć konfigurowanie stosu Z. Następnie ustaw ostrość nad próbką i naciśnij opcję końca.Aby skompensować fluorescencję obrazów, otwórz jeden z pojedynczych obrazów kontrolnych. Obserwuj okna skali szarości dla każdego kanału dla sygnału w nieodpowiednim kanale. Aby usunąć, ręcznie wprowadź liczby do matrycy, a następnie naciśnij Zastosuj, aby sprawdzić, czy została ona odpowiednio usunięta.Następnie zbierz wszystkie wartości z każdej kontrolki w jedną macierz. Nałożyć tę matrycę na całkowicie wybarwioną próbkę. Uruchom oprogramowanie ilastik i otwórz plik TIFF tkanek.Kliknij kartę treningu, a następnie użyj narzędzia pędzel, aby podświetlić poszczególne komórki na obrazach. Upewnij się, że podświetlisz komórki tak, aby wnętrze i błona komórkowa były uwzględnione. Następnie użyj etykiety drugiej, aby podświetlić wszystko, co nie jest interesującymi komórkami.Teraz uruchom oprogramowanie 3 i otwórz obraz IMS tkanki zawierającej wszystkie barwniki fluorescencyjne. Wybierz opcję maski nad jądrami jako kanał źródłowy do wykrywania jąder, a następnie wybierz opcję zaawansowaną do rozdzielania jąder według punktów zarodkowych. Ustaw wartość średnicy jądra.Sprawdź obraz pod kątem połączonych wielu komórek lub brakujących komórek. Następnie kliknij obiekt utworzonych komórek, a następnie zakładkę tworzenia, a następnie opcję zapisz parametry dla partii, aby zapisać ustawienia użytkowania. Uruchom program Anaconda, a następnie uruchom program Jupyter Lab w programie Anaconda.Otwórz dodatkowy plik kodowania, a następnie naciśnij uruchom wszystkie komórki lub uruchom wybrane komórki w menu uruchom. Gdy pojawi się monit, wprowadź katalog plików dla wyeksportowanych wartości fluorescencji. Następnie wprowadź katalog plików dla dowolnej lokalizacji odpowiedniej do zapisania przetworzonych plików.Uruchom następną sekcję kodu, aby dodać adnotacje do danych z nazwami każdego kanału. Po ustaleniu strategii bramkowania kliknij prawym przyciskiem myszy populację w menu, a następnie wybierz eksport. Wyeksportuj parametry jako plik CSV z dołączonymi nagłówkami.Uruchom ponownie Jupyter Lab w Anakondzie. Następnie otwórz skrypt w dodatkowym pliku kodowania drugim i uruchom kod. Po wyświetleniu monitu o wprowadzenie lokalizacji pliku oprogramowania czterech, wprowadź katalog plików wyeksportowanych plików CSV.Następnie, po wyświetleniu monitu o dodanie lokalizacji wyjściowej, wybierz wybrany katalog plików i upewnij się, że katalog plików zawiera nazwę pliku na końcu. Uruchom pozostałą część kodu. Teraz skopiuj tekst w pliku txt i otwórz odpowiedni plik IMS w oprogramowaniu trzecim.Kliknij na sprzedaj obiekt w pliku. Przejdź do zakładki statystyk, a następnie wklej tekst w pasku wyszukiwania i rozpocznij wyszukiwanie. Wszystkie interesujące komórki zostaną teraz podświetlone.Widmowo nakładające się barwniki fluorescencyjne zostały skutecznie oddzielone w tkance, która została zabarwiona wieloma barwnikami. Rozdzielenie barwników wyraźnie różnicowało różne typy komórek w tkance limfatycznej. Zdefiniowane przez użytkownika uczenie maszynowe zostało wykorzystane do rozdzielenia komórek nawet wtedy, gdy są blisko siebie zagęszczone.

generating-analyzing-high-parameter-histology-images-with-histoflow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

ExCYT to graficzny interfejs użytkownika (GUI) oparty na MATLAB, który pozwala użytkownikom analizować dane cytometrii przepływowej za pomocą powszechnie stosowanych technik analitycznych dla danych wysokowymiarowych, w tym redukcji wymiarowości za pomocą t-SNE, różnych automatycznych i ręcznych metod grupowania, map cieplnych i nowatorskich wysokowymiarowych wykresów przepływu.

ExCYT: Graficzny interfejs użytkownika usprawniający analizę danych z cytometrii wielowymiarowej

Cytofast to narzędzie do wizualizacji używane do analizy wyników z grupowania. Cytofast może być używany do porównywania dwóch metod grupowania: FlowSOM i Cytosplore. Cytofast może szybko wygenerować ilościowy i jakościowy przegląd danych z cytometrii masowej i podkreślić główne różnice między różnymi algorytmami grupowania.

Wizualizacja i kwantyfikacja danych z cytometrii wielowymiarowej przy użyciu Cytofast i metod grupowania FlowSOM i Cytosplore

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj pokazujemy, że lasery o dużej mocy 375 nm i 405 nm mogą skutecznie wzbudzić Hoechst 33342 i służyć jako realna alternatywa dla lasera 355 nm do wykrywania komórek populacji bocznej (SP), rozszerzając tym samym zakres dostępnych laserów w zastosowaniach cytometrii przepływowej.

Skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej

Odkryj metodę analizy wysokoparametrowych obrazów histologicznych przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej i potoku obliczeniowego. Ta technika umożliwia identyfikację podzbiorów komórek odpornościowych i glejowych w chorobach neurologicznych.

Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów