Name: Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Odkryj metodę analizy wysokoparametrowych obrazów histologicznych przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej i potoku obliczeniowego. Ta technika umożliwia identyfikację podzbiorów komórek odpornościowych i glejowych w chorobach neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Zaawansowanej Platformie Mikroskopowej Instytutu Mózgu Hotchkiss za infrastrukturę obrazowania i wiedzę. RWJ był wspierany przez stypendia podoktorskie z programu University of Calgary Eyes High oraz przez Multiple Sclerosis Society of Canada i nieograniczone stypendium edukacyjne Roche Canada. VWY otrzymało wsparcie płacowe w ramach programu Canada Research Chair Tier 1. Praca ta była wspierana przez fundusze operacyjne z Kanadyjskiego Instytutu Zdrowia Grant 1049959, Stwardnienia Rozsianego Towarzystwa Kanadyjskiego Grant 3236 oraz Departamentu Obrony USA w ramach Kongresowo Kierowanego Programu Badań nad Stwardnieniem Rozsianym. Rysunek 1 jest tworzony za pomocą BioRender.com. Rysunki zaadaptowane w tej publikacji zostały pierwotnie opublikowane w The Journal of Immunology. Rajiv W. Jain, David A. Elliott i V. Wee Yong. 2023. Analiza pojedynczych komórek wysokoparametrowych obrazów histologicznych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. J. Immunol. 210: 2038-2049. Prawa autorskie © [2023]. Amerykańskie Stowarzyszenie Immunologów, Inc.

Immunofluorescent Microscopy and Analysis for High-Parameter Tissue Imaging

<ol><li>Bar-Or, A., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunology+of+relapsing+multiple+sclerosis%3A+interactions%2C+checks%2C+and+balances%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances.</a> Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).</li>
<li>Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Immune+and+non-immune+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglia: Immune and non-immune functions.</a> Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).</li>
<li>Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-immune+cell+interactions+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology.</a> Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).</li>
<li>Absinta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lymphocyte-microglia-astrocyte+axis+in+chronic+active+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis.</a> Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).</li>
<li>Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+transcriptomics%3A+Deciphering+brain+complexity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease.</a> Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).</li>
<li>Schirmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+vulnerability+and+multilineage+diversity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis.</a> Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).</li>
<li>Jain, R. W., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+in+central+nervous+system+disease%3A+Diversity%2C+locations+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology.</a> Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).</li>
<li>Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+multiple+sclerosis%3A+Protectors+turn+destroyers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers.</a> Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).</li>
<li>Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practitioner%27s+view+of+spectral+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practitioner's view of spectral flow cytometry.</a> Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).</li>
<li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).</li>
<li>Ramaglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+immune+cells+in+staged+multiple+sclerosis+lesions+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry.</a> Elife. 8, e48051(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+staining+by+sequential+immunostaining+and+antibody+removal+on+routine+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections.</a> J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+An+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-cytometry%3A+A+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chrysalis%3A+A+new+method+for+high-throughput+histo-cytometry+analysis+of+images+and+movies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies.</a> J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).</li>
<li>Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+high-parameter+histology+images+using+histoflow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry.</a> J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Laboratory+Techniques.+Histological+Sample+Preparation+for+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+Interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Ruhlandt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantum+yield+measurements+of+fluorescent+proteins+using+a+plasmonic+nanocavity%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity.</a> Commun Biol. 3 (1), 627(2020).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+A+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. 79, 1-25 (2017).</li>
<li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+Principles+and+modern+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Guidance+for+quantitative+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+A+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

W tym miejscu opisano zastosowanie cytometrii przepływowej, techniki, która została wcześniej zwalidowana18. Wykazano, że podczas barwienia skrawków tkanek barwnikami nakładającymi się spektralnie, przesączanie się przez kanały można usunąć za pomocą kompensacji spektralnej, co skutkuje wyraźną rozdzielczością większej liczby parametrów fluorescencyjnych, niż byłoby to normalnie możliwe przy użyciu konwencjonalnych metod. Ponieważ obrazy histologiczne o wysokich parametrach są trudne do analizy pr...

Stan zapalny wywołany przez komórki układu odpornościowego i komórki glejowe może przyczyniać się do przewlekłych zaburzeń OUN, gdzie każda populacja może promować aktywność drugiej1,2,3. Zrozumienie, w jaki sposób układ odpornościowy oddziałuje z tymi elementami OUN w celu promowania zapalenia OUN, jest obecnie głównym tematem zainteresowania i zostało znacznie ułatwione dzięki technikom o wysokich parametrach, takim jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek. Dzięki sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki odkryliśmy, że istnieje rozległa komunikacja zachodząca między komórkami glejowymi a układem odpornościowym w kilku zaburzeniach OUN4,5,6. Zrozumienie, w jaki sposób te interakcje wpływają na te zaburzenia, będzie miało kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia biologii tych chorób.
Jednym z problemów związanych z analizami sekwencjonowania pojedynczych komórek jest to, że techniki te wymagają uszkodzenia tkanki w celu uzyskania pojedynczych komórek lub jąder, co skutkuje całkowitą utratą informacji przestrzennej. Wiedza o tym, gdzie w tkance znajduje się komórka, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli komórki w napędzaniu stanu zapalnego. Na przykład komórki odpornościowe, takie jak limfocyty B, mogą koncentrować się w OUN podczas zapalenia nerwów; jednak rzadko dostają się do miąższu OUN i zamiast tego koncentrują się w barierach OUN7. Biorąc pod uwagę ich lokalizację, jest mało prawdopodobne, aby komórki te przyczyniały się do zapalenia OUN poprzez fizyczną interakcję z komórkami glejowymi w miąższu OUN, co sugeruje, że wszelkie interakcje, które mogą mieć z komórkami glejowymi, zachodzą poprzez wydzielane czynniki. Dodatkowo, patologia występująca w zaburzeniach OUN często ma structure8,9 tak, że lokalizacja komórki w tkance może krytycznie określić, czy aktywnie przyczynia się ona do zaburzenia, czy też jest osobą postronną. W związku z tym niezbędne jest wykorzystanie orientacji przestrzennej do oceny roli komórki w patologii.
Badanie komórek w tkance zazwyczaj odbywa się za pomocą immunohistochemii lub immunologicznej mikroskopii fluorescencyjnej. Problem z tymi technikami polega na tym, że zazwyczaj mogą one obrazować tylko do czterech parametrów jednocześnie. Jest to główne ograniczenie tych technik, ponieważ wiemy z analiz cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, że wiele populacji komórek wymaga dwóch lub więcej parametrów do ich identyfikacji; Ponadto liczba wymaganych parametrów zwykle wzrasta podczas wyszukiwania określonych podzbiorów typu komórki10. W związku z tym niepraktyczne jest stosowanie standardowych technik obrazowania do badania, w jaki sposób podzbiory komórek mogą oddziaływać w tkance.
Ten problem został częściowo rozwiązany dzięki nowszym metodom o wysokich parametrach, które mogą zachować informacje przestrzenne, takim jak sekwencjonowanie przestrzenne RNA11 i obrazowanie cytometrii masowej12. Chociaż techniki te są cenne, mają kilka problemów, takich jak brak powszechnej dostępności, redukcja danych trójwymiarowych do dwóch wymiarów i wymaganie znacznej wiedzy specjalistycznej do wykonania. Inna technika znana jako barwienie sekwencyjne, w której tkanki są barwione jednym zestawem przeciwciał, a następnie inaktywacja poprzedniego zestawu przeciwciał przed barwieniem innym zestawem przeciwciał, może osiągnąć wysokoparametrową histologię bez potrzeby specjalistycznego sprzętu lub specjalistycznej wiedzy13,14,15. Jednak barwienie sekwencyjne może być niezwykle pracochłonne i wymaga dużej ilości czasu mikroskopowego, co może być niepraktyczne dla laboratoriów, które nie posiadają osobistego mikroskopu. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na techniki, które mogą rozszerzyć liczbę parametrów fluorescencyjnych, które można obrazować w tym samym czasie na mikroskopach, które są powszechnie dostępne i w odpowiednim czasie.
Po uzyskaniu danych o wysokich parametrach, pojawia się kolejny problem: konwencjonalne metody analizy obrazu raczej nie pozwolą skutecznie przeanalizować danych. Techniki takie jak ręczne zliczanie lub progowanie są opłacalne tylko wtedy, gdy analiza składa się z jednego parametru lub jeśli wiele markerów ma tę samą lokalizację, w której zliczane są tylko nakładające się sygnały. To ograniczenie sprawia, że tradycyjna analiza nie nadaje się do pracy z zestawami danych o wysokich parametrach. Udana analiza tych zbiorów danych została osiągnięta poprzez segmentację pojedynczych komórek na podstawie obrazów histologicznych, a następnie przeprowadzenie strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej w celu identyfikacji typów komórek16,17. Jednak inną kwestią, która wpływa na te analizy, jest to, że działają one tylko w przypadku zestawów danych, w których wszystkie komórki będące przedmiotem zainteresowania są fizycznie oddzielone od siebie, ponieważ techniki te nie wykorzystują metod, które mogłyby dokładnie oddzielić komórki, które są w kontakcie fizycznym. W związku z tym potrzebna jest nowsza metoda, która może przeprowadzać analizy pojedynczych komórek na skrawkach histologicznych, nawet jeśli komórki są w kontakcie fizycznym.
W tym artykule opisany jest prosty protokół zwany cytometrią przepływową, który został wcześniej wprowadzony18, który rozszerza liczbę parametrów fluorescencyjnych, które mogą być jednocześnie obrazowane za pomocą powszechnie dostępnych mikroskopów. Protokół ten działa poprzez barwienie tkanek spektralnie nakładającymi się barwnikami, a następnie wykorzystanie kompensacji spektralnej do usunięcia krwawienia z nakładających się kanałów w celu uzyskania wyraźnych pojedynczych plam. Aby ułatwić analizę wysokoparametrowych obrazów histologicznych, opisano szczegółowy potok analizy, który wyodrębnia pojedyncze komórki z odcinków tkanek w celu sortowania komórek w odrębne populacje przy użyciu strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej. Protokół ten działa w tkankach, w których komórki są rozproszone oraz w tkankach, w których komórki są ściśle zagęszczone razem, dzięki czemu technika ta jest wszechstronna w badaniu tkanek takich jak OUN zarówno w homeostazie, jak i zapaleniu nerwów. Cytometria przepływowa jest zatem przydatną techniką do badania interakcji między złożonymi typami komórek, które wymagają wielu markerów komórkowych do zdefiniowania komórek przy jednoczesnym zachowaniu informacji przestrzennych.

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma</td><td>676829-1L</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Anakonda</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.anaconda.com/download <tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna z plam rybnych na zimno&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Sortowanie wielokanałowych danych ze skryptu Imaris.ipynb</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Konwertuj</td></tr> <tr><td>dane wyjściowe FlowJo na plik txt w celu wyboru komórki w skrypcie Imaris.ipynb</td><td>N</td><td>/A N/A</td><td>https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Donkey</td></tr> <tr><td>anti-rat Alexa Fluor 647</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>1:300 stężenie</td></tr><tr><td>Osioł anty-szczurzy DyLight 405</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-475-153</td><td>1:200</td></tr><tr><td>stężenie Surowica osła</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2-koza anty-mysie IgG PerCP-eFluor 710</td><td>Thermofisher</td><td>46-4010-82</td><td>1:25 stężenie</td></tr><tr><td>FIDŻI</td><td>N/</td><td>A NIE DOTYCZY</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Oprogramowanie 4</td></tr><tr><td>Przeglądarka</td><td></td><td></td> spektrawizora fluorescencji <td>https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/</td></tr> <tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Świeżo mrożone ludzkie odcinki migdałków</td><td>amsbio</td><td>HF-707</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-ludzka IgA Alexa Fluor 488</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>109-546-011</td><td>1:400</td></tr><tr><td>stężenie Koza anty-ludzka IgG Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>709-166-098</td><td>1:400</td></tr><tr><td>stężenie Koza anty-ludzka IgM Dylight 405</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>109-476-129</td><td>1:300</td></tr><tr><td>stężenie Kozia anty-królik A546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11035</td><td>1:250 stężenie</td></tr><tr><td>Koza anty-królik IgG PE-Alexa Fluor 610</td><td>Thermofisher</td><td>A-20981</td><td>stężenie 1:250</td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>Ilastik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ilastik.org/ <tr><td>Ilastik FIJI</td><td>plugin N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin<tr><td>Imaris File Converter</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Software 2</td></tr><tr><td>Imaris z modułem komórkowym</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Software 3</td></tr><tr><td>kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>LasX Life Science software</td><td>Leica</td><td></td><td>Software 1</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD20</td><td>VWR</td><td>CA95024-322</td><td>1:40 stężenie</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD38 APC-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>564980</td><td>Stężenie 1:20</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica myszy</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>015-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica królika</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>011-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica szczura</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>012-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Yellow</td><td>Abcam</td><td>ab138903</td><td>Rozpuścić w DMSO w stężeniu 2 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4&deg; C w ciemności</td></tr><tr><td>Długopis PAP</td><td>Cedarlane</td><td>MU22</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>1:500 stężenie</td></tr><tr><td>Królik anty-mysz Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:500 stężenie</td></tr><tr><td>Szczur anty-ludzki Sterowiec1</td><td>Thermofisher</td><td>14-5963-82</td><td>1:40 stężenie</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz B220 Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>103226</td><td>stężenie 1:250</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz CD138</td><td>Biolegend</td><td>142502</td><td>stężenie 1:200</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz CD3 PE-eFluor 610</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61-0032-82</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD4 Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td></td><td>100529 stężenie 1:200</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD45 allofikocyjanina-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>565478</td><td>stężenie 1:50</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysi IgD PerCP-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5993-82</td><td>1:50 stężenie</td></tr><tr><td>SP8 Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Trueblack</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Kulki koralikowe Sigma</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultracomp</td><td>Thermofisher</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Generating and Analyzing High-Parameter Histology Images with Histoflow Cytometry

Użycie histologii do badania różnorodności komórek odpornościowych w sekcjach tkankowych, takich jak te pochodzące z ośrodkowego układu nerwowego (OUN), jest krytycznie ograniczone przez liczbę parametrów fluorescencyjnych, które mogą być obrazowane w tym samym czasie. Większość podzbiorów komórek odpornościowych została zdefiniowana za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu złożonych kombinacji markerów białkowych, często wymagających czterech lub więcej parametrów do jednoznacznej identyfikacji, co wykracza poza możliwości większości konwencjonalnych mikroskopów. Ponieważ cytometria przepływowa dysocjuje tkanki i traci informacje przestrzenne, istnieje zapotrzebowanie na techniki, które mogą zachować informacje przestrzenne podczas badania ról złożonych typów komórek. Zagadnienia te zostały tutaj rozwiązane poprzez stworzenie metody rozszerzania liczby parametrów fluorescencyjnych, które można obrazować, zbierając sygnały spektralnie nakładających się fluoroforów i wykorzystując demiksowanie widmowe do oddzielenia sygnałów każdego pojedynczego fluoroforu. Obrazy te są następnie przetwarzane przy użyciu potoku analitycznego w celu wykonania wysokoparametrowych obrazów histologicznych i wyodrębnienia pojedynczych komórek z tych obrazów, tak aby unikalne właściwości fluorescencyjne każdej komórki mogły być analizowane na poziomie pojedynczej komórki. Korzystając ze strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, komórki można następnie profilować w podzbiory i mapować z powrotem na skrawki histologiczne, aby nie tylko określić ilościowo ich liczebność, ale także ustalić, w jaki sposób oddziałują ze środowiskiem tkankowym. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano prostotę i potencjał wykorzystania cytometrii przepływowej do badania złożonych populacji immunologicznych w sekcjach histologicznych.

<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat pracy histoflow cytometrii. Przekroje tkankowe są barwione barwnikami o nakładających się widmach (krok 1). Obrazy są zbierane przy użyciu poszczególnych laserów wzbudzających w połączeniu z regulowanymi filtrami przepustowymi w celu zminimalizowania przenikania spektralnego między fluoroforami (krok 2). Przenikanie spektralne...

Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.

Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

The usage of histology to investigate immune cell diversity in tissue sections such as those derived from the central nervous system (CNS) is critically ...

Naszym nadrzędnym celem jest zbadanie, w jaki sposób komórki układu odpornościowego i komórki glejowe w ośrodkowym układzie nerwowym przyczyniają się do rozwoju i progresji zaburzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Mikroskopia immunofluorescencyjna jest standardową i szeroko stosowaną techniką w różnych dyscyplinach biologicznych i ma zasadnicze znaczenie dla neuronauki i badań immunologicznych. Jednym z głównych problemów, które nękają badaczy, jest to, że mikroskopia immunofluorescencyjna jest zazwyczaj ograniczona pod względem liczby sond, które można obrazować za jednym razem, ze względu na ograniczenia konwencjonalnych mikroskopów.W tym protokole opisano metodę zwiększania liczby sond, które wiele mikroskopów może obrazować jednocześnie, oraz zapewniamy potok analizy do przetwarzania obrazów o dużej gęstości informacji. Zaletą tego protokołu jest to, że można go dostosować do wielu powszechnie dostępnych mikroskopów i jest łatwy do wykonania, co sprawi, że multipleksowa analiza histologiczna będzie dostępna dla większej liczby laboratoriów. Aby rozpocząć, ustaw mikroskop fluorescencyjny do obrazowania.Włożyć całkowicie wybarwione szkiełko z sekcjami tkanki ba

generating-analyzing-high-parameter-histology-images-with-histoflow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Cytofast to narzędzie do wizualizacji używane do analizy wyników z grupowania. Cytofast może być używany do porównywania dwóch metod grupowania: FlowSOM i Cytosplore. Cytofast może szybko wygenerować ilościowy i jakościowy przegląd danych z cytometrii masowej i podkreślić główne różnice między różnymi algorytmami grupowania.

Wizualizacja i kwantyfikacja danych z cytometrii wielowymiarowej przy użyciu Cytofast i metod grupowania FlowSOM i Cytosplore

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Odkryj metodę analizy wysokoparametrowych obrazów histologicznych przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej i potoku obliczeniowego. Ta technika umożliwia identyfikację podzbiorów komórek odpornościowych i glejowych w chorobach neurologicznych.

Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów