Generowanie i analiza wysokoparametrowych obrazów histologicznych za pomocą cytometrii przepływowej
21 czerwca 2024
Opisana tutaj jest metoda, która może być użyta do zobrazowania pięciu lub więcej parametrów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiono proces analityczny służący do wyodrębniania pojedynczych komórek z tych obrazów i przeprowadzania analizy pojedynczych komórek za pomocą strategii bramkowania podobnych do cytometrii przepływowej, które mogą identyfikować podzbiory komórek w sekcjach tkanki.
Naszym nadrzędnym celem jest zbadanie, w jaki sposób komórki układu odpornościowego i komórki glejowe w ośrodkowym układzie nerwowym przyczyniają się do rozwoju i progresji zaburzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Mikroskopia immunofluorescencyjna jest standardową i szeroko stosowaną techniką w różnych dyscyplinach biologicznych i ma zasadnicze znaczenie dla neuronauki i badań immunologicznych. Jednym z głównych problemów, które nękają badaczy, jest to, że mikroskopia immunofluorescencyjna jest zazwyczaj ograniczona pod względem liczby sond, które można obrazować za jednym razem, ze względu na ograniczenia konwencjonalnych mikroskopów.
W tym protokole opisano metodę zwiększania liczby sond, które wiele mikroskopów może obrazować jednocześnie, oraz zapewniamy potok analizy do przetwarzania obrazów o dużej gęstości informacji. Zaletą tego protokołu jest to, że można go dostosować do wielu powszechnie dostępnych mikroskopów i jest łatwy do wykonania, co sprawi, że multipleksowa analiza histologiczna będzie dostępna dla większej liczby laboratoriów. Aby rozpocząć, ustaw mikroskop fluorescencyjny do obrazowania.
Włożyć całkowicie wybarwione szkiełko z sekcjami tkanki barwienia immunologicznego. Po ustawieniu celu naciśnij przycisk na żywo, a następnie skup się na próbce. Użyj ikony autoskalowania, aby ocenić, czy kanały są odpowiednio nasycone sygnałem.
Po sfinalizowaniu ustawień mikroskopu załaduj do mikroskopu jednokolorowe szkiełka kontrolne. Skoncentruj się poniżej próbki i naciśnij opcję rozpoczęcia w menu stosu Zs, aby rozpocząć konfigurowanie stosu Z. Następnie ustaw ostrość nad próbką i naciśnij opcję końca.
Aby skompensować fluorescencję obrazów, otwórz jeden z pojedynczych obrazów kontrolnych. Obserwuj okna skali szarości dla każdego kanału dla sygnału w nieodpowiednim kanale. Aby usunąć, ręcznie wprowadź liczby do matrycy, a następnie naciśnij Zastosuj, aby sprawdzić, czy została ona odpowiednio usunięta.
Następnie zbierz wszystkie wartości z każdej kontrolki w jedną macierz. Nałożyć tę matrycę na całkowicie wybarwioną próbkę. Uruchom oprogramowanie ilastik i otwórz plik TIFF tkanek.
Kliknij kartę treningu, a następnie użyj narzędzia pędzel, aby podświetlić poszczególne komórki na obrazach. Upewnij się, że podświetlisz komórki tak, aby wnętrze i błona komórkowa były uwzględnione. Następnie użyj etykiety drugiej, aby podświetlić wszystko, co nie jest interesującymi komórkami.
Teraz uruchom oprogramowanie 3 i otwórz obraz IMS tkanki zawierającej wszystkie barwniki fluorescencyjne. Wybierz opcję maski nad jądrami jako kanał źródłowy do wykrywania jąder, a następnie wybierz opcję zaawansowaną do rozdzielania jąder według punktów zarodkowych. Ustaw wartość średnicy jądra.
Sprawdź obraz pod kątem połączonych wielu komórek lub brakujących komórek. Następnie kliknij obiekt utworzonych komórek, a następnie zakładkę tworzenia, a następnie opcję zapisz parametry dla partii, aby zapisać ustawienia użytkowania. Uruchom program Anaconda, a następnie uruchom program Jupyter Lab w programie Anaconda.
Otwórz dodatkowy plik kodowania, a następnie naciśnij uruchom wszystkie komórki lub uruchom wybrane komórki w menu uruchom. Gdy pojawi się monit, wprowadź katalog plików dla wyeksportowanych wartości fluorescencji. Następnie wprowadź katalog plików dla dowolnej lokalizacji odpowiedniej do zapisania przetworzonych plików.
Uruchom następną sekcję kodu, aby dodać adnotacje do danych z nazwami każdego kanału. Po ustaleniu strategii bramkowania kliknij prawym przyciskiem myszy populację w menu, a następnie wybierz eksport. Wyeksportuj parametry jako plik CSV z dołączonymi nagłówkami.
Uruchom ponownie Jupyter Lab w Anakondzie. Następnie otwórz skrypt w dodatkowym pliku kodowania drugim i uruchom kod. Po wyświetleniu monitu o wprowadzenie lokalizacji pliku oprogramowania czterech, wprowadź katalog plików wyeksportowanych plików CSV.
Następnie, po wyświetleniu monitu o dodanie lokalizacji wyjściowej, wybierz wybrany katalog plików i upewnij się, że katalog plików zawiera nazwę pliku na końcu. Uruchom pozostałą część kodu. Teraz skopiuj tekst w pliku txt i otwórz odpowiedni plik IMS w oprogramowaniu trzecim.
Kliknij na sprzedaj obiekt w pliku. Przejdź do zakładki statystyk, a następnie wklej tekst w pasku wyszukiwania i rozpocznij wyszukiwanie. Wszystkie interesujące komórki zostaną teraz podświetlone.
Widmowo nakładające się barwniki fluorescencyjne zostały skutecznie oddzielone w tkance, która została zabarwiona wieloma barwnikami. Rozdzielenie barwników wyraźnie różnicowało różne typy komórek w tkance limfatycznej. Zdefiniowane przez użytkownika uczenie maszynowe zostało wykorzystane do rozdzielenia komórek nawet wtedy, gdy są blisko siebie zagęszczone.
Przegląd
Niniejsza praca opisuje metodę obrazowania wielu parametrów fluorescencyjnych za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii, wraz z procesem analizy danych pojedynczych komórek. Metoda ta zwiększa możliwości tradycyjnego obrazowania, umożliwiając identyfikację podzbiorów komórek związanych z funkcjami komórek odpornościowych i glejowych w zaburzeniach neurologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuroscience
- Immunology
- Cell biology
Tło
- Immunofluorescencyjna mikroskopia jest niezbędną techniką w neurobiologii i immunologii.
- W konwencjonalnych mikroskopach istnieją ograniczenia dotyczące liczby sond, które można jednocześnie obrazować.
- Proponowana metoda ma na celu przezwyciężenie tych ograniczeń i uczynienie analizy histologii wielokrotnej bardziej dostępną.
Cel badania
- Opracowanie protokołu, który umożliwia obrazowanie i analizę wielu etykiet fluorescencyjnych.
- Stworzenie procesu analizy, który obsługuje analizę pojedynczych komórek, podobnie jak cytometria przepływowa.
- Umożliwienie lepszego zrozumienia roli komórek odpornościowych i glejowych w zaburzeniach neurologicznych.
Wykorzystane metody
- Wykorzystano immunofluorescencyjną mikroskopię na barwionych przekrojach tkankowych.
- Badanie szczegółowo opisało krok po kroku podejście do konfiguracji mikroskopu i przeprowadzania kompensacji fluorescencji.
- Analiza obrazów obejmowała wykorzystanie narzędzi programowych do oddzielania i oznaczania poszczególnych komórek.
- Protokół umożliwia adaptację do różnych powszechnie używanych mikroskopów.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie rozróżnia różne typy komórek w barwionej tkance limfatycznej.
- Wykorzystano uczenie maszynowe, aby pomyślnie oddzielić ściśle upakowane komórki.
- Analiza dostarczyła znaczących informacji na temat populacji komórek w sekcjach tkankowych.
Wnioski
- Niniejszy protokół zwiększa możliwości tradycyjnej immunofluorescencyjnej mikroskopii.
- Ustanowiony proces usprawnia analizę pojedynczych komórek, umożliwiając łatwiejszy dostęp do histologii wielokrotnej.
- Wyniki te mogą poprawić nasze zrozumienie mechanizmów komórkowych zaangażowanych w zaburzenia neurologiczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-parameter histology imaging with histoflow cytometry addresses a critical bottleneck in immune cell profiling by enabling multiplexed spatial analysis at single-cell resolution. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking, especially for complex tissues like the CNS. The approach supports portfolio decisions by integrating spatial context with quantitative immune cell subset analysis, informing early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune and glial cell diversity within intact tissue architecture.
- Supports functional target validation by mapping cell subsets and their spatial interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking through high-content, multiplexed marker analysis.
- Improves predictive confidence for target selection in neuroimmunology pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, information-rich tissue systems for downstream screening workflows.
- Standardizes quantitative single-cell outputs using flow cytometry-like gating strategies.
- Enables reproducible profiling of cell populations across multiple experimental conditions.
- Supports scalable assay development by adapting to widely available microscope platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell subset mapping with disease-relevant CNS tissue models.
- Maintains spatial and phenotypic continuity from discovery through preclinical validation.
- Enables risk-adjusted advancement by quantifying cell-type abundance and tissue interactions.
- Provides translational biomarker insights for neurological disorder research.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by combining high-parameter imaging with single-cell analysis, supporting workflows from hypothesis testing to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing by enabling multiplexed spatial and phenotypic cell profiling.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible single-cell data for robust assay development.
- Analytics: Provides flow cytometry-like gating and statistical outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Connects immune cell subset data to disease-relevant tissue environments.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable imaging and analysis pipeline for diverse tissue systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes multiplex imaging and analysis across platforms and teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS and immunology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescent microscopy and spectral unmixing.
- Needs access to compatible microscopes and advanced image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and gating protocols.
- Adaptable to various tissue types but may require optimization for specific models.
- Image analysis complexity and software proficiency are practical considerations.
