Profilowanie pH światła w trójwymiarowych organoidach przewodu pokarmowego za pomocą mikroelektrod

Ogólnym celem naszych badań jest zrozumienie, w jaki sposób komórki nabłonka żołądka, komórki odpornościowe, komórki zrębu i ich produkty, takie jak cytokiny i śluz, współpracują ze sobą, aby odpowiedzieć na zakażenie patogenem żołądka Helicobacter pylori. W tym celu staramy się budować złożone, fizjologicznie istotne modele błony śluzowej żołądka człowieka. Wcześniejsze badania z organoidami żołądka wykazały sprzeczne wyniki dotyczące zdolności tych modeli do utrzymania komórek okładzinowych wydzielających kwas.

Korzystając z mikroelektrod pH, wykazaliśmy, że przy braku specyficznych protokołów różnicowania lub stymulacji, ludzkie organoidy żołądkowe utrzymują prawie neutralne pH w świetle. Względnie dostępne światło organoidu od dawna ogranicza nasze zrozumienie mikrośrodowiska w jego wnętrzu. Demonstrujemy pierwsze udane pomiary pH mikroelektrod w celu funkcjonalnej charakterystyki organoidów.

Nasza metoda oparta na mikroelektrodach może zapewnić naukowcom niezawodne narzędzie, które można dostosować do ich konkretnych potrzeb. Do tej pory pomiar pH w organoidach przewodu pokarmowego wymagał stosowania barwników wrażliwych na pH, które opierają się na obrazowaniu mikroskopowym w celu oceny ilościowej. Główną zaletą stosowania mikroelektrod jest to, że zapewniają one dokładne numeryczne odczyty pH.

Ponadto pH śródświetlne może być rejestrowane w czasie rzeczywistym i z doskonałą rozdzielczością przestrzenną. Pracujemy nad w pełni funkcjonalnym modelem warstwy śluzu żołądkowego człowieka z fizjologicznym gradientem pH, dzięki czemu możemy badać rolę tej bariery w zakażeniu Helicobacter pylori. Ostatecznym celem jest opracowanie nowych terapii cytoprotekcyjnych, które wzmacniają warstwę śluzu i zapobiegają inwazji bakterii.

Na początek uzyskaj aktywnie rosnące ludzkie organoidy żołądkowe o średnicach od 200 do 700 mikrometrów. Rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową lub podwielokrotność ECM na lodzie przez co najmniej 45 minut i podgrzać płytki do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po wyjęciu pożywki z dołków płytki hodowlanej, odpipetuj lodowaty PBS na każdą kroplę ECM i zdrap żel końcówką pipety P1000.

Zebrać PBS z fragmentami ECM zawierającymi organoidy do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować probówkę o masie 200 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Po zassaniu supernatantu dodaj 350 mikrolitrów 0,25% trypsyny-EDTA do każdej probówki i delikatnie wymieszaj.

Inkubować probówki w łaźni wodnej hartowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut. Dodaj 600 mikrolitrów lodowatego DMEM uzupełnionego penicyliną i streptomycyną do każdej probówki i energicznie pipetuj w górę iw dół 40 razy. Odwirować probówkę, jak pokazano, i ponownie zawiesić podniebienie komórkowe w lodowato zimnym płynie ECM.

Dla każdej próbki należy umieścić na płytce 40 mikrolitrów ciekłego ECM zawierającego fragmenty organoidów w cienkiej poziomej linii wzdłuż średnicy 35-milimetrowego naczynia ze szklanym dnem. Po 15 do 30 minutach inkubacji ostrożnie dodaj dwa mililitry pożywki do ekspandowania organoidów na płytkę wzdłuż krawędzi naczynia, nie naruszając spolimeryzowanego żelu. Pozyskać wcześniej przygotowane organoidy ludzkiego żołądka do profilowania pH.

Aby rozpocząć, podłącz elektrodę odniesienia do elektrody pH za pomocą złącza. Następnie podłącz mikroelektrodę do amplifier, a amplifier do uziemionego komputera z oprogramowaniem za pomocą USB. Umieść mikroelektrodę i elektrodę odniesienia w wodzie dejonizowanej, aby zanurzyć obie końcówki na co najmniej jeden centymetr w cieczy.

Napełnij 50-mililitrowe stożkowe probówki żądanymi kalibracyjnymi. Za pomocą delikatnej chusteczki laboratoryjnej delikatnie osusz rurkę ochronną wraz z elektrodą referencyjną. Po otwarciu oprogramowania, w zakładce Kalibracja zaznacz pole Y-Zoom, a następnie ustaw odczyt sygnału czujnika na miliwolty.

Zaczynając od elektrod w buforze pH 4,01, wprowadź 4,01 jako znaną wartość pH. Wybierz opcję Dodaj punkt, gdy odczyt miliwoltów się ustabilizuje. Następnie umieść obie elektrody z powrotem w wodzie dejonizowanej, aby je wypłukać.

Po powtórzeniu procesu dla buforu o pH 9,21 kliknij przycisk Dodaj punkt, gdy sygnał jest stabilny na poziomie około 83 miliwoltów. Sprawdź, czy mikroelektrody reagują liniowo w zakresie pH od 4,01 do 9,21 dla dwupunktowej krzywej kalibracyjnej. Ostrożnie połóż walizkę ochronną płasko na stole i zdejmij ją szybkim, szybkim ruchem, aby wyjąć mikroelektrodę.

Zamontuj mikroelektrodę na mikromanipulatorze i ustaw stereoskop i mikromanipulator tak, aby mikroelektroda mogła swobodnie przesuwać się w kierunku szalki hodowlanej. Ustawić szalkę hodowlaną zawierającą organoidy do profilowania. Lekko przymocuj elektrodę odniesienia do clamp na stojaku pierścieniowym po lewej stronie stereoskopu.

Wizualnie przesuwaj końcówkę mikroelektrody, aż zostanie wystarczająco zanurzona w mediach. Gdy sygnał się ustabilizuje, zapisz trzy odczyty pH podłoża. Następnie powoli wsuń mikroelektrodę do ECM, nie dotykając żadnych organoidów.

Zapisz co najmniej trzy odczyty pH, aby obliczyć średnią. Umieść mikroelektrodę wzdłuż osi prostopadłej do powierzchni organoidu, delikatnie wykonując niewielkie wgłębienie na podstawno-bocznej powierzchni organoidu, nie penetrując jej. Ostrożnie wsuń mikroelektrodę do organoidu i zmierz pH światła.

Po zakończeniu przystąp do pomiaru pH dla następnego organoidu. Umieść elektrodę, która ma być czyszczona, z powrotem w rurce ochronnej. Przepłucz elektrodę szeregowo wodą dejonizowaną, etanolem i buforem.

Umieścić elektrodę odniesienia w zlewce wypełnionej trójmolowym roztworem chlorku potasu. Napełnij szklaną kapilę o pojemności dwóch mikrolitrów sterylnym olejem mineralnym i załaduj ją do sterowanego mikromanipulatorem automatycznego wtryskiwacza nanolitrowego. Na koniec napełnij go roztworem zawierającym 0,02% czerwieni metylowej i 150 milimolowym kwasem solnym i wykonaj wstrzyknięcie 9,2 nanolitra roztworu.

Różnice w pH światła w 10 organoidach na tej samej płytce hodowlanej były minimalne, a pomiary utrzymywały się na poziomie 8,16. Śródświetlne pH w pięciu różnych liniach organoidów było spójne w każdej hodowli, ale zaobserwowano znaczną zmienność między liniami organoidów. pH luminalu organoidu było konsekwentnie niższe niż ECM, które z kolei było niższe niż pH pożywki, co sugeruje, że pH luminalu jest fizjologicznie istotne, a nie determinowane wyłącznie przez otaczające środowisko hodowli.

Wstrzyknięcie czerwieni metylowej do światła organoidu potwierdziło, że ma on pH większe niż 6,2, zgodne z pomiarami mikroelektrod, które wykazały pH bliskie neutralnemu.