Name: Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia in vivo w komórkach ziarnistych zakrętu zębatego u myszy. Protokół łączy iniekcję wirusa z implantacją soczewki GRIN, poprawiając jakość danych o aktywności neuronalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez Szanghajski Program Pilotażowy dla Badań Podstawowych - Fudan University 21TQ1400100 (22TQ019), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project, the Lingang Laboratory (grant no. LG-QS-202203-09) oraz Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (32371036).

Real-Time Imaging for Neuron Activity in the Dentate Gyrus Cells of Mice 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tutaj opisaliśmy procedurę obrazowania wapnia in vivo w DG myszy. Wierzymy, że protokół ten będzie przydatny dla badaczy dążących do zbadania funkcji DG w różnych procesach poznawczych, szczególnie w przypadkach, gdy interesująca jest genetycznie zidentyfikowana subpopulacja. Tutaj wyjaśniamy zalety naszego protokołu, kładąc nacisk na kilka kluczowych punktów w chirurgii i omawiamy ograniczenia tej metody.
Przetestowaliśmy różne procedury obrazowania DG na podstawie dostępnej literatu...

Poprzednie badania wykazały, że hipokamp jest strukturą mózgu niezbędną do przetwarzania i odzyskiwania wspomnień1,2. Od lat pięćdziesiątych XX wieku obwody neuronalne hipokampa u gryzoni są przedmiotem badań nad tworzeniem, przechowywaniem i odzyskiwaniem pamięci3. Struktury anatomiczne w hipokampie obejmują podregiony zakrętu zębatego (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 i subiculum4. Między tymi podregionami istnieją złożone połączenia dwukierunkowe, z których DG, CA1 i CA3 tworzą wyraźny obwód trisynaptyczny, który składa się z komórek ziarnistych i komórek piramidalnych5. Obwód ten otrzymuje swój główny sygnał wejściowy z kory śródwęchowej (EC) i jest klasycznym modelem do badania plastyczności synaptycznej. Wcześniejsze badania in vivo nad funkcją hipokampa koncentrowały się głównie na klasie CA1<sup="xref">6,7 ze względu na łatwiejszy dostęp. Podczas gdy neurony CA1 odgrywają ważną rolę w tworzeniu, konsolidacji i odzyskiwaniu pamięci, szczególnie w komórkach pamięci przestrzennej, inne podregiony hipokampa są również niezbędne8,9. W szczególności niedawne badania uwypukliły funkcje DG w tworzeniu pamięci. Komórki miejsca w DG zostały uznane za bardziej stabilne niż te w CA110, a ich działania odzwierciedlają informacje kontekstowe11. Co więcej, zależne od aktywności znakowanie komórek ziarnistych DG może być reaktywowane w celu wywołania zachowań związanych z pamięcią12. W związku z tym, aby lepiej zrozumieć kodowanie informacji w DG, kluczowe znaczenie ma zbadanie działań podregionu DG w czasie, gdy zwierzę wykonuje zadania zależne od pamięci.
Wcześniejsze badania działalności DG najczęściej wykorzystywały elektrofizjologię in vivo13. Technika ta ma jednak pewne wady: po pierwsze, w nagraniach elektrycznych może być trudno bezpośrednio zidentyfikować różne typy komórek, które generują sygnał. Zarejestrowane sygnały pochodzą zarówno z komórek hamujących, jak i pobudzających. W związku z tym wymagane są dalsze metody przetwarzania danych, aby oddzielić te dwa typy komórek. Co więcej, trudno jest połączyć inne informacje o typach komórek, takie jak podgrupy specyficzne dla projekcji lub etykietowanie zależne od aktywności, z nagraniami elektrycznymi. Ponadto, ze względu na anatomiczną morfologię DG, elektrody rejestrujące są często wszczepiane w kierunku ortogonalnym, co znacznie ogranicza liczbę neuronów, które można zarejestrować. W związku z tym w przypadku nagrań elektrycznych trudno jest osiągnąć monitorowanie setek pojedynczych neuronów ze struktury DG w tej samej klasie animal<sup="xref">14.
Uzupełniającą techniką rejestrowania aktywności neuronów w DG jest użycie obrazowania wapnia in vivo15. Jony wapnia mają fundamentalne znaczenie dla procesów sygnalizacji komórkowej w organizmach, odgrywając kluczową rolę w wielu funkcjach fizjologicznych, zwłaszcza w układzie nerwowym ssaków. Kiedy neurony są aktywne, wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia gwałtownie wzrasta, co odzwierciedla dynamiczną naturę aktywności neuronalnej i transmisji sygnałów. Dlatego rejestrowanie w czasie rzeczywistym zmian wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia w neuronach dostarcza ważnych informacji na temat mechanizmów kodowania neuronalnego.
Technologia obrazowania wapnia wykorzystuje specjalistyczne barwniki fluorescencyjne lub genetycznie modyfikowane wskaźniki wapnia (GECI) do monitorowania stężenia jonów wapnia w neuronach poprzez wykrywanie zmian w intensywności fluorescencji, które następnie mogą być rejestrowane przez obrazowanie mikroskopowe16. Powszechnie stosuje się rodzinę genów wskaźnikowych wapnia GCaMP, obejmującą sekwencje białka zielonej fluorescencji (GFP), kalmoduliny i polipeptydu M13. GCaMP może emitować zieloną fluorescencję, gdy wiąże się z jonami wapnia17, co pozwala na rejestrowanie fluktuacji zielonej fluorescencji za pomocą obrazowania18. Dodatkowo, aby uzyskać wyraźne obrazy docelowego obszaru mózgu, soczewka Gradient Index (soczewka GRIN) jest zwykle wszczepiana powyżej obszaru zainteresowania. Soczewka GRIN umożliwia obrazowanie głębokiego obszaru mózgu, do którego nie można uzyskać dostępu bezpośrednio z powierzchni.
Ta technika jest stosunkowo łatwa do połączenia z innymi narzędziami genetycznymi do oznaczania różnych typów komórek. Co więcej, ponieważ płaszczyzna obrazowania jest równoległa do orientacji komórek w DG, setki neuronów są dostępne do obrazowania przy każdej udanej operacji. W tej pracy przedstawiamy kompletny i szczegółowy protokół chirurgiczny obrazowania wapnia in vivo w zakręcie zębatym u myszy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Procedura obejmuje dwie główne operacje. Pierwszym z nich jest wstrzyknięcie wirusa AAV-CaMKIIα-GCaMP6f do DG. Drugą operacją jest wszczepienie soczewki GRIN powyżej miejsca wstrzyknięcia wirusa. Te dwie procedury są przeprowadzane na tym samym posiedzeniu. Po rekonwalescencji po tych operacjach następnym krokiem jest sprawdzenie jakości obrazowania za pomocą zminiaturyzowanych mikroskopów (miniskopów). Jeśli pole obrazowania ma setki aktywnych komórek, kolejną procedurą jest przymocowanie płytki podstawy miniskopu do czaszki myszy za pomocą cementu dentystycznego; Mysz może być następnie używana do eksperymentów obrazowych. Przedstawiamy również proces wstępnego przetwarzania oparty na MATLAB, który usprawnia analizę zebranych danych dotyczących wapnia.

<table><tbody><tr><td>200 &mu; L uniwersalne końcówki do pipet</td><td>Pipety Transcat</td><td>1030-260-000-9</td><td>Do usuwania igły z krwią i solą fizjologiczną</td></tr><tr><td>25 G luer lock (prebentowane końcówki dozujące)</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Do usuwania tkanki mózgowej</td></tr><tr><td>Wydrukowana w 3D nasadka ochronna</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Aby chronić soczewkę GRIN 75</td></tr><tr><td>% etanolu</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co., Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>Do dezynfekcji i czyszczenia powierzchni soczewki GRIN</td></tr><tr><td>Wirus AAV2/9-CaMKII&alpha;-GCaMP6f</td><td>Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>Do wstrzykiwania wirusa</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 wersja 22.1</td><td>Do rysowania figur</td></tr><tr><td>Anestezjologiczna pompa powietrza</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-30</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące kamerą</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td> <td>Do rejestrowania danych behawioralnych</td></tr><tr><td>Uchwyty kaniuli/ceramicznej skuwki (uchwyt soczewki GRIN)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68214</td><td>Do trzymania soczewki GRIN</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>W celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego myszy&nbsp;</td></tr><tr><td>koncentryczny</td><td>Otwórz ephys</td><td>CW8251</td><td>Do połączenia miniskopu i miniskopu DAQ box</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus Life Science&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>Do obserwacji wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Wacik bawełniany</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co., Ltd</td><td>20202140438</td><td>Do dezynfekcji</td></tr><tr><td>Dostosowana płyta czołowa</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY NIE DOTYCZY</td><td>Do trzymania myszy na kierownicy</td></tr><tr><td>Niestandardowy uchwyt płyty czołowej</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY</td> Nie dotyczy <td>Do trzymania płyty głównej myszy</td></tr><tr><td>Podstawy protezy (samoutwardzalne)</td> <td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>Do mocowania miniskopu</td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet</td><td>ASIN : B001DUUPQ0</td><td>Do usuwania włosów myszy</td></tr><tr><td>Pulpit cyfrowy stereotaktyczny w strumencie, SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>Do wstrzykiwania wirusa i implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Aby zapobiec pooperacyjnemu zapaleniu myszy</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Do obserwacji warunków podczas operacji</td></tr><tr><td>Kanister z filtrem gazu, duży, opakowanie 6 sztuk</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Soczewka GRIN</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>Do implantacji soczewki GRIN</td></tr><tr><td>Soczewka</td> <td>GRINInFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Indukcyjna mysz komorowa (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>V100</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Kamera przemysłowa</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Do pozyskiwania danych behawioralnych</td></tr><tr><td>Środek dezynfekujący Jodophor</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Do dezynfekcji</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Probówka do pobierania próbek płynnych (mikropipeta ze szklanymi kapilarnami do Nanoject III)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Do wstrzykiwania wirusa</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Do analizy danych</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>78001</td><td>Do kraniotomii</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Do wyciągania probówki do pobierania próbek cieczy</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Do wstrzykiwań wirusowych</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Do rejestrowania danych obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Skrzynka do akwizycji danych miniskopu (DAQ) (V3.3)</td><td>Otwórz ephys</td><td>V3.3</td><td>Aby uzyskać dane obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>Do obrazowania wapnia in vivo</td></tr><tr><td>Płyta podstawy miniskopu V4 (Wariant 2)</td><td>Open ephys</td><td>Wariant 2</td><td>Do trzymania miniskopu</td></tr><tr><td>nanoject III Programowalny wtryskiwacz nanolitrowy</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Do wstrzykiwań wirusowych</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H37022025</td><td>Aby oczy były wilgotne</td></tr><tr><td>Probówka do PCR</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Do rozcieńczania wirusa</td></tr><tr><td>Komputer osobisty (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Do rejestrowania danych obrazowania wapnia i danych behawioralnych</td></tr><tr><td>Koło do biegania</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co., Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Do trzymania myszy podczas mocowania płyty podstawy</td></tr><tr><td>Śrubokręt (M1.6)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>60902</td><td>Aby odkręcić M1.6</td></tr><tr><td>Śrubokręt (dociskowe)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>S2</td><td>Do odkręcenia dociskowych</td></tr><tr><td>Śruba ustalająca</td><td>TBD</td><td>2-56 śruba ustalająca stożek</td><td>Do mocowania miniskopu do płyty podstawy</td></tr><tr><td>Maszyna do znieczulenia małych zwierząt</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R500</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka</td><td>Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD</td><td>20163140236</td><td>Do płukania krwi</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>S14016-13</td><td>Do odcinania włosów i skóry głowy</td></tr><tr><td>Regulator temperatury ThermoStar, podkładka 69025 w zestawie.</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>69027</td><td>Aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia</td></tr><tr><td>Ultra cienkie kleszcze</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>F11020-11</td><td>Do usuwania resztek kostnych i opony twardej</td></tr><tr><td>USB 3.0</td><td>Otwórz ephys</td><td>Nie dotyczy</td><td>Aby podłączyć skrzynkę DAQ miniskopu i komputerową lampę</td></tr><tr><td>UV</td><td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>Aby zamocować soczewkę GRIN na czaszce</td></tr><tr><td>Żywica UV (klej utwardzany światłem)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>Aby zamocować soczewkę GRIN na czaszce</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>Aby usunąć krew, sól fizjologiczną i tkankę mózgową</td></tr></tbody></table>

obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Podejścia czasu rzeczywistego są zazwyczaj potrzebne w badaniach nad uczeniem się i pamięcią, a obrazowanie wapnia in vivo daje możliwość zbadania aktywności neuronalnej u obudzonych zwierząt podczas zadań behawioralnych. Ponieważ hipokamp jest ściśle związany z pamięcią epizodyczną i przestrzenną, stał się istotnym regionem mózgu w badaniach w tej dziedzinie. W ostatnich badaniach komórki engramowe i komórki miejsca badano, rejestrując aktywność neuronalną w regionie CA1 hipokampa za pomocą miniaturowego mikroskopu u myszy podczas wykonywania zadań behawioralnych, w tym na otwartym polu i toru liniowego. Chociaż zakręt zębaty jest kolejnym ważnym regionem hipokampa, rzadko był badany za pomocą obrazowania in vivo ze względu na jego większą głębokość i trudność w obrazowaniu. W tym protokole szczegółowo przedstawiamy proces obrazowania wapnia, w tym sposób wstrzykiwania wirusa, wszczepienia soczewki GRIN (Gradient-index) i dołączenia płytki bazowej do obrazowania zakrętu zębatego hipokampa. Dalej opisujemy, jak wstępnie przetworzyć dane obrazowania wapnia za pomocą MATLAB. Ponadto badania innych głębokich obszarów mózgu, które wymagają obrazowania, mogą odnieść korzyści z tej metody.

Rysunek 1 przedstawia schemat procedury eksperymentalnej, obejmujący iniekcję wirusa, implantację soczewki GRIN, mocowanie płytki bazowej, obrazowanie wapnia in vivo za pomocą miniskopu oraz przetwarzanie danych. Zazwyczaj cała procedura trwa 1 miesiąc. Rysunek 2 przedstawia przykładowe procedury iniekcji wirusa, w tym rozmieszczenie otworu wiertniczego w czaszce oraz stan tkanki mózgowej przed implantacją soczewki GRIN.
<str...

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

Cóż, w tym protokole używamy miniaturowego mikroskopu do zbadania neuroaktywności w zakręcie zębatym hipokampa. Naszym celem jest zbadanie kodowania neuronów i reprezentacji przestrzennych w różnych stanach chorobowych. Uważam, że kluczowym wyzwaniem związanym z badaniem zakrętu zębatego in vivo jest uzyskanie wysokiej jakości danych obrazowych dotyczących wapnia.To, czy różne wyrazy twarzy są zadowalające, czy soczewka GRIN jest wszczepiona we właściwym miejscu i takie szczegóły podczas całej operacji mają kluczowe znaczenie dla powodzenia badania. W tradycyjnej chirurgii obrazowania wapnia wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki GRIN są zwykle wykonywane jako oddzielne operacje. W naszym protokole połączyliśmy te dwa kroki w jedną procedurę, która nie tylko skraca czas oczekiwania, ale także zapewnia dokładne umieszczenie soczewki GRIN.Nasze laboratorium wykorzystuje różne techniki mikroskopowe do badania neurodynamiki leżącej u podstaw funkcji poznawczych. Mamy nadzieję zrozumieć wzorce neuroaktywności, które wspierają procesy poznawcze, a łącząc modelowanie teoretyczne i manipulacje przyczynowe, mamy nadzieję przeanalizować procesy przepływu informacji i neuroobliczeń w móz

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Źródło: Calvo-Rodríguez, et al. Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca2+ w starzejących się neuronach hipokampa. J. vis. exp. (2015).  Ten film demonstruje zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego do pomiaru poziomu cytozolowego wapnia w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów. Porównując młode i starzejące się neurony, podkreśla, w jaki sposób zwiększona gęstość kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L i przedłużona aktywacja w starzejących...

Obrazowanie wapnia in vitro w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj metodę obrazowania wapnia in vivo w komórkach ziarnistych zakrętu zębatego u myszy. Protokół łączy iniekcję wirusa z implantacją soczewki GRIN, poprawiając jakość danych o aktywności neuronalnej.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Przeglądaj więcej filmów