Name: Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj izolację naczyń włosowatych siatkówki i macierzy podśródbłonkowej myszy do pomiaru sztywności metodą mikroskopii sił atomowych. Technika ta pozwala badać mechanobiologię naczyń w retinopatii cukrzycowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (dla K.G.), Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (dla K.G.), The Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant od W.M. Keck Foundation (dla Doheny Eye Institute) oraz Ursula Mandel Fellowship i UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (dla I.S.T.). Praca ta była również wspierana przez nieograniczony grant od Research to Prevent Blindness, Inc. dla Wydziału Okulistyki UCLA. Za treść tego artykułu wyłączną odpowiedzialność ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Measurement of Stiffness in Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix

<ol><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+current+understanding%2C+mechanisms%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).</li>
<li>Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+pathological+changes+in+the+diabetic+retina%3A+Implications+for+targeting+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy.</a> Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+retinal+vascular+inflammation+and+degeneration+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes.</a> Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+matrix+stiffening+by+lysyl+oxidase+enhances+RAGE-mediated+retinal+endothelial+activation+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes.</a> Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+stiffening+promotes+retinal+endothelial+activation+associated+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes.</a> FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).</li>
<li>Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+Mechanotransduction+pathways+that+control+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology.</a> Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).</li>
<li>Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stresses+and+translational+distortion+of+the+nucleus+during+fibroblast+migration+on+a+physiologically+relevant+ECM+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic.</a> Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).</li>
<li>Ghosh, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell+and+tissue+development%3A+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+cell+and+basement+membrane+architecture+contribute+to+sidestream+smoke-induced+choroidal+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+increases+choroidal+endothelial+stiffness+and+susceptibility+to+complement+injury%3A+Implications+for+choriocapillaris+loss+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+stiffness+contributes+to+complement-mediated+injury+of+choroidal+endothelial+cells+in+a+monkey+model+of+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration.</a> J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. (76), e50489(2013).</li>
<li>Beacham, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+extracellular+matrices+produced+by+cultured+and+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).</li>
<li>Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+stiffness+of+ex+vivo+mouse+aortas+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (116), e54630(2016).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+intimal+stiffening+enhances+endothelial+permeability+and+leukocyte+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration.</a> Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).</li>
<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
<li>Ashraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+density+of+deep%2C+intermediate+and+superficial+vascular+plexuses+are+differentially+affected+by+diabetic+retinopathy+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).</li>
<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

AFM jest szeroko stosowany do pomiaru związanych z chorobą zmian w sztywności większych naczyń, takich jak aorta i tętnice16. Odkrycia te pomogły ustalić rolę mechanobiologii śródbłonka w powikłaniach sercowo-naczyniowych, takich jak miażdżyca17. Opierając się na tych odkryciach, zaczęliśmy badać wcześniej nierozpoznaną rolę mechanobiologii śródbłonka w rozwoju zmian mikronaczyniowych siatkówki we wczesnym DR. Sukces w tym dążeniu zależy jednak od dokładnego pomiaru wywołanych cukrzycą zmian w sztywności naczyń włosowatych siatkówki. Ostatnie badania wykazały, że podobnie jak w przypadku dużych naczyń krwionośnych, sztywność naczyń włosowatych siatkówki i macierzy podśródbłonka wydzielanej przez EC siatkówki można również bezpośrednio, dokładnie i niezawodnie zmierzyć za pomocą AFM 4,5,6.
Podejście to polega na izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy od łagodnie unieruchomionych oczu za pomocą trawienia trypsyną. Z doświadczenia wynika, że ten łagodny etap stabilizacji jest konieczny, ponieważ naczynia włosowate odizolowane od nieruchomych oczu (metodą hipotoniczną) są kruche i ulegają fragmentacji, co czyni je nieodpowiednimi do pomiaru sztywności AFM4. I odwrotnie, silniejsze utrwalenie i wynikająca z tego potrzeba intensywnego trawienia trypsyny, która została opisana w innym protokole trawienia trypsyny siatkówki18, może również zagrozić integralności strukturalnej naczyń włosowatych, co ocenia się na podstawie przerwania połączeń ścisłych. W związku z tym łagodne utrwalanie kapilar i delikatne trawienie trypsyny stosowane tutaj pomagają zmniejszyć artefakty sztywności wynikające z nadmiernego sieciowania wywołanego formaliną i zapewniają integralność strukturalną naczyń włosowatych w celu wiarygodnego pomiaru sztywności AFM.
Jako alternatywne podejście, niedawne badanie wykazało pomiar sztywności AFM naczyń włosowatych siatkówki z lekko zamocowanych płaskich mocowań siatkówki19. Wykonując wgłębienia siły AFM na naczyniach włosowatych siatkówki w nienaruszonej siatkówce, podejście to umożliwia pomiar sztywności in situ . Jednak te pomiary sztywności kapilarnej prawdopodobnie obejmują sztywność wewnętrznej membrany ograniczającej. Co więcej, podejście to ogranicza się do pomiaru tylko powierzchownych naczyń włosowatych, które są dostępne na płaskim montażu siatkówki, pomijając głębiej położony splot kapilarny, który jest specyficznie dotknięty we wczesnym DR20. Problemy te można rozwiązać za pomocą tego podejścia, które usuwa naczynia w sposób czysty (pozbawiony resztkowej tkanki siatkówki) ze wszystkich warstw siatkówki. Obecnie optymalizujemy ten protokół, aby wyizolować naczynia naczyniówkowe z modeli zwierzęcych wczesnego AMD. To powiedziawszy, zdajemy sobie sprawę, że łagodne utrwalanie formaliny zastosowane w protokole może powodować artefakt usztywniający związany z sieciowaniem w pomiarach AFM. W związku z tym rozsądne byłoby interpretowanie wartości sztywności naczyń krwionośnych uzyskanych przy użyciu tego podejścia bardziej w kategoriach względnych zmian sztywności (między różnymi grupami eksperymentalnymi), a nie sztywności bezwzględnej.
W przeciwieństwie do naczyń włosowatych siatkówki, które wymagają łagodnego unieruchomienia, macierz podśródbłonkowa uzyskana z hodowli EC siatkówki może być oceniana bez żadnych modyfikacji. Wynika to w dużej mierze z odporności zdeponowanej matrycy, która wynika z połączenia kilku czynników, w tym dodania kwasu askorbinowego do pożywki hodowlanej (co zwiększa syntezę kolagenu15), chemicznej modyfikacji szklanych szkiełek nakrywkowych, która zapobiega odklejaniu się matrycy podczas decelularyzacji oraz wydłużonego czasu trwania hodowli (10-15 dni). Co ważne, wykazaliśmy, że wywołany hiperglikemią wzrost sztywności macierzy podśródbłonkowej in vitro jest zgodny z wywołanym cukrzycą wzrostem sztywności naczyń włosowatych siatkówki obserwowanym in vivo4. Nie jest to zaskakujące, ponieważ oczekuje się, że wzrost sztywności matrycy zwiększy sztywność EC leżących nad siatkówką (ze względu na wzajemność mechaniczną), które razem zwiększają ogólną sztywność kapilarną. Rzeczywiście, niedawno wykazaliśmy, że EC siatkówki stają się sztywniejsze, gdy rosną w warunkach cukrzycowych4, prawdopodobnie poprzez wzrost napięcia cytoszkieletu aktyny zależnego od Rho / ROCK21. Odkrycia te sugerują również, że usztywnienie naczyniówki EC obserwowane w modelu małpy rezusów wczesnego AMD odzwierciedla zwiększoną sztywność macierzy podśródbłonka naczyniówki i nienaruszonych naczyń12, co jest testowane w trwających badaniach. Ogólnie rzecz biorąc, fakt, że zmiany sztywności w nieutrwalonej macierzy podśródbłonkowej siatkówki i EC odzwierciedlają trend obserwowany w łagodnie utrwalonych nienaruszonych naczyniach siatkówki, świadczy o słuszności podejścia łagodnego unieruchomienia.
Bezpośredni pomiar sztywności naczyń włosowatych siatkówki na podstawie zwierzęcych modeli DR nie tylko pomaga w ustaleniu mechanobiologii śródbłonka jako nowego celu terapeutycznego w leczeniu DR, ale także stanowi mocne uzasadnienie do opracowania nowych czułych technik obrazowania do nieinwazyjnej oceny sztywności naczyń włosowatych siatkówki u pacjentów z DR w przyszłości. Takie nieinwazyjne techniki mogą potencjalnie wykryć subtelne zmiany w przepływie krwi, które mogą wynikać ze sztywnienia naczyń włosowatych, podobnie jak zmiany prędkości fali tętna tętniczego, które są powszechnie wykrywane w chorobach sercowo-naczyniowych wywołanych cukrzycą. Pomiary sztywności AFM naczyń włosowatych siatkówki wyizolowanych z pośmiertnych oczu ludzkich od dawców chorych na cukrzycę dostarczą ważnego dowodu słuszności koncepcji w tym zakresie. Biorąc poduwagę, że sztywność naczyń włosowatych siatkówki wzrasta na wczesnym etapie w mysim modelu cukrzycy typu 1 typu 4 (streptozotocyna), udane zastosowanie AFM w walidacji metod obrazowania mierzących sztywność może prowadzić do identyfikacji sztywności naczyń włosowatych siatkówki jako klinicznego biomarkera wczesnej patogenezy DR.

Naczynia włosowate siatkówki są niezbędne do utrzymania homeostazy siatkówki i funkcji wzrokowych. Rzeczywiście, ich zwyrodnienie we wczesnej cukrzycy jest silnie związane z rozwojem zagrażających wzrokowi powikłań retinopatii cukrzycowej (DR), choroby mikronaczyniowej, która dotyka prawie 40% wszystkich osób z cukrzycą1. Zapalenie naczyń krwionośnych w znacznym stopniu przyczynia się do zwyrodnienia naczyń włosowatych siatkówki w DR. Wcześniejsze badania wykazały ważną rolę nieprawidłowych sygnałów molekularnych i biochemicznych w zapaleniu naczyń siatkówki wywołanym cukrzycą2,3. Jednak ostatnie prace wprowadziły nowy paradygmat patogenezy DR, który identyfikuje usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako kluczowy, ale wcześniej nierozpoznany czynnik zapalenia i zwyrodnienia naczyń siatkówki4,5,6.
W szczególności, wywołany cukrzycą wzrost sztywności naczyń włosowatych siatkówki jest spowodowany regulacją w górę enzymu sieciującego kolagen oksydazy lizylowej (LOX) w komórkach śródbłonka siatkówki (ECs), co usztywnia macierz podśródbłonkową (błonę podstawną)4,5,6. Usztywnienie macierzy z kolei usztywnia leżące nad siatkówką EC (ze względu na mechaniczną wzajemność), prowadząc w ten sposób do ogólnego wzrostu sztywności naczyń włosowatych siatkówki4. Co najważniejsze, samo to usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki wywołane cukrzycą może sprzyjać aktywacji EC siatkówki i śmierci EC za pośrednictwem stanu zapalnego. Ta mechaniczna regulacja wad EC siatkówki może być przypisana zmienionej mechanotransdukcji śródbłonka, procesowi, w którym sygnały mechaniczne są przekształcane w sygnały biochemiczne w celu wytworzenia odpowiedzi biologicznej7,8,9. Co ważne, zmienione sygnały mechaniczne EC i struktura macierzy podśródbłonkowej są również związane ze zwyrodnieniem naczyniówek związanym ze zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wczesnym wiekiem (AMD)10,11,12, co świadczy o szerszych implikacjach mechanobiologii naczyń w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.
Warto zauważyć, że usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki występuje we wczesnym stadium cukrzycy, co zbiega się z początkiem zapalenia siatkówki. W związku z tym wzrost sztywności naczyń włosowatych siatkówki może służyć zarówno jako cel terapeutyczny, jak i wczesny marker diagnostyczny DR. W tym celu ważne jest uzyskanie wiarygodnych i bezpośrednich pomiarów sztywności naczyń włosowatych siatkówki i macierzy podśródbłonkowej. Można to osiągnąć za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM), który oferuje unikalną, czułą, dokładną i niezawodną technikę bezpośredniego pomiaru sztywności komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej i tkanek13. AFM przykłada niewielką (nanoniutonową) siłę wgłębienia na próbkę, której sztywność określa stopień, w jakim wgłębienie AFM wygina się - im sztywniejsza próbka, tym bardziej wygina się wspornik i odwrotnie. Intensywnie używaliśmy AFM do pomiaru sztywności hodowanych komórek śródbłonka, matryc subśródbłonkowych i izolowanych naczyń włosowatych siatkówki myszy4,5,6,11,12. Te pomiary sztywności AFM pomogły zidentyfikować mechanobiologię śródbłonka jako kluczowy czynnik determinujący patogenezę DR i AMD. Aby poszerzyć zakres mechanobiologii w badaniach nad wzrokiem, poniżej przedstawiamy przewodnik krok po kroku dotyczący stosowania AFM do pomiarów sztywności izolowanych naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej.

<table><tbody><tr><td><silna>izolacja naczyń włosowatych siatkówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>Low Protein Binding Durapore</td></tr><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez wapnia % magnezu</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>Stężenie końcowe 1X, pH 7,4</td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Bez rnazy-dnaz, niepirogenne</td></tr><tr><td>20 ml Strzykawka Luer-Lok TIP</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 cala Jednorazowa pipeta ze szkła borokrzemianowego/niesterylna pipeta Pasteura</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL</td><td>Pen Laboratorium Urządzeń Naukowych</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt ostrza</td> Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej <td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10%</td> <td>miliporów Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>Stężenie końcowe 5% (v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - chusteczka do wycierania</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 Stal nierdzewna 115mm&nbsp; Pęseta</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem fazowym</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ Klasa II, Typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td></td> Probówki wirówkowe <td>Labconco</td> 302380001 <td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>AmScope</td><td>SM-3 Trójokularowy mikroskop stereoskopowy z zoomem 3,5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe Superfrost Plus - Biała zakładka - Wstępnie oczyszczone - 25x75x1,0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer, 0,1 M roztwór, pH 7,4 - Klasa biologiczna</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 do roztworu trypsyny</td></tr><tr><td>Trypsyna 1:250 w proszku Klasa kultur tkankowych</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10 % (w/v) roztwór trypsyny</td></tr><tr><td>Woda Biologia molekularna Klasa</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td><silny>Matryca podśródbłonkowa</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS z wapniem i magnezem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV przeciwciało</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało fibronektyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane (12mm)</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka siatkówki (HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 medium</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mysie komórki śródbłonka siatkówki (mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>&nbsp; BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>AFM Pomiar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 i mikro; m Sonda</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>Półkulista sonda o wysokości 19 mikronów z promieniem końcowym 1 mikron, stała sprężystości 0,25 N / m</td></tr><tr><td>Sonda LC 70 nm</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>Półkulista sonda o wysokości 19 mikronów i promieniu końcowym 70 nm, &nbsp; Stała sprężystości 0,1N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; kamera</td><td>Rodzina XCAM</td><td>Toupcam</td><td>1080P</td></tr><tr><td>HDMI Desktop do uruchamiania kamery</td><td>Asus</td><td>Asus desktop</td><td>Intel i5-6600 CPU , 8 GB RAM</td></tr><tr><td>Uchwyt na naczynie do szkiełka nakrywkowego</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm szklane dno z &nbsp; Mikrostudzienka 14 mm</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td> Mikroskop sił atomowych <td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>Bioscience zamontowany na mikroskopie optycznym do czułego pomiaru właściwości mechanostrukturalnych (sztywności i topografii) miękkich próbek biologicznych</td></tr><tr><td>Mikrskop z kontrastem fazowym</td> Mikroskop odwrócony <td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>z obiektywem 10X</td></tr></tbody></table>

izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Zwyrodnienie naczyń włosowatych siatkówki jest klinicznym znakiem rozpoznawczym wczesnych stadiów retinopatii cukrzycowej (DR). Nasze ostatnie badania wykazały, że usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki wywołane cukrzycą odgrywa kluczową i wcześniej nierozpoznaną rolę przyczynową w zwyrodnieniu naczyń włosowatych siatkówki za pośrednictwem stanu zapalnego. Wzrost sztywności naczyń włosowatych siatkówki wynika z nadekspresji oksydazy lizylowej, enzymu, który sieciuje i usztywnia macierz podśródbłonkową. Ponieważ oczekuje się, że zwalczanie DR na wczesnym etapie zapobiegnie lub spowolni postęp DR i związaną z tym utratę wzroku, macierz podśródbłonkowa i sztywność naczyń włosowatych stanowią istotne i nowe cele terapeutyczne dla wczesnego leczenia DR. Co więcej, bezpośredni pomiar sztywności naczyń włosowatych siatkówki może służyć jako kluczowy etap walidacji przedklinicznej dla opracowania nowych technik obrazowania do nieinwazyjnej oceny sztywności naczyń włosowatych siatkówki u zwierząt i ludzi. Mając to na uwadze, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół izolacji i pomiaru sztywności naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej przy użyciu mikroskopii sił atomowych.

Kapilary siatkówki myszy 
Pomiar sztywności wyizolowanych kapilar siatkówki za pomocą AFM obejmuje etapy manipulacji próbkami, które mogłyby potencjalnie uszkodzić ich integralność mechanostrukturalną. Aby temu zapobiec i tym samym zapewnić wykonalność, wiarygodność i powtarzalność pomiarów AFM, wyjęte oczy utrwala się w 5% formalinie przez noc w temperaturze 4 °C przed izolacją naczyń. Ten łagodny protokół utrwalania z obniżonym stężeniem formaliny, niską temperaturą utrwalania, ograniczonym czasem procesu oraz bez nakłuwania rogówki został opracowany w celu zminimalizowania potencjalnych artefaktów związanych z sieciowaniem lub usztywnianiem wywołanym fiksacją chemiczną. Jak pokazano na Rysunku 2B,C, to stosunkowo łagodne utrwalanie sprawia, że wyizolowane naczynia siatkówki są wytrzymałe strukturalnie i wystarczająco trwałe do pomiaru AFM. W przeciwieństwie do nich, naczynia siatkówki izolowane z nieutrwalonych oczu (metodą hipotoniczną)4 lub oczu utrwalanych krótko (przez 8 h) ulegają fragmentacji lub zapadaniu się, co czyni je nieprzydatnymi do pomiarów AFM (Rysunek 2B).
Macierz podśródbłonkowa siatkówki 
Sztywność naczyniowa odzwierciedla łączną sztywność komórek naczyniowych i błony podstawnej (macierzy podśródbłonowej)4Ponieważ komórki adaptują się do sztywności macierzy, przechodząc podobną zmianę we własnej sztywności – proces ten nazywa się wzajemnością mechaniczną9sztywność macierzy podśródbłonowej staje się istotnym czynnikiem determinującym całkowitą sztywność naczyniową. W celu pomiaru sztywności macierzy ważne jest uzyskanie jednorodnie gęstej macierzy podśródbłonowej. W przypadku ludzkich komórek śródbłonka siatkówki hodowanych w pożywce uzupełnionej kwasem askorbinowym proces ten trwa zazwyczaj od 10 do 15 dni (Rycina 3A)4,5,6Ta różnica w okresie hodowli może wynikać z różnic między partiami komercyjnie dostępnych pierwotnych komórek śródbłonka (EC) siatkówki. Ponadto zazwyczaj stwierdzamy, że komercyjnie dostępne EC siatkówki myszy C57BL/6 odkładają gęstszą macierz w porównaniu z hodowlą pierwotnych EC siatkówki ludzkiej, co wskazuje na różnice gatunkowe. Jak pokazano w Rysunek 3Aobrazowanie w kontraście fazowym pozwala jedynie na ogólny wgląd w macierz w skali makro. Jednak dokładniejsza struktura włóknista w skali od nano do mikro staje się widoczna na obrazach konfokalnych o wysokiej rozdzielczości, uzyskanym po immunoznakowaniu macierzy przeciwciałami przeciwko białkom strukturalnym macierzy: kolagenowi IV i fibronektynie. (Rysunek 3B)Należy zauważyć, że białka macierzy te dostarczają również sygnałów instruktowych komórkom śródbłonka poprzez wiązanie się ze specyficznymi receptorami integrynowymi.9.
Pomiar sztywności za pomocą AFM 
Wybór odpowiedniej sztywności wspornika (stała sprężystości, k) oraz wymiarów sondy jest niezbędny dla uzyskania wiarygodnych i czułych pomiarów. Parametry te powinny być dobrane tak, aby odpowiadały sztywności i wymiarom próbki biologicznej. Po zamontowaniu wybranego wspornika w AFM, wiązka lasera podczerwonego musi zostać skupiona na końcówce wspornika, a odbita plamka lasera musi zostać wycentrowana na fotodetektorze. Taka kalibracja lasera zapewnia precyzyjną i czułą detekcję ugięcia wspornika, a w konsekwencji dokładny pomiar sztywności. Pomiar sztywności AFM rozpoczyna się od ruchu piezoelektryka w osi z, który przesuwa wspornik pionowo w dół w stronę próbki. W tym momencie nie występuje ugięcie wspornika, co skutkuje płaską linią bazową krzywej zbliżania (Rysunek 4A). W momencie, gdy sonda wspornika styka się z próbką i powoduje jej wgniecenie, wspornik wygina się, co powoduje odchylenie wiązki lasera na fotodetektorze, przedstawione jako pionowe ugięcie krzywej zbliżania. Po przyłożeniu do próbki zaprogramowanej siły wgniecenia (siły setpoint), wspornik cofa się do pozycji wyjściowej (docelowa wysokość Z) w kierunku oddalenia od próbki. Uzyskana krzywa cofania jest następnie dopasowywana do modelu Hertza/Sneddona w celu obliczenia modułu Younga (sztywności) próbki.
Z reprezentacyjnego pomiaru wgłębienia siłowego przedstawionego na Rysunku 4 wynika wyraźnie, że krzywe zbliżania i cofania uzyskane z naczynia włosowatego siatkówki izolowanego od myszy z cukrzycą (Rysunek 4B) są znacznie bardziej strome niż krzywe uzyskane od myszy bez cukrzycy (Rysunek 4A). Stromszy nachylenie krzywych wgłębienia siłowego wskazuje na większe ugięcie wspornika spowodowane wyższym oporem próbki przeciwko wgłębieniu siłowemu, co odzwierciedla wyższą sztywność próbki13. Rzeczywiście, późniejsza analiza danych z wielu krzywych wgłębienia siłowego wykazała, że naczynia włosowate siatkówki myszy stają się znacznie sztywniejsze w przebiegu cukrzycy4. Należy również zauważyć, że kontakt między sondą wspornika a próbkami biologicznymi często powoduje niespecyficzną adhezję powierzchniową, co prowadzi do ujemnego ugięcia wspornika podczas cofania, co widać po przedłużeniu krzywej cofania poza linię bazową (Rysunek 4B). Ponadto próbki biologiczne, takie jak komórki, macierz i naczynia krwionośne, są z natury wiskoelastyczne i mogą zatem ulec pewnej trwałej deformacji i/lub zmianie pozornej sztywności po wgłębieniu siłowym. Jeśli tak się stanie, będzie to widoczne w niedopasowaniu krzywych zbliżania i cofania (histereza). Porównanie Rysunku 4A i Rysunku 4B potwierdza oczekiwany trend, zgodnie z którym wgłębienie siłowe bardziej miękkich naczyń włosowatych u myszy bez cukrzycy wywołuje większą histerezę niż w przypadku ich sztywniejszych odpowiedników. Jak raportowano wcześniej5,6, sztywność (moduł Younga) macierzy podśródbłonkowych uzyskanych z kultur EC siatkówki jest również obliczana w wyżej wymieniony sposób.
<img alt="Schemat operacji oka ze skalpelem i pęsetą, przedstawiający proces nacięcia w obrębie limbusa i siatkówki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie nacięcia wykonanego na oku myszy w celu izolacji siatkówki. Przytrzymując nerw wzrokowy pęsetą, skalpelem wykonuje się pełne nacięcie za limbususem, aby oddzielić siatkówkę myszy od soczewki i komory przedniej. Fioletowa przerywana linia wskazuje miejsce pionowego nacięcia. Schemat został przygotowany przy użyciu oprogramowania do ilustracji i obrazowania naukowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie izolacji i fiksacji naczyń oka; metoda trawienia trypsyną; wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Optymalizacja protokołu izolacji nienaruszonych naczyń siatkówki myszy do pomiarów AFM. (A) Obraz z mikroskopu stereoskopowego przedstawia nienaruszoną siatkówkę wyizolowaną z lekko utrwalonego oka myszy przed etapami izolacji naczyń kapilarnych. Pasek skali: 2 mm. (B) Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym przy powiększeniu 4x przedstawiają naczynia siatkówki myszy uzyskane za pomocą różnych metod izolacji. Porównując integralność strukturalną i trwałość wyizolowanych naczyń, stwierdzono, że trawienie trypsyną siatkówek z oczu usuniętych i utrwalonych w 5% formalinie przez 24 h w 4 °C (czerwona ramka) pozwala uzyskać unaczynienie siatkówki najodpowiedniejsze do pomiaru sztywności metodą AFM. Naczynia siatkówki wyizolowane tą metodą wykazały wyraźną sieć naczyniową, która rozprzestrzeniała się równomiernie wzdłuż powierzchni szkła. Pasek skali: 500 µm. (C) Widok przy dużym powiększeniu (20x) nienaruszonej sieci kapilarnej siatkówki, podobnej do tej przedstawionej w (B), potwierdza wysoką integralność strukturalną kapilar uzyskanych z lekko utrwalonych oczu. Pasek skali: 100 µm. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie źródła4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia: porównanie wzrostu ludzkich i mysich REC (10-15 d), barwienie kolagenem IV i fibronektyną, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Macierze decelularyzowane otrzymane z pierwotnych kultur ludzkich i mysich REC. (A) Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym przy powiększeniu 20x, przedstawiające agregaty macierzy podśródbłonkowej na szklanych zakrywkach po decelularyzacji 10-dniowych (10 d) lub 15-dniowych (15 d) kultur ludzkich lub mysich REC. Pasek skali: 100 µm. (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne konfokalne przy dużym powiększeniu (100x) decelularyzowanych macierzy otrzymanych z 15-dniowych kultur ludzkich REC i znakowanych przeciwciałami anty-kolagen IV oraz anty-fibronektyna, ukazujące gęstą nanofibrylarną macierz kolagenu IV i fibronektyny. Pasek skali: 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe siła-odległość; niecukrzycowe vs cukrzycowe; podejście/wycofanie wspornika; analiza danych AFM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Krzywe siła-odległość z pomiaru sztywności AFM kapilar siatkówki myszy. Wykresy liniowe przedstawiają reprezentatywną krzywą podejścia (jasny kolor) i wycofania (ciemny kolor) z pojedynczego pomiaru wciskania siłowego w jednym miejscu kapilary siatkówki myszy wyizolowanej od myszy (A) niecukrzycowej lub (B) cukrzycowej. Krzywe siły uzyskane przy użyciu hemispherical cantilever probe SAA-SPH o promieniu 1 µm obrazują zależność między odległością wspornika od próbki (kontrolowaną przez z-piezo) a przyłożoną siłą pionową powodującą ugięcie wspornika. (A) Żółta strzałka wskazuje podejście wspornika do próbki sterowane przez z-piezo, biała strzałka wskazuje punkt kontaktu, w którym sonda wspornika styka się z próbką, a zielona strzałka wskazuje ugięcie wspornika do określonej wartości zadanej (szczytowej) siły wciskania (*). (B) Zarówno krzywe podejścia, jak i wycofania uzyskane z kapilary siatkówki wyizolowanej od myszy cukrzycowej wykazują wyraźnie bardziej stromy nachylenie niż krzywe od ich niecukrzycowych odpowiedników (pokazane w A), co wskazuje na wyższą sztywność kapilar u myszy cukrzycowych. Grot strzałki wskazuje spadek krzywej wycofania poniżej linii bazowej, co odzwierciedla ujemne ugięcie sondy wspornika spowodowane adhezją między sondą a próbką podczas wciskania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that ...

Wiadomo, że zapalenie naczyń powoduje zwyrodnienie naczyń włosowatych siatkówki we wczesnej retinopatii cukrzycowej, która jest głównym widzeniem zagrażającym mikronaczyniowym powikłaniom cukrzycy. Nasze laboratorium bada, czy i w jaki sposób mechaniczne sygnały w postaci sztywności naczyń mogą przyczyniać się do tych nieprawidłowych zmian naczyniowych siatkówki we wczesnej cukrzycy. Rośnie zainteresowanie opracowywaniem sposobów zapobiegania retinopatii cukrzycowej we wczesnym stadium, ze szczególnym naciskiem na hamowanie zapalenia siatkówki, które występuje we wczesnym stadium cukrzycy i przyczynia się do dysfunkcji nerwowo-naczyniowej siatkówki.Nasze ostatnie prace wskazują, że oprócz czynników genetycznych i biochemicznych, sygnały mechaniczne, takie jak sztywność naczyń krwionośnych, mogą sprzyjać zapaleniu siatkówki we wczesnej cukrzycy. Nasz protokół pozwoli naukowcom wyizolować nienaruszone naczynia siatkówki i macierz podśródbłonkową w celu późniejszych pomiarów sztywności za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pomiary te pomogą określić rolę sztywności naczyń krwionośnych i mechanobiologii śródbłonka w rozwoju wad naczyniowych związanych z retinopatią cukrzycową i zwyrodnieniem plamki żółtej.Stosując niewielkie siły iteracyjne na poziomie nano dwóch Pictona, mikroskopia sił atomowych oferuje czułą, dokładną i niezawodną technikę bezpośredniego pomiaru sztywności próbek miękkich fiolek, takich jak naczynia krwionośne, komórki i dostępne metryki. O ile nam wiadomo, takie delikatne pomiary są wyjątkowo możliwe przy użyciu mikroskopu sił atomowych. Nasze ostatnie prace wykazały, że naczynia włosowate siatkówki stają się sztywniejsze w cukrzycy, co prowadzi do zapalenia naczyń krwionośnych siatkówki i zwyrodnienia.Głębsze zrozumienie mechanicznej regulacji retinopatii cukrzycowej może potencjalnie zidentyfikować cele przeciwzapalne oparte na mikrobiologii, które umożliwią skuteczniejsze terapie w przyszłości. Na początek umieść formalne i nieruchome oko myszy na kawałku woskowanego papieru pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą pary mikrokleszczy przytrzymaj resztki mięśnia i nerwu wzrokowego.Następnie ustaw oko tak, aby rogówka była skierowana w jedną stronę. Teraz użyj ostrza chirurgicznego, aby wykonać nacięcie o długości od jednego do dwóch milimetrów z tyłu i równolegle do rąbka. Zastosuj siłę ostrza w dół, przytrzymując oko na miejscu, aż przedni segment oddzieli się od tylnego końca.Następnie wyrzuć przedni odcinek i soczewkę. Przenieś tylny segment do sześciocentymetrowego naczynia wypełnionego PBS. Użyj mikroszpatułki, aby zgarnąć siatkówkę, jednocześnie przytrzymując nerw wzrokowy za pomocą mikrokleszczyków.Aby przepłukać siatkówkę, przenieś ją do studzienki z 12-dołkową płytką, która ma sześć studzienek wypełnionych podwójnie destylowaną wodą. Użyj pipety P 1000, aby ostrożnie odpipetować wodę w górę i w dół, w pobliżu siatkówki, jednocześnie przedmuchując wodę, aby spowodować delikatne mieszanie. Następnie użyj odwróconej szklanej pipety, aby przenieść siatkówkę do drugiego dołka.Aby strawić siatkówkę, przenieś przepłukaną siatkówkę do roztworu trypsyny w 12-dołkowej płytce za pomocą odwróconej szklanej pipety. Wyśrodkuj w nasączonej trypsyną końcówce pipety P 200 na nerwie wzrokowym. Następnie delikatnie pipetuj całą sieć naczyniową w górę iw dół, aby zdysocjować tkankę nienaczyniową.Teraz użyj pipety z odwróconego szkła wstępnie przepłukanej trypsyną, aby przenieść naczynia krwionośne siatkówki do studzienki zawierającej podwójnie destylowaną wodę, na płytce z sześcioma dołkami. Zakręć płytką, a następnie pipetuj naczynia krwionośne w górę iw dół za pomocą pipety ze szkła płukanego trypsyną w celu usunięcia wszelkich resztek tkanki nienaczyniowej. Ostrożnie przenieś układ naczyniowy siatkówki do środka zaznaczonego obszaru na szkiełku mikroskopowym o naładowanej powierzchni.Następnie za pomocą pipety P 200 ostrożnie usuń nadmiar wody z jednej krawędzi. Umieść szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego blisko przedniej strony, aby resztki wody odparowały. Gdy układ naczyniowy jest prawie suchy, przenieś go pod mikroskop z kontrastem fazowym.Użyj pipety P 200, aby powoli dodawać podwójnie destylowaną wodę po jednej stronie zaznaczonego obszaru, aby ostrożnie nawodnić naczynia krwionośne. Unieruchomienie izolowanego układu naczyniowego siatkówki pozwoliło uzyskać strukturalnie solidną i wystarczająco trwałą tkankę nadającą się do pomiarów AFM. Natomiast naczynia siatkówki odizolowane od niestałych lub krótko nieruchomych oczu uległy fragmentacji i zapadły się.Na początek spłucz szkiełka nakrywkowe pokryte żelatyną usieciowaną aldehydem glutarowym w PBS zawierającym wapń i magnez, około pięć razy na wytrząsarce orbitalnej. Podczas pierwszych trzech płukań należy podnieść szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnej pęsety, aby umożliwić dokładne wypłukanie aldehydu glutarowego. Następnie zastąp pożywkę hodowlaną mysich REC świeżą pożywką uzupełnioną sterylnym przefiltrowanym kwasem askorbinowym.Po 15 dniach leczenia przepłukać komórki PBS bez wapnia i magnezu. Inkubować komórki w 250 mikrolitrach ciepłego buforu decelularyzacyjnego przez dwie do trzech minut. Potwierdź decelularyzację komórek pod mikroskopem z kontrastem fazowym.Delikatnie odpipetować bufor, nie naruszając macierzy podśródbłonka wydzielanej przez REC. Następnie dodaj 0,5 mililitra PBS do każdej studzienki. Po wyjęciu PBS dodaj 200 mikrolitrów naszego N-ace free DN-ace 1.Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby usunąć wszystkie zanieczyszczenia komórkowe. Następnie obejrzyj włóknistą matrycę podśródbłonkową w makroskali pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Następnie użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobaczyć drobniejsze włókna matrycy w skali nano w powiększeniu 100x.Agregaty macierzy podśródbłonkowej obserwowano na szklanych szkiełkach nakrywkowych po decelularyzacji 10-dniowych lub 15-dniowych hodowli ludzkich lub mysich REC. Mikroskopia konfokalna matryc zdecelularnych wykazała gęstą nanofibrylarną matrycę kolagenową four i fibronektyny. Aby rozpocząć, zamocuj uchwyt wspornika AFM na stanowisku do wymiany wsporników.Użyj kleszczyków zegarmistrzowskich, aby zamontować wybrany wspornik na uchwycie. Dokręć na uchwycie, aby zabezpieczyć wspornik. Umieść i zablokuj uchwyt wspornika na głowicy AFM, która spoczywa na stojaku.Użyj funkcji silnika krokowego w oprogramowaniu AFM, aby wycofać głowicę AFM do najwyższego punktu i ustaw tę pozycję jako punkt zerowy. Ostrożnie podnieś głowicę AFM ze stojaka, a następnie zamontuj ją na stoliku na próbki, umieszczając nogi w odpowiednich szczelinach. Aby skalibrować wspornik, użyj funkcji silnika krokowego, aby zbliżyć go do powierzchni próbki.Następnie kliknij na podejście w oknie trybu kontaktu dla spektroskopii. Opuszczaj wspornik w małych odstępach co 15 mikrometrów. Naciśnij przycisk Acquire, aby uchwycić krzywą siły.Następnie wybierz krzywą siły. Otwórz go w oknie menedżera kalibracji i wybierz tryb oparty na kontakcie w sekcji metody. Teraz użyj funkcji wybierz zakres dopasowania i wybierz krzywą cofania wspornika, aby uzyskać dopasowanie krzywej liniowej.Następnie zaznacz pole wyboru czułości, aby przeliczyć jednostkę siły z wolta na niuton. Podnieś wspornik o 100 do 200 mikrometrów w cieczy i wybierz funkcję szumu termicznego. Ponownie kliknij wybierz zakres dopasowania i dopasuj krzywą dzwonową szumu termicznego do krzywej Lawrence'a.Po dopasowaniu krzywej należy wybrać pole stałej sprężystości K. Upewnij się, że stała sprężystości jest zbliżona do wartości producenta i zanotuj ją na przyszłość. Następnie umieść zamontowaną na szkiełku próbkę naczyń siatkówki oka gryzonia lub macierzy podśródbłonkowej na etapie AFM i uwidocznij naczynia siatkówki.Wybierz tryb kontaktowy dla spektroskopii w sekcji eksperymentu oprogramowania. Następnie ustaw nastawę siły na 0,5 nanoniutona i kliknij podejście. Użyj stolika na stoliku AFM, aby ostrożnie ustawić sondę wspornikową w żądanym miejscu na próbce.Kliknij przycisk Approach, aby ustawić wspornik bliżej próbki, a następnie kliknij przycisk acquire, aby przechwycić krzywe siły. Na koniec zapisz wszystkie krzywe sił do analizy. Krzywe podejścia i retrakcji uzyskane z naczynia włosowatego siatkówki wyizolowanego od myszy z cukrzycą były bardziej strome niż te uzyskane od myszy bez cukrzycy.

isolation-mouse-retinal-capillaries-subendothelial-matrix-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych

Prezentujemy metodę badania wczesnych zmian zwyrodnieniowych stawów na poziomie komórkowym w chrząstce stawowej za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do wykrywania wczesnej choroby zwyrodnieniowej stawów

Przedstawiamy protokół do pomiaru modułów sprężystości obszarów bogatych w kolagen w prawidłowej i chorej wątrobie za pomocą mikroskopii sił atomowych. Jednoczesne zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej zapewnia wysoką precyzję przestrzenną do lokalizacji obszarów bogatych w kolagen w wycinkach wątroby.

Pomiar sztywności wątroby za pomocą mikroskopii sił atomowych sprzężonej z mikroskopią polaryzacyjną

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Poznaj izolację naczyń włosowatych siatkówki i macierzy podśródbłonkowej myszy do pomiaru sztywności metodą mikroskopii sił atomowych. Technika ta pozwala badać mechanobiologię naczyń w retinopatii cukrzycowej.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów