Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery
24 maja 2024
Szybka i ustandaryzowana procedura tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z różnych gleb ryzosfery jest przedstawiona tutaj. Jest to unikalny protokół przeznaczony do badania i symulacji złożonej mikrobioty glebowej ryzosfery.
W naszych badaniach skupiliśmy się na bakteriach ryzosferowych i bionawozach, a naszym celem jest opracowanie syntetycznych zbiorowisk biobakteryjnych, które będą wykorzystywane jako bionawozy drugiej generacji. Punkt ciężkości naszych badań nad bakteriami ryzosferowymi przesunął się z pojedynczego szczepu na poziom społeczności. Nie ma jednak standardowych metod budowania syntetycznych społeczności bakteryjnych.
Obecnie nadal nie ma pewności co do kompatybilności i zdolności kolonizacyjnej syntetycznych społeczności bakteryjnych przewidywanych na podstawie analizy mikrobiomu. W związku z tym jest to również główne wąskie gardło w rozwoju bionawozów drugiej generacji. W porównaniu z dużymi danymi sekwencjonowania konwencjonalnymi metodami, nasze podejście "najpierw kultura, później identyfikacja" znacznie zmniejsza ilość pracy związanej z sekwencjonowaniem genów 60 SRR.
Opłacalne jest tworzenie syntetycznych społeczności bakteryjnych, które kolonizują, wykorzystują szybko i skutecznie. Nasze przyszłe badania będą koncentrować się na biologicznej funkcji zbiorowisk bakteryjnych opartych na wielogatunkowych biofilmach, a szczególną uwagę zwrócimy na promowanie wzrostu roślin, poprawę odporności roślin na stres i ochronę zdrowia roślin. Na początek zdobądź nasiona ogórka i zdezynfekuj je 75% etanolem, a następnie 2% roztworem podchlorynu sodu.
Po wypłukaniu nasion w sterylnej wodzie kiełkuj je w sterylnych warunkach. Przeszczep konsekwentnie kiełkujące, dwulistne sadzonki do doniczek zawierających dwa kilogramy czarnej ziemi. Gdy sadzonki osiągną fazę czterech liści, odwróć doniczkę i odizoluj korzenie wraz z glebą ryzosferową o grubości dwóch milimetrów, używając wysterylizowanych rękawiczek.
Umieść korzenie w 30 mililitrach buforu PBSS w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Potrząsaj probówką przez 20 minut i przefiltruj zawiesinę przez nylonowy filtr komórkowy o grubości 100 mikrometrów, aby usunąć korzenie lub duże osady. Przenieść filtrat do innej 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować go przy 3,200 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Tymczasowo przechowuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed ekstrakcją komórek bakteryjnych gleby ryzosferycznej. Na początek należy stworzyć wielogatunkowy biofilm ryzosfery i uzyskać zawiesinę komórek mikrobioty. Mieszane podłoża bulionowe sojowe Triptyc z minimalną ilością soli glutaminianu glicerolu w stosunku jeden do jednego.
Zawiesinę komórkową inkubować w pożywce w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. aby aktywować bakterie. Umieść nylonowe filtry komórkowe o średnicy 100 mikrometrów na 24-dołkowej płytce.
Zaszczepić zawiesinę bakteryjną w trzech powtórzeniach i hodować biofilm błonki przez 36 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Usunąć filtr zawierający biofilm błonki i dodać dwa mililitry buforu PBSS do nowej 24-dołkowej płytki komórkowej. Umieść filtr na płytce, aby umyć biofilm i usunąć wolne komórki.
Po zidentyfikowaniu i wyhodowaniu pięciu głównych gatunków w biofilmie, należy inkubować 31 kombinacji syntetycznych zbiorowisk w pożywce. W następstwie wspomnianej procedury zaobserwowano znaczne gradienty zdolności do tworzenia biofilmu z mikrobioty glebowej ryzosfery ogórka. Sekwencjonowanie amplikonów biofilmu potwierdziło obecność różnych gatunków w błonce.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zestandaryzowaną procedurę tworzenia synergistycznych wielogatunkowych społeczności biofilmu pochodzących z gleb ryzosferowych. Protokół ma na celu rozwój syntetycznych społeczności biobakteryjnych, przenosząc punkt ciężkości z zastosowań pojedynczych szczepów na poziom całych społeczności jako potencjalnych bionawozów drugiej generacji.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Bakterie ryzosferowe
- Bionawozy
- Wielogatunkowe biofilmy
Wprowadzenie
- Potrzeba stosowania standardowych metod w tworzeniu syntetycznych społeczności bakteryjnych
- Wyzwania związane z kompatybilnością i kolonizacją społeczności syntetycznych
- Przejście z konwencjonalnych metod sekwencjonowania na podejścia bardziej efektywne kosztowo
Zastosowane metody
- Podejście „najpierw hodowla, później identyfikacja” w celu ustanowienia społeczności bakteryjnych
- Wykorzystanie nasion ogórka i specyficznych protokołów sterylizacji
- Inkubacja kultur w temperaturze 30 °C i techniki hodowli biofilmu
Główne wyniki
- Skuteczne utworzenie wielogatunkowych biofilmów ryzosferycznych
- Obserwacja znaczących różnic w zdolnościach do tworzenia biofilmów
- Identyfikacja wielu gatunków potwierdzona poprzez sekwencjonowanie
Wnioski
- Badanie prezentuje metodę tworzenia efektywnych społeczności bakteryjnych do zastosowań w rolnictwie
- Potencjalne znaczenie w poprawie wzrostu i zdrowotności roślin poprzez zastosowanie bionawozów
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka konstrukcja wielogatunkowych społeczności biofilmu z gleby ryzosfery rozwiązuje kluczowy problem w opracowywaniu biofertilizatorów nowej generacji. Podejście to umożliwia funkcjonalną analizę konsorcjów drobnoustrojów, co zwiększa wiarygodność predykcyjną interwencji na poziomie społeczności w celu poprawy zdrowotności roślin. Przedstawiona metodologia pozycjonuje syntetyczne społeczności biofilmu jako wielokrotnie wykorzystywalną platformę do wczesnego odkrywania i badań translacyjnych w ramach portfolio biotechnologii rolniczej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę oddziaływań mikrobiologicznych istotnych dla środowisk związanych z roślinami.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie kompatybilności i potencjału kolonizacyjnego kandydowanych taksonów.
- Ułatwia zwiększenie pewności predykcyjnej w wyborze stabilnych składów konsorcjów dla dalszych zastosowań.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane wielogatunkowe systemy biofilmu do wysokoprzepustowego przesiewania cech funkcjonalnych.
- Standaryzuje testy tworzenia biofilmu z wykorzystaniem barwienia fioletem krystalicznym oraz ilościowego oznaczenia qPCR.
- Umożliwia powtarzalną ocenę zdolności do tworzenia biofilmu w wielu kombinacjach wspólnot.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność translacyjną poprzez dopasowanie syntetycznych społeczności do modeli roślinnych istotnych dla danej choroby.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów na nawozy biologiczne w oparciu o funkcjonalne wskaźniki biofilmu.
- Stanowi platformę do mechanistycznej redukcji ryzyka w odniesieniu do konsorcjów mikrobiologicznych przed walidacją polową.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje proces od wczesnego etapu odkrywania, poprzez przesiewanie, aż po badania translacyjne, co umożliwia iteracyjną optymalizację syntetycznych społeczności biofilmu do zastosowań w rolnictwie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących synergii mikrobiologicznej i składania się społeczności z gleby ryzosferowej.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych dotyczących tworzenia biofilmu w celu wyboru kandydatów.
- Analityka: Wykorzystuje sekwencjonowanie 16S rRNA oraz qPCR do uzyskania wiarygodnych odczytów składu i liczebności społeczności.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki laboratoryjne z systemami związanymi z roślinami w celu walidacji przedklinicznej.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Ustanawia zestandaryzowany przepływ pracy, który można dostosować do różnych modeli glebowych i roślinnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do interwencji na poziomie zbiorowisk oraz walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Usprawnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność konstrukcji syntetycznych biofilmów.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w rozwoju bionawozów i ogranicza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację konsorcjów mikrobiologicznych z uwzględnieniem ryzyka w celu ich wdrożenia translacyjnego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu ekologii drobnoustrojów, testów biofilmu oraz technik kwantyfikacji molekularnej.
- Wymaga dostępu do infrastruktury do wirowania, filtracji i sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji kwantyfikacji biofilmu oraz kryteriów doboru społeczności.
- Możliwość adaptacji do różnych modeli ryzosfery i roślin poprzez modyfikacje protokołu w razie potrzeby.
- Zależne od dokładnej identyfikacji i izolacji dominujących taksonów z próbek środowiskowych.
