Name: Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Poznaj metodę budowania wielogatunkowych biofilmów z bakterii ryzosfery gleby. Technika ta umożliwia tworzenie syntetycznych wspólnot bakteryjnych jako nowej generacji biofertyliatorów wspierających wzrost roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (42307173 i 42107328) oraz Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju (2022YFD1500202 i 2022YFF1001800). P.W, Z.X zaprojektowali badanie. P.W, B.X, Z.C, J.X i N.Z przeanalizowali dane i stworzyli liczby. P.W. napisał pierwszy szkic rękopisu. Z.X., R.Z. i Q.S. dokonali poprawek w rękopisie.

Ten protokół ma ogólne zastosowanie do mikrobioty glebowej ryzosfery z różnych roślin. Tutaj jako przykład używany jest ogórek. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja bakteryjna
<ol>
	<li>Izolacja gleby ryzosfery
	<ol>
		<li>Kultura ogórkowa
		<ol>
			<li>Zdezynfekuj nasiona ogórka 75% etanolem i 2% roztworem podchlorynu sodu (NaClO), a następnie opłucz je w sterylnej wodzie11.</li>
			<li>Kiełkuj nasiona w sterylnych warunkach i wybierz te, które osiągną fazę dwóch liści12. Następnie przesadzić konsekwentnie kiełkujące sadzonki ogórka do doniczek zawierających 2 kg czarnej ziemi. 
			UWAGA: W celu zmniejszenia liczby błędów systematycznych stosuje się dwa rodzaje czarnej gleby z różnych lokalizacji w północno-wschodnich Chinach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie zawiesiny glebowej
		<ol>
			<li>Przygotować bufor PBS-S stosując preparat: 6,33 g NaH2PO4·H2O, 16,5 g Na2HPO4·7H2O, 200 μL Silwet L-77 i 1 l wody destylowanej.</li>
			<li>Gdy siewki osiągną fazę czterech liści12, odwróć doniczkę i odizoluj korzenie wraz z ziemią ryzosferyczną o grubości 2 mm za pomocą wysterylizowanych rękawiczek.</li>
			<li>Umieść korzenie w 30 ml buforu PBS-S w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Po wytrząsaniu przez 20 minut przefiltruj zawiesinę przez nylonowy filtr komórkowy o średnicy 100 μm, aby usunąć korzenie i duże osady.</li>
			<li>Przenieść filtrat do innej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, odwirować go przy 3200 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej i tymczasowo przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja komórek bakteryjnych gleby ryzosferowej. 
	UWAGA: Ta metodologia przyjmuje metodę wirowania różnicowego13, chociaż metoda wirowania w gradicynie gęstości Nycodenz14 ma również zastosowanie do tego kroku.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę glebową 0,2% roztworem Na4P2O7 do 500 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut, aby wstępnie oddzielić organizmy od gleby.</li>
		<li>Ponownie homogenizuj osad, odwiruj go z tą samą niską prędkością przez 60 s i powtórz proces trzy razy. Połączyć supernatanty, odwirować je przy 12 000 x g przez 20 minut, a następnie odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 50 ml buforu PBS-S, stanowiącego zawiesinę komórek bakteryjnych w glebie ryzosfery.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekwencjonowanie i identyfikacja mikrobioty biofilmu ryzosfery
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża 
	UWAGA: W handlu dostępny jest bulion sojowy tryptyczny (TSB) i minimalna ilość soli glutaminianu glicerolu (MSgg). Poniższe sformułowania mają wyłącznie charakter poglądowy.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę TSB przy użyciu następującego preparatu: 15 μg/ml tryptonu, 5 μg/ml peptonu sojowego, 5 μg/ml NaCl, pH = 7.</li>
		<li>Przygotować pożywkę MSgg stosując następujący preparat: 5 mM KH2PO4, 100 mM kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM tiamina, 0,5% glicerol, 0,5% glutaminian, 50 μg/ml tryptofanu, 50 μg/ml fenyloalaniny, pH = 7.</li>
		<li>Aby przygotować nośnik TSB-MSgg, wymieszaj nośnik TSB z nośnikiem MSgg w stosunku 1:1 (v/v)15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kokultura biofilmu błonki
	<ol>
		<li>Zawiesinę komórkową inkubować w pożywce TSB w temperaturze 30 °C przez noc (zwykle 12 godzin) w celu aktywacji bakterii.</li>
		<li>Umieść nylonowe filtry komórkowe 100 μm na płytkach 24-dołkowych. Inkubuj bakterie w pożywce TSB i ustaw trzy powtórzenia. Hodować biofilm błonki przez 36 godzin w temperaturze 30 °C. 
		UWAGA: Jeśli biofilm błonki z ostatniego etapu nie jest dobrze wyhodowany, pożywka TSB-MSgg jest skutecznym substytutem pożywki TSB.</li>
		<li>Usunąć filtr zawierający biofilm błonki. Dodaj 2 ml buforu PBS-S do nowej 24-dołkowej płytki komórkowej, umieść w niej 24-dołkowy filtr, aby przepłukać biofilm i usunąć wolne komórki. Powtórz proces prania trzy razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA biofilmu błonki
	<ol>
		<li>Wyodrębnij genom biofilmu za pomocą zestawu DNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości 
	UWAGA: Firmy biotechnologiczne mogą pomóc w przeprowadzaniu eksperymentów sekwencjonowania dla większości laboratoriów. Jeśli potrzebna jest kompozycja mikrobiologiczna w pozostałym roztworze, uporządkuj ją na tym etapie. Krok sekwencjonowania różni się w zależności od instrumentów. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Krok 2.4.1 służy wyłącznie jako odniesienie.
	<ol>
		<li>Amplifikacja regionów V3-V4 genu 16S rRNA na podstawie bazy danych z sekwencjami genu 16S rRNA o pełnej długości. Utwórz OTU gatunków zgodnie z minimalną liczbą sekwencji na próbkę16. Grupuj adnotacje klasyfikacyjne gatunków i uzyskaj skład zbiorowisk z każdej próbki.</li>
		<li>Na podstawie danych z sekwencjonowania wybierz pięć najlepszych szczepów pod względem ich względnej liczebności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysokowydajna izolacja i hodowla bakterii 
	UWAGA: Ten krok został zaprojektowany zgodnie z najnowszą metodologią mikrobiologiczną i bioinformatyczną17. Do izolacji bakteryjnej dostępna jest tutaj metoda płytki powlekanej rozcieńczeniem, chociaż jest ona bardziej czasochłonna i mniej ukierunkowana w porównaniu z technikami wysokoprzepustowymi.
	<ol>
		<li>Wymieszaj wyhodowany biofilm. Stosować rozcieńczenie ograniczające, aby upewnić się, że nie więcej niż 30% studzienek w płytce 24-dołkowej wykazuje rozwój bakterii. 
		UWAGA: Aby określić najbardziej odpowiednie rozcieńczenie, należy przeprowadzić wstępne eksperymenty z użyciem szerokiego zakresu rozcieńczeń. Optymalne rozcieńczenie powinno zawierać nie więcej niż dwie bakterie nadające się do hodowli na mililitr, co stanowi inkubację bakterii w mniej niż 30% studzienek.</li>
		<li>Amplifikuj gen 16S rRNA bakterii, dodając etykiety dla studzienek i płytek, a następnie sekwencjonuj je za pomocą wysokowydajnej platformy Illumina17.</li>
		<li>Przeprowadzaj analizy bioinformatyczne przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania w celu uzyskania informacji o czystości i taksonomii gatunków dla każdej kultury.</li>
		<li>Hoduj pięć pierwszych obfitych czystych bakterii przez ciągłą hodowlę liniową i użyj glicerolu, aby zachować bakterie w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Budowa syntetycznych zbiorowisk mikrobiologicznych
<ol>
	<li>Zrekonstruowana kultura biofilmu 
	UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z Ren et al.18. 5 szczepów odpowiada 31 syntetycznym kombinacjom, w tym 5 jednogatunkowym, 10 dwugatunkowym, 10 trzygatunkowym, 5 czterogatunkowym i 1 pięciogatunkowym.
	<ol>
		<li>Inkubuj 5 szczepów w pożywce TSB, aż ich OD600 osiągnie 1, aby je aktywować.</li>
		<li>Przygotuj kilka 24-dołkowych płytek z podłożem TSB i umieść na nich nylonowe filtry komórkowe 100 μm. 
		UWAGA: Jeśli biofilm z ostatniego etapu nie jest dobrze wyhodowany, pożywka TSB-MSgg jest skutecznym substytutem pożywki TSB.</li>
		<li>Inkubuj 31 kombinacji syntetycznych społeczności w podłożu. Upewnij się, że liczba inokulacji bakterii jest stała w każdym dołku. Ustaw trzy powtórzenia dla każdej kombinacji.</li>
		<li>Hodować biofilm w temperaturze 30 °C przez 36 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie ilościowe biofilmu błonki
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 2.2.3.</li>
		<li>Przenieść biofilm na nową 24-dołkową płytkę zawierającą 180 μl roztworu fioletu krystalicznego i barwić go przez 20 minut.</li>
		<li>Przenieść wybarwioną próbkę na inną 24-dołkową płytkę zawierającą 200 μl 96% etanolu, eluować ją przez 30 minut i zmierzyć OD590.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja liczby komórek błonki
UWAGA: Aby określić proporcje każdego gatunku i liczbę komórek w błonce i pozostałym roztworze, konieczne jest ilościowe PCR. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z artykułem Sun et al.16.
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery specyficzne dla szczepu dla wybranych syntetycznych zbiorowisk mikroorganizmów.</li>
	<li>Użyj Roary'ego, aby przeprowadzić porównania genomów i dowiedzieć się, jakie są specyficzne dla szczepu pojedyncze kopie genów każdego izolatu. Upewnij się, że startery są ukierunkowane na te geny.</li>
	<li>Ligazuj amplifikowane fragmenty do plazmidów PMD19T. Wygeneruj krzywe standardowe, używając plazmidów zawierających odpowiednie fragmenty jako szablony.</li>
	<li>Wykonaj te same czynności, jak opisano w kroku 2.2.</li>
	<li>Przygotować składniki reakcji w następujący sposób: 7,2 μlH2O, 10 μl 2x qPCR Master mix, 0,4 μL 10 μM każdego startera i 2 μl matrycy DNA.</li>
	<li>Wykonaj PCR za pomocą przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym w następujących warunkach: 95 °C przez 10 minut, 40 cykli po 95 °C przez 30 s i 60 °C przez 45 s, a następnie standardowy segment krzywej topnienia.</li>
	<li>Wykonaj sześć powtórzeń biologicznych dla każdego zabiegu.</li>
</ol>

Developing Synergistic Multispecies Biofilms from Rhizosphere Soil

<ol><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
<li>Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+community+structure+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Rhizosphere%22%5BJournal%5D)">Anatomy and community structure of the rhizosphere.</a> Rhizosphere. , 11-34 (1990).</li>
<li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-growth-promoting+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-growth-promoting rhizobacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).</li>
<li>Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+in+the+rhizo-+and+endosphere+of+plants%3A+Their+role%2C+colonization%2C+mechanisms+involved+and+prospects+for+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization.</a> Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).</li>
<li>Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocontrol+of+Bacillus+subtilis+against+infection+of+Arabidopsis+roots+by+Pseudomonas+syringae+is+facilitated+by+biofilm+formation+and+surfactin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production.</a> Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).</li>
<li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-microbiome+interactions%3A+From+community+assembly+to+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+velezensis+stimulates+resident+rhizosphere+Pseudomonas+stutzeri+for+plant+health+through+metabolic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions.</a> ISME J. 16, 774-787 (2021).</li>
<li>Pandhal, J., Noirel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+ecosystems+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial ecosystems for biotechnology.</a> Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).</li>
<li>Grosskopf, T., Soyer, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial communities.</a> Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana.+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528, 364-369 (2015).</li>
<li>Bakken, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+bacteria+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of bacteria from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).</li>
<li>Yang, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+extraction+from+fresh+and+stored+soil+samples%3A+Impact+on+microbial+viability+and+community+compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions.</a> Soil Biol Biochem. 155, 108178(2021).</li>
<li>Ren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+multispecies+biofilm+formation+and+quantitative+PCR-based+assessment+of+individual+species+proportions%2C+useful+for+exploring+interspecific+bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions.</a> Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interactions+affect+the+biomass+of+synthetic+bacterial+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities.</a> mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cultivation+and+identification+of+bacteria+from+the+plant+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota.</a> Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).</li>
<li>Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+biofilm+synergy+among+bacterial+soil+isolates+in+cocultures+indicates+bacterial+interspecific+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation.</a> ISME J. 9, 81-89 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).</li>
<li>Palková, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+microorganisms%3A+Laboratory+versus+nature%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature.</a> EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+in+plant-microbe+beneficial+interactions%3A+a+toolbox+for+precise+management+of+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes.</a> Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zgodnie z protokołem zbudowano szereg wytrzymałych, syntetycznych, wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu w oparciu o mikrobiotę w glebie ryzosferowej pochodzących z różnych roślin. Korzystając z ilościowych technik PCR, skład każdej społeczności jest wyraźnie rozszyfrowywany. Biomasa biofilmu wskazuje na siłę ich potencjalnych oddziaływań metabolicznych, choć nie udało się tu ujawnić różnych właściwości i mechanizmów stojących za współpracą19. Biorąc pod uwagę wielkość i złożoność naturalnych zbiorowisk mikroorganizmów, zbiorowiska syntetyczne (SynComs) stanowią modelowy system pokonywania istniejących przeszkód14. W protokole tym podkreślono systematyczną i fundamentalną metodologię konstruowania syntetycznych zbiorowisk biofilmu ze złożonej ryzosfery mikrobioty glebowej.
Z ostatniej części jasno wynika, że SQR9, XL-1 i XL-2 wykazują duży potencjał do stabilnej kolonizacji w rzeczywistej ryzosferze. Naukowcy mogą rozpocząć badania nad relacjami metabolicznymi i mechanizmami kokolonizacji w oparciu o te szczepy. Późniejsze badania nad inokulantami mikrobiologicznymi dla ogórka są również dostępne w późniejszym terminie.
Pomimo wymienionych zalet ważne jest, aby nie przeoczyć wad protokołu. Ze względu na różnice między hodowlą laboratoryjną a warunkami in situ , wyniki każdego syntetycznego zbiorowiska mogą nie odzwierciedlać dokładnie mikrobioty w rzeczywistej glebie ryzosfery20. Konieczne jest potwierdzenie poprzez dalszą inokulację ryzosfery. Ponadto powtarzalność tych wyników jest stosunkowo słaba. Gatunki biofilmu błonki w laboratorium mogły ulegać mutacjom na przestrzeni wielu pokoleń w porównaniu z dzikimi typami w glebie, co prowadzi do pewnych niekontrolowanych niedokładności.
Istnieje kilka alternatyw dla niektórych kroków w protokole. Na przykład w kroku 1.2 metoda wirowania w gradionym gradimencie gęstości Nycodenz jest stosunkowo bardziej efektywna w przypadku pobierania próbek komórek glebowych13. Dodatkowo, w kroku 2.4, najnowsza wysokowydajna hodowla i identyfikacja bakterii znacznie zwiększa wydajność eksperymentów, choć wiąże się to z wyższymi kosztami. W związku z tym tradycyjna metoda powlekania rozcieńczonymi płytkami pozostaje odpowiednia do selekcji kilku gatunków. Wreszcie, w kroku 3.2, biomasę uprawianego biofilmu można ocenić zarówno za pomocą barwienia fioletem krystalicznym, jak i przez bezpośrednie zważenie jej na wadze analitycznej.
Protokół ten wykracza poza samo tworzenie podstawowych materiałów eksperymentalnych do badań mikrobiologicznych i środowiskowych. Zidentyfikowanie najbardziej wytrzymałych zbiorowisk biofilmu wielogatunkowego z syntetycznych bakterii to dopiero pierwszy krok na drodze do odkrycia otwartego i złożonego ekosystemu ryzosfery. Koncentrując się na podstawowych gatunkach SynComs, naukowcy mogą uzyskać wgląd w rzeczywiste sytuacje in situ w bardziej ukierunkowany i szybszy sposób. Podejście to może również zapewnić nową perspektywę badania biofilmów na większą skalę, takich jak agregaty glebowe ryzosfery, oraz precyzyjnego zarządzania zbiorowiskami mikroorganizmów ryzosfery dla wzrostu i zdrowia roślin21.
Co najważniejsze, metodologia ta rzuci światło na dalsze badania nad interakcjami międzygatunkowymi, które rządzą zbiorowiskiem i dynamiką mikrobioty glebowej ryzosfery. Na przykład, gdy mamy do czynienia ze złożoną społecznością ryzosfery, inne metody analityczne, takie jak analiza sieci współwystępowania lub modelowanie metaboliczne w skali genomu15 są często łączone z tymi podstawowymi krokami w celu sztucznego skonstruowania reprezentatywnej społeczności biofilmu. Obejmuje to rozważania na temat relacji międzygatunkowych.

Biofilmy reprezentują skomplikowane społeczności mikroorganizmów przymocowane do powierzchni lub połączone interfejsami. Powszechnie uznaje się, że większość bakterii napotkanych w różnych środowiskach, takich jak siedliska naturalne, warunki kliniczne i konteksty przemysłowe, przetrwa w społecznościach biofilmu1. W glebie ryzosfera – obejmująca powierzchnię korzenia i przylegający do niego obszar o grubości 2 mm – tworzy niszę ekologiczną o zwiększonej dostępności składników odżywczych. Konkretne bakterie rozwinęły strategie wykorzystania tej niszy, sprzyjając namnażaniu się drobnoustrojów i tworzeniu zbiorowisk biofilmu w ryzosferze2.
Mikroorganizmy ryzosfery są uważane za 'drugi genom' roślin3. Mikroorganizmy wspomagające wzrost roślin (PGPM) angażują się w wzajemną symbiozę z roślinami, zapewniając znaczące funkcje wspomagania wzrostu i kontroli biologicznej4. Z jednej strony PGPM może dostarczać składniki odżywcze do korzeni roślin, zwiększać pobieranie składników odżywczych, bronić przed patogenami i rozkładać zanieczyszczenia w glebie ryzosfery5. Z drugiej strony, PGPM wykorzystuje wysięki z korzeni roślin jako źródło składników odżywczych dla wzrostu i ewolucji, wpływając w ten sposób na glebę ryzosfery i system korzeniowy poprzez własny metabolizm. Warto zauważyć, że warunkiem wstępnym dla wszystkich tych funkcji jest skuteczna kolonizacja PGPM w ryzosferze rośliny, tworząca stabilne biofilmy6.
Biofilm ryzosfery wpływa na proces składania mikroorganizmów ryzosfery, a czasowe i przestrzenne cechy składania mikroorganizmów ryzosfery są ściśle związane z interakcją wielogatunkowego biofilmu7. Służy jako centrum interakcji roślina-mikrobiom, zapewniając stabilną i kontrolowaną niszę, w której mogą one skutecznie współdziałać. Dlatego badanie biofilmu ryzosfery jest również ważnym kierunkiem w celu uzyskania wglądu w interakcje między roślinami a drobnoustrojami.
Jednak obecnie niewiele jest badań nad wielogatunkowymi biofilmami ryzosfery. Wysoka złożoność składu mikrobiomu sprawia, że trudno jest odpowiedzieć na podstawowe pytania ekologiczne dotyczące naturalnych społeczności mikroorganizmów8. W procesie eksperymentów należy wziąć pod uwagę wiele warunków, takich jak rodzaj gleby, rodzaj rośliny i duża liczba zbiorowisk drobnoustrojów. Różne czynniki ograniczają badania biofilmów wielogatunkowych ryzosfery.
W celu dalszego zbadania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery, takich jak synergiczne interakcje międzygatunkowe czy wzajemne karmienie metabolitów8, pożądane jest sztuczne skonstruowanie uproszczonej, reprezentatywnej, stabilnej i łatwej do opanowania syntetycznej społeczności mikrobiologicznej w warunkach laboratoryjnych9,10. W tym przypadku ustandaryzowany protokół łączy w sobie kilka najnowszych technik mikrobiologicznych i bioinformatycznych.

<table><tbody><tr><td>0,2 % roztwór Na4P2O7</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>20041418</td><td>Służy do rozcieńczania zawiesiny glebowej.</td></tr><tr><td>100 μ m Nylonowy filtr komórkowy</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>F613463-0001</td><td>Służy do filtrowania roztworu hodowlanego i oddzielania biofilmu błonki.</td></tr><tr><td>2% roztwór NaClO</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>L03336903</td><td>Służy do sterylizacji nasion.</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>PSRP010</td><td>Służy do hodowli mikolialnej i separacji biofilmu błonki.</td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)</td><td>Bioolook Badania Naukowe Specjalny</td><td>2360010</td><td>Służy do przygotowania pożywki MSgg.</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.</td><td>62.547.254</td><td>Probówki wirówkowe o odpowiedniej wielkości dla naszego protokołu.</td></tr><tr><td>75% roztwór C2H5OH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>801769680</td><td>Służy do sterylizacji nasion.</td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii XL-1</td><td>Uniwersytet Rolniczy w Nankinie</td><td>N/A</td><td>Szczepy wyizolowane z gleby ryzosferowej.</td></tr><tr><td>Bacillus velezensis SQR9</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Szczepy wyizolowane z gleby ryzosferowej.</td></tr><tr><td>Zestaw DNA bakterii</td><td>Nanjing Dinsi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>D3350020000K04U021</td><td>Służy do ekstrakcji bakteryjnego DNA.</td></tr><tr><td>gleba I</td><td>Uniwersytet Rolniczy w Nankinie</td><td>Nie dotyczy</td><td>gleba z prowincji Jilin.</td></tr><tr><td>gleba II</td><td>Uniwersytet Rolniczy w Nankinie</td><td>N/A</td><td>gleba z prowincji Heilongjiang.</td></tr><tr><td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td><td>Uniwersytet Rolniczy w Nankinie</td><td>N/A</td><td>Szczepy wyizolowane z gleby ryzosferowej.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10035048</td><td>Służy do przygotowania nośników MSgg.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>G508009-0001</td><td>Wirówka szybkoobrotowa.</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme Biotech Co., Ltd.</td><td>Q311-02</td><td>Służy do amplifikacji DNA w qPCR.</td></tr><tr><td>Czysta ławka</td><td>Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.</td><td>NB026143</td><td>Służy do pracy aseptycznej.</td></tr><tr><td>Inkubator stałotemperaturowy</td><td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co., Ltd</td><td>GNP-9080BS-<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Używany do hodowli mikrobiologicznej.</td></tr><tr><td>Krystaliczny fioletowy barwnik</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600331</td><td>Służy do barwienia biofilmu błonki i kwantyfikacji.</td></tr><tr><td>Nasiona ogórka</td><td>Uniwersytet Rolniczy w Nankinie</td><td>N/A</td> <td>"Jinchun I" nasiona ogórka.</td></tr><tr><td>Culturome v 1.0</td><td>Instytut Genetyki i Biologii Rozwoju Chińskiej Akademii Nauk</td><td>Nie dotyczy</td><td>Służy do wysokoprzepustowej hodowli i identyfikacji bakterii glebowych ryzosfery FeCl</td></tr><tr><td>3</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011918</td><td>Służy do przygotowania pożywki MSgg.</td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>Hefei Midea Lodówka Co., Ltd.</td><td>BCD-556WKPM(Q)</td><td>Służy do konserwacji szczepów.</td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Bioolook Badania Naukowe Specjalny</td><td>2180020</td><td>Służy do przygotowania pożywki MSgg.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Służy do przygotowania pożywki MSgg.</td></tr><tr><td>Hydroponiczny kosz do sadzenia</td><td>Sklep meblowy Yulv 6526262626</td><td></td><td>Używany do hydroponiki ogórków.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10017618</td><td>Służy do przygotowania nośników MSgg.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>7791186</td><td>Służy do przygotowania nośników MSgg.</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10400101</td><td>Służy do przygotowania nośników MSgg.</td></tr><tr><td>Msgg Medium</td><td>Shanghai Bioesn Biotechnology Co., Ltd.</td><td>BES20791KB</td><td>Pożywka do hodowli biofilmu błonki.</td></tr><tr><td>Na2HPO4· 7H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9390-100G</td><td>Służy do przygotowania pożywek TSB.</td></tr><tr><td>NaCI</td><td>Chinasun Produkty specjalistyczne co., Ltd.</td><td>HS0416</td><td>Służy do przygotowania pożywek TSB.</td></tr><tr><td>NaH2PO4· H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9638-25G</td><td>Służy do przygotowania pożywek TSB.</td></tr><tr><td>PBS-S Bufor</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.</td><td>E607008-0001</td><td>Podstawowy bufor dla żywych tkanek.</td></tr><tr><td>Fenyloalanina</td><td>RYON</td><td>RT3486L005</td><td>Służy do przygotowania pożywki MSgg.</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BS-1000-T</td><td>Służy do inokulacji szczepów.</td></tr><tr><td>PMD19T Plazmid</td><td>Takara Technologia biomedyczna (Pekin) Co., Ltd.</td><td>D102A</td><td>Służy do generowania krzywych standardowych qPCR.</td></tr><tr><td>Garnek</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny Co., Ltd.</td><td>YHHWS2401</td><td>Służy do uprawy gleby ogórka.</td></tr><tr><td>Podkład do qPCR</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Stosowany do amplifikacji DNA w qPCR.</td></tr><tr><td>Przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.</td><td>4484073</td><td>Służy do wykonywania qPCR na wybranym biofilmie błonki.</td></tr><tr><td>Roary</td><td>The Wellcome Trust SangerInstitute</td><td>N/A</td><td>Służy do projektowania starterów qPCR</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd</td><td>ZQTY-50S</td><td>Służy do mieszania roztworów i hodowli drobnoustrojów.</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cytiva Bio-technology (Hangzhou) Co., Ltd.</td><td>SL77080596</td><td>Służy do przygotowania pożywek TSB.</td></tr><tr><td>Pepton sojowy</td><td>Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd</td><td>HB8275</td><td>Służy do przygotowania pożywek TSB.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Shanghai Yidian Analysis Instrument Co., Ltd.</td><td>76713100010</td><td>Służy do ilościowego oznaczania biofilmu błonki fioletu krystalicznego.</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>SW150302</td><td>Służy do płukania biofilmu błonki.</td></tr><tr><td>Sterylizowane rękawice nitrylowe</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>223016852LLZA</td><td>Używany do podstawowych operacji eksperymentalnych.</td></tr><tr><td>Szablon DNA</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Stosowany do amplifikacji DNA w qPCR.</td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2180020</td><td>Służy do przygotowania pożywek MSgg.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Służy do przygotowania pożywek TSB.</td></tr><tr><td>Tryptofan</td><td>Bioolook Badania Naukowe Specjalny</td><td>2190020</td><td>Służy do przygotowania pożywki MSgg.</td></tr><tr><td>TSB Medium</td><td>Guangdong Huankai Microbial Sci. &amp; Tech. Co., Ltd.</td><td>024048</td><td>Pożywka bakteryjna o szerokim spektrum działania.</td></tr><tr><td>TSB-Msgg Meidium</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A Mieszane</td><td>podłoże do hodowli biofilmu błonki o szerszym zastosowaniu.</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>C0310520123</td><td>Służy do przygotowania pożywki MSgg.</td></tr></tbody></table>

podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

Wielogatunkowy biofilm jest naturalnie występującym i dominującym stylem życia bakterii w przyrodzie, w tym w glebie ryzosferycznej, chociaż obecne zrozumienie tego jest ograniczone. W tym miejscu zapewniamy podejście do szybkiego tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu. Pierwszym krokiem jest ekstrakcja komórek z gleby ryzosfery metodą wirowania różnicowego. Następnie te komórki glebowe są zaszczepiane w pożywce hodowlanej w celu utworzenia biofilmu błonki. Po 36 godzinach inkubacji określa się skład bakteryjny biofilmu i roztworu pod spodem za pomocą metody sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Tymczasem wysokoprzepustową izolację bakteryjną z biofilmu błonki przeprowadza się metodą rozcieńczenia ograniczającego. Następnie wybiera się 5 najlepszych taksonów bakteryjnych o największej liczebności w danych sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA (próbki biofilmu błonki) do dalszego wykorzystania w budowie wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu. Wszystkie kombinacje 5 taksonów bakteryjnych zostały szybko ustalone przy użyciu 24-dołkowej płytki, wybranej pod kątem najsilniejszej zdolności tworzenia biofilmu za pomocą testu barwienia fioletem krystalicznym i oznaczonej ilościowo za pomocą qPCR. Ostatecznie za pomocą powyższych metod uzyskano najsolidniejsze zbiorowiska biofilmu wielogatunkowego bakterii syntetycznych. Metodologia ta dostarcza wskazówek informacyjnych do prowadzenia badań nad wielogatunkowym biofilmem ryzosfery i identyfikacji reprezentatywnych społeczności w celu zbadania zasad rządzących interakcjami między tymi gatunkami.

Po zastosowaniu opisanej procedury zaobserwowano znaczne różnice w zdolności do tworzenia biofilmu przez mikrobiotę gleby z ryzosfery ogórka (Rysunek 1). Sekwencjonowanie amplikonów biofilmu potwierdziło gatunki obecne w błonie (Rysunek 2). Na podstawie mapy ciepła danych sekwencyjnych wybrano pięć najliczniejszych gatunków bakterii, których obfitość w błonie była większa niż w pozostałej części roztworu (Rysunek 3). W tym przypadku jako przykład przyjęto typową grupę syntetycznych społeczności. Barwienie fioletem krystalicznym oraz ilościowy PCR pozwalają na bezpośrednią wizualizację różnic w biomasie błony i względnej obfitości poszczególnych gatunków w społecznościach. Zwiększona biomasa kokultury świadczy o sukcesie w konstruowaniu synergistycznych, wielgatunkowych społeczności biofilmu z gleby ryzosferycznej (Rysunek 4 i Rysunek 5).
Wyniki pokazują, że Bacillus velezensis SQR9, Acinetobacter baumannii XL-1 oraz Burkholderia cenocepacia XL-2 mogą tworzyć wyraźne konsorcja synergistyczne, przy czym najbardziej odporna społeczność składa się ze wszystkich trzech gatunków. Przewiduje się, że wykażą one silny synergizm w tworzeniu biofilmu. Warto również zauważyć, że szczep XL-1 pełni rolę „dedykatora”. Promuje on tworzenie biofilmu przez XL-2 i SQR9, pomimo słabego wzrostu i minimalnej liczebności w konsorcjach (Rysunek 5). Podczas gdy szereg wielogatunkowych biofilmów z kokultur wykazuje fenotyp synergistyczny, niektóre gatunki, takie jak Chryseobacterium sp., zawsze wykazują negatywną relację z innymi szczepami, redukując biomasę syntetycznego biofilmu (Rysunek 2). Chociaż zjawisko to nie jest związane z celem niniejszego protokołu, może ono zasługiwać na dalsze badania w przyszłości.
<img alt="Schemat eksperymentu na szalce Petriego; etapy wzrostu drobnoustrojów; próbki XL-1, XL-1+XL-2, XL-1+SQR9." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Tworzenie biofilmu przez różne społeczności syntetyczne (SynComs). Próbki znajdują się w standardowych płytkach 24-dołkowych. Zdjęcia wykonano bez powiększenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy różnorodności mikrobiologicznej; względna liczebność rodzajów w czarnych biofilmach i roztworach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Skład bakteryjny w błonie i roztworze. Wykresy opracowano na podstawie danych z sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA, wspomnianych w kroku 2.3 protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapa ciepła obfitości drobnoustrojów; dane zakodowane kolorami; rozkład taksonomiczny; analiza zmiany krotności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Mapa ciepła zdolności do tworzenia biofilmu w błonie i roztworze. Kolor czerwony reprezentuje większą obfitość w biofilmie niż w roztworze, a kolor niebieski reprezentuje sytuację odwrotną. Rodzaje, które nie wykazały różnic, nie zostały przedstawione. Gatunki o największej obfitości (top 5) są zaznaczone po lewej stronie. bb: czarny biofilm; bs: czarny roztwór. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy biomasy biofilmu (OD₅₉₀) przedstawiający różne zabiegi i ich wpływ na wzrost." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ilościowe oznaczenie biomasy biofilmu społeczności syntetycznych przedstawionych na Rycini 1. Dane pochodzą z ilościowego oznaczenia fioletem krystalicznym przy OD = 590 nm. Przedstawione dane stanowią średnią ± SD, n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy liczby kopii DNA, porównujący XL-1, XL-1+XL-2, XL-1+SQR9, XL-1+XL-2+SQR9." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Liczba komórek i względna liczebność gatunków w syntetycznych społecznościach przedstawionych na Rysunku 1. Dane pochodzą z ilościowej PCR. Przedstawione dane to średnia ± SD, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Szybka i ustandaryzowana procedura tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z różnych gleb ryzosfery jest przedstawiona tutaj. Jest to unikalny protokół przeznaczony do badania i symulacji złożonej mikrobioty glebowej ryzosfery.

Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

W naszych badaniach skupiliśmy się na bakteriach ryzosferowych i bionawozach, a naszym celem jest opracowanie syntetycznych zbiorowisk biobakteryjnych, które będą wykorzystywane jako bionawozy drugiej generacji. Punkt ciężkości naszych badań nad bakteriami ryzosferowymi przesunął się z pojedynczego szczepu na poziom społeczności. Nie ma jednak standardowych metod budowania syntetycznych społeczności bakteryjnych.Obecnie nadal nie ma pewności co do kompatybilności i zdolności kolonizacyjnej syntetycznych społeczności bakteryjnych przewidywanych na podstawie analizy mikrobiomu. W związku z tym jest to również główne wąskie gardło w rozwoju bionawozów drugiej generacji. W porównaniu z dużymi danymi sekwencjonowania konwencjonalnymi metodami, nasze podejście "najpierw kultura, później identyfikacja" znacznie zmniejsza ilość pracy związanej z sekwencjonowaniem genów 60 SRR.Opłacalne jest tworzenie syntetycznych społeczności bakteryjnych, które kolonizują, wykorzystują szybko i skutecznie. Nasze przyszłe badania będą koncentrować się na biologicznej funkcji zbiorowisk bakteryjnych opartych na wielogatunkowych biofilmach, a szczególną uwagę zwrócimy na promowanie wzrostu roślin, poprawę odporności roślin na stres i ochronę zdrowia roślin. Na początek zdobądź nasiona ogórka i zdezynfekuj je 75% etanolem, a następnie 2% roztworem podchlorynu sodu.Po wypłukaniu nasion w sterylnej wodzie kiełkuj je w sterylnych warunkach. Przeszczep konsekwentnie kiełkujące, dwulistne sadzonki do doniczek zawierających dwa kilogramy czarnej ziemi. Gdy sadzonki osiągną fazę czterech liści, odwróć doniczkę i odizoluj korzenie wraz z glebą ryzosferową o grubości dwóch milimetrów, używając wysterylizowanych rękawiczek.Umieść korzenie w 30 mililitrach buforu PBSS w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Potrząsaj probówką przez 20 minut i przefiltruj zawiesinę przez nylonowy filtr komórkowy o grubości 100 mikrometrów, aby usunąć korzenie lub duże osady. Przenieść filtrat do innej 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować go przy 3,200 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Tymczasowo przechowuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed ekstrakcją komórek bakteryjnych gleby ryzosferycznej. Na początek należy stworzyć wielogatunkowy biofilm ryzosfery i uzyskać zawiesinę komórek mikrobioty. Mieszane podłoża bulionowe sojowe Triptyc z minimalną ilością soli glutaminianu glicerolu w stosunku jeden do jednego.Zawiesinę komórkową inkubować w pożywce w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. aby aktywować bakterie. Umieść nylonowe filtry komórkowe o średnicy 100 mikrometrów na 24-dołkowej płytce.Zaszczepić zawiesinę bakteryjną w trzech powtórzeniach i hodować biofilm błonki przez 36 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Usunąć filtr zawierający biofilm błonki i dodać dwa mililitry buforu PBSS do nowej 24-dołkowej płytki komórkowej. Umieść filtr na płytce, aby umyć biofilm i usunąć wolne komórki.Po zidentyfikowaniu i wyhodowaniu pięciu głównych gatunków w biofilmie, należy inkubować 31 kombinacji syntetycznych zbiorowisk w pożywce. W następstwie wspomnianej procedury zaobserwowano znaczne gradienty zdolności do tworzenia biofilmu z mikrobioty glebowej ryzosfery ogórka. Sekwencjonowanie amplikonów biofilmu potwierdziło obecność różnych gatunków w błonce.

an-approach-to-constructing-multispecies-biofilm-communities-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Miquel Guennoc, C. i inni. Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów włóknistych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje przygotowanie hodowli grzybów na poddanych leczeniu błon celofanowych, aby wspierać tworzenie kolonii i wzrost promieniowy. Następnie pokazuje uprawę i przygotowanie komórek bakteryjnych glebowych do testów interakcji. Na koniec ilustruje, jak komórki bakteryjne...

Ustanowienie współkultury grzybowo-bakteryjnej do tworzenia biofilmu

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Ten artykuł opisuje szczegółowe protokoły do produkcji urządzeń ekosystemowych (EcoFAB), które umożliwiają badania roślin i interakcji roślina-mikroorganizm w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Wydobywanie korzeni roślin z pola, jak również przetwarzanie próbek do endosfery, ryzosfery i gleby są szczegółowo opisane, łącznie z metodami ekstrakcji DNA i analizy danych. Niniejszy artykuł ma na celu umożliwienie innym laboratoriom wykorzystania tych technik do badania mikrobiomów glebowych, endosfery i ryzosfer.

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Poznaj metodę budowania wielogatunkowych biofilmów z bakterii ryzosfery gleby. Technika ta umożliwia tworzenie syntetycznych wspólnot bakteryjnych jako nowej generacji biofertyliatorów wspierających wzrost roślin.

Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

Przeglądaj więcej filmów