Name: Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Naucz się techniki bocznego wstrzyknięcia żyły ogonowej u myszy do podawania wirusa AAV w badaniach terapii genowej. Ta metoda zapewnia skuteczną i powtarzalną ekspresję transgenu w tkankach docelowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować personelowi placówki opieki nad zwierzętami NINDS za wsparcie. Praca ta była wspierana przez Wydział Badań Wewnętrznych NIH, NINDS (Raport roczny nr 1ZIANS003129). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

AAV-Based Therapies via Intravenous Injection in Preclinical Mouse Models

<ol><li>Tisdale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ideas+initiative%3A+Pilot+study+to+assess+the+impact+of+rare+diseases+on+patients+and+healthcare+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">The ideas initiative: Pilot study to assess the impact of rare diseases on patients and healthcare systems.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 429(2021).</li>
<li>Condo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+monogenic+diseases%3A+Molecular+pathophysiology+and+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rare monogenic diseases: Molecular pathophysiology and novel therapies.</a> Int J Mol Sci. 23 (12), 6525(2022).</li>
<li>Vaisitti, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+rare+and+monogenic+diseases+in+pediatric+organ+transplant+recipients+in+italy%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">The frequency of rare and monogenic diseases in pediatric organ transplant recipients in italy.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 374(2021).</li>
<li>Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+platforms+within+the+gene+therapy+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vector platforms within the gene therapy landscape.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+gene+therapy%3A+Where+do+we+stand+in+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in gene therapy: Where do we stand in 2023.</a> Viruses. 15 (3), 698(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+non-viral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Emerging non-viral vectors for gene delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 272(2023).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl 3rd, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28aav%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (aav) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li>
<li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+systems+for+gene+therapy%3A+A+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biosaf%22%5BJournal%5D)">Viral vector systems for gene therapy: A comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Appl Biosaf. 25 (1), 7-18 (2020).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+and+strategies+for+the+development+of+safe+and+effective+optimized+aav+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized aav vectors for human gene therapy.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).</li>
<li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+animal+models+in+biomedical+research%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">Role of animal models in biomedical research: A review.</a> Lab Anim Res. 38 (1), 18(2022).</li>
<li>Jucker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefits+and+limitations+of+animal+models+for+translational+research+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The benefits and limitations of animal models for translational research in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 16 (11), 1210-1214 (2010).</li>
<li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Bioallied+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of rodents as models of human diseases.</a> J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Anders, H. J., Vielhauer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+validating+novel+targets+with+in+vivo+disease+models%3A+Guidelines+for+study+design%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Identifying and validating novel targets with in vivo disease models: Guidelines for study design.</a> Drug Discov Today. 12 (11-12), 446-451 (2007).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+Routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li>Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aav9+transduction+mediated+by+systemic+delivery+of+vector+via+retro-orbital+injection+in+newborn%2C+neonatal+and+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice.</a> Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).</li>
<li>Hauff, P., Nebendahl, K. Drug administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHauff%2C+P+%22Small+Animal+Imaging%3A+Basics+and+Practical%22">Small Animal Imaging: Basics and Practical</a>. Kiessling, F., Pichler, B. J., Hauff, P. , Springer International Publishing. Cham. 127-152 (2017).</li>
<li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+best+practice+for+validating+tail+vein+injections+in+rat+with+near-infrared-labeled+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents.</a> J Vis Exp. (146), (2019).</li>
<li>Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+tail-vein+injection+in+mice+using+a+modified+anaesthesia+induction+chamber+versus+a+common+restrainer+without+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia.</a> Lab Anim. 53 (2), 190-201 (2019).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28icv%29+and+intravenous+%28iv%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (icv) and intravenous (iv) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), e2968(2011).</li>
<li>Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+tips+for+intravenous+administration+of+adeno-associated+virus+to+rats+and+evaluation+of+central+nervous+system+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction.</a> J Vis Exp. (126), e55994(2017).</li>
<li>Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contemporary+warming%2Frestraining+device+for+efficient+tail+vein+injections+in+a+murine+fungal+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model.</a> J Vis Exp. (165), e61961(2020).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+tail+vein+metastasis+assays+and+real-time+in+vivo+imaging+to+quantify+breast+cancer+metastatic+colonization+and+burden+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs.</a> J Vis Exp. (154), e60687(2019).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Compound+administration+I%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Compound administration I.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Lateral tail vein injection in mice and rats (preferred technique for vascular access in mice. UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf">https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf</a> (2023).</li>
<li>Jones, K. Tail vein injections in the mouse and rat sop. UBC Animal Care Guidelines SOP: ACC-2012-Tech03. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACS-2012-Tech03.pdf">https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACS-2012-Tech03.pdf</a> (2012).</li>
<li>Liadaki, K., Luth, E. S., Kunkell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-detection+of+gfp+and+dystrophin+in+skeletal+muscle+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Co-detection of gfp and dystrophin in skeletal muscle tissue sections.</a> Biotechniques. 42 (6), 699-700 (2007).</li>
<li>Burr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allometric-like+scaling+of+aav+gene+therapy+for+systemic+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Allometric-like scaling of aav gene therapy for systemic protein delivery.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 368-379 (2022).</li>
<li>Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+screening+methods+underreport+aav-mediated+transduction+and+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Standard screening methods underreport aav-mediated transduction and gene editing.</a> Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).</li>
<li>Rodriguez-Estevez, L., Asokan, P., Borras, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+optimization+of+aav+vectors+for+human+gene+therapy+of+glaucoma+and+their+reversed+cell+entry+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transduction optimization of aav vectors for human gene therapy of glaucoma and their reversed cell entry characteristics.</a> Gene Ther. 27 (3-4), 127-142 (2020).</li>
<li>Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+formation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor formation assays.</a> Methods Enzymol. 479, 397-411 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie posiadają żadnych ujawnień, które są istotne dla pracy opublikowanej w tym artykule.

Terapie oparte na AAV mają ogromny potencjał w przypadku zaburzeń monogenowych ze względu na wszechstronność AAV jako wektora terapii genowej, co umożliwia dostosowanie AAV do różnych potrzeb związanych z dostarczaniem różnych zaburzeń 4,5,7,9. AAV są powszechnie podawane w postaci wstrzyknięcia dożylnego w przedklinicznych modelach mysich w celu przetestowania bezpieczeństwa i skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych16. Ponieważ różne wstrzykiwane dawki AAV mogą powodować znaczne różnice w wynikach eksperymentalnych, niezwykle ważne jest, aby eksperymentatorzy byli w stanie konsekwentnie wstrzykiwać zamierzoną dawkę AAV, aby zapewnić ważność i solidność wygenerowanych danych in vivo 28. Zastrzyki dożylne są szeroko stosowane, ale są technicznie trudne, wymagają intensywnego szkolenia i ciągłej praktyki, aby rozwinąć i utrzymać poziom umiejętności, który zapewnia niezmiennie udane zastrzyki 16,17,18,19. Oprócz prawidłowego wstrzykiwania AAV, zwykle pożądane jest stosowanie testów w celu oceny biodystrybucji wstrzykniętego AAV i skuteczności dostarczania do tkanek lub komórek docelowych29,30.
Protokół ten ma na celu pomóc eksperymentatorom w łatwym wykonywaniu skutecznych i spójnych wstrzyknięć dożylnych poprzez dokładne opisanie szczegółów zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwania dożylnego w celu podania AAV u 7-9 tygodniowych myszy bez sedacji. Należy zauważyć, że myszy, które są znacznie mniejsze lub większe niż myszy typu dzikiego w zastosowanym tutaj przedziale wiekowym, mogą stanowić większe wyzwanie ze względu na zmniejszoną widoczność żył lub niekompatybilność z ogranicznikami stosowanymi w tej metodzie. Wcześniej donoszono, że zastrzyki dożylne z ogona nie są odpowiednie do dożylnego podawania odczynników myszom w wieku poniżej 6 tygodni ze względu na mały rozmiar naczynia31. Chociaż jest to możliwe, konsekwentne wstrzykiwanie myszom ważącym mniej niż 22,0 g może być trudne. Badacze wykorzystujący myszy o nietypowych rozmiarach mogą być zmuszeni do dostosowania procedury. Protokół ten przedstawia również kilka testów, które można wykorzystać do oceny biodystrybucji AAV i skuteczności transdukcji.
Podczas przestrzegania tego protokołu należy pamiętać o kilku krytycznych punktach. Podczas wstrzykiwania igły 29 G zapewniają większy opór, jeśli igła nie znajduje się wewnątrz żyły. Zmniejsza to objętość traconą w wyniku przypadkowego okołonaczyniowego wstrzyknięcia roztworu podczas nieudanych prób wstrzyknięcia. Strzykawki insulinowe mają mniejsze objętości martwe niż zwykłe strzykawki. W przypadku użycia innej strzykawki i (lub) igły niż wymienione tutaj, może być konieczne przygotowanie dodatkowej objętości wstrzykniętej w krokach protokołu 1.1.3.3 w celu uwzględnienia większej objętości przestrzeni martwej (np. dodać 30 μl do zamierzonej dawki zamiast 15 μl).
Jeśli podczas zasysania dawki AAV do strzykawki na bokach strzykawki tworzą się drobne pęcherzyki powietrza spowodowane aspiracją, należy powoli pociągnąć wstrzyknięcie w górę strzykawki. Spowoduje to usunięcie większości małych pęcherzyków powietrza. Załadować co najmniej dodatkowe 10-15 μl AAV do zamierzonej objętości do wstrzyknięcia. Ta dodatkowa objętość ma na celu uwzględnienie wszelkiej objętości, która może zostać utracona podczas usuwania pęcherzyków powietrza lub potencjalnych nieudanych prób wstrzyknięcia. (np. jeśli objętość docelowa do wstrzyknięcia wynosi 150 μl, należy załadować 165 μl do strzykawki (w połowie odległości między oznaczeniami 160 μl i 170 μl na skali strzykawki). Jeśli igła jest prawidłowo umieszczona w żyle, a objętość w strzykawce wynosi 165 μl bezpośrednio przed udaną próbą wstrzyknięcia, należy dostarczyć odczynnik do momentu, gdy w strzykawce pozostanie 15 μl (w połowie drogi między znacznikami 10 μl i 20 μl), dostarczając w ten sposób 150 μl (165 μl - 150 μl = 15 μl)). Wyrównanie prześwitu skosu (skos skierowany do góry) ze skalą strzykawki umożliwia śledzenie dostarczanej objętości podczas iniekcji.
Niektórzy eksperymentatorzy mogą preferować umieszczenie myszy na boku, tak aby jedna z jej żył była prosta i łatwo dostępna, w porównaniu z myszą na nogach. Jednak ogon myszy na boku będzie nachylony pod różnymi kątami w zależności od wielkości myszy, co wymaga regulacji kąta wstrzyknięcia podczas wstrzykiwania myszom o różnych rozmiarach. Może to negatywnie wpłynąć na spójność powodzenia zabiegu. Podczas początkowych prób ćwiczeniowych eksperymentatorzy mogą wypróbować obie orientacje krępujące myszy, aby określić preferowane podejście. Trzymanie myszy na nogach umożliwia szybki i łatwy dostęp do obu bocznych żył ogonowych. Skraca to czas krępowania, gdy potrzebny jest dostęp do obu żył w przypadku wielu nieudanych prób wstrzyknięcia.
W przypadku wstrzykiwania żyły bocznej blisko podstawy ogona (bliżej ciała myszy) (szczególnie w przypadku myszy o masie ciała >30 g.), należy dostosować kąt wstrzyknięcia z równoległego do żyły na 5°-10° do żyły, ponieważ żyła u podstawy ogona jest nieco głębsza niż dystalnie.
Wymienione tutaj protokoły kontroli trawienia RNazy i zanieczyszczenia RNA zostały zweryfikowane na próbkach DNA wyizolowanych ze świeżo mrożonych tkanek wątroby zawierających łącznie 175-700 ng kwasów nukleinowych w 20 μL. Protokół trawienia RNazy został również przetestowany na próbkach DNA wyizolowanych ze świeżo zamrożonych tkanek wątroby i komórek posortowanych za pomocą FACS, aby potwierdzić obecność genomu wektora i genomu myszy po trawieniu RNazy. Wyniki zwizualizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym amplifikacji PCR docelowych amplikonów metodą PCR.
Postępowanie zgodnie z opisaną metodologią może skrócić czas szkolenia i praktyki potrzebny do opanowania iniekcji dożylnych i skutkować wyższym wskaźnikiem udanych wstrzyknięć, co pozwoliłoby zaoszczędzić odczynniki. Protokół ten wykorzystuje proste i powszechnie używane narzędzia bez potrzeby korzystania z zaawansowanego sprzętu lub konfiguracji, które mogą nie być łatwo dostępne. Ponadto, wymienione tutaj etapy iniekcji dożylnej mogą być stosowane do szerokiej gamy zastrzyków, które muszą być podawane dożylnie, takich jak oligonukleotydy antysensowne (ASO), z odpowiednimi modyfikacjami wprowadzonymi do etapów przygotowania iniekcji w zależności od wstrzyknięcia.

Choroby monogenowe stanowią 80% chorób rzadkich, które łącznie dotykają 300 milionów osób na całym świecie1,2. Obecnie nie ma zatwierdzonych terapii leczniczych dla większości tych bardzo wyniszczających rzadkich zaburzeń1,2,3. Jednak zaburzenia monogenowe są idealnymi kandydatami do terapii genowych, które mogą zastąpić, uzupełnić, poprawić lub wyciszyć dysfunkcyjne geny4,5. Obecnie opracowywanych jest wiele wektorów, które są wykorzystywane do dostarczania terapii genowych do określonych typów komórek4,6. Jednym z tych wektorów jest wirus związany z adenowirusem (AAV). AAV jest niepatogennym parwowirusem, który jest coraz częściej stosowany jako wektor terapii genowej7. W porównaniu z innymi wektorami wirusowymi, AAV ma niższą immunogenność, mniejszy potencjał integracji z genomem gospodarza oraz zdolność do efektywnej transdukcji komórek dzielących się i niedzielących w różnych tkankach7,8. Ponadto opracowano wiele podejść do inżynierii i identyfikacji AAV o pożądanych cechach, takich jak specyficzny tropizm tkankowy lub jeszcze bardziej zmniejszona immunogenność, co znacznie zwiększa wszechstronność AAV jako wektora wirusowego dla różnych wskazań9. Czynniki te sprawiły, że AAV stał się szeroko badanym wektorem terapii genowej i doprowadziły do opracowania wielu zatwierdzonych przez FDA terapii genowych opartych na AAV10.
Modele mysie są powszechnie używane do testowania potencjalnych terapii genowych in vivo i lepszego zrozumienia patomechanizmów zaburzeń monogenowych. Wynika to z rekapitulacji patologii różnych schorzeń w modelach mysich, podobieństwa ich genomu do genomu ludzkiego oraz względnej łatwości obsługi, utrzymania i generowania na myszach11,12,13. Badania in vivo są szczególnie ważne podczas badania zaburzeń, które wpływają na wiele układów lub regionów ciała, takich jak dystrofie mięśniowe. W przypadku tych zaburzeń badania in vitro mogą nie być wystarczające do kompleksowej oceny bezpieczeństwa, skuteczności, farmakokinetyki i farmakodynamiki środków terapeutycznych przeznaczonych do dotarcia do różnych obszarów ciała po podaniu ogólnoustrojowym14.
Różne drogi podawania ogólnoustrojowego mogą być używane do dostarczania leków. Każda trasa ma swoje zalety, wady i stopień zgodności z badanym modelem zwierzęcym i lekiem15. Dożylne (IV) wstrzyknięcie bocznej żyły ogonowej jest powszechnie stosowaną drogą ogólnoustrojowego dostarczania AAV u myszy16. Boczne zastrzyki do żyły ogonowej umożliwiają szybkie i bezpośrednie podanie iniekcji do krwiobiegu myszy, zapewniając wysoką biodostępność leku w krążeniu ogólnoustrojowym17. Wymagają one również do wykonania stosunkowo prostych i powszechnie dostępnych narzędzi. Jednakże, głównie ze względu na małą średnicę żyły ogonowej i trudności w zlokalizowaniu żyły, wstrzyknięcia boczne do żyły ogonowej są technicznie trudne i wymagają wysokiego stopnia umiejętności oraz stałej praktyki, aby uniknąć nieudanych prób wstrzyknięcia lub niepełnego podania dawki16,17,18,19. Może to spowodować utratę drogich odczynników lub niedokładne wyniki, zwłaszcza jeśli niepełne wstrzyknięcie nie zostanie rozpoznane podczas wykonywania iniekcji. Nasze podsumowane tutaj doświadczenie opiera się na protokołach opisanych w dobrze udokumentowanych artykułach, które dostosowaliśmy do naszego użytku, optymalizując różne etapy procedury iniekcji bocznej żyły ogonowej, aby zapewnić niezmiennie udane wstrzyknięcia20,21,22,23,24,25,26,27.
Tutaj opisujemy ten szczegółowy, zoptymalizowany protokół wstrzykiwania żyły bocznej w żyłę ogonową, aby dostarczyć AAV nieuspokojonym myszom w wieku 7-9 tygodni za pomocą prostych i powszechnie dostępnych narzędzi. Dodatkowo udostępniamy protokoły dla metod stosowanych do oceny dostarczania i biodystrybucji AAV. Protokoły te obejmują pobieranie tkanek po wstrzyknięciu, utrwalanie tkanek, ekstrakcję DNA i kwantyfikację ilościową genomu wektorowego cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) na genom diploidalny (vg/dg). Protokół wstrzyknięcia dożylnego i podane tutaj wskazówki mają na celu zwiększenie łatwości skutecznego wykonywania iniekcji do żył bocznych ogonowych. Potencjalnie przyczyni się to do skrócenia czasu potrzebnego do opanowania umiejętności wstrzykiwania, jednocześnie poprawiając dokładność i spójność wstrzyknięć.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>0,3 ml strzykawki insulinowe z igłą 29G</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka 1,7 ml&nbsp; probówka</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Firma Warner Graham 201096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x buforowana fosforanem sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Służy do przygotowania 1x PBS do utrwalania tkanek</td></tr><tr><td>15 ml stożkowa rurka</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowy uchwyt na probówkę</td><td>Wiele źródeł</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>190-procentowy alkohol etylowy</td><td>Warner Graham Company</td><td>6810-01-113-7320</td><td>Służy do przygotowania 70% etanolu</td></tr><tr><td>1x sterylny PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>2 ml probówki do przechowywania tkanek z mikrowirówką</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Wirus związany z adenowirusem (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>Jednoniciowy DNA (ssDNA) AAV został zapakowany w celu dostarczenia rekombinazy Cre jako transgenu napędzanego przez promotor CMV</td></tr><tr><td>Wacik nasączony alkoholem</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do lizy perełkowej</td><td>Next Advance</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny BsuRI (HaeIII)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik pocisków</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Myszy pochodzące z Ai14 ze szczepu 007914 JAX (tło genetyczne: C57BL/6J)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Myszy zawierające allel Ai14 Cre-reporter zakupiono od JAX (numer katalogowy: 007914)</td></tr><tr><td>Jednorazowe wkłady chłonne</td><td>Fisherbrand</td><td>1420662</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do degradacji DNA (DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>RNaza do ekstrakcji DNA A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Do trawienia RNA podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>RNaza wolna od DNaz do oczyszczania DNA</td><td>&nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>Do trawienia RNA po kwasie nukleinowym ekstrakcja</td></tr><tr><td>sondy dPCR Zestaw do PCR</td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie dPCR&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>Nie dotyczy&nbsp;</td><td>Pakiet oprogramowania QIAcuity&nbsp;</td></tr><tr><td>Podwyższona platforma</td><td>Wiele źródeł</td><td>Nie dotyczy</td><td>Puste pudełko na końcówki do pipet zostało użyte do podniesienia ogranicznika myszy podczas rozgrzewania ogona</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Wiele źródeł</td><td>Nie dotyczy</td><td>Model użyty tutaj: Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopu fluorescencyjnego&nbsp;</td><td>Wiele źródeł&nbsp;</td><td>Nie dotyczy&nbsp;</td><td>Użyte tutaj oprogramowanie: NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Gaza</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>Metalowy pojemnik</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>Metylobutan</td><td>J.T. Baker</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>Jakość wody molekularnej</td><td>Biologiczna</td><td>351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik rurki myszy</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka Myfuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler do reakcji łańcuchowej polimerazy</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1851148</td><td>Model: Chusteczki precyzyjne C1000 Touch</td></tr><tr><td></td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-dołkowy</td><td>system Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One dPCR</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood & Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Używany do ekstrakcji DNA z tkanek</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Używany do oczyszczania genomowego DNA i izolacji DNA z małych objętości krwi prtocotol był używany do ekstrakcji DNA z komórek posortowanych przez FACS</td></tr><tr><td>Stożek powstrzymujący gryzonie</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko styropianowe</td><td>Wiele źródeł</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia i dezynfekcji powierzchni</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Wiele źródeł</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze transferowe</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Daigger & Firma</td><td>22220A</td><td>Model: Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

Wiele zaburzeń wpływa na wiele organów lub obejmuje różne regiony ciała, dlatego ważne jest, aby dostarczać terapie systemowo, aby celować w dotknięte komórki zlokalizowane w różnych miejscach. Wstrzyknięcie dożylne jest szeroko stosowaną drogą podawania ogólnoustrojowego w badaniach przedklinicznych, w których ocenia się leczenie przeznaczone do podawania w całym organizmie. U dorosłych myszy polega na dożylnym podaniu środka terapeutycznego do bocznych żył ogonowych myszy. Po opanowaniu iniekcje do żyły ogonowej są bezpieczne i szybkie, wymagają jedynie prostych i powszechnie dostępnych narzędzi. Jednak wstrzyknięcia do żyły ogonowej są technicznie trudne i wymagają intensywnego szkolenia oraz ciągłej praktyki, aby zapewnić dokładne podanie zamierzonej dawki.
Tutaj opisujemy szczegółowy, zoptymalizowany, boczny protokół iniekcji żyły ogonowej, który opracowaliśmy na podstawie naszego doświadczenia i zaleceń, które zostały wcześniej zgłoszone przez inne grupy. Poza ogranicznikami dla myszy i strzykawkami insulinowymi, protokół ten wymaga tylko odczynników i sprzętu, które są łatwo dostępne w większości laboratoriów. Odkryliśmy, że przestrzeganie tego protokołu skutkuje konsekwentnie udanym dożylnym dostarczaniem wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do żył ogonowych nieuspokojonych myszy w wieku 7-9 tygodni. Dodatkowo opisujemy zoptymalizowane protokoły histologicznego wykrywania fluorescencyjnych białek reporterowych i kwantyfikacji genomu wektorowego na genom diploidalny (vg / dg) stosowane do oceny transdukcji i biodystrybucji AAV. Celem tego protokołu jest pomoc eksperymentatorom w łatwym i konsekwentnym wykonywaniu skutecznych i konsekwentnych iniekcji do żył ogonowych, co może skrócić czas ćwiczeń potrzebny do opanowania techniki.

Samce myszy w wieku od siedmiu do dziewięciu tygodni otrzymały AAV poprzez wstrzyknięcie do bocznej żyły ogonowej w dawce 1,5 × 1012 vg/mysz w objętości wstrzykiwanego roztworu od 150 do 200 µL. Zastosowany tutaj ssDNA AAV dostarczał transgen rekombinazy Cre pod kontrolą promotora CMV. Wstrzyknięte myszy były homozygotami pod względem allelu reporterowego Cre Ai14. W obecności rekombinazy Cre komórki zawierające allel Ai14 wykazują ekspresję fluorescencyjnego białka tdTomato. Ponieważ ekspresja tdTomato jest wynikiem indukowanej przez Cre rekombinacji genomicznej, komórki wykazujące ekspresję tdTomato wskazują na komórki, które zostały bezpośrednio transdukowane przez AAV lub są komórkami potomnymi komórek transdukowanych. Przedstawione tutaj dane pochodzą od myszy wstrzykniętych AAV9-CMV-Cre w dawce 1,5 × 1012 vg/mysz w objętości 160 µL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). Myszy uśmiercono 28 dni po wstrzyknięciu, a tkanki pobrano zgodnie z powyższym opisem. Kilka mięśni szkieletowych oraz płatów wątroby poddano trawieniu, a ich komórki wyizolowano za pomocą FACS. Kilka płatów wątroby zamrożono natychmiast przy użyciu schłodzonego metylobutanu w celu ekstrakcji kwasów nukle innych. Kilka mięśni szkieletowych i płatów wątroby utrwalono i zamrożono do obrazowania histologicznego fluorescencyjnego białka tdTomato. tdTomato wykazuje rozproszoną ekspresję w całej wątrobie (Rycina 2A) oraz w mięśniu czworogłowym (Rycina 2C), co wskazuje, że AAV9 w szerokim zakresie dotarł do różnych obszarów obu tkanek i dokonał ich transdukcji.
DNA wyekstrahowany z zamrożonej w świeżym stanie wątroby oraz komórek sortowanych metodą FACS wykorzystano do ilościowego oznaczenia vg/dg za pomocą dPCR. Ilościowe oznaczenie vg/dg może służyć do oceny powtarzalności wstrzykiwań oraz wydajności transdukcji AAV w analizowanej próbce. Jednowymiarowe wykresy rozrzutu kropel (scatterplots) z próbki tkanki wątroby zamrożonej w świeżym stanie oraz komórek sortowanych metodą FACS wykorzystano do zapewnienia poprawności analizy (Rysunek 3A,C). Wykres rozrzutu wykazał obecność partycji pozytywnych i negatywnych, wyraźne oddzielenie partycji pozytywnych od negatywnych, co pozwala na dokładne określenie progu detekcji, oraz obecność zerowej lub niewielkiej liczby kropel pomiędzy partycjami pozytywnymi a negatywnymi, co może obniżyć dokładność analizy dPCR. Spełnienie wszystkich tych kryteriów wskazało, że wyniki analizy dPCR były prawidłowe. Liczba Polr2a ilość kopii genu w każdej próbce została określona w celu wyznaczenia liczby diploidalnych genomów myszy (2 Polr2a kopii genu/diploidowy genom myszy), a primery/sonda przeciwko sekwencji transgenu rekombinazy Cre zostały użyte do ilościowego oznaczenia genomu wirusowego (1 kopia transgenu/genom wirusowy, Tabela 1). Wartość vg/dg została określona dla świeżomrożonej próbki tkanki wątroby oraz komórek sortowanych metodą FACS; w każdej z tych próbek stwierdzono obecność odpowiednio 187,7 vg/dg i 4,7 vg/dg (Rycina 3B,D). W charakterze kontroli negatywnych zastosowano próbki od myszy wstrzykniętych PBS oraz kontrole bez matrycy, niezawierające kwasów nukleinowych.
<img alt="Układ do edycji genów; stanowisko PCR; mikropipeta, elektroforeza żelowa; eksperyment analizy DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd stanowiska do wstrzykiwań dożylnych. (A) Narzędzia niezbędne do wykonania wstrzyknięcia dożylnego (IV). Przedstawiono tutaj: (1) minutnik, (2) rurkę ograniczającą dla myszy, (3) nieocięty i (4) ocięty plastikowy stożek ograniczający, (5) gazik nasączony alkoholem, (6) puste pudełko na końcówki do pipet użyte jako platforma do podwyższenia rurki ograniczającej, (7) jednorazowe podkładki chłonne, (8) probówkę stożkową 15 mL z ciepłą wodą, (9) uchwyt do probówek 15 mL, (10) gazę oraz (11) strzykawkę insulinową. (B) Mysz jest najpierw umieszczana w rurce ograniczającej. Następnie, jeśli mysz jest zbyt mała, aby rurka mogła ją samodzielnie unieruchomić, wprowadza się ocięty stożek ograniczający, tworząc rękaw unieruchamiający wokół myszy. Należy upewnić się, że ograniczniki nie utrudniają oddychania myszy. Rurkę ograniczającą umieszcza się na podwyższonej platformie, aby umożliwić zanurzenie ogona myszy w ciepłej wodzie. (C) Pozycjonowanie ogona myszy i kąt trzymania igły bezpośrednio przed wykonaniem wstrzyknięcia. Należy odciągnąć ogon tak, aby był wyprostowany, a miejsce wstrzyknięcia znajdowało się całkowicie w poziomie. Igła jest równoległa do ogona i żyły, a ścięcie igły jest skierowane ku górze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ekspresja genu wirusowego AAV9-CMV-Cre w wątrobie i mięśniach czworogłowych; porównanie mikroskopii fluorescencyjnej z PBS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Detekcja fluorescencyjnego białka reporterowego po wtryśnięciu dożylnym. Samcom myszom samcom w wieku od siedmiu do dziewięciu tygodni, posiadającym allel reporterowy Cre Ai14, wstrzyknięto dożylnie (IV) albo AAV9-CMV-Cre w dawce 1,5 × 1012 vg/mysz w objętości 160 µL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg), albo PBS. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekrojów (A) wątroby lub (C) mięśni czworogłowych myszy po dożylnym podaniu AAV9 dostarczającego Cre. (B) Przekroje wątroby lub (D) mięśni czworogłowych myszy po wstrzyknięciu PBS zostały zobrazowane w celu uzyskania kontroli negatywnej. Tkanki pobrano i zamrożono po utrwaleniu 28 dni po wtryśnięciu dożylnym. Po ekspozycji na Cre fluorescencyjne białko tdTomato jest wyrażane w komórkach transdukowanych oraz komórkach potomnych komórek transdukowanych. Przekroje o grubości 10 µm zobrazowano przy powiększeniu 10x. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej analizy wiązania DNA; wykresy kropkowe i grafiki analizowanych próbek partycji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ilościowe oznaczenie genomów wektora na genom diploidalny (vg/dg). Jednowymiarowy wykres rozrzutu ilościowego genomów wektora dPCR w (A>) tkance wątroby lub (C>) komórkach sortowanych metodą FACS, pobranych od myszy wstrzykniętych AAV9-CMV-Cre lub PBS. Wykresy rozrzutu przedstawiają dodatnie i ujemne partycje dPCR, a także próg detekcji wskazany poziomą linią przechodzącą przez próbki. (B,D) Ilościowe oznaczenie vg/dg po analizie genomów diploidalnych myszy i genomów wektora w (B>) tkance wątroby lub (D>) próbkach komórek sortowanych metodą FACS. Przedstawione wyniki pochodzą od jednej myszy wstrzykniętej AAV9 oraz jednej myszy wstrzykniętej PBS, z technicznym duplikatem dPCR dla każdej myszy. Słupki błędów wskazują 95% przedział ufności dla każdej próbki. Skróty: NTC = kontrola bez matrycy; dPCR = cyfrowa PCR; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Starter</td>
			<td>Sekwencja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre starter prawy</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre starter odwrotny</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre sonda</td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polr2a starter prawy</td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polr2a starter rewersyjny</td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polr2a sonda</td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje starterów i sond użytych do ilościowego oznaczania vg/dg. Startery i sonda Cre zostały użyte do ilościowego oznaczenia genomu wektora. Startery i sonda Polr2a zostały użyte do ilościowego oznaczenia diploidalnego genomu myszy.

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

Pracujemy nad opracowaniem terapii genowych dla wrodzonych i wczesnych dystrofii mięśniowych oraz zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Aby to osiągnąć, stosujemy różne metody terapii genowej, aby zająć się podstawowymi genetycznymi przyczynami tych zaburzeń. Ciągły rozwój wirusowych i niewirusowych wektorów terapii genowej był bardzo ważny dla naszej dziedziny.Ponieważ nowe, ulepszone wektory wirusowej i niewirusowej terapii genowej pozwalają na opracowanie bezpieczniejszych i bardziej wydajnych terapii genowych, to z kolei zwiększa bezpieczeństwo i skraca czas przygotowania tych terapii dla pacjentów. W tym protokole zapewniamy dokładne i szczegółowe, zoptymalizowane kroki wykonywania iniekcji do bocznych żył ogonowych myszy. Celem tego protokołu jest pomoc eksperymentatorom w konsekwentnym wykonywaniu procedur iniekcji z powodzeniem.Aby rozpocząć, włóż ogonek myszy do górnego otworu rurki ograniczającej. Powoli wciągnij mysz do rurki i umieść wtyczkę przed myszą, aby zapobiec jej ucieczce. Aby zrobić rękaw ograniczający dla mniejszej myszy, przyciąć końcówkę stożka na końcu nosa, aby upewnić się, że nos myszy nie jest zasłonięty i ma wystarczająco dużo miejsca do oddychania.Następnie odetnij tył stożka na długość podobną do długości myszy. Umieść mysz w ograniczniku rurki, jak opisano wcześniej. Trzymając ogon myszy, pozwól myszy wejść w stożek.Wsuń stożek ograniczający do rurki. Upewnij się, że ogon myszy wystaje całkowicie z tyłu rurki, a mysz ma miejsce na oddychanie wewnątrz stożka. Zamocuj zatyczkę rurki bezpośrednio przed otworem nosowym stożka.Napełnij stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów ciepłą wodą. Umieść ogranicznik rurki z myszą w środku na podwyższonej platformie. Zanurz skrępowany ogon myszy w ciepłej wodzie na co najmniej jedną minutę, aż żyły boczne będą wyraźnie rozszerzone i widoczne.Umieść niezakorkowany wirus związany z adenowirusem lub AAV zawierający 1,7 mililitra probówki mikrowirówkowej w stojaku na probówki. Dominującą ręką włóż igłę pionowo do tuby. Gdy igła znajdzie się w tubce, przytrzymaj rurkę ręką niedominującą.Następnie podnieść jednocześnie rurkę i strzykawkę na poziom oczu, upewniając się, że igła nie dotyka ścianki rurki. Oprzyj obie ręce na stole i powoli wciągnij dawkę do strzykawki. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki przez jednorazową wkładkę chłonną.Przytrzymaj wstrzyknięte wstrzykiwanie przez 40 sekund, aby je rozgrzać. Po upewnieniu się, że żyły ogonowe są wyraźnie widoczne, zdejmij ogranicznik rurki z podwyższonej platformy i umieść go bezpośrednio na stole. Umieść mysz w uchwycie ze stopami skierowanymi w dół, aby ułatwić obsługę ogona.Szybko wytrzyj ogon gazą, aby go wysuszyć. Następnie przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem i ponownie osusz go suchą gazą. Obróć ogon o około 90 stopni w lewo lub w prawo, tak aby jedna z dwóch bocznych żył była skierowana do góry.Zlokalizować odpowiednie miejsce wstrzyknięcia w środkowej jednej trzeciej ogona. Trzymać ogon ręką niedominującą za pomocą kciuka i palca wskazującego bezpośrednio dystalnie do miejsca wstrzyknięcia. Zawinąć ogon na palcu wskazującym tak, aby miejsce wstrzyknięcia leżało płasko na palcu wskazującym.Następnie pociągnij ogon do tyłu, aby go rozciągnąć, a miejsce wstrzyknięcia będzie całkowicie poziome. Trzymać strzykawkę palcami wskazującym i środkowym ręki dominującej po obu stronach kołnierza cylindra strzykawki, trzymając kciuk w pozycji przyciśniętej do tłoka. Oprzyj obie ręce na stole i umieść igłę bezpośrednio na ogonie i żyle i równolegle do niego, skosem skierowanym do góry.Teraz należy docisnąć igłę w dół i wsunąć ją do przodu do żyły, aby wstrzyknąć roztwór AAV do żyły. Po podaniu dawki należy powoli wyjąć igłę i natychmiast uciskać gazą miejsce wstrzyknięcia przez co najmniej 10 sekund, aż do ustania krwawienia. Obrazowanie histologiczne fluorescencyjnego białka reporterowego po wstrzyknięciu wykazało, że tdTomato ulegało ekspresji rozproszonej w wątrobie i mięśniu czworogłowym, co wskazuje, że AAV9 szeroko docierał i transdukował różne regiony obu tkanek.

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Źródło:Pourshafie, N., et al. Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).W tym filmie mysz z rdzeniowym i opuszkowym zanikiem mięśni lub dotknięta SBMA przechodzi wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanych wektorów AAV (wektorów związanych z adeno) przenoszących plazmid kodujący terapeutyczne mikroRNA. Wektor wytwarza mikroRNA, które wiąże się ze zmutowanym...

Wstrzykiwanie rekombinowanych wektorów związanych z adenowirusem w mysim modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni

Źródło: Grames, M. S., et al. Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) u szczurów. Po wstrzyknięciu do żyły ogonowej bocznej wirus dostaje się do krwiobiegu, krąży w sercu i dociera do mózgu, gdzie dostaje się do neuronów i ułatwia produkcję białka docelowego do zastosowań...

 Dożylne podawanie rekombinowanych wektorów wirusa związanego z adenowirusem w modelu szczurzym 

Tutaj opisujemy dostarczanie mikroRNA za pomocą rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 9 w mysim modelu choroby nerwowo-mięśniowej. Pojedyncze podanie obwodowe myszom spowodowało trwałą nadekspresję miRNA w neuronach mięśniowych i ruchowych, co dało możliwość zbadania funkcji miRNA i potencjału terapeutycznego in vivo.

Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni

Celem obecnego badania było opracowanie i potwierdzenie siły działania oraz bezpieczeństwa dostarczania genów za pośrednictwem wirusa AAV9 (ang. spinal adeno-associated virus 9) za pośrednictwem metody u dorosłych myszy.

Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

W tym manuskrypcie, iniekcja podspojówkowa jest demonstrowana jako prawidłowa metoda dostarczania wektora do tkanek oka u myszy za pomocą systemu iniekcyjnego składającego się z pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania i gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. Ten system iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego.

Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Naucz się techniki bocznego wstrzyknięcia żyły ogonowej u myszy do podawania wirusa AAV w badaniach terapii genowej. Ta metoda zapewnia skuteczną i powtarzalną ekspresję transgenu w tkankach docelowych.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów