Name: Ekstrakcja RNA z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR u niesporczaka Hypsibius exemplaris (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj szybką ekstrakcję RNA z pojedynczych niesporczaków Hypsibius exemplaris do analizy ekspresji genów metodą qRT-PCR. Ta technika przyspiesza badania neurobiologii molekularnej i mechanizmów odporności na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować NIH Ruth Kirschstein Fellowship # 5F32AG081056-02 oraz Errett Fisher Post-Doctoral Fellowship, które wsparło dr Molly J. Kirk, Crowe Family Fellowship, które wsparło Chaoming Xu, oraz University of California, Santa Barbara Academic Senate Grant, oraz granty NIH #R01GM143771 i #2R01HD081266, które wsparły te wysiłki badawcze. Autorzy przyznają również o wykorzystaniu Laboratorium Nanostruktur Biologicznych w ramach Kalifornijskiego Instytutu NanoSystemów, wspieranego przez Uniwersytet Kalifornijski w Santa Barbara i Uniwersytet Kalifornijski, Biuro Prezydenta.

<img alt="Proces syntezy cDNA niesiorów: schemat cykli zamrażania i rozmrażania, analiza RT-PCR, zestaw do pipetowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Jednoprotokółowa procedura ekstrakcji RNA z pojedynczego niesiora w jednej probówce. (A) Schemat przedstawiający protokół ekstrakcji RNA z pojedynczego niesiora, obejmujący sześć cykli zamrażania i rozmrażania oraz następującą po nich syntezę cDNA. Próbki mogą być następnie wykorzystane do analiz RT-PCR i qRT-PCR. (B) Zdjęcie końcówki mikropipety użytej do usunięcia wody. Pasek skali: 2 mm. (C) Obraz w polu jasnym przedstawiający niesiora w niewielkiej objętości wody (linia przerywana). Usunięcie większości wody do poziomu wskazanego na zdjęciu jest niezbędne do prawidłowej ekstrakcji i zapobiega rozcieńczeniu buforu lizującego. Pasek skali: 50 μm. (D) Zdjęcie przedstawiające zanurzanie próbek w ciekłym azocie za pomocą długiej pęsety w celu bezpiecznego i szybkiego zamrażania i rozmrażania próbek. Część treści została przygotowana w programie BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
UWAGA: Rysunek 1A przedstawia schemat procedury. Szczegółowe procedury hodowli niesiorówek i glonów opisano w opublikowanych wcześniej raportach45,46,47.
1. Sterylizacja wody źródlanej
<ol>
	<li>Wlać 2 L wody źródlanej z 5-galonowego baniaka (szczegóły w Tabeli materiałów) do 2 L szklanej butelki odpornej na autoklawowanie.</li>
	<li>Nałożyć zakrętkę na butelkę odporną na autoklawowanie i zabezpieczyć niewielką ilością taśmy do autoklawowania. Nie dokręcać butelki; zakrętkę należy jedynie położyć na górze.</li>
	<li>Autoklawować wodę źródlaną przez 50 min w cyklu mokrym, bez etapu suszenia.</li>
	<li>Odstawić wodę do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT), a następnie mocno zakręcić butelkę przed przechowywaniem w RT.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie szklanych mikropipet (za pomocą wyciągacza do pipet)
<ol>
	<li>Zamocuj szklaną mikropipetę (średnica zewnętrzna: 1 mm, średnica wewnętrzna: 0.58 mm, długość: 10 cm) w wyciągaczu do mikropipet. Należy unikać kontaktu z włóknem grzejnym, ponieważ spowoduje to zmianę kształtu pipety i uszkodzenie włókna.
	<ol>
		<li>Parametry wyciągania pipety należy ustalić empirycznie dla każdego włókna i wyciągacza. Jako punkt wyjścia do optymalizacji należy jednak zastosować temperaturę 78 °C oraz pojedynczy krok wyciągania z ciężarem 182.2 g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól włóknu się rozgrzać i grawitacji rozdzielić szklaną mikropipetę na dwie szklane mikropipety z ostrymi końcówkami (Ryc. 1B).</li>
	<li>Przechowuj wyciągnięte szklane mikropipety w zamkniętej szalce Petri 100 mm z woskiem lub gliną, aby utrzymać je w miejscu i zapobiec złamaniu ostrych końcówek.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie szklanych mikropipet (bez użycia wyciągacza do pipet)
<ol>
	<li>Zapalić palnik Bunsena lub inne kontrolowane źródło ognia, ustawiając mały płomień.</li>
	<li>Chwycić szklaną mikropipetę, trzymając jej końce w obu dłoniach.</li>
	<li>Przymieścić środek szklanej mikropipety do płomienia, aż szkło zacznie topnieć. Następnie gwałtownie rozciągnąć oba końce. W ten sposób powstaną dwie bardzo delikatne, ostre końcówki.</li>
	<li>Ostrożnie ułamać wierzchołek końcówki za pomocą sterylnej pęsety precyzyjnej.</li>
	<li>Przechowywać tak przygotowane wyciągane szklane mikropipety w zamkniętej szalce Petriego o średnicy 100 mm, używając wosku lub gliny do ich unieruchomienia i zapobiegania pękaniu ostrych końcówek.</li>
</ol>
4. Izolacja RNA
<ol>
	<li>Przygotować 0,5 L ciekłego azotu w pojemniku odpornym na niskie temperatury. 
	OSTROŻNIE: Ciekły azot jest substancją kriogeniczną i może powodować oparzenia w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami. Podczas pracy należy używać odzieży ochronnej, gogli ochronnych, rękawic nitrylowych, rękawic kriogenicznych, fartucha laboratoryjnego i zamkniętego obuwia. Przed transportem należy upewnić się, że pojemnik jest przystosowany do przechowywania ciekłego azotu. Na tym etapie możliwe jest również zastosowanie łaźni z etanolem i suchym lodem.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę master mix do syntezy cDNA: roztwór o objętości 10 µL zawierający 1 µL startera z przypadkowych heksamerów, 2 µL DNazy, 4 µL buforu RT 5x, 1 µL mieszaniny enzymów, 1 µL H2O oraz 1 µL dNTPs 10 mM. Roztwór przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy niesiorów (5 mM Tris (pH = 8), 0,5% (v/v) Detergentu 1, 0,5% (v/v) Detergentu 2, 0,25 mM EDTA w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz). 
	UWAGA: Roztwór ten można przechowywać na blacie przez 6 miesięcy. Należy jednak zachować sterylność i unikać potencjalnych źródeł kontaminacji RNazami.</li>
	<li>Odmierzyć odpowiednią ilość buforu do lizy niezbędną do ekstrakcji (2 μL na niesiora).</li>
	<li>Do roztworu buforu do lizy niesiorów dodać inhibitor RNazy do uzyskania stężenia końcowego 4 U/μL.</li>
	<li>Wymieszać roztwór w wirówce typu vortex i odwirować w temperaturze pokojowej (RT) w wirówce stołowej z prędkością 2000 x g przez 5 s, a następnie przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety P1000 z końcówką z filtrem pobrać z hodowli taką liczbę niesiorów, jaka jest potrzebna do eksperymentu, i umieścić je w sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 mm. 
	UWAGA: W ten sposób można przetworzyć dowolną liczbę niesiorów. Zazwyczaj do ekstrakcji wykorzystuje się trzy niesiory na każdą warunek.</li>
	<li>Przemyć niesiory trzykrotnie, używając 1 mL autoklawowanej sterylnej wody źródlanej i sterylnej pipety P1000 z końcówką z filtrem. Powolne pipetowanie w górę i w dół pomaga usunąć zanieczyszczenia algami.</li>
	<li>Używając mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu od 25x do 50x, przenieść pojedynczego niesiora z przemytej hodowli do nowej sterylnej szalki Petriego o średnicy 35 mm za pomocą sterylnej pipety P10 z końcówką z filtrem.</li>
	<li>Używając sterylnej pipety P200 z końcówką z filtrem, przemyć pojedynczego niesiora w 100 μL sterylnej wody wolnej od nukleaz. 
	UWAGA: Ten etap przemywania służy do dalszego usuwania zanieczyszczeń, w tym rybonukleaz.</li>
	<li>Przenieść przemytego niesiora na dno czystej, sterylnej probówki PCR w 1-2 μL sterylnej wody wolnej od nukleaz, używając sterylnej pipety P10 z końcówką z filtrem, uważając, aby niesiór nie przykleił się do ścianki końcówki.</li>
	<li>Zwizualizować niesiora pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 25x.</li>
	<li>Aby ułatwić usuwanie wody, lekko odłamać końcówkę wyciąganej szklanej mikropipety poza probówką. Upewnić się, że otwór jest wystarczająco duży, aby pobrać wodę, ale nie niesiora.</li>
	<li>Wykorzystując zjawisko kapilarne szklanej mikropipety, usuwać wodę do momentu, aż zwierzę zostanie otoczone małą pęcherzykiem wody o średnicy około dwóch długości niesiora.</li>
	<li>Monitorować proces usuwania wody za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby upewnić się, że poziom wody jest odpowiedni i niesiór pozostaje nawodniony. 
	UWAGA: Rycina 1C przedstawia przykład ilości wody do usunięcia. Jest to krytyczny etap. Mały pęcherzyk wody wokół niesiora zapobiegnie jego wyschnięciu, ale należy usunąć jak najwięcej nadmiaru wody, aby uniknąć rozcieńczenia buforu do lizy. Przykład pozostałych poziomów wody znajduje się na Rycini 1C.</li>
	<li>Natychmiast po usunięciu wody dodać 2 μL buforu do lizy niesiorów na dno probówki, krótko wymieszać w wirówce typu vortex i odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 s przy 2000 x g w wirówce stołowej.</li>
	<li>Niezwłocznie umieścić próbki zawierające niesiory w statywie do probówek PCR i upewnić się, że są one mocno utrzymane przez statyw.</li>
	<li>Chwycić statyw za pomocą długich pęsety i ostrożnie zanurzyć statyw z próbkami w ciekłym azocie do całkowitego zamrożenia (Rycina 1D).</li>
	<li>Wyjąć statyw z ciekłego azotu i natychmiast umieścić go w lodzie. Pozostawić próbkę do rozmrożenia (trwa to ok. 45 s do 1 min). Monitorować próbkę co 15 s, wyjmując ją z lodu i dokonując inspekcji wizualnej. Gdy próbka stanie się wyraźnie przezroczysta, przejść do następnego kroku.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.18-4.19 jeszcze pięć razy. Do maksymalnej lizy i ekstrakcji wymaganych jest łącznie sześć cykli zamrażania i rozmrażania (Rycina 2A,B).</li>
	<li>Po zakończeniu cykli zamrażania i rozmrażania umieścić próbki w lodzie i niezwłocznie przejść do następnego etapu. Na tym etapie nie zamrażać próbek w celu przechowywania, ponieważ zmniejszy to ilość dostępnego RNA do przygotowania cDNA.</li>
</ol>
5. Synteza cDNA
<ol>
	<li>Do probówki PCR zawierającej lizat niesiorów należy dodać 2 μL master mixu do syntezy cDNA. Krótko potrząsnąć probówką i wirować w temperaturze pokojowej przy 2000 x g przez 5 s w wirówce stołowej, a następnie umieścić próbki w lodzie.</li>
	<li>Próbki należy umieścić w termocyklerze i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 min w celu przyłączenia starterów, w 55 °C przez 30 min w celu przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji, a na koniec inaktywować enzymy termicznie w 85 °C przez 5 min.</li>
	<li>Po inkubacji należy niezwłocznie umieścić probówkę w lodzie i rozcieńczyć próbkę do całkowitej objętości 25 μL, dodając 21 μL sterylnej wody wolnej od nukleaz. W przypadku transkryptów o niskiej liczbie kopii należy zmodyfikować ten etap rozcieńczania na podstawie wyników empirycznych.</li>
</ol>
6. qPCR
<ol>
	<li>Wyznaczyć temperaturę przyłączania zestawu starterów, wykorzystując całkowite RNA przygotowane z większej ilości niesiorówek, np. metodą ekstrakcji masowej przedstawioną w pracy Boothby, 201843.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR z gradientem temperatury w celu ustalenia optymalnej temperatury przyłączania przed wykonaniem qRT-PCR (wszystkie parametry PCR zastosowane w niniejszym protokole znajdują się w Tabeli 1 oraz Tabeli 2).</li>
	<li>Rozmrozić na lodzie jedną probówkę supermixu z barwnikiem wskaźnikowym i chronić przed światłem. Umieścić 96-dołkową płytkę qPCR na lodzie, a następnie do odpowiedniej liczby dołków nanieść 5 μL supermixu, 2 μL wody, 1 μL każdego startera (10 μM) oraz 1 μL produktu cDNA.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę PCR folią uszczelniającą i przeprowadzić qRT-PCR, stosując temperaturę przyłączania odpowiednią dla danego zestawu starterów (wszystkie parametry qRT-PCR zastosowane w niniejszej pracy znajdują się w Tabeli 3).</li>
</ol>
7. Ilościowe oznaczenie i interpretacja wyników
<ol>
	<li>Porównaj ilościowo wyniki z jednym lub więcej kontrolnymi genami housekeepingowymi, których ekspresja powinna pozostać stała w zastosowanych warunkach. W niniejszym badaniu wykorzystano gen aktyny.</li>
	<li>Wyznacz wartości Ct (próg cyklu) dla każdej studzienki i porównaj je z wartościami Ct dla reakcji z kontrolnym genem housekeepingowym. Oblicz krotność zmiany ekspresji genu, korzystając z poniższego równania: 
	<img alt="Równanie analizy qPCR: ΔCt = Ct(gen badanego) - Ct(gen housekeepingowy), porównanie formuł." src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	<img alt="Równanie metody ΔΔCt dla porównawczej analizy ekspresji genów, przedstawiające ΔCt(Próbka)−ΔCt(Kontrola)." src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> 
	<img alt="Równanie krotności ekspresji genu, 2^(-ΔΔCt), analiza regulacji genów; formuła." src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"> 
	UWAGA: Krotność ekspresji genu dla każdego transkryptu i niesiorza jest przedstawiona jako 2-(ΔΔCt)48.</li>
	<li>Aby uzyskać przybliżoną liczbę transkryptów na podstawie wartości Ct, zastosuj poniższe równanie: 
	<img alt="Równanie wykładniczego spadku N=10×2^(35-ct), wyrażenie matematyczne." src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4"> 
	Gdzie N oznacza liczbę transkryptów, a 2 jest przyjętą wydajnością PCR lub krotnością wzrostu fluorescencji w każdym cyklu PCR48.</li>
</ol>

Optimized RNA Extraction for qRT-PCR in Individual Tardigrades

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów do ujawnienia.

W pracy przedstawiono skuteczną metodę ekstrakcji RNA do pojedynczego niesporczaka qRT-PCR. Bezpośrednie porównanie metodologii STST z istniejącym zestawem do ekstrakcji RNA z pojedynczym niesporniakiem ujawniło, że ekstrakcja RNA STST daje >200-krotnie większe ilości transkryptów RNA aktyny, co zmniejsza koszt do mniej niż jednego dolara za próbkę i skraca czas potrzebny na ekstrakcję o 30%. Aby zastosować STST do odpowiedniego pytania biologicznego, oceniliśmy krótkoterminowy profil ekspresji reakcji na szok cieplny. O...

Niesporczaki to małe wielokomórkowe zwierzęta znane ze swojej zdolności do przetrwania w ekstremalnych warunkach, które są śmiertelne dla większości innych form życia1. Na przykład, zwierzęta te mogą przetrwać prawie 1000 razy większą dawkę promieniowania jonizującego, która jest śmiertelna dla ludzi2,3,4,5,6,7,8,9,10, prawie całkowite wysuszenie11,12,13,14,15, zamrażanie przy braku dodanych krioprotektantów16,17,18, a w stanie wysuszonym nawet próżnia przestrzeni19,20. Ze względu na ich wyjątkową zdolność do przetrwania w ekstremalnych warunkach, zwierzęta te stały się podstawowymi modelami do zrozumienia ekstremoligencji w złożonych, wielokomórkowych organizmach1,21,22,23.
Stabilna manipulacja genetyczna tych niezwykłych zwierząt, w tym transgeneza i modyfikacja genów linii zarodkowej, pozostawała do niedawna nieuchwytna24,25. W związku z tym większość eksperymentów mających na celu ujawnienie molekularnych mechanizmów ekstremtolerancji przeprowadza się poprzez profilowanie transkrypcji za pomocą sekwencjonowania RNA. Istnieje wiele cennych i pouczających zestawów danych sekwencjonowania RNA dla niesporczaków w różnych ekstremalnych warunkach, począwszy od promieniowania8,9,26,27,28, stres cieplny29, stres zamrażający12, oraz desiccation27,30,31,32,33. Niektóre z tych badań wykorzystywały metody ekstrakcji i oczyszczania masowego RNA, aby rzucić światło na nasze molekularne zrozumienie ekstremtolerancji. Jednak masowa ekstrakcja transkryptów RNA od wielu zwierząt uniemożliwia analizę zmienności ekspresji genów między osobnikami, tracąc w ten sposób potencjalne bogactwo bardziej wyrafinowanych zestawów danych. Co ważne, badania te często analizują niejednorodne populacje zwierząt, które obejmują zarówno zwierzęta, które przetrwały stresory środowiskowe, jak i te, które tego nie przeżyły. W związku z tym badania te są mylone przez uśrednianie danych dotyczących ekspresji z wielu i potencjalnie dramatycznie różnych stanów odpowiedzi. Aby rozwiązać ten problem, Arakawa i in., 201634 opracowali elegancki potok sekwencyjny RNA o niskim nakładzie wejściowym, który stosuje zestaw do ekstrakcji RNA, a następnie liniowy etap amplifikacji PCR przy użyciu single34,35,36 lub multiple30,37,38zwierząt jako danych wejściowych. Badania te miały fundamentalne znaczenie dla naszego zrozumienia ekstremolatolerancji niesporczaków22. Co ciekawe, protokół ten został również zastosowany do qRT-PCR przy użyciu siedmiu zwierząt jako materiału wyjściowego24.
W większości organizmów modelowych, po zidentyfikowaniu potencjalnych celów za pomocą sekwencji RNA, qRT-PCR jest następnie wykonywany w celu potwierdzenia zmian transkrypcyjnych zidentyfikowanych przez sekwencję RNA i oceny przebiegu czasowego ekspresji genów kandydujących w sposób wysokorozdzielczy. Aby przetestować funkcję zidentyfikowanych genów, po takich badaniach często przeprowadza się eliminację celów molekularnych za pośrednictwem RNAi39,40 oraz analizę zdolności ekstremalnego12,41. Skuteczność każdego knockdownu RNAi jest zwykle potwierdzana za pomocą qRT-PCR poprzez bezpośrednie monitorowanie spadku liczebności transkryptu. Jednak RNAi jest pracochłonnym procesem u niesporczaków, ponieważ każdy dsRNA musi być dostarczony poprzez ręczne mikrowstrzyknięcie osobników39,40. Ze względu na niską przepustowość tej strategii, szybka i tania metoda ekstrakcji RNA dostosowana do qRT-PCR od pojedynczych zwierząt byłaby bardzo cenna dla badań nad niesporczakami. Chociaż poprzednie metody zostały opracowane do ekstrakcji RNA z pojedynczych niesporczaków, protokoły te nie łączyły ich ekstrakcji z qRT-PCR, zamiast tego polegając na metodach opartych na gęstości optycznej12,40,41. Zmotywowani tymi wyzwaniami, staraliśmy się opracować protokół, który niezawodnie dostarcza RNA w ilości i jakości, który można wykorzystać do qRT-PCR z pojedynczego H. exemplaris.
Adaptacja z protokołu ekstrakcji RNA na jednym zwierzęciu opracowanego dla Caenorhabditis elegans42, STST jest zoptymalizowany dla H. exemplaris. Metoda ekstrakcji składa się z sześciu szybkich etapów zamrażania i rozmrażania, fizycznie rozrywających naskórek, umożliwiając ekstrakcję RNA, a następnie syntezę cDNA. Metoda STST skraca czas ekstrakcji ponad 24-krotnie w porównaniu z metodami ekstrakcji RNA luzem, opisanymi przez Boothby, 201843, oraz o 30% w porównaniu z zestawami do ekstrakcji RNA z pojedynczym niesporakiem, jak opisali Arakawa i in., 201634. Co więcej, liczba interakcji próbka-eksperymentator została zmniejszona z 5 do zaledwie 1 w porównaniu z preparatami z zestawu do ekstrakcji RNA, zmniejszając w ten sposób ryzyko zanieczyszczenia egzogennymi rybonukleazami. Podczas poszukiwania genów o wysokiej ekspresji, metoda STST wytwarza wystarczającą ilość cDNA dla 25 ilościowych reakcji RT-PCR na pojedynczy niesporczak, wymagając tylko 1 μL z całkowitej objętości cDNA wynoszącej 25 μl na reakcję. Jednak stężenia matryc muszą być empirycznie określone dla transkryptów o niższej liczebności.
Skuteczność metody STST do analizy dynamicznych zmian w ekspresji genów została oceniona poprzez badanie różnicowej ekspresji genów kodujących białko szoku cieplnego-90α (HSP90α) i białko szoku cieplnego 70β2 (HSP70β2) w odpowiedzi na krótkotrwały szok termiczny w temperaturze 35°C przez 20 minut. Zarówno HSP70β2, jak i HSP90α w większości organizmów eukariotycznych są szybko regulowane w górę po krótkotrwałej ekspozycji na szok cieplny (20 min)42. Analiza H. exemplaris wykazała, że zarówno RNA kodujące HSP70β2, jak i HSP90α wyekstrahowane z pojedynczych niesporczaków poddanych obróbce cieplnej wykazywały statystycznie istotny wzrost ekspresji po krótkotrwałej ekspozycji na ciepło. Odkrycia te pokazują, że protokół STST może być używany do analizy dynamicznych zmian w ekspresji genów u poszczególnych zwierząt w czasie.
Metoda ekstrakcji STST powinna uzupełniać istniejące metody eksperymentalne, takie jak sekwencjonowanie RNA, ułatwiając szybką i tanią ekstrakcję RNA oraz późniejsze porównywanie poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR. Metoda ta będzie również przydatna do oceny wydajności i penetracji RNAi u osób, którym wstrzyknięto ręcznie więcej niż sama gęstość optyczna. Wreszcie, ze względu na ich podobne struktury kutykularne i cechy fizyczne, jest prawdopodobne, że metoda ta będzie również skuteczna w analizie ekspresji genów u innych gatunków niesporczaków44.

<table><tbody><tr><td>10 &mikro; L Końcówki barierowe Premium Słabo wiążące, zębate, sterylne</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td><td>określane jako sterylna pipeta P 10 z końcówką filtra&nbsp; Porady</td></tr><tr><td>1000 & mikro; L&nbsp; Wysokiej jakości końcówki do pipet, o niskim wiązaniu, zębate, sterylne</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td><td>określane jako sterylna pipeta P 1000 z końcówką filtra&nbsp; Porady</td></tr><tr><td>200 & mikro; L&nbsp; Końcówki barierowe premium o niskim poziomie wiązania, zębate, sterylne</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-412</td><td>określane jako sterylna pipeta P 200 z końcówką filtra&nbsp; Porady</td></tr><tr><td>4-gwiazdkowa prosta, mocna pęseta średniopunktowa&nbsp;</td><td>Excelta&nbsp;</td><td>00-SA-DC</td><td>Określany jako długie kleszcze</td></tr><tr><td>96-dołkowy stojak do PCR z pokrywką Różne, 5 stojaków / jednostkę</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-202A</td><td>Określany jako stojak do PCR</td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; 3M BEZOŁOWIOWA TAŚMA AUTOKLAWU 1"</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC0802040</td><td>nazywana taśmą autoklawową&nbsp;</td></tr><tr><td>Taśma autoklawowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td>określana jako uszczelki płytowe do PCR</td></tr><tr><td>Benchling V8</td><td>Benchling</td><td>N/A</td><td>określana jako Benchling&nbsp;</td></tr><tr><td>BioRadHard-Shell 96-dołkowa płytka do PCR BioRad</td><td>&nbsp;</td><td>HSS9641</td><td>Określany jako płytka PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Fartuch laboratoryjny BULWARK FR:&nbsp;</td><td>Grainger&nbsp;</td><td>26CF64</td><td>określany jako termocykler Lab Coat</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td>określany mianem termocyklera&nbsp;</td></tr><tr><td>Termocykler C1000 Touch Bio-rad z modułem optyki CFX&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td><td>określany jako termocykler qPCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroccoccum hypnosporum.&nbsp; &nbsp;</td><td>Carolina</td><td>152091</td><td>określana jako Algae</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Butelki do przechowywania multimediów wielokrotnego użytku PYREX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td>Określane jako 2-litrowa szklana butelka bezpieczna w autoklawie</td></tr><tr><td>Daigger & O firmie Vortex-Genie 2 Mieszalnik laboratoryjny&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>3030A</td><td>określany jako Vortexer&nbsp;</td></tr><tr><td>Preparat Direct-zol Micro&nbsp;</td><td>Badania Zymo&nbsp;</td><td>R2060</td><td>Określany jako zestaw do ekstrakcji RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Pęseta biologiczna Dumont 5</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>11254-20</td><td>Określany jako kleszcze drobne</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500&nbsp;</td><td>Określany jako EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>FIDŻI v 2.14.0/1.54f&nbsp;</td><td>ImageJ,N</td><td>/A</td><td>Określany jako filament FIJI/ImageJ</td></tr><tr><td>do ściągacza pipet&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td><td>określany jako</td></tr><tr><td>Filament Fisherbrand Economy Impact Gogle</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-181-501</td><td>Określany jako Gogle Splash&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana mikropipeta Ø Zewnętrzna 1mm ID 0,58, Długość 10 cm</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&nbsp;</td><td>Określana jako szklana mikropipeta</td></tr><tr><td>Szczep Hypsibius exemplaris Z151&nbsp;</td><td>Carolina</td><td>133960</td><td>Określana jako niesporczaki&nbsp; lub H. exemplaris&nbsp;</td></tr><tr><td>Ciekły azot Dewar 1 L</td><td>Agar Scientific&nbsp;</td><td>AGB7475</td><td>Określany jako pojemnik kriobezpieczny&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA Maxima H Minus&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1651</td><td>określany jako cDNA Synthesis Master Mix&nbsp;</td></tr><tr><td>Dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych Narishige&nbsp;</td><td>Badania Tritech</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>Określany jako ściągacz do mikropipet&nbsp;</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-000-314</td><td>określane jako rękawice nitrylowe&nbsp;</td></tr><tr><td>SZALKA PETRIEGO, PS, 35/10 mm, Z OTWORAMI WENTYLACYJNYMI</td><td>Grenier</td><td>627102</td><td>Określany jako szalka Petriego 35 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>PIPETMAN P10, 1&ndash; 10 &mikro; L, metalowy wyrzutnik</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td>określany jako pipeta P 10</td></tr><tr><td>PIPETMAN P1000, 100&ndash; 1000 &mikro; L, metalowy wyrzutnik</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>określany jako P 1000 Pipeta</td></tr><tr><td>PIPETMAN P200, 20&ndash; 200 i mikro; L, Wyrzutnik metalowy</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F144058M</td><td>określany jako P 200 Pipette</td></tr><tr><td>Pound Ta 4-kolorowa plastelina&nbsp;</td><td>Amerykańska nadwyżka naukowa</td><td>&nbsp; 96517P001</td><td>Określany jako glina&nbsp;</td></tr><tr><td>Pryzmat v10.0&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>odnosi się do pryzmatu&nbsp;</td></tr><tr><td>Bez RNAse, 8-paskowe probówki do PCR 0,2 ml z nakrętkami&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM12230</td><td>określany jako sterylny</td></tr><tr><td>inhibitor rybonukleazy RNasin</td> w probówce do PCR <td>Promega&nbsp;</td><td>N2111</td><td>określany jako inhibitor RNAzy&nbsp;</td></tr><tr><td>Woda źródlana&nbsp;</td><td>Nestlé Pure Life</td><td>44221229</td><td>nazywany wodą źródlaną</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td><td>określany jako barwnik wskaźnikowy Super mix&nbsp;</td></tr><tr><td>System stereomikroskopowy z optyką i oświetleniem&nbsp;</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1</td><td>określany jako mikroskop preparacyjny</td></tr><tr><td>Supertek Scientific&nbsp; Palniki Tirrill</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S09572B</td><td>określane jako Bunsen Burner&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Qualitron</td><td>&nbsp; DW-41-115-NOWOŚĆ</td><td>Określany jako wirówka stołowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Osłona tymczasowa&nbsp; Rękawice kriogeniczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-305</td><td>określane jako rękawice krio&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Szalki Petriego</td><td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>Określane jako szalka Petriego 100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-500&nbsp;</td><td>Określany jako Tris lub Tris Base&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>93443</td><td>Określany jako detergent 1&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma aldrich</td><td>P1379-500&nbsp;</td><td>Określany jako detergent 2</td></tr><tr><td>Woda - Certyfikat PCR / RT-PCR, wolne od nukleaz</td><td>Growcells</td><td>PCPW-0500</td><td>określane jako sterylna woda wolna od nukleaz</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja rna z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qrt-pcr u niesporczaka hypsibius exemplaris

Single-Animal, Single-Tube RNA Extraction for Comparison of Relative Transcript Levels via qRT-PCR in the Tardigrade Hypsibius exemplaris

Niesporczak Hypsibius exemplaris to wyłaniający się organizm modelowy, znany ze swojej zdolności do przetrwania ekstremalnych warunków środowiskowych. Aby zbadać mechanizmy molekularne i genetyczne podstawy takiej ekstremotolerancji, wiele badań opiera się na sekwencjonowaniu RNA (RNA-seq), które można przeprowadzić na populacjach od dużych kohort po pojedyncze zwierzęta. Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) i interferencja RNA (RNAi) są następnie wykorzystywane do potwierdzenia wyników sekwencjonowania RNA i oceny wymagań genetycznych dla genów kandydujących. Takie badania wymagają wydajnej, dokładnej i niedrogiej metody ekstrakcji RNA i pomiaru względnych poziomów transkryptu za pomocą ilościowego RT-PCR (qRT-PCR). Praca ta przedstawia wydajną metodę ekstrakcji RNA z pojedynczym niesporzkiem i pojedynczą rurką (STST), która nie tylko niezawodnie izoluje RNA z poszczególnych niesporczaków, ale także skraca czas i koszty każdej ekstrakcji. Ta metoda ekstrakcji RNA pozwala uzyskać ilości cDNA, które można wykorzystać do amplifikacji i wykrywania wielu transkryptów metodą ilościowego PCR (qRT-PCR). Metoda została zwalidowana poprzez analizę dynamicznych zmian w ekspresji genów kodujących dwa białka regulowane szokiem cieplnym, Heat-Shock Protein 70 β2 (HSP70 β2) i Heat-Shock Protein 90α (HSP90α), co umożliwia ocenę ich względnych poziomów ekspresji u osób narażonych na działanie ciepła za pomocą qRT-PCR. STST skutecznie uzupełnia istniejące metody ekstrakcji masowego i pojedynczego niesporczakowego RNA, umożliwiając szybkie i niedrogie badanie indywidualnych poziomów transkrypcji niesporczaków za pomocą qRT-PCR.

Opracowanie i optymalizacja ekstrakcji RNA z pojedynczego niesporczaka 
Dostosowując protokół Ly i wsp., 201542 do ekstrakcji RNA u niesporczaków, zoptymalizowano system STST w celu maksymalizacji ilości i jakości preparatu (Ryc. 1A). Wykonano RT-PCR dla transkryptów aktyny, kwantyfikując wydajność transkrypcji poprzez amplifikację regionu o długości 527 bp obejmującego eksony 1 i 2 (sekwencje tych starterów znajdują się w Tabeli 1...

Ta praca przedstawia metodę szybkiej ekstrakcji RNA i porównywania poziomów transkryptów do analizy ekspresji genów u niesporczaka Hypsibius exemplaris. Ta wysokoprzepustowa metoda, wykorzystująca fizyczną lizę, wymaga pojedynczego niesporczaka jako materiału wyjściowego i powoduje solidną produkcję cDNA do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR).

Ekstrakcja RNA z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR u niesporczaka Hypsibius exemplaris

The tardigrade Hypsibius exemplaris is an emerging model organism renowned for its ability to survive environmental extremes. To explore the molecular ...

Koncentrujemy się na odkryciu molekularnych mechanizmów neuroodporności u niesporczaka Hypsibius exemplaris. Badamy zmiany w układzie nerwowym po ekspozycji na ekstremalne środowiska. Odkryliśmy zmiany na dużą skalę w strukturach neuroanatomicznych i funkcjach motorycznych u niesporczaków po doświadczeniu w ekstremalnych warunkach.Wykorzystanie niesporczaków jako organizmu modelowego do badań biologii molekularnej jest stosunkowo nowe. W związku z tym istnieje wiele technik, które nie są jeszcze w pełni zoptymalizowane pod kątem ich zastosowania u niesporczaków. Chociaż poczyniliśmy znaczne postępy w transkryptomice, proteomice i transgenezie, nadal istnieją metody i narzędzia wymagane do weryfikacji i oceny funkcjonalnej białek docelowych, które pozostają słabo rozwinięte.Obecne protokoły ekstrakcji RNA z pojedynczych niesporczaków nie zostały jeszcze zastosowane do qPCR ani nie wymagają ekstrakcji wielu zwierząt. Aby kontynuować nasze prace nad neurobiologią molekularną niesporczaków, potrzebowaliśmy sposobu na ekstrakcję i ilościowe określenie RNA pochodzącego od poszczególnych zwierząt, aby po pierwsze, potwierdzić wyniki sekwencjonowania RNA, po drugie, ocenić wydajność RNAi u indywidualnie wstrzykniętych zwierząt, a po trzecie, zbadać indywidualne różnice w zmianach transkrypcji w populacjach. Nasza metoda ulepsza poprzednie techniki na trzy sposoby.Skraca czas ekstrakcji o około 30% w porównaniu z dotychczasowymi metodami ekstrakcji pojedynczych niesporczaków. Nasza metoda obniża również koszt ekstrakcji o ponad 100-krotnie, ponieważ omija potrzebę liniowego etapu amplifikacji PCR. Wreszcie, nasza metoda jest 200 razy bardziej wydajna niż poprzednie metody, ponieważ omija potrzebę oczyszczania, co często skutkuje znaczną utratą RNA.Nasze odkrycia pozwolą naukowcom zajmującym się niesporczakami na ilościowe określenie względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR z poszczególnych niesporczaków w tani i skuteczny sposób. Widzimy, że jest to wykorzystywane do ilościowego określenia skuteczności knockdownu RNAi w wysoce ilościowy sposób, potwierdzania trafień sekwencjonowania i badania indywidualnych różnic w odpowiedzi transkrypcyjnej u różnych zwierząt. Na początek zapal palnik Bunsena lub inne kontrolowane źródło płomienia na niskim poziomie.Trzymaj szklaną mikropipetę z jednym końcem w każdej ręce i umieść jej środek nad płomieniem, aż szklanka zacznie się topić. Po zmiękczeniu szybko rozsuń dwa końce, aby utworzyć dwie ostre końcówki. Następnie, używając sterylnych cienkich szczypiec, delikatnie złamij końcówkę mikropipety, aby dostosować jej ostrość.Przymocuj szklaną mikropipetę do ściągacza do mikropipet, unikając kontaktu z żarnikiem grzewczym. Jako punkt wyjścia do optymalizacji, ustaw biegun na 78 stopni Celsjusza za pomocą jednego kroku ciągnięcia, używając ciężaru 182,2 grama. Pozwól żarnikowi się nagrzać, powodując rozdzielenie szklanej mikropipety na dwie mikropipety z ostrymi końcami pod wpływem grawitacji.Wyciągnięte szklane mikropipety należy przechowywać w zamkniętej 100-milimetrowej szalce Petriego i zabezpieczyć je woskiem lub gliną, aby zapobiec pękaniu ostrych końcówek. Na początek zaopatrz się w mikropipety z wyciąganego szkła o pożądanych wymiarach. Następnie przygotuj komplementarną syntezę DNA Master Mix i bufor do lizy niesporczaków.Podwielokrotność buforu do lizy wystarczającej do ekstrakcji przy użyciu dwóch mikrolitrów na niesporczak. Dodaj inhibitor rybonukleazy do buforu do lizy, aby osiągnąć końcowe stężenie czterech jednostek na mikrolitr. Krótko zmieszaj roztwór, a następnie odwiruj go w wirówce stołowej o wadze 2000 g przez pięć sekund w temperaturze pokojowej.Przechowywać roztwór na lodzie. Za pomocą sterylnej pipety P1000 z końcówką filtrującą usuń wymaganą liczbę niesporczaków z kultury i umieść je na sterylnej 35-milimetrowej szalce Petriego. Umyj niesporczaki trzykrotnie jednym mililitrem autoklawowanej sterylnej wody źródlanej, aby usunąć zanieczyszczenia z glonów.Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym o powiększeniu od 25x do 50x i użyj pipety P10 z końcówką filtra, aby przenieść pojedynczy niesporczak na nową, sterylną 35-milimetrową szalkę Petriego. Teraz za pomocą sterylnej pipety P200 z końcówką filtra umyj pojedynczy niesporczak w 100 mikrolitrach sterylnej wody wolnej od nukleaz. Przenieś umyty niesporczak do czystej, sterylnej probówki do PCR w jednym do dwóch mikrolitrów sterylnej wody wolnej od nukleaz.Wizualizuj niesporczaka pod mikroskopem preparacyjnym w 25-krotnym powiększeniu. Aby ułatwić usuwanie wody, delikatnie oderwij końcówkę wyciągniętej szklanej mikropipety na zewnątrz tuby. Za pomocą kapilarnego działania szklanej mikropipety usuń wodę, aż niesporczak zostanie otoczony małym pęcherzykiem wody.Dodać dwa mikrolitry buforu do lizy niesporczaków do probówki. Po krótkim wirowaniu odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć sekund przy 2000 g i przechowywać próbkę na lodzie. Następnie umieść próbkę zawierającą niesporczaki w stojaku na probówki do PCR i mocno ją zabezpiecz.Chwytając stojak długimi, grubymi kleszkami, delikatnie zanurz go w ciekłym azocie, aż próbka zostanie całkowicie zamrożona. Następnie wyjmij stojak z ciekłego azotu i umieść go na lodzie. Rozmrozić próbkę, monitorując ją co 15 sekund, aż stanie się widocznie przezroczysta.Po pięciokrotnym powtórzeniu procesu zamrażania i rozmrażania umieścić próbkę na lodzie. Dodaj dwa mikrolitry komplementarnej syntezy DNA Master Mix do probówki PCR zawierającej lizat niesporczaków. Krótko poruszyć probówką i obracać ją w temperaturze 2000 g przez pięć sekund w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić próbkę na lodzie.Teraz załaduj próbkę do termocyklera i rozpocznij program syntezy cDNA. Po zakończeniu syntezy natychmiast umieścić probówkę na lodzie. Rozcieńczyć próbkę do całkowitej objętości 25 mikrolitrów 21 mikrolitrami sterylnej wody wolnej od nukleaz.Zoptymalizowany protokół osiągnął trzykrotny wzrost wydajności komplementarnego DNA w porównaniu z protokołami bez cykli zamrażania i rozmrażania, przy czym sześć cykli jest optymalnych. Ekstrakcja RNA nie powiodła się, gdy obecna była woda resztkowa, co wskazuje na krytyczną potrzebę usunięcia nadmiaru wody w celu spójnej lizy. Wydajność RNA wynosiła około 14,24 nanogramów na niesporczak.Protokół ten był ponad 200 razy bardziej wydajny niż zestawy do ekstrakcji RNA pod względem wydajności transkryptu aktyny, o czym świadczą znacznie niższe wartości Ct i solidna amplifikacja pasma żelowego.

single-animal-single-tube-rna-extraction-for-comparison-relative

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mięśnie lotu Drosophila są używane jako modelowy system dla rozwoju i fizjologii mięśni. Ten film opisuje muskulaturę lotu dorosłych osobników i przedstawia protokół analizy rozwijających się pośrednich mięśni lotu, które są odpowiednie do sekwencjonowania RNA z poczwarek.

Drosophila Rozwarstwienie mięśni lotu pośredniego późnej poczwarki (IFM): metoda wysokoprzepustowego pobierania tkanek

Mikrodysekcja jest szeroko stosowana do badania DNA, RNA i białek w tkance.   Mikroskopia laserowa (LCM) jest najczęściej stosowaną metodą, ale od niedawna dostępna jest nowa technika mielenia, mezodysekcja.  Pokazujemy ekstrakcję RNA z mezorozpreparowanych szkiełek tkankowych zatopionych w parafinie w formalinie ziarniniaków Mycobacterium tuberculosis.

Nowatorskie podejście do mikrodysekcji w celu odzyskania specyficznych transkryptów Mycobacterium tuberculosis z ziarniniaków płuc zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Zanieczyszczenie podczas sekwencjonowania genomu mikroskopijnych organizmów pozostaje dużym problemem. Tutaj pokazujemy metodę sekwencjonowania genomu niesporczaka z pojedynczej próbki z zaledwie 50 pg genomowego DNA bez amplifikacji całego genomu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.

Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania genomu o bardzo niskim poziomie wejściowym z pojedynczej próbki niesporczaka

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje skuteczne podejście do hybrydyzacji in situ w celu wykrycia poziomów ekspresji mRNA i wzorców przestrzennych docelowych genów w płynie celomicznym Sipunculus nudus.

Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Obecny protokół opisuje metodę hodowli owadów szkodników w laboratoriach. Procedury rozróżniania płci owadów i ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości są ustalane przy użyciu dwóch szkodników tortricid.

Masowy chów i badania molekularne owadów szkodników Tortricidae

Poznaj szybką ekstrakcję RNA z pojedynczych niesporczaków Hypsibius exemplaris do analizy ekspresji genów metodą qRT-PCR. Ta technika przyspiesza badania neurobiologii molekularnej i mechanizmów odporności na stres.

Ekstrakcja RNA z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR u niesporczaka Hypsibius exemplaris (Wideo) | JoVE Journal

Ekstrakcja RNA z pojedynczego zwierzęcia w jednej probówce w celu porównania względnych poziomów transkryptów za pomocą qRT-PCR u niesporczaka Hypsibius exemplaris

Przeglądaj więcej filmów