Name: Niedroga adaptacja komercyjnego reaktora mikrofalowego do syntezy peptydów fazy stałej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Poznaj ekonomiczną metodę syntezy peptydów z użyciem mikrofalowego reaktora do oligomerów aminokwasów o utrudnionej przestrzeni. To rozwiązanie umożliwia małym laboratoriom akademickim prowadzenie zaawansowanych badań w chemii organicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie grantów INSPIRE Uniwersytetu Fairfield, wsparcie Wydziału Chemii i Biochemii na Uniwersytecie Fairfield oraz za pomoc dr Dorothy Szobcynski za jej wiedzę w zarządzaniu laboratorium. Ponadto autorzy są wdzięczni profesorom Jillian Smith-Carpenter i Aaronowi Van Dyke'owi za dyskusje dotyczące syntezy peptydów i organów organicznych. Autorzy doceniają wsparcie Funduszu Publikacji Wydziału Sztuk i Nauk Uniwersytetu Fairfield.

1. Zmontuj aparat (Rysunek 1)
UWAGA: Wszystkie komponenty do montażu aparatury znajdują się w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Złóż gniazdko odkurzacza.<ol>
		<li>Podłącz 2" rurki teflonowej o długości 1/8" do prawej strony "T" (Rysunek 1, część oznaczona "1") wykonanej z etylentetrafluoroetylenu (ETFE).</li>
		<li>Podłącz rurkę teflonową o średnicy 1/8" do zaworu (Rysunek 1, część oznaczona "2") wykonanego z ETFE.</li>
		<li>Przymocuj 100 cm rurki teflonowej po drugiej stronie zaworu (Rysunek 1, część oznaczona "2").</li>
		<li>Włóż tę rurkę przez otwór 1/8" gumowego korka i użyj tego korka, aby zakryć boczną kolbę Erlenmeyera (Rysunek 1A, część oznaczona "8") podłączoną do podciśnienia (pompa domowa lub skromna).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmontuj wlot gazu azotowego.<ol>
		<li>Podłącz 2" rury teflonowej o średnicy 1/8" z lewą stroną "Tee" ETFE (Rysunek 1, część oznaczona "1").</li>
		<li>Podłącz rurkę teflonową o średnicy 1/8" do zaworu ETFE (Rysunek 1, część oznaczona "3").</li>
		<li>Przymocuj 100 cm rurki teflonowej o średnicy 1/8" po drugiej stronie zaworu EFTE (Rysunek 1, część oznaczona "3").</li>
		<li>Przeciągnij dalszy koniec rurki teflonowej o średnicy 1/8" przez gumowy korek i użyj tego korka, aby podłączyć się do rurki tygon podłączonej do butli z azotem wyposażonej w regulator (Rysunek 1A, część oznaczona "7").</li>
		<li>Gdy zawór iglicowy regulatora jest zamknięty, użyj zaworu membranowego regulatora (Rysunek 1A, część oznaczona "7"). aby osiągnąć ciśnienie 5-10 psi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Złóż aspirator/bubbler.<ol>
		<li>Połącz trzonk "Tee" (Rysunek 1, część oznaczona "1") z rurką teflonową o średnicy 100 cm o średnicy 1/8".</li>
		<li>Wprowadź tę rurkę przez mikroprzegrodę (Rysunek 1, część oznaczona "6") wcześniej przekłutą igłą.</li>
		<li>Włóż rurkę całkowicie do rury dyspersyjnej gazu. Użyj mikroprzegrody, aby utworzyć uszczelnienie między rurką dyspersyjną gazów (Rysunek 1, część oznaczona "4") a rurką teflonową.</li>
		<li>Włóż rurkę dyspersyjną gazu do naczynia reakcyjnego probówki (Rysunek 1, część oznaczona "5") i umieść probówkę w jej uchowku (na zdjęciu 1B), który znajduje się na zewnątrz reaktora mikrofalowego. UWAGA: Podczas reakcji chemicznych probówka zostanie włożona do reaktora mikrofalowego. Podczas dodawania roztworów reakcyjnych i płukań rozpuszczalnika, probówka jest przechowywana na zewnątrz reaktora mikrofalowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz otwarty tłumik naczynia do reaktora mikrofalowego. Aparat powinien być już gotowy do użycia.</li>
</ol>
2. Przygotować odczynniki
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory aminokwasów FMOC. Dla skali 0,100 mmol przygotuj 0,2 M FMOC-AA-OH w DMF. Każdy cykl sprzężenia wykorzystuje 2,5 mL roztworów aminokwasowych.</li>
	<li>Przygotuj odczynnik sprzężenia diizopropylkarbodiimidem (DIC). Przygotuj 1,0 M DIC w DMF. Każde sprzężenie wykorzystuje 1,0 mL roztworu DIC.</li>
	<li>Przygotuj roztwór dodatkowy Oxyma Pure. Przygotuj 0,5 M oksymiana w DMF. Każde sprzężenie będzie wymagało 1,0 mL roztworu oksymamatyzmu.</li>
	<li>Przygotuj roztwór deochronny. Przygotuj 20% morfolinu v/v, roztwór DMF. Każdy uruchomienie deochrony wymaga 7 ml roztworu. Wykonaj dwa próby deochrony dla każdego deprotekcjonującego fmoc.</li>
</ol>
3. Przygotowanie żywicy peptydowej
<ol>
	<li>Zmierz odpowiednią masę żywicy SPPS Wang, siatki 100-200, polistyrenu z 1% dinylbenzenem, a suchą żywicę umieść w naczyniu reakcyjnym probówki. Na przykład dla syntezy na skali 0,100 mmol, żywica o ładunku 0,500 mmol g-1 wymagałaby 200 mg żywicy.</li>
	<li>Dodaj 3 mL rozpuszczalnika DMF do żywicy i puchnij żywicę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. W tym etapie upewnij się, że dopływ gazu azotowego jest "włączony/otwarty" dla mieszania, a zawór próżniowy (Rysunek 1, oznaczony "2") jest "wyłączony/zamknięty". Użyj zaworu iglicowego w docieku azotu (Rysunek 1A, oznaczony 7), aby uzyskać delikatne bulgotanie w roztworze. UWAGA: To ustawienie powinno być odpowiednie dla wszelkich dalszych wzburzeń przez gaz azotowy.</li>
	<li>Po 15 minutach pęcznienia żywicy zasysaj rozpuszczalnik DMF pod próżnią: zamknąć zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3"). Otwórz zawór na próżnię (Rysunek 1, oznaczony "2") i zasysaj rozpuszczalnik DMF. Gdy rozpuszczalnik jest prawie usunięty, otwórz zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3").</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2 i 3.3 dwa razy, aby żywica całkowicie spuchła.</li>
</ol>
4. Usunięcie FMOC
UWAGA: Żywice są dostępne wstępnie załadowane różnymi aminokwasami chronionymi FMOC, załadowanymi jako reszty C-końcowe. Dlatego usunięcie FMOC jest zwykle pierwszym krokiem po pęcznieniu żywicy.
<ol>
	<li>Gdy zbiornik reakcyjny probówki znajduje się na zewnątrz reaktora mikrofalowego i zawór próżniowy (Rysunek 1, oznaczony "2") jest zamknięty, należy bezpośrednio do probówki dodać 7 ml 20% piperydy/DMF lub 20% morfoliny/DMF.</li>
	<li>Odkręć zawór azotowy (rysunek 1, oznaczony "3"), aby poruszyć kulki. UWAGA: Żywice SPPS są dostępne wstępnie z resztą C-terminal, chronioną przez FMOC.</li>
	<li>Włóż probówkę z kulkami do reaktora mikrofalowego przez tłumik "otwartego naczynia" (Rysunek 1B, metalowy port reaktora).</li>
	<li>Podgrzej do 90 °C przez 2 minuty, używając mikrofalówki w trybie dynamicznym: ustaw docelową temperaturę na 90 °C, moc 50 W, czas utrzymania = 2,0 min (patrz Plik Uzupełniający 1 , aby uzyskać raport o deochronie w mikrofalówce). Monitoruj temperaturę za pomocą czujnika podczerwieni mikrofalowej; Mikrofala zmniejsza moc, aby utrzymać temperaturę reakcji.</li>
	<li>Usuń probówkę z kulkami z reaktora mikrofalowego.</li>
	<li>Aspiruj roztwór DMF i produkty uboczne reakcji w próżni: zamknąć zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3"). Otwórz zawór próżniowy (rysunek 1, oznaczony "2"). Gdy roztwór jest prawie usunięty, otwórz zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3").</li>
	<li>Zamknij zawór próżniowy (Rysunek 1, oznaczony "2"). Dodaj 3 mL DMF do przepłukania probówki i probówki do dyspersji gazów.</li>
	<li>Aspiruj rozpuszczalnik DMF pod próżnią: zamknij zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3"). Otwórz zawór próżniowy (rysunek 1, oznaczony "2"). Gdy roztwór jest prawie usunięty, otwórz zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3").</li>
	<li>Powtórz kroki 4.7 i 4.8 dwa razy, co daje łącznie trzy płukania z rozpuszczalnikiem DMF.</li>
	<li>Powtórz kroki usuwania FMOC 4.1-4.9, co daje łącznie dwa kolejne kroki deochrony.</li>
</ol>
5. Sprzężenie aminokwasów FMOC
<ol>
	<li>Umieść zbiornik reakcyjny w jego uchwycie na zewnątrz reaktora mikrofalowego.</li>
	<li>Ręcznie dodaj 2,5 mL 0,2 M aminokwasu FMOC (nadmiar 5x molowy), 1,0 mL roztworu sprzężenia 1,0 M DIC (nadmiar 10x molowy) oraz 1,0 mL roztworu dodatkowego oksymizanacystycznego 0,5 M (nadmiar 5x molowy) do żywicy w probówce.</li>
	<li>Otwórz zawór azotowy (Rysunek 1, oznaczony "3"), aby uzyskać mieszanie kulek.</li>
	<li>Włóż probówkę z kulkami do reaktora mikrofalowego przez otwarty tłumik naczynia (Rysunek 1B, metalowy port reaktora). Podgrzej roztwór do 100 °C przez 10 minut. Używając mikrofali w trybie dynamicznym, ustaw docelową temperaturę na 100 °C, moc 60 W, czas utrzymania = 10,0 min (patrz Plik Uzupełniający 1 , aby uzyskać raport o sprzężeniu w mikrofali). Monitoruj temperaturę za pomocą czujnika podczerwieni mikrofalowej; Mikrofala zmniejsza moc, aby utrzymać temperaturę reakcji.</li>
	<li>Usuń probówkę z kulkami z reaktora mikrofalowego.</li>
	<li>Aspiruj rozpuszczalnik DMF i produkty uboczne reakcji w próżni: zamknąć zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3"). Otwórz zawór próżniowy (rysunek 1, oznaczony "2"). Gdy roztwór jest prawie usunięty, otwórz zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3").</li>
	<li>Zamknij zawór próżniowy (Rysunek 1, oznaczony "2"). Dodaj 3 mL DMF do przepłukania probówki i probówki do dyspersji gazów.</li>
	<li>Aspiruj rozpuszczalnik DMF pod próżnią: zamknij zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3"). Otwórz zawór próżniowy (rysunek 1, oznaczony "2"). Gdy roztwór jest prawie usunięty, otwórz zawór N2 (Rysunek 1, oznaczony "3").</li>
	<li>Powtórz kroki 5.7 i 5.8 2 razy, co daje łącznie trzy płukania rozpuszczalnikiem DMF.</li>
</ol>
6. Powtarzanie cykli peptydowych SPPS
<ol>
	<li>Powtarzaj wszystkie kroki w sekcjach 4 (usunięcie FMOC) i 5 (Sprzężenie aminokwasów FMOC) aż do uzyskania peptydu o pożądanej sekwencji. UWAGA: Pamiętaj, aby roztwory odczynnikowe dodać poza reaktorem mikrofalowym, w temperaturze pokojowej, bezpośrednio do zbiornika reakcyjnego probówki. Upewnij się również, że przed umieszczeniem probówki w reaktorze mikrofalowym rozpoczęto mieszanie azotem.</li>
</ol>
7. Rozszczepienie peptydów
<ol>
	<li>Przelej żywicę do smażonej plastikowej strzykawki.</li>
	<li>Przygotuj koktajl rozszczepienia składający się z 95% kwasu trifluorooctowego (TFA), 2,5% wody i 2,5% triizopropylosilanu (TIPS) w objętości 1 mL/100 mg żywicy.</li>
	<li>Rozszczepia peptyd przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, z ciągłym lub okazjonalnym potrząsaniem.</li>
	<li>Wytrąć produkt peptydowy w 10 mL lodowatego eteru dietylo.</li>
	<li>Ponownie zawiesij granulek w minimalnej ilości MeCN/0,1% wodnych TFA i liofilizuj przez noc.</li>
</ol>

Versatile Home-Built Microwave-Assisted System for Peptide Synthesis

<ol><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+Synthesis+of+a+Tetrapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide.</a> J Am Chem Soc. 85 (14), 2149-2154 (1963).</li>
<li>Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+prize%3A+Merrifield+wins+in+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nobel prize: Merrifield wins in chemistry.</a> Nature. 311 (5988), 699-699 (1984).</li>
<li>Jaradat, D. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirteen+decades+of+peptide+synthesis%3A+key+developments+in+solid+phase+peptide+synthesis+and+amide+bond+formation+utilized+in+peptide+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Thirteen decades of peptide synthesis: key developments in solid phase peptide synthesis and amide bond formation utilized in peptide ligation.</a> Amino Acids. 50 (1), 39-68 (2018).</li>
<li>Paradís-Bas, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+the+synthesis+of+%26%2334%3Bdifficult+peptides.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The road to the synthesis of &#34;difficult peptides.&#34.</a> Chem Soc Rev. 45 (3), 631-654 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Study+of+diketopiperazine+formation+during+solid-phase+peptide+synthesis+of+tirzepatide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Study of diketopiperazine formation during solid-phase peptide synthesis of tirzepatide.</a> ACS Omega. 7 (50), 46809-46824 (2022).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylation+in+amino+acids+and+peptides%3A+Scope+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">N-methylation in amino acids and peptides: Scope and limitations.</a> Biopolymers. 109 (10), e23110(2018).</li>
<li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+coupling+reagents%2C+more+than+a+letter+soup%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Peptide coupling reagents, more than a letter soup.</a> Chem Rev. 111 (11), 6557-6602 (2011).</li>
<li>Subirós-Funosas, R., Nieto-Rodriguez, L., Jensen, K. J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMU%3A+scope+and+limitations+of+the+latest+innovation+in+peptide+acyl+transfer+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peptide+Sci%22%5BJournal%5D)">COMU: scope and limitations of the latest innovation in peptide acyl transfer reagents.</a> J Peptide Sci. 19 (7), 408-414 (2013).</li>
<li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMU%3A+A+third+generation+of+uronium-type+coupling+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peptide+Sci%22%5BJournal%5D)">COMU: A third generation of uronium-type coupling reagents.</a> J Peptide Sci. 16 (1), 6-9 (2010).</li>
<li>Wenschuh, H., Beyermann, M., Rothemund, S., Carpino, L. A., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+solid-phase+synthesis+via+Fmoc-amino+acid+fluorides%5BTitle%5D)+AND+%22Tet+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple solid-phase synthesis via Fmoc-amino acid fluorides.</a> Tet Lett. 36 (8), 1247-1250 (1995).</li>
<li>Wenschuh, H., Beyermann, M., Krause, E., Carpino, L. A., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+solid+phase+assembly+of+peptides+bearing+contiguous+highly+hindered+Aib+residues+via+Fmoc+Aib+fluoride%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Efficient solid phase assembly of peptides bearing contiguous highly hindered Aib residues via Fmoc Aib fluoride.</a> Tetrahedron. 34 (23), 3733(1993).</li>
<li>Wenschuh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fmoc+amino-acid+fluorides+-+convenient+reagents+for+the+solid-phase+assembly+of+peptides+incorporating+sterically+hindered+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Fmoc amino-acid fluorides - convenient reagents for the solid-phase assembly of peptides incorporating sterically hindered residues.</a> J Org Chem. 59 (12), 3275-3280 (1994).</li>
<li>Manne, S. R., De La Torre, B. G., El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OxymaPure+coupling+reagents%3A+beyond+solid-phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Synthesis%22%5BJournal%5D)">OxymaPure coupling reagents: beyond solid-phase peptide synthesis.</a> Synthesis. 52 (21), 3189-3210 (2020).</li>
<li>Collins, J. M. Microwave-enhanced synthesis of peptides, proteins, and peptidomimetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+JM+%22Microwaves+in+Organic+Synthesis%22">Microwaves in Organic Synthesis</a>. Hoz, A., Loupy, A. , Wiley-VCH Verlag & Co. KGaA: Weinheim, Germany. 897-959 (2012).</li>
<li>Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+heating+in+solid-phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Microwave heating in solid-phase peptide synthesis.</a> Chem Soc Rev. 41 (5), 1826-1844 (2012).</li>
<li>Pedersen, S. L., Sørensen, K. K., Jensen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+microwave-assisted+SPPS%3A+Optimization+of+protocols+and+synthesis+of+difficult+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Sci%22%5BJournal%5D)">Semi-automated microwave-assisted SPPS: Optimization of protocols and synthesis of difficult sequences.</a> Peptide Sci. 94 (2), 206-212 (2010).</li>
<li>Zeko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT-IR+spectroscopy+and+density+functional+theory+calculations+of+13C+isotopologues+of+the+helical+peptide+Z-Aib+6+-OtBu%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">FT-IR spectroscopy and density functional theory calculations of 13C isotopologues of the helical peptide Z-Aib 6 -OtBu.</a> J Phys Chem B. 118 (1), 58-68 (2014).</li>
<li>Gord, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation-specific+spectroscopy+of+capped%2C+gas-phase+Aib+oligomers%3A+Tests+of+the+Aib+residue+as+a+310-helix+former%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Conformation-specific spectroscopy of capped, gas-phase Aib oligomers: Tests of the Aib residue as a 310-helix former.</a> Phys Chem Chem Phys. 18 (36), 25512-25527 (2016).</li>
<li>Fischer, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-conformation+spectroscopy+of+capped+aminoisobutyric+acid+dipeptides%3A+the+effect+of+C-terminal+cap+chromophores+on+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Single-conformation spectroscopy of capped aminoisobutyric acid dipeptides: the effect of C-terminal cap chromophores on conformation.</a> J Phys Chem A. 123 (19), 4178-4187 (2019).</li>
<li>Hjørringgaard, C. U., Pedersen, J. M., Vosegaard, T., Nielsen, N. C., Skrydstrup, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automatic+solid-phase+synthesis+of+peptaibols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">An automatic solid-phase synthesis of peptaibols.</a> J Org Chem. 74 (3), 1329-1332 (2009).</li>
<li>Haynes, S. R., Hagins, S. D., Juban, M. M., Elzer, P. H., Hammer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+solid-phase+synthesis+of+%CE%B1%2C%CE%B1-dialkylated+amino+acid-rich+peptides+with+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peptide+Res%22%5BJournal%5D)">Improved solid-phase synthesis of α,α-dialkylated amino acid-rich peptides with antimicrobial activity.</a> J Peptide Res. 66 (6), 333-347 (2005).</li>
<li>Zieleniewski, F., Woolfson, D. N., Clayden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+solid-phase+concatenation+of+Aib+residues+to+form+long%2C+water-soluble%2C+helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Automated solid-phase concatenation of Aib residues to form long, water-soluble, helical peptides.</a> Chem Commun. 56 (80), 12049-12052 (2020).</li>
<li>CEM Corporation. Manual peptide synthesis. Discover SPSS. , https://cem.com/discover-spps (2023).</li>
<li>Theis, C., Degenkolb, T., Brückner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+selective+trifluoroacetolytic+scission+of+native+peptaibols+and+model+peptides+using+HPLC+and+ESI-CID-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biodivers%22%5BJournal%5D)">Studies on the selective trifluoroacetolytic scission of native peptaibols and model peptides using HPLC and ESI-CID-MS.</a> Chem Biodivers. 5 (11), 2337-2355 (2008).</li>
<li>Ya-Ting Huang, A., Kao, C. -L., Selvaraj, A., Peng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+dendrimer+synthesis%3A+a+promising+approach+to+transform+dendrimer+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-phase dendrimer synthesis: a promising approach to transform dendrimer construction.</a> Materials Today Chemistry. 27, 101285(2023).</li>
<li>Flemmich, L., Bereiter, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+modified+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of modified RNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 63 (22), e202403063(2024).</li>
<li>Li, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+electrosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solid-phase electrosynthesis.</a> Acc Chem Res. 56 (24), 3694-3703 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Prezentowane tutaj urządzenia wykorzystują prostą, nowatorską i niedrogą metodę usuwania rozpuszczalników, nadmiaru odczynników i produktów odpadowych, a także dodawania mieszania gazu azotowego podczas mikrofalowego SPPS. W przeciwieństwie do konwencjonalnych zbiorników SPPS, które wywołują frit na dnie naczynia, prezentowane urządzenie wywołuje rurę dyspersyjną gazu pod próżnią do zasysania naczynia. Zbiornik reakcyjny jest więc zwykłą probówką, która jest podgrzewana w miejscu zalecanym przez producenta reaktora mikrofalowego w "otwartym tłumiku naczynia".
Naszą główną innowacją jest usuwanie rozpuszczalników i produktów ubocznych reakcji z probówki za pomocą "rurki dyspersyjnej gazu" pod próżnią. Podczas przemian chemicznych pod napromieniowaniem mikrofalowym, a także podczas płukań rozpuszczalnikiem (N,N-dimetyloformamid (DMF) lub N-metylopirolidynon, NMP), kulki SPPS są wzburzane przez gaz azotowy rozpraszany przez rurkę. Próżnia i gaz azotowy są kontrolowane przez zawory ETFE, aby zoptymalizować odporność na rozpuszczalnik. Odpady SPPS są zbierane w bocznej kolbce Erlenmeyera. Wszystkie elementy są połączone rurami teflonowym o średnicy 1/8". Chociaż używamy odkurzacza "domowego", mechaniczna pompa próżniowa również by się przystosowała. Rysunek 1 powyżej to schemat naszego aparatu.
Skuteczne SPPS wymaga nie tylko aparatu, ale także protokołów chemicznych dotyczących temperatury, czasu i odczynników chemicznych. Wykorzystując protokół Claydena i in.22, przygotowaliśmy kilka peptydów, których przygotowanie byłoby trudne, jeśli nie niemożliwe, za pomocą konwencjonalnych metod SPPS w temperaturze pokojowej. Do sprzężenia aminokwasów używamy diizopropylowego karbodiamidu (DIC) i oksymu jako koktajlu sprzężenia i naświetlamy do 100 °C przez 10 minut. Uważa się, że oksyma tłumi racemizację reszt podczas procesu sprzężenia13. Do deochrony FMOC stosujemy 20% morfolinu w DMF, napromieniowaną w 90 °C przez 2 minuty, i powtarzamy to jeszcze raz. Między reakcjami używamy DMF do wielokrotnego (3x) płukania koralików SPPS (żywica Wang).
Korzystając z tego manualnego aparatu, przygotowaliśmy trudne do syntezy peptydy z tempem około 40 minut na resztę. Nie badaliśmy jeszcze możliwych optymalizacji tej szybkości. Na przykład uważamy, że czas w reaktorze mikrofalowym mógłby być ograniczony do "całkowitego czasu reakcji", a nie "czasu w temperaturze docelowej", bez obniżania wyników. Wynika to z czasu poświęconego asymptotycznie na zbliżanie się do temperatury docelowej (szczegóły w Pliku Uzupełniającym 1 ). Co więcej, w zasadzie można było dodać wszystkie odczynniki i rozpuszczalniki bez usuwania zbiornika reakcyjnego z mikrofalówki. Jednak wolimy móc kontrolować żywicę na każdym etapie.
Chociaż naszym zastosowaniem jest SPPS, należy zauważyć, że metody fazy stałej są coraz częściej stosowane do różnych syntez, takich jak dendrimer25, RNA26 oraz syntezy elektrochemiczne27. Różne zastosowania mogłyby skorzystać z pomocy mikrofalowej, do czego to urządzenie byłoby odpowiednie. Na koniec, choć urządzenie zostało skonstruowane do mikrofalowego wspomagania SPPS, jego podstawowym zbiornikiem reakcyjnym jest probówka. Dlatego urządzenie może być stosowane zarówno w konwencjonalnych, pokojowych SPPS, jak i w podwyższonych temperaturach, na przykład w kąpieli olejowej.

Wprowadzenie przez Merrifielda syntezy peptydów w fazie stałej SPPS w latach 60. zrewolucjonizowało syntezy peptydów i chemii i zostało słusznie nagrodzone Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii 1,2. W kolejnych dekadach wielu badaczy udoskonaliło oryginalne techniki Merrifielda, co doprowadziło do powstania dwóch alternatyw dominujących w praktykach SPPS: opartych na fluorenylmetoksykarbonylu (FMOC) kontra na tert-butylowym oksykarbonylu (BOC)3. Ostateczne rozszczepienie peptydu od żywicy stałej w FMOC wymaga koktajlu zawierającego kwas trójfluorocetowy, w przeciwieństwie do HF w technikach BOC, co sprawia, że metody oparte na FMOC są preferowanym wyborem wielu laboratoriów.
Nowoczesne metody SPPS są czasami kwestionowane przez pożądane sekwencje. W ostatnich latach nastąpiły postępy w przezwyciężaniu niektórych specyficznych obaw dotyczących agregacji4, powstawania diketopiperazyny5 oraz reszt aminokwasów N-metylowanych6. W celu optymalizacji wydajności sprzężenia badane są tysiące odczynników sprzężenia i dodatków7. Konkretnie, aktywacja kwasu karboksylowego za pomocą COMU 8,9 lub fluorków kwasu 10,11,12, wraz z dodatkami takimi jak Oxyma13 i hydroksybenzotriazol (HOBt), została opracowana do szczególnie trudniejszych sprzężeń, takich jak te z udziałem pozostałości α,α-dialkilatowanych.
Stosowane są także inne metody nieoparte na odczynnikach, aby zwiększyć wydajność przy trudnych sprzężeniach, w tym wydłużone czasy reakcji, tzw. "podwójne sprzężenie" oraz ogrzewanie, zwłaszcza przy ogrzewaniu mikrofalowym 14,15,16. Rzeczywiście, komercyjnie dostępne zautomatyzowane syntezatory peptydów wykorzystujące ogrzewanie mikrofalowe należą do najbardziej komercyjnie skutecznych urządzeń na rynku, ponieważ przyspieszają szybkość reakcji, wydają się poprawiać końcową czystość peptydów oraz minimalizować odpady rozpuszczalników. Niestety, te urządzenia mogą być drogie, w niektórych przypadkach kosztować ponad 100 000 dolarów.
Nasze laboratorium interesuje się przygotowywaniem wariantów peptydów zawierających silnie helikogenny pozostałość kwasu alfa-aminoizobutrynowego (Aib)17,18,19. Ze względu na steryczną przeszkodę wynikającą z dialkilacji alfa-węgla, Aib jest znany z tego, że trudno go sprzężyć. Wspomniane powyżej metody (fluorki kwasowe, podgrzewanie mikrofalowe20), a także sprytna chemia "dipeptidowa" SPPS21, zostały wykorzystane do dostosowania SPPS do wyzwań związanych ze sprzężeniem Aib. Przygotowanie dimerów Aib poza żywicą, choć poprawia ogólną wydajność, wymaga dodatkowej chemii mokrej i podwyższonej temperatury (50 °C)21. Ponadto unikamy stosowania kwasowych fluorków Aib ze względu na toksyczny charakter fluorujących substancji. Niestety, nasze laboratorium nie dysponuje dedykowanym mikrofalowym zautomatyzowanym syntezatorem SPPS, wyposażonym w dedykowane naczynia reakcyjne do niezbędnego odprowadzania produktów ubocznych SPPS. Niemniej jednak niedawny raport zespołu Claydena, wykazujący spektakularny sukces w przygotowaniu oligomerów opartych na Aib przy użyciu SPPS i mikrofalowego napromieniowania22, zmotywował nas do dostosowania mikrofalowej jednostki CEM Discover SP naszego laboratorium do syntez SPPS.
Najpierw zbadaliśmy komercyjnie dostępne akcesoria CEM do przekształcenia reaktora mikrofalowego w ręczną jednostkę SPPS/mikrofalową23. Poza kosztami, to akcesorię wymagałoby zaangażowania naszej mikrofalówki wyłącznie do ręcznego SPPS. Inni użytkownicy laboratoriów nie mieliby już dostępu do doskonałych możliwości mikrofalowej. Dlatego wdrożenie komercyjnego dodatku zostało uznane za niedopuszczalne w naszej sprawie.
Zamiast tego zmontowaliśmy, za pomocą stosunkowo tanich komponentów, urządzenie do wykonywania mikrofalowego SPPS w skali milimolarnej. Poniższy protokół opisuje wykorzystanie prostych i stosunkowo tanich komponentów do ręcznego, mikrofalowego wspomagania SPPS.

<table><tbody><tr><td>Reaktor mikrofalowy CEM Discover SP</td><td>CEM</td><td></td><td>Wycofany.&nbsp; Niedawno zastąpiony w linii produktów przez Discover 2.0</td></tr><tr><td>Diizopropylkarbodiimid (DCC)</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylformamid (DMF)</td><td>Chemikalia termonaukowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka dyspersyjna gazu, mikro,&nbsp;</td><td>Chemglass</td><td>CG-207-02</td><td>Porowatość średnia</td></tr><tr><td>Mikroprzegroda</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3022-20</td><td>Przegroda typu "NMR"</td></tr><tr><td>Morfolia</td><td>Chemikalia termonaukowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy chronione N-Fmoc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oyxma Pure</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piersiówka Ehrlenmeyera z bocznym ramieniem</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Zbieranie odpadów</td></tr><tr><td>"Tee"</td><td>Idex</td><td>P-713</td><td>ETFE</td></tr><tr><td>rurki teflonowe 1/8" i bez śladu;</td><td>Restek</td><td>25306</td><td>OD x 0,063" ID, 3 m</td></tr><tr><td>Probówka (uchwyt na naczynie reakcyjne zewnętrzne dla mikrofalówki) &nbsp;</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>(30 x 175)</td></tr><tr><td>Probówka (naczynie reakcyjne)</td><td>Szkło Corning</td><td>9820-25X</td><td>Pyrex 25 x 200 mm, bez obręczy &nbsp;</td></tr><tr><td>Zawór</td><td>Idex</td><td>P-721</td><td>ETFE (2x)</td></tr><tr><td>Żywica Wang SPPS, 1% sieciowana diwinylbenzen, 100-200 mesh</td><td>Zaawansowany ChemTech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

niedroga adaptacja komercyjnego reaktora mikrofalowego do syntezy peptydów fazy stałej

An Inexpensive Adaptation of a Commercial Microwave Reactor for Solid Phase Peptide Synthesis

Prezentowano domowo zbudowane urządzenie do syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS), wspomagane przez mikrofalowe napromieniowanie i ogrzewanie. W przeciwieństwie do konwencjonalnych zbiorników reakcyjnych SPPS, które odprowadzają odprowadzanie rozpuszczalnika i produktów ubocznych za pomocą fritu umieszczonego na dnie naczynia, prezentowane urządzenie wykorzystuje rurę dyspersyjną gazową pod próżnią do usuwania rozpuszczalnika, produktów ubocznych i nadmiaru odczynników. Ta sama rurka dyspersyjna gazu dostarcza mieszanie gazu azotowego kulek SPPS podczas etapów reakcji sprzężenia i deochrony. Podgrzewanie mikrofalowe jest korzystne dla SPPS sprzężeń sterycznie utrudnionych reszt, takich jak kwas alfa-aminoizobutyrowy (Aib), aminokwasowy alfa-dialkilowany. Ten domowy aparat był wykorzystywany do przygotowania, za pomocą ręcznych metod Fmoc SPPS, peptydów heptamerowych i oktamerycznych zdominowanych przez resztę Aib, która jest notorycznie trudna do sprzężenia w standardowych warunkach temperatury pokojowej oraz reagentów. Ponadto typowe komercyjne mikrofalowe reaktory SPPS są dedykowane wyłącznie syntezie SPPS, co czyni je niedostępnymi dla użytkowników spoza SPPS. Dla kontrastu, prezentowane urządzenie zachowuje wszechstronność reaktora mikrofalowego do konwencjonalnego przyspieszania mikrofal reakcji chemicznych, ponieważ urządzenie jest nieznacznie oddzielone od komercyjnego reaktora mikrofalowego.

Przykłady sekwencji peptydowych przygotowanych naszym aparatem przedstawiono na Rysunku 2 i Rysunku 3. Tabela 1 podsumowuje roztwory, parametry mikrofalowe i płukania, które zastosowaliśmy. Potwierdzenie spektrometrii mas MALDI-TOF przedstawiono na rysunkach. Masowy odzysk tych peptydów przekracza 80%. Co istotne, wszystkie te sekwencje mają wiele sprzężeń między sąsiadującymi aminokwasami alfa, alfa-diakilatowanymi. Są to jedne z najtrudniejszych pozostałości do sprzężenia poprzez tworzenie wiązań peptydowych.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66937/66937fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Domowo zbudowany, mikrofalowy, ręczny aparat SPPS. (A) Schemat przedstawiający 1) ETFE "tee"; 2) ETFE zawór do próżni; 3) zawór ETFE na gaz azotowy; 4) rurka dyspersyjna gazu, wewnątrz 5) zbiornik reakcyjny z pyreksu; 6) Przegroda typu NMR do połączenia rury teflonowej o średnicy 1/8" z rurą dyspersyjną gazów; 7) zawory iglicowe do kontroli przepływu gazu azotowego; 8) piersiówki bocznej do zbierania odpadów reakcyjnych. Zobacz Tabelę materiałów dla producentów oraz numery katalogowe komponentów. (B) Fotografia złożonego obrazu. Numeracja jest identyczna jak na rysunku 1A. Skróty: SPSS = synteza peptydów w fazie stałej; ETFE = etylentetrafluoroetylen; NMR = jądrowy rezonans magnetyczny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66937/66937fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66937/66937fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Struktura peptydu 1, syntetyzowana metodami SPPS mikrofalowymi oraz potwierdzeniem MALDI-TOF. (A) Zastosowano CHCA jako macierz. Szczyt przy m/z = 880,18 to adukt potasowy, [MK+], obliczony m/z=880,45. (B) Ślad HPLC surowego peptydu 1. Gradient rozpuszczalnika to MeCN od 20% do 80% przy 0,1% wodnych TFA, 20 min. Długość fali obserwacji = 222 nm. Skróty: SPSS = synteza peptydów w fazie stałej; MALDI-TOF = czas jonizacji laserowej wspomaganej macierzą; CHCA = kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamowy, HPLC = wysokowydajna chromatografia cieczowa; MeCN = acetonitryl; TFA = kwas trifluorooctowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66937/66937fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66937/66937fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Struktura peptydu 2, syntetyzowana metodami mikrofalowymi SPPS oraz potwierdzeniem MALDI-TOF. (A) Zastosowano CHCA jako macierz. Szczyt m/z = 1022,7 przypisany jest adductowi potasowym, [MK+], obliczonym m/z=1023,5. Szczyt m/z = 966,5 został wstępnie przypisany oksazolonowi C-końcowemu na podstawie utraty wody24, obliczonej m/z = 967,5. (B) Ślad HPLC surowego peptydu 2. Gradient rozpuszczalnika to MeCN od 20% do 80% przez 20 minut w porównaniu do 0,1% wodnego TFA. Długość fali obserwacji = 222 nm. Skróty: SPSS = synteza peptydów w fazie stałej; MALDI-TOF = czas jonizacji laserowej wspomaganej macierzą; CHCA = kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamowy, HPLC = wysokowydajna chromatografia cieczowa; MeCN = acetonitryl; TFA = kwas trifluorooctowy, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66937/66937fig03large.jpg" target="_blank">prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Krok</td>
			<td>Roztwór/rozpuszczalnik</td>
			<td>Volume (mL)</td>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>Temperatura (°C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Deprotekcja</td>
			<td>20% morfolina</td>
			<td>7</td>
			<td>2</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Washes</td>
			<td>DMF</td>
			<td>4, 4, 4</td>
			<td>-</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Deprotekcja</td>
			<td>20% morfolina</td>
			<td>7</td>
			<td>2</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Washes</td>
			<td>DMF</td>
			<td>4, 4, 4</td>
			<td>-</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Sprzężenie</td>
			<td>Fmoc-AA-OH, OXYMA, DIC</td>
			<td>5, 2, 2</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Washes</td>
			<td>DMF</td>
			<td>4, 4, 4</td>
			<td>-</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Powtórz</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koniec</td>
			<td>Rozłup</td>
			<td>TFA/TIPS/H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>>120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Kroki dla jednego cyklu mikrofalowego SPPS wspomaganego mikrofalami na skali 0,1 mmol: deochrona FMOC, płukania oraz sprzężenie FMOC-aminokwas .0,2 M FMOC-AA-OH, 0,5 M OKSYMA, 1,0 M DIC. Roztwory dodawane ręcznie przez mikropipetter bezpośrednio do probówki dla każdego kroku. Skróty: SPSS = synteza peptydów w fazie stałej; FMOC = fluorenymetoksykarbonyl; DIC = diizopropylkarbodimid.
Plik uzupełniający 1: Raport CEM Discover o reaktorze mikrofalowym dotyczący usunięcia grupy ochronnej Fmoc oraz raport reaktora mikrofalowego CEM Discover SP dotyczący sprzężenia aminokwasu chronionego Fmoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66937/66937_Supporting information.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Prezentowano prosty, niedrogi i nowatorski aparat do syntezy peptydów w fazie stałej w komercyjnym reaktorze mikrofalowym.

Niedroga adaptacja komercyjnego reaktora mikrofalowego do syntezy peptydów fazy stałej

A home-built apparatus to perform solid phase peptide synthesis (SPPS), assisted by microwave irradiation and heating, is presented. In contrast to ...

Nasz zespół badawczy opracował metodę tworzenia oligomerów aminokwasów sterycznie utrudnionych, wykorzystując reaktor mikrofalowy do syntezy peptydów w fazie stałej. Chociaż jednostki komercyjne do tego celu są kosztowne, nasze urządzenia okazały się skuteczne i opłacalne w przygotowaniu tych oligomerów. Dla naukowców takich jak my, zautomatyzowany mikrofalowy syntezator peptydów w fazie stałej o 100 000 jest poza naszym budżetem.Aparat, który zbudowaliśmy, pozwala nam łączyć zalety syntezy chemicznej wspomaganej mikrofalami z syntezą peptydów w fazie stałej. Nasze urządzenia są ekonomicznie opłacalne dla małych laboratoriów akademickich. Pozwala laboratoriom takim jak nasze stosować syntezę wspomaganą mikrofalą do przygotowania oligomerów sterycznie utrudnionych aminokwasów z wykorzystaniem technik peptydów w fazie stałej.Aminokwasy sterycznie hamowane zazwyczaj mają słabe wydajności sprzężenia. Jednak coraz częściej stosuje się je w lekach peptydowych, na przykład w popularnym leku na odchudzanie Wegovy. Nasze urządzenie pomoże naukowcom stosować sterycznie utrudnione reszty aminokwasów w ich pracy.Na początek podłącz dwa cale zewnętrznej rurki teflonowej o średnicy 1/8 cala do prawej strony T wykonanej z etylentetrafluoroetylenu, czyli ETFE. Następnie podłącz rurkę teflonową o średnicy zewnętrznej 1/8 cala do zaworu wykonanego z ETFE. Przymocuj 100 centymetrów rurki teflonowej po drugiej stronie zaworu.Włóż tę rurkę przez otwór 1/8 cala gumowego korka i użyj go do zakręcenia bocznej kolby Erlenmeyera połączonej z odkurzaczem. Aby zmontować wlot gazu azotowego, podłącz dwa cale rurki teflonowej do lewej strony ETFE T i podłącz rurkę teflonową do zaworu ETFE. Następnie przymocuj 100 centymetrów rurki teflonowej o średnicy zewnętrznej 1/8 cala po drugiej stronie zaworu ETFE.Przełóż dalszy koniec rurki teflonowej przez gumowy korek i użyj tego korka, aby podłączyć się do rurki Tygon podłączonej do butli z azotem wyposażoną w regulator. Gdy zawór iglicowy regulatora jest zamknięty, użyj zaworu membranowego regulatora, aby osiągnąć ciśnienie od 5 do 10 funtów na cal kwadratowy. Aby złożyć aspirator lub bubbler, należy połączyć trzonek T z rurką teflonową o średnicy zewnętrznej o średnicy 100 centymetrów.Włóż tę rurkę przez mikroprzegrodę wcześniej przekłutą igłą. Teraz włóż rurkę całkowicie do rury dyspersyjnej gazu. Użyj mikroprzegrody, aby utworzyć uszczelnienie między rurką dyspersyjną gazu a rurką teflonową.Włóż rurkę dyspersyjną gazu do zbiornika reakcyjnego i umieść probówkę w jej uchowaniu, które znajduje się na zewnątrz reaktora mikrofalowego. Na początek dodaj do żywicy trzy mililitry rozpuszczalnika DMF i pozwól jej puchnąć w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Upewnij się, że dopływ azotu jest włączony do mieszania, a zawór próżniowy jest wyłączony.Użyj zaworu iglicowego dopływu azotu, aby uzyskać delikatne bąbelki w roztworze. Po 15 minutach zamknij zawór azotowy, otwórz zawór próżniowy i wciągnij rozpuszczalnik DMF. Gdy rozpuszczalnik jest prawie usunięty, otwórz zawór azotowy.Gdy zbiornik reakcyjny znajduje się na zewnątrz reaktora mikrofalowego i zawór próżniowy zamknięty, należy dodać siedem mililitrów 20% piperydyny w DMF lub 20% morfoliny w DMF bezpośrednio do probówki. Odkręć zawór azotowy, aby poruszyć kulki. Włóż probówkę z kulkami do reaktora mikrofalowego przez tłumik otwartego naczynia.Używając mikrofalówki w trybie dynamicznym, ustaw docelową temperaturę na 90 stopni Celsjusza, moc na 50 watów, a czas utrzymania na dwie minuty. Monitoruj temperaturę za pomocą czujnika podczerwieni. Teraz wyjmij probówkę z kulkami z reaktora mikrofalowego.Aby zasysać roztwór DMF, zamknąć zawór azotowy, otworzyć zawór próżniowy i zasysać roztwór. Gdy roztwór jest prawie usunięty, otwórz zawór azotowy. Następnie zamknij zawór próżniowy.Dodaj trzy mililitry DMF do przepłukania probówki i rurki dyspersyjnej gazu. Wsysaj rozpuszczalnik DMF, jak pokazano wcześniej. Ręcznie dodaj 2,5 mililitra aminokwasu FMOC, 1,0 mililitra roztworu sprzężącego DIC oraz roztworu dodatkowego Oxyma do żywicy w probówce.Otwórz zawór azotowy, aby uzyskać mieszanie kulek. Włóż probówkę z kulkami do reaktora mikrofalowego za pomocą tłumika otwartego naczynia. Użyj mikrofalówki w trybie dynamicznym, aby podgrzać roztwór.Ustaw docelową temperaturę na 100 stopni Celsjusza, moc na 60 watów i czas utrzymania na 10 minut. Monitoruj temperaturę za pomocą czujnika podczerwieni. Następnie usuń probówkę zawierającą kulki z reaktora mikrofalowego, zasysaj rozpuszczalnik DMF i produkty uboczne, jak pokazano wcześniej.Zamknij zawór próżniowy. Dodaj trzy mililitry DMF do przepłukania probówki i rurki dyspersyjnej gazu. Gdy roztwór jest prawie usunięty, otwórz zawór azotowy.

an-inexpensive-adaptation-commercial-microwave-reactor-for-solid

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opracowano prostą, jednoetapową syntezę N-sukcynimidylo-4-[18F]fluorobenzoesanu ([18F]SFB) w oparciu o beznawodny, trzyetapowy proces radiochemiczny. Dzięki zastosowaniu ogrzewania mikrofalowego całą procedurę można przeprowadzić w czasie krótszym niż 30 min, lub w 60 min w przypadku dodatkowego oczyszczania za pomocą preparatywnej HPLC. Skorygowane o czas rozpadu wydajności radiochemiczne (RCYs) wynosiły 35-5% (n &gt; 30).

Synteza jednoputowa z wykorzystaniem mikrofal N-succinimidylo-4-[18F]fluorobenzoesanu ([18F]SFB)

Opisano wydajną syntezę na fazie stałej funkcjonalizowanego trimeru bis-peptydowego z wykorzystaniem procedury odszczepiania typu „safety catch” z żywicy HMBA.

Synteza na fazie stałej funkcjonalizowanego bis-peptydu z wykorzystaniem metodologii „safety catch”

Poniższy protokół dostarcza techniki kapsułkowania komórek β trzustki w hydrożelach peptydowych PEG powstałych w wyniku reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. Ta platforma materiałowa nie tylko oferuje cytokompatybilne mikrośrodowisko do enkapsulacji komórek, ale także umożliwia kontrolowane przez użytkownika szybkie odzyskiwanie struktur komórkowych utworzonych w hydrożelach.

Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Przedstawiono prostą i ogólną metodę syntezy cyklicznych peptydów za pomocą promieniowania mikrofalowego. Procedura ta umożliwia syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych ze zbiorem różnych konformacji przy zachowaniu łańcuchów bocznych i ugrupowań farmakoforycznych, a tym samym pozwala na badanie przesiewowe pod kątem konformacji bioaktywnej.

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Przedstawiamy protokół budowy spiralnych peptydów tioeterowych/siarczków winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiol-en/tiol-yne.

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Związki heteroarylowe są ważnymi cząsteczkami wykorzystywanymi w syntezie organicznej, chemii medycznej i biologicznej. Heteroarylacja wspomagana mikrofalami przy użyciu katalizy palladowej zapewnia szybką i wydajną metodę przyłączania ugrupowań heteroarylowych bezpośrednio do substratów ketonowych.

Bezpośrednia heteroarylacja ketonów wspomagana mikrofalami przy użyciu katalizy metali przejściowych

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Poznaj ekonomiczną metodę syntezy peptydów z użyciem mikrofalowego reaktora do oligomerów aminokwasów o utrudnionej przestrzeni. To rozwiązanie umożliwia małym laboratoriom akademickim prowadzenie zaawansowanych badań w chemii organicznej.

Niedroga adaptacja komercyjnego reaktora mikrofalowego do syntezy peptydów fazy stałej

Przeglądaj więcej filmów